CN104558581A - 马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物,由泊洛沙姆共聚物的两末端或单末端经马来酰亚胺衍生化而制成,具有马来酰亚胺末端;泊洛沙姆的羟基末端进行氨基衍生化,得到具有氨基化末端的氨基化泊洛沙姆共聚物,再与马来酸酐混合反应,氨基化末端经马来酰亚胺衍生化制得马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物。本发明扩大了泊洛沙姆分子的应用范围,可作为连接材料吸附或嵌入疏水表面或内部,利用具有活性的马来酰基末端进行另一物质的连接,还可与巯基化生物大分子共价结合,达到活性分子纳米化的目的;应用于疏水物质的表面改性。泊洛沙姆共聚物的末端马来酰亚胺化有利于增加泊洛沙姆在医药、生物、化工等领域的应用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物及其制备方法与应用。
背景技术
泊洛沙姆是一类由聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)组成的PEO-PPO-PEO非离子型三嵌段共聚物,其结构式为:HO-(CH2CH2O)y-(CHCH3CH2O)x-(CH2CH2O)y-H,商品名为Pluronic、LutrolF(BASF,Germany)及Poloxamer(ICI),中文译名为普流罗尼克或泊洛沙姆。泊洛沙姆系列有30多种不同高聚物,均具有疏水性的聚氧丙烯嵌段和亲水性的聚氧乙烯嵌段,因而具有表面活性,可以吸附在疏水表面,也可形成胶束。
泊洛沙姆无生理活性、无溶血性、对皮肤无刺激性、毒性小,作为药用辅料可充当乳化剂、增溶剂、吸收促进剂、缓释材料等,应用到溶液剂、乳剂、栓剂、软膏、注射剂以及脂质体等新型给药系统中。
因泊洛沙姆具有广泛应用的前景,又因泊洛沙姆末端羟基的活性基团,泊洛沙姆的修饰衍生化研究一直受到人们关注,如利用羟基末端和难溶性羧酸类药物共价偶联,增加难溶性药物的应用前景;又如将泊洛沙姆末端氨基化和肝素等糖胺聚糖成分结合,作为抗凝血药物载体或生长因子缓控释载体。
高分子聚合物的链的末端引入马来酰亚胺基可以扩大高分子聚合物的应用范围,例如马来酰化端基聚乙二醇即是将马来酰亚胺基引入到链的两端,而马来酰亚胺和巯基的偶合是蛋白和多肽偶联中的一个非常有用的反应,可以被用作聚合物试剂来选择性诱捕巯基的多肽,以马来酰亚胺化材料为连接技术,在医药、生物及化工领域有重要意义。目前,国际上尚未有关末端马来酰基化的泊洛沙姆两亲性聚合物这一结构分子的研究。
发明内容
发明目的:为了克服现有技术中存在的不足,本发明提供一种马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物及其制备方法与应用,将泊洛沙姆聚合物的羟基末端进行马来酰亚胺衍生化,增强其疏水性和表面活性等性质。
本发明采取如下技术方案:
一种马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物,由泊洛沙姆共聚物的两末端或单末端经马来酰亚胺衍生化而制成,所述泊洛沙姆共聚物是由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段形成的具有羟基末端的共聚物。
进一步的,在本发明中,马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物具有马来酰亚胺末端,结构式为:
或
所述泊洛沙姆共聚物结构通式为:HO-(CH2CH2O)y-(CHCH3CH2O)x-(CH2CH2O)y-H,其中,x和y表示相应嵌段的聚合度,x=25~30,y=75~85。在泊洛沙姆系列中,Poloxamer.188(Pluronic F68,x=25~30且y=75~85),因其较高的安全性得到美国FDA批准。
一种马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物的制备方法,包括以下步骤:
1)将所述泊洛沙姆的羟基末端进行氨基衍生化,得到具有氨基化末端的氨基化泊洛沙姆共聚物;
