CN1732207A - 马来酰胺酸聚合物衍生物及其生物轭合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水溶性聚合物的马来酰胺酸衍生物、化学稳定的水溶性聚合物琥珀酰胺酸－活性剂轭合物及进行重复性制备的方法，该方法中使用了该聚合物试剂及其轭合物并以此为特征。

Description

马来酰胺酸聚合物衍生物及其生物轭合物

                       发明领域

本发明主要涉及聚合物化学领域，更具体而言，涉及由马来酰亚胺或马来酰胺酸官能化的水溶性聚合物，如聚乙二醇制成的化学稳定的活性剂轭合物，以及合成、表征和使用该聚合物试剂和轭合物的方法。

                       发明背景

由于生物技术的最新进展，治疗蛋白质和其它生物分子，如抗体和抗体链段目前可以大规模地制备，使得这些生物分子可以更广泛地得到利用。不幸的是，潜在的治疗生物分子的临床应用往往被其快速的蛋白酶解降解、低生物利用率、在生产、贮存或给药时的不稳定性，或其免疫原性所阻碍。由于对给药蛋白质及其它生物分子的治疗用途的持续关注，人们已经对克服这些缺陷的各种方法进行了研究。

一种已经得到广泛研究的方法是通过共价连接水溶性聚合物对蛋白质及其它潜在的治疗分子进行修饰，所述水溶性聚合物例如为聚乙二醇或“PEG”(Abuchowski，A.，等人，J.Biol.Chem.252(11)，3579(1977)；Davis，S.，等人，Clin.Exp Immunol.，46，649-652(1981))。在许多情况下已表明，PEG修饰蛋白质，也称PEG轭合物或聚乙二醇化的蛋白质的生物性能较之未聚乙二醇化的对应物有显著的提高(Herman，等人，Macromol.Chem.Phys.，195，203-209(1994))。已经表明，聚乙二醇修饰蛋白质由于提高的蛋白酶解降解抗性而在体内具有更长的循环周期，并且还具有提高的热稳定性(Abuchowski，A.，等人，J.Biol.Chem.，252，3582-3586(1977))。在其它的生物分子，如抗体和抗体链段上观察到了类似的生物效能提高(Chapman，A.，Adv.DrugDel.Rev.54，531-545(2002))。

通常，是通过活化的PEG衍生物将聚乙二醇连接到药物或其它表面上的，也就是说，通过至少具有一个适合于与生物分子(例如，赖氨酸、半胱氨酸及类似的蛋白质残基)的亲核中心进行反应的活化末端的PEG。最常用的方法是基于活化的PEG与蛋白质氨基，例如位于蛋白质的赖氨酸侧链上的氨基进行反应。具有适合于与蛋白质氨基进行反应的活化端基的聚乙二醇包括PEG-醛(Harris，J.M.，Herati，R.S.，polym Prepr.(Am.Chem.Soc.，Div.Polym.Chem)，32(1)，154-155(1991))、混合酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺酯、羰基咪唑烷(carbonylimadazolide)和氯氰脲酸酯(Herman，S.，等人，Macromol.Chem.Phys.195，203-209(1994))。尽管已表明许多蛋白质在PEG修饰过程中保持了活性，但在某些情况下，聚合物通过蛋白质氨基的连接是所不期望的，例如，当特定的赖氨酸残基的衍生作用钝化该蛋白质时(Suzuki，T.，等人，Biochimica et Biophysica Acta 788，248-255(1984))。并且，由于大多数蛋白质具有几个可利用的/可接近的氨基，所形成的聚合物轭合物通常是单聚乙二醇化、二聚乙二醇化、三聚乙二醇化等产物的混合物，这对于表征和分离是困难的并且也是耗时的。另外，该混合物往往不能重现性地制备，这在为管理许可而进行放大时及随后的商品化中出现问题。

一种避免这些问题的方法是使用以氨基以外的其它官能团为标靶的位点选择性聚合物试剂。一种特别有吸引力的标靶是硫羟基，其存在于蛋白质的氨基酸，半胱氨酸上。在蛋白质中半胱氨酸通常比赖氨酸更少，因而与那些含硫羟基氨基酸连接时降低了蛋白质发生惰化作用的可能性。并且，与半胱氨酸位点的连接通常是以非常明确的方式进行的，这导致了单一种类聚合物轭合物的形成。

具有硫羟基选择性反应端基的聚乙二醇衍生物包括马来酰亚胺、乙烯基砜、碘乙酰胺、硫醇和二硫化物，其中马来酰亚胺是最常用的。这些衍生物都已用于与蛋白质的半胱氨酸侧链的偶联。(Zalipsky，S.Bioconjug.Chem.6，150-165(1995)；Greenwald，R.B.等人Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17，101-161(2000)；Herman，S.，等人，Macromol.Chem.Phys.195，203-209(1994))。但是，由于其合成和纯化困难，许多此类试剂还未得到广泛的研究。

具有马来酰亚胺端基的聚乙二醇衍生物是最常用类型的巯基选择性试剂之一，可从多种来源进行商购。尽管未得到广泛的赞同或认可，申请人已认识到许多PEG-马来酰亚胺在贮存和/或与候选药物结合的过程中不幸地显示出了水解不稳定性。更具体而言，无论在结合前还是结合后，都已经观察到了马来酰亚胺环的大幅度水解。这种不稳定性可以导致在药物轭合物组合物中形成多种药物轭合物。各种药物轭合物品种可能具有相似的生物活性，但在药代动力学性能上可能有所不同。这对于病人给药用组合物尤其不利，因为所形成的药物组合物可能是各种药物轭合物品种的不明确混合物，其实际安全性和累积效果是未知的。并且，由于影响水解速率的因素不同，药物轭合物组合物批次间的不一致性可能会引起其它问题。

申请人所观察到的另一个潜在问题是由PEG马来酰亚胺制成的轭合物脱聚乙二醇而形成改变的药物和脱除的PEG杂质的混合物。因此申请人已发现，对于与目标药物上的硫羟基或其它活性剂进行偶联，PEG马来酰亚胺可能不是所希望的试剂。为了解决该问题，以前的尝试集中在通过使其更不易水解(即，开环)来提高聚合物马来酰亚胺的稳定性。参见，例如美国专利申请公开No.US 2003/0065134。

因而，申请人已认识到本技术领域中对开发用于与生物活性分子以所希望的位点选择方式进行偶联的新型活化PEG的持续需求，这种活化PEG克服了目前使用的硫羟基选择性聚合物试剂的缺点并在贮存和偶联过程中保持稳定。本发明满足了这些需求。

                       发明概述

本发明提供(i)在贮存和偶联过程中保持稳定、(ii)耐水解和(iii)表现出提高的耐脱聚乙二醇性的硫羟基选择性聚合物试剂及其轭合物，从而使得可以形成化学上充分稳定且非常明确的药物轭合物组合物，下文将对该组合物作更详细的描述。

本发明是基于申请人对常规聚合物马来酰亚胺试剂替代物需求的有关认识。对于这种需求，申请人已经设计了一种与目前使用的其它方法完全相反的方法。也就是说，申请人不是使用通常的方法及试图防止马来酰亚胺环的水解，而是有意地强制打开马来酰亚胺环，来提供聚合物试剂和轭合物，其中“马来酰亚胺”被转化为稳定的琥珀酰胺酸开环形式。