2)所述氨基化泊洛沙姆共聚物与马来酸酐混合反应,氨基化末端经马来酰亚胺衍生化,得到具有马来酰亚胺末端的马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物。
进一步的,在本发明中,所述泊洛沙姆的羟基末端与乙二胺反应进行氨基衍生化。乙二胺常用于有机合成及高分子聚合,广泛用于制造药物、乳化剂、农药、离子交换树脂等,也是粘合剂环氧树脂的固化剂,以及酪蛋白、白蛋白和虫胶等的良好溶剂;可作为氨基的供体。
进一步的,在本发明中,具体反应过程为:
或
进一步的,在本发明中,具体操作过程包括:
a)将对甲磺酰氯或磺酰氯溶于二氯甲烷中,慢慢滴加到含有三乙醇胺的泊洛沙姆和二氯甲烷混合溶液中,冰水浴反应2~10时,然后将含有乙二胺的二氯甲烷溶液缓慢滴加至反应物中,反应持续6~24小时,反应物通过冷乙醚沉淀,再经二氯甲烷溶解和冷乙醚沉淀,收集后进行真空干燥,即得氨基化泊洛沙姆共聚物;
b)称取所述氨基化泊洛沙姆共聚物和马来酸酐,一同溶于冰醋酸中,常温反应12h,反应液用乙醚沉淀后得白色沉淀,真空干燥,得中间产物;
c)将所述中间产物溶于乙酸酐,反应液中加入乙酸钠,在90℃下加热,将反应液用二氯甲烷清洗,收集有机相,再使用冷乙醚沉淀;将得到的沉淀物溶于氯化钠水溶液,调节pH到4.0~7.5,再用二氯甲烷清洗,收集有机相,冷乙醚沉淀;抽滤并真空干燥,即得具有马来酰亚胺末端的马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物。
进一步的,在本发明中,马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物在制备共价连接氨基酸、多肽、蛋白类生物活性分子中的应用。
进一步的,在本发明中,马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物在生物医药材料、分离与分析检测材料和疏水物质的表面改性中的应用。
有益效果:本发明将具有两亲性的泊洛沙姆分子进行端基马来酰基化,可以扩大泊洛沙姆分子的应用范围,例如可以作为连接材料吸附或嵌入疏水表面或内部,利用具有活性的马来酰基末端进行另一物质的连接;马来酰化末端的泊洛沙姆分子可以与巯基化生物大分子共价结合,达到活性分子纳米化的目的;马来酰化末端的泊洛沙姆应用于疏水物质的表面改性。泊洛沙姆共聚物的末端马来酰基化有利于增加泊洛沙姆在医药、生物、化工等领域的应用。
附图说明
附图1是本发明中提及的泊洛沙姆188的红外谱图;
附图2是本发明马来酰亚胺化泊洛沙姆188和中间产物(Ⅲ)的红外谱图。
具体实施方式
一种马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物,其特征在于:由泊洛沙姆共聚物的两末端或单末端经马来酰亚胺衍生化而制成,泊洛沙姆共聚物是由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段形成的具有羟基末端的共聚物。
泊洛沙姆共聚物结构通式为:HO-(CH2CH2O)y-(CHCH3CH2O)x-(CH2CH2O)y-H,其中,x和y表示相应嵌段的聚合度,优选x=25~30,y=75~85。
一种马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物的制备方法,包括以下步骤:
1)将泊洛沙姆的羟基末端进行氨基衍生化,得到具有氨基化末端的氨基化泊洛沙姆共聚物,其分子为如下结构:
或
2)氨基化泊洛沙姆共聚物与马来酸酐混合反应,氨基化末端经马来酰亚胺衍生化,得到具有马来酰亚胺末端的马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物,其分子为如下结构:
或
泊洛沙姆共聚物的两末端或单末端羟基末端与乙二胺反应进行氨基衍生化,再与马来酸酐混合反应进行马来酰亚胺衍生化,马来酸酐作为马来酰基供体,乙二胺作为氨基供体。具体反应过程为:
或
马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物制备方法的具体操作过程包括:
a)将对甲磺酰氯或磺酰氯溶于二氯甲烷中,慢慢滴加到含有三乙醇胺的泊洛沙姆和二氯甲烷混合溶液中,冰水浴反应2-10小时,然后将含有乙二胺的二氯甲烷溶液缓慢滴加至反应物中,反应持续6-24小时,反应物通过冷乙醚沉淀,再经二氯甲烷溶解和冷乙醚沉淀三次,收集后进行真空干燥,即得氨基化泊洛沙姆共聚物(Ⅱ);
b)称取氨基化泊洛沙姆共聚物(Ⅱ)和马来酸酐,一同溶于冰醋酸中,常温反应12h,反应液用乙醚沉淀后得白色沉淀,真空干燥,得中间产物(Ⅲ);
c)将中间产物(Ⅲ)溶于乙酸酐,反应液中加入乙酸钠,在90℃下加热一段时间,将反应液用二氯甲烷清洗三次,收集有机相,再使用冷乙醚沉淀;将得到的沉淀物溶于氯化钠水溶液,调节pH到4.0-7.5,再用二氯甲烷清洗三次,收集有机相,冷乙醚沉淀;抽滤并真空干燥,即得具有马来酰亚胺末端的马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物(Ⅰ)。
马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物在制备共价连接氨基酸、多肽、蛋白类生物活性分子中的应用。
马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物在生物医药材料、分离与分析检测材料和疏水物质的表面改性中的应用。
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1 马来酰亚胺化泊洛沙姆188的制备
1.1.泊洛沙姆188的氨基化
取1g对甲磺酰氯溶于10mL二氯甲烷中,慢慢滴加到含有31μL三乙醇胺和2g泊洛沙姆的10mL二氯甲烷溶液中,冰水浴反应4小时,然后将含有乙二胺的二氯甲烷溶液缓慢滴加至反应物中,反应持续12小时,反应物通过冷乙醚沉淀再二氯甲烷溶解再冷乙醚沉淀,重复三次,收集后进行真空干燥,即得氨基化泊洛沙姆188;
1.2.氨基化泊洛沙姆188的马来酰亚胺化
称取260mg氨基化泊洛沙姆188和30mg马来酸酐,将其一同溶于冰醋酸中,常温下搅拌反应12h,反应液用冷乙醚沉淀后得白色沉淀,真空干燥后,得中间产物(Ⅲ),将中间产物(Ⅲ)溶于乙酸酐,再加入乙酸钠,在90℃下加热30分钟,反应液用二氯甲烷萃取洗三次,收集有机相;再使用冷乙醚沉淀,将得到的产物溶于氯化钠水溶液,调pH到6.0,用二氯甲烷清洗三次,收集有机相,冷乙醚沉淀;抽滤真空干燥即得具有马来酰亚胺末端的马来酰亚胺化泊洛沙姆188产物(Ⅰ)。
对比附图1,泊洛沙姆188在1600~1800cm-1无特征峰;采用附图2的红外谱图表征,发现中间物(Ⅲ)在1571cm-1出现-NH-峰,1629cm-1出现为-C=C-峰,1722cm-1和1694cm-1为羰基峰;产物(Ⅰ)的红外图谱检测结果在波长在1733cm-1出现了一个峰,中间物(Ⅲ)的两个羰基峰消失;1571cm-1的氮氢峰消失,以上证明了酰胺成环,证明有马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物生成。
实施例2 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)-泊洛沙姆共聚物的制备
取TRAIL蛋白适量加入Traut’s试剂,混合均匀,氮气保护下室温反应2小时,过Sephadex G25(Tris-HCl缓冲液,5mM EDTA),收集巯基化蛋白部位,4℃保存,巯基化蛋白浓度和巯基化程度分别采用BCA和Ellman法测定。
按一定比例加入到马来酰亚胺化泊洛沙姆水溶液中,放置过夜,加入适量β巯基乙醇封闭没有反应的马来酰亚胺化泊洛沙姆,用COMW=3500透析袋,在4℃下,用Tris-HCl透析液透析,每隔8h换液,除去多余的β巯基乙醇,透析两天,收集透析袋内的泊洛沙姆化蛋白。
该蛋白共价修饰到泊洛沙姆嵌段共聚物上,在水溶液中为纳米胶束形式,可以改变蛋白在体内的分布,增加TRAIL在肿瘤的富集。
实施例3.Anti-CD33 mAb修饰脂质体的制备
3.1.抗体巯基化的制备
取CD33单克隆抗体(Clone No.2C6B7)适量加入Traut’s试剂,抗体与Traut’s试剂摩尔比为1:200,混合均匀,氮气保护下室温反应2小时,通过透析方法4℃下除去多余Traut’s试剂,每次足量透析液(pH7.4 PBS,5mM EDTA),磁力小心低速搅拌,6~8h换透析液,共两次,巯基化抗体浓度和巯基化程度分别采用BCA和Ellman’s试剂法测定,收集透析袋内液体,4℃保存。