更具体来说，一方面，本发明提供一种方法，其中水溶性聚合物的马来酰亚胺基团被强制(有意地)转化为其开环的马来酰胺酸形式，所述转化发生在与活性剂进行偶联之前或更常规地发生在偶联之后。从而，提供了具有(i)非常明确的组分和(ii)被降低的水解趋势的马来酰胺酸或琥珀酰胺酸聚合物组合物，尤其是相对于其马来酰亚胺衍生的琥珀酰亚胺对应物。

更具体来说，一方面，本发明提供一种用于制备聚合物轭合物的方法。该方法包括步骤(a)提供包含马来酰亚胺基团的水溶性聚合物，和步骤(b)使该聚合物在能有效地使活性剂和水溶性聚合物通过Micheal加成反应进行偶联的条件下与具有亲核基团的活性剂进行反应，以形成聚合物-琥珀酰亚胺-连接的活性剂轭合物。然后在步骤(c)中，在能有效地强制打开琥珀酰亚胺环的条件下处理该轭合物，从而形成聚合物-琥珀酰胺酸-轭合物。

在一个实施方案中，通过水解反应强制使马来酰亚胺环打开。通常，开环水解是在碱的存在下进行的，所述碱可以存在于溶液中或固体载体上。用于控制水解的典型pH是在约6-12的范围内。

在优选实施方案中，水解是在可有效地提供化学稳定的聚合物-琥珀酰胺酸-轭合物组合物的条件下进行的。

在该方法的一个实施方案中，水解反应进行到至少形成约15％的聚合物琥珀酰胺酸轭合物，基于闭环形式的转化。在替代实施方案中，水解反应进行到至少形成约35％、或50％、或80％、或95％、或98％或基本上100％的聚合物琥珀酰胺酸轭合物，即，其中的聚合物马来酰亚胺轭合物基本上全部开环。

本发明中使用的水溶性聚合物包括聚(氧化烯)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰基吗啉)和聚(乙氧基化多元醇)。优选的水溶性聚合物是聚乙二醇。

另一方面，本发明提供一种由上述方法制备的聚合物琥珀酰胺酸轭合物组合物。

又一方面，本发明提供包含以下成分的组合物：

和/或

其中POLY为水溶性聚合物链段，L为任选的连接基，且“Nu-ActiveAgent”表示包含亲核基团“Nu”的活性剂。优选亲核基团包括 硫羟基、硫醇盐和氨基。

再一方面，本发明提供一种用水溶性聚合物衍生的的蛋白质，其中聚合物通过共价连接在半胱氨酸巯基或赖氨酸氨基上的琥珀酰亚胺基被偶联到蛋白质上，并且基本上所有的琥珀酰亚胺基以开环的形式存在。

当结合以下的附图和详细说明进行理解时，本发明的这些及其它目标和特征会变得更为明了。

                        附图简述

图1中图解了聚合物马来酰亚胺及聚合物马来酰胺酸与代表性活性剂的硫羟基进行的一种形成本发明的聚合物-琥珀酰胺酸轭合物的典型反应，该情况下的代表性活性剂为蛋白质。

图2中图解了聚合物马来酰亚胺及聚合物马来酰胺酸与代表性活性剂的氨基进行的一种形成本发明的聚合物-琥珀酰胺酸轭合物的典型反应，该情况下的代表性活性剂为蛋白质。

图3为实施例2中详细描述的连接有支化聚合物的马来酰亚胺的浓度对数随时间变化的曲线图。

                         发明详述

在对本发明进行详细说明之前，应该理解的是本发明并不局限于具体的聚合物、合成技术、活性剂等，它们是可以改变的。还应理解的是本发明使用的术语仅仅是为了对具体实施方案进行说明，而不是为了进行限定。

在对本发明进行说明和要求权利时，将按下述定义使用以下的术语。

定义

下述术语在本发明中具有如下含义。

说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”、“所述”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。

本发明中使用的“PEG”或“聚(乙二醇)”的意思包括任何水溶性聚(氧化乙烯)。通常，本发明中所用的PEG将包含以下两种结构：“-(CH₂CH₂O)_n-1”或“-(CH₂CH₂O)_n-1CH₂CH₂-”，这取决于端基氧是否被取代，例如在合成转换过程中。变量(n)为3-3000，且整个PEG的端基和结构可以改变。当PEG进一步包含连接基部分(下面将进行更详细描述)时，包含连接基的原子在共价连接于PEG链段上时并不会导致形成(i)氧-氧键(-O-O-，过氧连接键)，或(ii)氮-氧键(N-O、O-N)。“PEG”是指含有大部分，即大于50％的-CH₂CH₂O-子单元的聚合物。本发明使用的PEG包括具有各种分子量、结构或几何形状的PEG(例如，支化、线性、叉状PEG、树枝状等)，以下将对其进行更详细的说明。

“PEG二醇”也称为α-、ω-二羟基聚(乙二醇)，可以以简略地形式表示为HO-PEG-OH，其中PEG的定义如上。

在本发明聚合物范围内的“水溶性”或“水溶性聚合物链段”是在室温下可溶于水的任何链段或聚合物。通常，水溶性聚合物或链段可透过至少约75％的光，更优选过滤后同样的溶液可透过至少约95％的光。以重量计，优选水溶性聚合物或其链段的至少约35％(以重量计)可溶于水中，更优选至少约50％(以重量计)可溶于水中，进一步优选至少约70％(以重量计)可溶于水中，更进一步优选至少约85％(以重量计)可溶于水中。但是，最优选的是水溶性聚合物或其链段的约95％(以重量计)或全部可溶于水中。

“封端”基团是存在于诸如PEG的聚合物末端的惰性或非活性基团。封端基团是在典型的合成反应条件下不易发生化学转变的基团。封端基团通常为烷氧基，-OR，其中R为包含1-20个碳原子的有机基团，且优选为低级烷基(例如，甲基、乙基)或苄基。“R”可以是饱和或不饱和的，包括芳基、杂芳基、环、杂环、和前述基团的被取代形式。例如，封端的PEG通常包含“RO-(CH₂CH₂O)_n-”结构，其中R的定义如上。另外，封端基团也可以有利地包含可检测的标记。当聚合物具有包含可检测标记的封端基团时，聚合物和/或偶联聚合物的组成部分(例如活性试剂)的量或位置就能够通过使用适当的检测器进行测定。这种标记包括但不限于荧光剂、化学发光剂、酶标记中使用的成分、比色(例如，染料)、金属离子、放射性成分等。封端基团也可以有利地包含磷脂。当聚合物具有诸如磷脂的封端基团时，聚合物就被赋予了独特的性能(例如与进行了类似封端的聚合物形成有组织的结构的能力)。典型的磷脂包括但不限于那些选自称为磷脂酰胆碱的那类磷脂。具体的磷脂包括但不限于那些选自二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、山萮酰磷脂酰胆碱、花生四烯酰磷脂酰胆碱和卵磷脂的磷脂。

关于本发明共聚物的“非天然形成”是指完全未在自然界发现的聚合物。但是本发明的非天然形成聚合物可以含有天然形成的一个或多个子单元或子单元链段，只要整个聚合物结构未在自然界发现。

在本发明的水溶性聚合物如PEG的上下文中的“分子量”是指聚合物的标称平均分子量，通常是通过尺寸排除色谱、光散射技术或在1，2，4-三氯苯中测定内禀速度来确定的。本发明的聚合物通常为多分散的，具有小于约1.20的低多分散值。

术语“反应性的”或“活化的”是指在常规的有机合成条件下易于反应或以实用的速率进行反应的官能团。这和那些或者不反应或者要求强催化剂或不实际的反应条件以进行反应的基团(即，“非反应性的”或“惰性的”基团)大不相同。

关于位于反应混合物分子上的官能团的“不易反应的”或“惰性的”，是指在使反应混合物产生预期反应的有效条件下该官能团基本保持原状。

“保护基”是在某种反应条件下防止或阻断分子上特定的化学反应性官能团进行反应的成分。“保护基”将根据所要保护的化学反应基团的类型及所采用的反应条件和分子中其它反应性或保护性基团的存在而改变。可以被保护的官能团包括，例如羧酸基、氨基、羟基、硫羟基、羰基等。用于羧酸的代表性保护基包括酯(如，对甲氧基苄基酯)、酰胺和酰肼；用于氨基的有氨基甲酸酯(如叔丁氧羰基)和酰胺；用于羟基的有醚和酯；用于硫羟基的有硫醚和硫酯；用于碳基的有缩醛和缩酮等。这些保护基对于本领域技术人员来说是熟知的，其被描述于例如，T.W.Greene和G.M.Wuts，Protecting Groups in Organic Synthesis，第三版，wiley，纽约，1999及其中引用的参考文献中。

“被保护形式”的官能团是指带有保护基的官能团。本发明中使用的术语“官能团”或其任何同义词的意思包括其被保护形式。

本发明中使用的术语“连接键”是指任选用于连接互联部分的原子或原子团，所述互联部分例如为聚合物链段和马来酰亚胺。本发明的连接键通常是水解稳定的。

“可生物分裂的”或“可水解的”或“可降解的”键是在生理条件下与水反应(即，被水解)的较弱键。键在水中水解的趋势将不仅取决于连接两中心原子的键的一般类型，还取决于这些中心原子上所连接的取代基。适宜的水解不稳定连接键或弱连接键包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧烷基醚、亚胺、原酸酯、肽和低聚核苷酸、硫酯、硫羟酸酯和碳酸酯。

“可酶促降解连接键”是指被一种或更多种酶降解的连接键。

“水解稳定的”连接键对于本发明来说，特别是对于本发明的聚合物来说是指在正常的生理条件下水解稳定的原子或原子团。也就是说，水解稳定的键在长时间的生理条件下不发生明显的水解。水解稳定的连接键的例子包括但不限于碳-碳键(例如，在脂肪链中)、醚、酰胺、尿烷、胺等。代表性化学键的水解速率可以在大部分的标准化学教科书中找到。

关于聚合物的几何或整体结构的“支化的”是指具有2或更多个聚合物“臂”的聚合物。支化聚合物可以具有2个聚合物臂、3个聚合物臂、4个聚合物臂、6个聚合物臂、8个聚合物臂或更多聚合物臂。一种特殊类型的高度支化聚合物是树枝状聚合物或树状聚合物，其对于本发明来说被认为具有与支化聚合物明显不同的结构。

“支化点”是指含有一个或更多个原子的分枝点，聚合物在此处由线性结构分裂或支化成一个或更多个另外的聚合物臂。

“树状聚合物”是一种球状、尺寸单分散的聚合物，其中所有键以放射状从中心焦点或核心伸出，具有规则的支化形态且每个重复单元都产生一个支化点。树状聚合物表现出某些树枝形状态的性能，如核包囊，使其具有相对于其它类型聚合物的独特性。

“实质上”或“基本上”是指几乎整个地或完全地，例如某个给定量的95％或更大。

取决于在分子中的位置及该基团与氢以外原子的连接点数，“烷基”或“烷撑”基团是指烃链或其一部分，长度通常为约1-20个碳原子。所述烃链优选但不必须是饱和的，除非指明如此，并且可以是支化链或直链，但通常直链是优选的。烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1一甲基丁基、1一乙基丙基、3-甲基戊基等。

“低级烷基”或“低级烷撑”是指含有1-6个碳原子的上述烷基或烷撑基团，可以是直链或支化的，例子有甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基。

取决于在分子中的位置及该基团与氢以外原子的连接点数，“环烷基”或“环烷撑”是指饱和或不饱和的环烃链，包括多环，如桥环、稠合环或螺环化合物，优选由3-约12个碳原子构成，更优选为3-约8个碳原子。

“低级环烷基”或“低级环烷撑”是指含有1-6个碳原子的环烷基。

“脂环的”是指含有碳原子环的任何脂肪族化合物。脂环基是指含有被一个或更多个烷基或烷撑取代的上述所定义的“环烷基”或“环烷撑”基的基团。

“非干扰取代基”是指当存在于分子中时，通常与分子中所含的其它官能团不发生反应的基团。

例如在“被取代的烷基”中的术语“被取代的”是指用一个或更多个非干扰取代基所取代的成分(例如，烷基)，所述非干扰取代基例如是但不限于C₃-C₈环烷基，如环丙基、环丁基等；卤素，如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基、低级苯基；被取代的苯基等。对于在苯环上的取代，取代基可以任何方位(即，邻位、间位或对位)。

“烷氧基”是指-O-R基，其中R为烷基或取代烷基，优选为C₁-C₂₀烷基(例如，甲基、乙基、丙基、苄基等)，优选为C₁-C₇。

本发明中使用的“烯基”是指支化的或非支化的长度为1-15个原子的烃基，含有至少一个双键，例如乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、辛烯基、癸烯基、十四碳烯基等。

本发明中使用的术语“炔基”是指支化的或非支化的长度为2-15个原子的烃基，含有至少一个三键，有乙炔基、正丙炔基、异丙炔基、正丁炔基、异丁炔基、辛炔基、癸炔基等。

“芳基”是指一个或更多个芳环，每个环含有5或6个核心碳原子。芳基包括可能稠合的多个芳环，如在萘基中，或非稠合的多个芳环，如在联苯中。芳环还可以与一个或更多个环烃、杂芳基或杂环进行稠合或不进行稠合。本发明中使用的“芳基”包括“杂芳基”。

“杂芳基”是含有1-4个杂原子的芳基，杂原子优选为N、O或S，或它们的组合。杂芳环还可以与一个或更多个环烃、杂环、芳基或杂芳环进行稠合。

“杂环”或“杂环的”是指具有5-12个原子的一个或更多个环，优选为5-7个原子，其具有或不具有不饱和性或芳香性且带有至少一个非碳的环原子。优选杂原子包括硫、氧和氮。