3.2.普通脂质体的制备
称取蛋黄磷脂80mg、胆固醇10mg,溶于氯仿,50℃减压下缓慢蒸除氯仿,继续减压旋蒸3h,加入10mL 0.2Mol/L pH7.4的PBS,孵育1h,探针超声(功率750W,脉冲2s,间歇2s,振幅20%)有效时间6min,过0.45μm膜和0.22μm膜各一次,收集过滤液,即得制备的脂质体。
3.3.anti-CD33 mAb修饰的脂质体的制备
取实施例1制备的马来酰亚胺化泊洛沙姆12mg,加入到步骤3.2制得的脂质体中,孵育过夜,加入适量步骤3.1制得的巯基化抗体,反应过夜,加入适量β巯基乙醇封闭没有反应的马来酰亚胺泊洛沙姆,通过SEPHAROSE CL-4B纯化收集脂质体部分,即得CD33 mAb修饰的脂质体。
该脂质体具有靶向细胞表面CD33抗原和一定的长循环功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物,其特征在于:由泊洛沙姆共聚物的两末端或单末端经马来酰亚胺衍生化而制成,所述泊洛沙姆共聚物是由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段形成的具有羟基末端的共聚物。
2.根据权利要求1所述的马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物,其特征在于:具有马来酰亚胺末端,结构式为:
或
所述泊洛沙姆共聚物结构通式为:HO-(CH2CH2O)y-(CHCH3CH2O)x-(CH2CH2O)y-H,其中,x和y表示相应嵌段的聚合度,x=25~30,y=75~85。
3.根据权利要求1至2任一所述的马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)将所述泊洛沙姆的羟基末端进行氨基衍生化,得到具有氨基化末端的氨基化泊洛沙姆共聚物;
2)所述氨基化泊洛沙姆共聚物与马来酸酐混合反应,氨基化末端经马来酰亚胺衍生化,得到具有马来酰亚胺末端的马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物。
4.根据权利要求3所述的马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物的制备方法,其特征在于:所述泊洛沙姆的羟基末端与乙二胺反应进行氨基衍生化。
5.根据权利要求4所述的马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物的制备方法,其特征在于:具体反应过程为:
6.根据权利要求4所述的马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物的制备方法,其特征在于:具体操作过程包括:
a)将对甲磺酰氯或磺酰氯溶于二氯甲烷中,慢慢滴加到含有三乙醇胺的泊洛沙姆和二氯甲烷混合溶液中,冰水浴反应2~10时,然后将含有乙二胺的二氯甲烷溶液缓慢滴加至反应物中,反应持续6~24小时,反应物通过冷乙醚沉淀,再经二氯甲烷溶解和冷乙醚沉淀,收集后进行真空干燥,即得氨基化泊洛沙姆共聚物;
b)称取所述氨基化泊洛沙姆共聚物和马来酸酐,一同溶于冰醋酸中,常温反应12h,反应液用乙醚沉淀后得白色沉淀,真空干燥,得中间产物;
c)将所述中间产物溶于乙酸酐,反应液中加入乙酸钠,在90℃下加热,将反应液用二氯甲烷清洗,收集有机相,再使用冷乙醚沉淀;将得到的沉淀物溶于氯化钠水溶液,调节pH到4.0~7.5,再用二氯甲烷清洗,收集有机相,冷乙醚沉淀;抽滤并真空干燥,即得具有马来酰亚胺末端的马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物。
7.权利要求1至2任一所述的马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物在制备共价连接氨基酸、多肽、蛋白类生物活性分子中的应用。
8.权利要求1至2任一所述的马来酰亚胺化泊洛沙姆共聚物在生物医药材料、分离与分析检测材料和疏水物质的表面改性中的应用。
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