“取代杂芳基”是带有一个或更多个非干扰基团作为取代基的杂芳基。

“取代杂环”是带有由非干扰取代基形成的一个或更多个侧链的杂环。

“亲电试剂”是指离子、可以电离的原子或原子团，其具有亲电中心，即，搜寻电子的中心，能够与亲核试剂反应。

“亲核试剂”是指离子、可以电离的原子或原子团，其具有亲核中心，即，搜寻亲电中心的中心，能够与亲电试剂反应。

本发明中使用的“活性剂”包括可产生某种病理效果的任何试剂、药物、化合物、材料的组合物或混合物，所述病理效果往往是有益的且表现在体内或体外。其包括食物、食品增补剂、营养素、营养药物食品、药物、疫苗、抗体、维生素及其它有益试剂。在本发明中使用的这些术语还包括在病人上产生局部或全身作用的生理或病理学活性物质。

“制药上可接受的赋形剂”或“制药上可接受的载体”是指可以包含在本发明的组合物中且不会对病人产生明显毒副作用的赋形剂。

本发明中可相互替代使用的“药理学有效量”、“生理学有效量”和“治疗有效量”是指在制药时存在的PEG-活性剂轭合物的量，该量必需能在血流或靶组织中提供预期水平的活性剂和/或轭合物。精确的量取决于多种因素，例如，具体的活性剂、制药成分和物理特性、所针对的病人群体、病人条件等，基于本发明提供的信息和可从相关文献中获取的信息，该量对于本领域技术人员来说是易于确定的。

在本发明聚合物范围内的“多官能性”是指带有本发明中的三个或更多个官能团的聚合物骨架，其中的官能团可以相同或不同，且通常位于聚合物末端。本发明的多官能性聚合物将通常在聚合物骨架上含有约3-300个官能团、或3-50个官能团、或3-25个官能团、或3-15个官能团、或3-10个官能团、或将含有3、4、5、6、7、8、9或10个官能团。

“双官能性”聚合物是指带有本发明中的两个官能团的聚合物，官能团通常位于聚合物末端。当官能团相同时，聚合物被称为是同双官能性的。当官能团不相同时，聚合物被称为是异双官能性的。

本发明所述的碱性或酸性反应物包括不带电的、带电的、和其任意形式的对应盐。

“聚烯醇”是指含有烯烃聚合物骨架，如聚乙烯，且在聚合物骨架上连接有多个侧羟基的聚合物。聚烯醇的一个例子是聚乙烯醇。

本发明中使用的“非肽”是指基本上不含肽键的聚合物骨架。但是，该聚合物可以包括沿重复单体子单元间隔开的少量肽键，例如，大约每50个单体单元存在约1个肽键。

术语“病人”是指患有或易患某种病症的生物机体，所述病症可以通过本发明聚合物的给药进行预防或治疗，但是通常不一定采取聚合物-活性剂轭合物的形式，其包括人类和动物。

“任选的”或“任选地”是指随后描述的情况可以发生或不发生，以使说明书包括该情况发生的例子和该情况不发生的例子。

“残基”是指与一种或更多种分子进行反应后残存的一部分分子。例如，在本发明的聚合物轭合物中的生物活性分子残基通常相当于那部分生物活性分子，直至但是排除由生物活性分子上的反应性基团与聚合物试剂上的反应性基团进行反应所形成的共价键。

术语“轭合物”用来指由分子，例如生物活性分子或任何反应性表面与反应性聚合物分子共价连接而形成的实体，所述反应性聚合物分子优选为反应性聚(乙二醇)。术语“吸电子基团”是指通过中介机制(即，通过π键增加或减少局部电子密度)或诱导机制(即，负电部分沿σ键吸引电子密度，从而使该键极化)使电子密度向自身移动并远离分子的其它区域的化学部分。

在本发明所述的组合物、聚合物和轭合物范围中的“化学稳定”是指从初始样品制备起计算经过3个月并作为基本上为中性pH(例如，6.8-7.2)的缓冲溶液在室温下进行贮存后，在其聚合物组合物中发生5％或更少变化的样品(即，主题聚合物、轭合物等未发生任何明显的化学变化或降解，例如，使用时通过脱聚乙二醇(depegylation)或水解而形成化学物质，这些化学物质在数量上或结构上都不同于样品中初始存在的成分)。

在本发明范围内的“耐水解”聚合物或组合物是从初始样品制备起计算经过3个月的贮存、并作为基本上为中性pH(例如，6.8-7.2)的缓冲溶液在室温下进行贮存后，发生的水解程度小于5％的聚合物或组合物。

“2或3-取代的琥珀酰胺酸”是指取代基的位置，例如，在聚合物琥珀酰胺酸上作为活性剂一部分的亲核基团的位置，其中琥珀酰胺酸的羧酸基表示碳号1，与其相邻的碳或位置为碳号2等。

发明概述

通常，位于聚合物上的马来酰亚胺基团被用来与活性剂进行共价连接或将聚合物轭合至活性剂，所述活性剂例如为生物分子，尤其是含有一个或更多个活性硫羟基的生物分子。该硫羟基可以是天然具有的，或者，该生物分子可进行修饰或设计而使其含有适合于与马来酰亚胺进行偶联的硫羟基。在某些更为严酷的反应条件下，例如在更高的pH水平下，生物分子上的活性氨基也可以加成到聚合物衍生物的马来酰亚胺基团上而形成相应的轭合物。通过一系列的实验，申请人已经发现某些聚合物-马来酰亚胺衍生物，依赖于其结构，易于在与活性剂进行轭合之前或之后水解成开环的马来酰胺酸形式的聚合物。水解反应不仅取决于聚合物衍生物的整体结构，还取决于pH值。通常，水解速率随pH值的升高而加快。另外，取决于所形成组分的湿含量和pH值，开环形式的聚合物轭合物的形成也可以发生在干聚合物轭合物组合物的存贮期间，例如当活性剂为非蛋白质药物时。在发生开环的情况下，所形成的组合物可能实际上是开环和闭环轭合物的复杂混合物。总之，这种水解是有问题的，尤其是对于长期稳定性及药物批次间的一致性要求极高的商品化药物组合物。

在为解决该问题而进行的尝试中，本发明提供某些马来酰胺酸聚合物衍生物、其轭合物和含有它们的组合物，以及制备和使用这些源自马来酰胺酸的聚合物衍生物的方法。本发明聚合物的提供是为了通过强制或促进马来酰亚胺环的水解来克服有关马来酰亚胺官能化聚合物的那些问题，所述水解或者在轭合之前或者更优地在轭合的随后进行。从而，就提供了开环聚合物马来酰胺酸结构，该结构比对应的马来酰亚胺(或琥珀酰亚胺)要稳定的多。优选本发明的聚合物马来酰胺酸组合物具有非常明确和实质上未改变数量的聚合物马来酰胺酸或聚合物琥珀酰胺酸轭合物，这使得本发明的组合物极适合于用作向哺乳动物对象给药的药物组合物。

本发明中提供了显示该方法概况的两个图解性的反应图式图1和图2。反应图式I(图1)图解了聚合物马来酰亚胺(结构I)及聚合物马来酰胺酸(结构II)与生物活性分子的硫羟基的反应，此时的生物活性分子为蛋白质。图1和2中所示的反应条件是仅仅是用于例示，而不是为了进行限定。反应图式II(图2)类似地图解了聚合物马来酰亚胺及聚合物马来酰胺酸与生物活性分子的氨基的反应，此时的生物活性分子为蛋白质。在每个图式中，轭合的琥珀酰胺酸产物的两种异构体结构都作了显示(结构IV和V，其中IV-A和V-A对应于连接硫羟基的聚合物琥珀酰胺酸且IV-B、V-B对应于连接氨基的聚合物琥珀酰胺酸)。引入的亲核基团在马来酰亚胺环的双键的两个碳：C-2或C-3中任一个上进行加成产生了两种不同的产物。

参照图1或图2，可以看出尽管活性剂与聚合物马来酰胺酸II的连接可以进行，但反应特别慢。因此，获得预期的马来酰胺酸轭合物的更优选的路线是通过聚合物马来酰亚胺轭合物的水解，所述聚合物马来酰亚胺轭合物一般显示为结构III。也就是说，与相应的聚合物马来酰亚胺衍生物相比，马来酰胺酸聚合物衍生物更不易与亲核基团反应形成相应的轭合物。因而，与聚合物马来酰亚胺连接后再进行开环通常比聚合物马来酰亚胺开环后再进行连接更为可取，尽管两种方法都导致了聚合物-琥珀酰胺酸轭合物的形成，所述轭合物通常显示为结构IV和V。

马来酰胺酸或琥珀酰胺酸聚合物衍生物和轭合物的形成

聚合物马来酰亚胺

通常，本发明提供的方法以聚合物马来酰亚胺为起点。聚合物马来酰亚胺可以从商业途径获得，例如从Nektar，Huntsville，Alabama。例如可以从Nektar商购到多种分子量的聚合物马来酰亚胺，如mPEG(MAL)2、mPEG2(MAL)2、mPBG2-MAL、和mPEG-MAL。这些聚合物马来酰亚胺的相应结构可以在Nektar Catalog，2001中题为“PolyethyleneGlycol and Derivatives for Biomedical Applications”的内容的第8页找到，在此将其引入作为参考。

另外，本发明的聚合物马来酰亚胺可以通过包括以下内容的多种合成路线中的任一种进行制备。一种方法是，通过使连接在聚合物链段(即，活化的聚合物链段)上的官能团与双官能性试剂的官能团进行反应来制备马来酰亚胺封端的聚合物，其中的双官能性试剂带有的官能团之一为马来酰亚胺或可转化为马来酰亚胺的官能团，例如氨基。聚合物链段与双官能性试剂的反应导致了试剂与聚合物链段的共价连接，从而形成了聚合物马来酰亚胺或聚合物马来酰亚胺前体，所述共价连接通常是通过水解稳定性连接键。

例如，双官能性试剂可以具有A-L-B的结构，其中A是可与聚合物链段上的第二官能团反应形成键L并从而形成POLY-L-B的第一官能团，其中B为马来酰亚胺或易转变为马来酰亚胺的官能团(例如胺，其可通过与甲氧羰基马来酰亚胺进行反应而转变为马来酰亚胺)。在上述方法中，A可以是诸如以下的适合于与活化聚合物试剂上的目标官能团进行反应的多种官能团中的任一种：卤素、羟基、活性酯，如N-琥珀酰亚胺基酯、活性碳酸酯、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、硫醇、羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺和环氧化物。

在以下情况下，即所采用的方法使用聚合物胺POLY-L_0.1-NH₂作为原料或中间体时，所述胺可以通过例如使用马来酸酐而被转变为马来酰亚胺。优选在转变为马来酰亚胺基团之前，通过例如色谱或其它适宜的方法对该聚合物胺进行纯化，以提高最终的马来酰亚胺产品的纯度。一种具体的方法是首先使聚合物胺与马来酸酐反应形成开环的酰胺羧酸中间体，然后在第二步中通过在乙酸酐和乙酸盐(例如，乙酸钠或乙酸钾)的存在下加热该中间体而使其闭环。优选在约50℃-约140℃的温度下对该中间体加热约0.2-约5小时。

另外，可以通过与诸如N-甲氧羰基马来酰亚胺或外-7-氧杂[2.2.1]二环庚烷-2，3-二羧酸酐的试剂进行反应而将POLY-L_0.1-NH₂上的氨基转变为马来酰亚胺。

代表性聚合物马来酰胺酸和聚合物琥珀酰胺酸轭合物(在以下部分中提供)的相应结构可以被扩展到上述的相应原料和中间体。

与活性剂的轭合

使用本领域已知的适宜反应条件将聚合物马来酰亚胺偶联到生物活性分子或活性剂上。当然，精确的条件将取决于具体的活性剂、拟向马来酰亚胺基团上进行Michael加成的明确的亲核试剂、聚合物试剂本身等。

适宜的连接条件是足以使聚合物马来酰亚胺和活性剂进行连接的时间、温度、pH值、试剂浓度、溶剂等条件。具体的条件尤其取决于活性剂、所希望的连接类型、反应混合物质中存在的其它物质等。在任何具体条件下实施连接所采用的的充足条件是本领域普通技术人员可以通过阅读本发明的公开内容、参考相关文献和/或通过常规实验进行确定的。

典型的连接条件包括在pH值为约6-10，例如在pH值约为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10的条件下实施连接反应。更优选聚合物马来酰亚胺通常在pH约为6-9.5的条件下与含巯基的活性剂进行连接，更优选在pH为约7-9的条件下进行连接，更优选在pH约为7-8的条件下进行连接。最优选的是在pH约为7的情况下进行硫羟基选择性连接。

反应温度高度取决于生物分子的活性且通常为0℃-75℃，优选为10℃-45℃，更优选为18℃-28℃。更高的温度可能会使更敏感的生物分子失活，但对于转化更稳定的生物分子来说可能是必需的。

连接反应可以在诸如磷酸盐或醋酸盐缓冲剂或类似体系的缓冲剂中实施。

通常，使用摩尔数轻微过量的聚合物马来酰亚胺，例如1.5-15倍的摩尔数过量，优选为2倍-10倍的摩尔数过量。前体聚合物与生物活性分子的摩尔比率可以为1.0-50，优选为1.0-8.0，更优选为1.04-1.5。聚合物试剂与活性剂的典型比率包括约1∶1(聚合物试剂∶活性剂)、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、8∶1或10∶1的摩尔比。连接反应被容许进行到实质上不再有连接反应发生，这通常可以通过监测反应随时间的进程来确定。可以通过在各个时间点从反应混合物中提取等分试样并使用SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱或任何其它适宜的分析方法分析反应混合物，来监测反应进程。一旦所形成的轭合物量或剩余的未连接聚合物量达到稳定状态，反应就被认为已经完成。

还有，反应时间是具体活性剂的反应性的函数且在活性剂反应慢及对温度敏感时会变得更长。在这种情况下，可能需要伴随适中反应温度的更长的反应时间。反应时间通常为5分钟到10天，优选为30分钟到48小时，更优选为2-17小时，这也取决于各组分的活性，且通常是通过小规模的试反应来确定的。可任选地使用搅动(例如，搅拌、振荡等)来促进偶联反应。对于位阻巯基，所需反应时间可能明显更长。

与氨基的反应在更高的pH下进行，但和与巯基反应相比反应较慢。

具体的反应条件和方法应使得活性分子至少部分地保持活性。

然后，可以采用诸如MALDI、毛细管电泳、凝胶电泳和/或色谱的分析方法对如此制成的轭合物进行进一步的表征。通过活性剂向聚合物马来酰亚胺的Michael加成而形成的聚合物轭合物在本发明中被称为聚合物琥珀酰亚胺轭合物或轭合的聚合物琥珀酰亚胺(例如，参见结构III)。

马来酰亚胺环的水解

在已经拥有聚合物马来酰亚胺或轭合的聚合物琥珀酰亚胺(分别对应于结构I和III)的情况下，再将这些聚合物品种水解成其开环形式。当以聚合物马来酰亚胺开始时，相应的开环形式在本发明中被称为聚合物马来酰胺酸，对应于结构II。当来源是轭合的聚合物琥珀酰亚胺(III)时，相应的开环形式在本发明中被称为轭合的聚合物琥珀酰胺酸，对应于结构IV或结构V。结构IV和V是结构异构体，差别仅在于活性剂亲核基团的连接点。通过向马来酰亚胺进行Michael加成而引入的亲核基团可以加成在C2位置上或C3位置上，所述位置相对于被指定为C1的开环形式的最末羧基碳而言。

通常，轭合的琥珀酰胺酸是通过使聚合物马来酰亚胺在可有效地水解聚合物的马来酰亚胺基并达到可测量程度的条件下与碱的水溶液接触而制备的，所述聚合物马来酰亚胺优选是与活性剂轭合的。优选该水解反应是通过调节反应条件(水量、温度、反应物的相对摩尔比等)来实施的，并从而获得预期的水解或开环度。通常，水解反应的实施要形成至少约15％或更多的聚合物开环形式，或者是轭合的或者是非轭合的，相对于其对应的闭环聚合物而言。现在集中到聚合物琥珀酰胺酸轭合物上，本发明特别优选的组合物含有至少约35％，优选40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、或基本上100％的轭合的聚合物琥珀酰胺酸，相对于其对应的未水解聚合物。例如，包含60％聚合物琥珀酰胺酸轭合物的水解聚合物组合物将因而含有40％的轭合的聚合物琥珀酰亚胺(其对应的闭环聚合物)。

最优选的是，进行水解直到完全，也就是说，直到在轭合物上基本上所有的聚合物马来酰亚胺或琥珀酰亚胺基都转变成了其开环形式，并且所形成的组合物基本上不含有任何可检测量的闭环形式。完全开环的聚合物轭合物是最优选的，因为它们进行逆反应即脱水反应的倾向在上述开环反应中所采用的水解条件下是最小的。相对于上述的部分开环的的组合物而言，全部开环的组合物对于诸如脱聚乙二醇或水解的另外的化学转变是最稳定的。

特别优选的组合物是那些含有少于约50％重量的闭环形式，或少于约40％的闭环形式的组合物。更优选的组合物是那些含有少于约30％重量的闭环形式，或更优选少于约15％的闭环形式的组合物。再进一步优选的是那些含有少于约10％重量，或少于约5％，甚至是含有约2％或更少的闭环形式的组合物。

现在转向进行水解时所采用的条件，水解通常是在碱性条件下实施的。通过将反应混合物或溶液的pH提高到中性pH以上，可以强制使开环反应基本反应完全。为了获得最有效的(即，最短的)反应时间，希望是在可能的最高pH值下实施水解反应，例如高达约12的pH值下进行水解以开环，同时又不对活性剂的活性或完整性产生不利影响。

可以使用碱性溶液或结合在固体载体材料上的碱即离子交换剂来进行碱促开环。优选的碱是那些能为相当快的开环提供适宜的pH值、同时不会引起不希望有的副反应的碱。碱的例子包括诸如钠或钾的碱金属；诸如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等的碱金属氢氧化物，和诸如氢氧化四铵、氢氧化四丁基铵、氢氧化苄基三甲基铵的季铵碱。

水解通常在约6-约12的pH范围内实施。也就是说，水解在大约以下的pH值下实施：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、或甚至是12.0。优选的pH为约7.5-11。

水解反应可任选地包括缓冲剂。缓冲剂的例子包括有机缓冲剂，例如HEPES，即，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；以及诸如以下物质的缓冲剂：阴离子的钠、钾、铵盐，例如柠檬酸盐、烷基磺酸盐、氢氧化物、醋酸盐、碳酸盐、四硼酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐和磷酸氢盐。理想的做法是应在大规模操作前，采用具体的马来酰亚胺或马来酰亚胺轭合物在小规模上对具体的碱和任选缓冲剂系统进行评估，以确保转化速率是可接受的且无任何不希望有的副反应。

实施水解的适宜温度为约4℃-约75℃，优选为约0℃-约60℃，更优选为约15℃-约45℃，进一步优选为约18℃-约30℃。如上所述，反应时间取决于pH值。反应时间通常为约5分钟至数天，例如96小时或更长，如果没有任何明显的副反应。但是，优选的时间为约30分钟至约24小时，更优选为约2小时至约17小时。任选使用搅拌来促进反应。

在某些情况下，例如，在某种浓度的一些缓冲剂及聚合物马来酰亚胺的存在下，开环反应可能随时间而变慢。为了获得稳定的反应速率，可能会希望采用一种在所使用的水解条件下可在整个时间上提供稳定pH值的缓冲系统，或，必要时对pH值进行监测并定期加入碱来保持恒定的pH值范围。但是，应该强调的是稳定的pH值对获得完全开环并不是必要的。

理想的方法是在足够的温度和足够的时间下使聚合物琥珀酰亚胺轭合物与碱接触，使得开环达到预期的程度。由于开环反应可以在某个pH值范围内发生，优选尝试例如在更高的pH下平衡地获得短反应时间及促成更高的水解程度，例如形成完全水解的组合物，此时基本上所有的琥珀酰亚胺环都已水解，同时防止了可能导致不希望的产品混合物或失活的活性剂的竞争性副反应的发生可能性。因而，应该通过小规模的试反应，选择能够最小化这些不希望有的副反应的理想pH值。例如，在pH值为5.0-6.5时，副反应最小，但聚合物马来酰亚胺或其轭合物的开环都非常慢，往往达到了禁止性的程度。

例如，mPEG2-MAL-40K，结构VII，

可以由Nektar(Huntsville，AL)获得，其在某种条件下经历了程度非常有限的马来酰亚胺环水解，形成了相应的马来酰胺酸。实施例2中提供了对应开环反应的动力学数据。

还有，应该理解的是，如果要将聚合物衍生物轭合到生物活性分子上，水解反应条件和方法应该使得生物活性分子保持至少部分的活性。

水解后，含有聚合物琥珀酰胺酸轭合物的反应混合物的pH值通常被调节到约为5.5-8。任选然后对组合物进行脱盐和干燥，例如进行冻干。若需要，然后对获得的组合物作进一步的纯化，例如通过沉淀或色谱。可以采用的不同色谱分离方法包括SDS PAGE、凝胶渗透色谱和离子交换色谱。特别优选的方法是离子交换色谱，其对于使含有羧酸官能团的聚合物琥珀酰胺酸轭合物与相应的闭环轭合聚合物琥珀酰亚胺分离是有利的。降低pH值和对组合物进行干燥例如进行冻干，对于未进行完全开环的即水解未进行完全的组合物是特别有利的，因为更低的pH值和无水不利于进一步的水解。在这种方法中，反应混合物的组合物在某种不平衡量的开环形式下基本上是“冻结的”，即化学稳定的。

另外，本发明所述的含有聚合物琥珀酰胺酸轭合物的组合物还可以进行进一步的纯化以获得/分离不同PEG化的琥珀酰胺酸品种。另外，对于更低分子量的PEG，例如分子量小于约20千道尔顿、优选小于或等于约10千道尔顿的PEG，更优选的是，可以对产品混合物进行纯化以获得在某个PEG数附近每个蛋白质分子的分布，此时可进行实用。例如，可对产品混合物进行纯化以获得约1-5个PEG每蛋白质分子的平均数，通常平均数为约3个PEG每蛋白质分子。用来纯化最终的轭合反应混合物的策略取决于许多因素：所使用的聚合物的分子量、具体的蛋白质、预期的剂量服法和残留活性及单独轭合物品种的体内特性。该方法更常用于通过PEG马来酰亚胺与蛋白质氨基进行反应制备的轭合物，给定蛋白质中的所述氨基通常比巯基更为丰富。

如果需要，可以使用凝胶过滤色谱分离具有不同分子量的PEG轭合物。尽管该方法可被用来分离具有不同分子量的PEG轭合物，但其对于分离在蛋白质中具有不同聚乙二醇化(pegylation)位点的位置异构体通常是无效的。例如，可以使用凝胶过滤色谱使混合物中的含1个PEG的轭合物、含2个PEG的轭合物、含3个PEG的轭合物等相互分离，但每种被回收的PEG轭合物组合物可能含有连接在蛋白质的不同反应性氨基(例如，赖氨酸残基)上的PEG。

适合于进行这种分离的凝胶过滤柱包括可从AmershamBiosciences获得的Superdex^TM和Sephadex^TM柱。具体柱的选择取决于预期的分级范围。通常采用非氨类的缓冲剂，例如磷酸盐、醋酸盐等进行洗提。所收集的级份可以用许多不同的方法分析，例如，(i)用280nm的OD测定蛋白质含量，(ii)BSA蛋白质分析，(iii)用于测定PEG含量的碘测试(Sims G.E.C.，等，Anal.Biochem，107，60-63，1980)，或(iv)运行SDS PAGE凝胶色谱，然后用碘化钡染色。

位置异构体的分离可以通过以下方法实施：使用例如RP-HPLC C18柱(Amersham Biosciences或Vydac)的反相色谱，或使用离子交换柱，例如可从Amersham Biosciences获得的Sepharose^TM离子交换柱的离子交换色谱。可以用任何一种方法分离具有相同分子量的PEG-生物分子异构体(位置异构体)。

取决于形成的PEG-轭合物的拟定用途，在连接和任选的另外的分离步骤以后，该轭合物混合物可以进行浓缩、无菌过滤和在约-20℃至约-80℃的低温下进行贮存。另外，可以将该轭合物进行冻干，可以含有或不含有残余缓冲剂并作为冻干粉末进行贮存。在某些情况下，优选将连接时使用的缓冲剂例如醋酸钠改为在冻干过程中易于除去的挥发性缓冲剂例如碳酸铵或醋酸铵，使得冻干的蛋白质轭合物粉末成分中不含残留的缓冲剂。另外，所采用的改换缓冲剂步骤可以是使用配方缓冲剂，使得冻干轭合物的形态适宜于重新形成配方缓冲剂并最终适合于对哺乳动物给药。

前体马来酰亚胺聚合物衍生物和聚合物琥珀酰胺酸轭合物

本发明中所使用的前体马来酰亚胺聚合物衍生物通常包含至少一个偶联到水溶性聚合物链段上的马来酰亚胺取代基。该马来酰亚胺取代基可以被直接共价键接在水溶性聚合物链段上，或通过连接键L被连接在聚合物链段上。下面的式I是一种概括性的结构，其中任选的连接键被命名为L，其中L₀是指没有连接键，L₁是指存在连接键。

相应的聚合物马来酰胺酸II和聚合物琥珀酰胺酸轭合物IV和V具有下面提供的结构。由于这些结构都是相关的，本发明提供的对于POLY和L的说明和实施方案同样适用于所有这些结构。

聚合物链段

如上述结构所示，本发明的聚合物试剂和轭合物包含水溶性聚合物链段。代表性的POLY包括聚烷撑二醇，如聚(乙二醇)、聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷酯)、多糖、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉和聚(N-丙烯酰基吗啉)。POLY可以是上述任何聚合物的均聚物、交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、交替三聚物、无规三聚物、或嵌段三聚物。水溶性聚合物链段优选而非必须地为聚乙二醇“PEG”或其衍生物。

聚合物链段可以具有多种不同的几何形状中的任何一种，例如POLY可以是线性、支化或叉状的。最常见的情况是POLY为线性或支化的，例如具有两个聚合物臂。尽管本发明的很多讨论是集中在PEG上以作为对POLY的解释，但可以容易地将本发明的讨论和结构扩展到包括上述的任何水溶性聚合物链段。

任何具有至少一个反应性马来酰亚胺端基的水溶性聚合物都可以被用于制备本发明的聚合物马来酰胺酸轭合物，就此而言，本发明是不受限制的。尽管可以使用仅具有一个反应性马来酰亚胺的水溶性聚合物，但还可以使用本发明所述的具有两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或更多个适宜于转变成其开环形式的反应性马来酰亚胺的聚合物。与水溶性聚合物链段相关的马来酰亚胺或氨基前体部分的个数的上限值的非限定性的例子包括约1-约500、1-约100、1-约80、1-约40、1-约20和约1-约10。

现在再转向优选的POLY，PEG包括任何的线性、支化或多臂形式的聚乙二醇，包括封端PEG、叉状PEG、支化PEG、悬垂的PEG，不太优选的是，PEG含有一个或多个将单体的次级单元分开的可降解键，以下将作更详细的描述。

PEG聚合物链段包含-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-，其中(n)通常为约3-约4,000，或约3-约3,000、或更优选为约20-约1,000。

POLY可以是封端的，例如用惰性封端基团对PEG进行末端封闭的封端PEG。优选的封端PEG是那些具有以下封端成分的PEG：例如烷氧基、取代烷氧基、链烯氧基、取代链烯氧基、炔氧基、取代炔氧基、芳氧基、取代芳氧基。优选的封端基团是甲氧基、乙氧基和苄氧基。封端基团还可以有利地包含磷脂。磷脂的例子包括卵磷脂胆碱，如二月桂酰卵磷脂胆碱、二油酰卵磷脂胆碱、二棕榈酰卵磷脂胆碱、二硬脂酰卵磷脂胆碱、山萮酰卵磷脂胆碱、花生四烯酰卵磷脂胆碱和卵磷脂。但是，在一个实施方案中，本发明的聚合物基本上不含脂肪酸基或其它亲油部分。

现在讨论含有聚合物链段POLY的任何结构，POLY可相当于或包含以下结构：

“Z-(CH₂CH₂O)_n-”或“Z-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-”，

其中n为约3-约4,000，或约10-约4,000，Z是或包括官能团，该官能团可以是反应性基团或封端基团。Z的例子包括羟基、氨基、酯、碳酸酯、醛、缩醛、水合醛、酮、缩酮、水合酮、链烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、砜、硫羟基、羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰肼、脲、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、烷氧基、苄氧基、硅烷、类脂物、磷脂、生物素、和荧光素，包括其活化的和被保护的可应用形式。优选的官能团是，例如N-羟基琥珀酰亚胺基酯、苯并三唑基碳酸酯、氨、乙烯基砜、马来酰亚胺、N-琥珀酰亚胺基碳酸酯、酰肼、琥珀酰亚胺基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、琥珀酰亚胺基酯、缩水甘油醚、氧羰基咪唑、对硝基苯基碳酸酯、醛、邻吡啶基二硫醚和丙烯酰基。

这些以及其它的官能团Z描述于以下的参考文献中，本发明将其全部引入作为参考：N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(参见，例如美国专利No.5,281,698、No.5,468,478)、氨(参见，例如Buckmann等人Makromol.Chem.182：1379(1981)，Zalipsky等人Eur.Polym.J.19：1177(1983))、酰肼(参见，例如Andresz等人Makromol.Chem.179：301(1978))、琥珀酰亚胺基丙酸酯和琥珀酰亚胺基丁酸酯(参见，例如Olson等人在Poly(ethylene glycol)Chemistry & Biological Applications，pp170-181，Harris & Zalipsky编，ACS，华盛顿，DC，1997；还参见美国专利No.5,672,662)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(参见，例如Abuchowski等人Cancer Biochem.Biophys.7：175(1984)以及Joppich等人，Makromol.Chem.180：1381(1979))、琥珀酰亚胺基酯(参见，例如美国专利No.4,670,417)、苯并三唑基碳酸酯(参见，例如美国专利No.5,650,234)、缩水甘油醚(参见，例如Pitha等人Eur.J.Biochem.94：11(1979)、Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13：354(1991))、氧羰基咪唑(参见，例如Beauchamp，等人，Anal.Biochem.131：25(1983)、Tondelli等人J.ControlledRelease1：251(1985))、对硝基苯基碳酸酯(参见，例如Veronese，等人，Appl.Biochem.Biotech.，11：141(1985)；和Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.，27：45(1991))、醛(参见，例如Harris等人J.Polym.Sci.Chem.Ed.22：341(1984)、美国专利No.5,824,784、美国专利No.5,252,714)、马来酰亚胺(参见，例如Goodson等人Bio/Technology 8：343(1990)、Romani等人在Chemistry of Peptides and Proteins 2：29(1984)和Kogan，SyntheticComm.22：2417(1992))、邻吡啶基二硫醚(参见，例如Woghiren，等人Bioconj.Chem.4：314(1993))、丙烯酰基(参见，例如Sawhney等人，Macromolecules，26：581(1993))、乙烯基砜(参见，例如美国专利No.5,900,461)。

另外，上述刚刚所示的POLY结构可以表示线性聚合物链段，或可以形成支化或叉状聚合物链段的一部分。在聚合物链段为支化结构的情况下，上述刚刚提到的POLY结构可以相当于例如形成整体POLY结构一部分的聚合物臂。另外，当POLY具有叉状结构时，上述的POLY结构可以相当于例如支化点之前的聚合物链段的线性部分。

POLY也可以相当于具有两个臂、三个臂、四个臂、五个臂、六个臂、七个臂、八个臂或更多个臂的支化PEG分子。用来制备本发明的聚合物马来酰亚胺的支化聚合物可以具有大约2-300个活性末端。优选的是具有2或3个聚合物臂的支化聚合物链段。如美国专利No.5,932,462所述，一种解释性的支化POLY对应于以下的结构：

在该表达式中，R”为非反应性部分，例如H、甲基或PEG，P和Q为非反应性连接键。在优选的实施方案中，支化的PEG聚合物链段是甲氧基聚(乙二醇)二取代的赖氨酸，且相当于：

在上述的具体支化构造中，支化聚合物链段具有延伸自“C”支化点的单一反应性位点，该反应性位点用于通过本发明所述的连接键定位反应性马来酰亚胺基团。用于本发明的诸如此类的支化PEG通常具有少于4个的PEG臂，更优选具有2或3个PEG臂。该支化PEG提供了以下优点：与对应的线性PEG相比，具有与更大的、更密的聚合物云进行偶联的单一反应性位点。

一种具体类型的支化PEG马来酰亚胺符合以下结构：(MeO-PEG-)_iG-L_0.1MAL，其中MAL表示马来酰亚胺，i等于2或3，G为赖氨酸或其它适宜的氨基酸残基。

本发明的一种解释性支化聚合物马来酰亚胺具有以下所示的结构，其中L是本发明中所述的任何一种连接键。

具有上述通式所示支化结构的一种解释性PEG马来酰亚胺符合结构VII。

用于制备本发明的聚合物马来酰亚胺的支化PEG另外还包括那些更概括性地用式R(PEG)_n表示的支化PEG，其中R为中心或核心分子，其上延伸出2或更多个PEG臂。变量n表示PEG臂的数量，其中每个聚合物臂可以被独立地封端，或在末端具有反应性的官能团，例如马来酰亚胺或其它的反应性官能团。在本发明的这些多臂方案中，每个PEG臂通常在末端具有马来酰亚胺基团。支化PEG、例如通常用式R(PEG)_d概括性表示的支化PEG具有两个到约300个聚合物臂(即，n为2-约300)。诸如此类的支化PEG优选具有2-约25个聚合物臂，更优选2-约20个聚合物臂，更优选2-约15个聚合物臂或更少。最优选的是具有3、4、5、6、7或8个臂的多臂聚合物。

上述支化PEG的核心分子优选是多元醇。该多元醇包括具有1-10个碳原子和1-10个羟基的脂肪族多元醇，其包括乙二醇、链烷二醇、烷基二醇、次烷基烷基二醇、烷基环烷二醇、1，5-萘烷二醇、4，8-双(羟甲基)三环癸烷、环次烷基二醇、二羟基链烷、三羟基链烷等。还可以使用脂环族多元醇，其包括直链或闭环的糖和糖醇，例如甘露醇、山梨糖醇、纤维醇、木糖醇、白雀木醇、苏糖醇，阿拉伯糖醇，赤藻糖醇、福寿糖醇、  己六醇、facose，核糖、树胶醛糖、木糖、来苏糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、甘露糖、吡喃糖、阿卓糖、塔罗糖、tagitose、吡喃糖苷、蔗糖、乳糖、麦芽糖等。其它的脂肪族多元醇包括甘油醛、葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖和有关立体异构体的衍生物。可以使用的其它核心多元醇包括冠醚、环糊精、糊精及其它碳水化合物，例如淀粉和直链淀粉。优选的多元醇包括甘油、季戊四醇、山梨糖醇和三羟甲基丙烷。

上述类型的多臂聚合物结构的代表是：

其中d是3-约100的整数，R是具有3个或更多个羟基、氨基或它们的组合的中心分子的残基。

用于制备本发明的聚合物马来酰亚胺的多臂PEG包括可由Nektar，Huntsville，Alabama获得的多臂PEG。在优选的实施方案中，本发明的多臂聚合物马来酰亚胺相当于下式，其中分子上所联接的马来酰亚胺部分的细节存在于本发明中的其它地方。

其中，PEG是-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-

M是：

m选自3、4、5、6、7和8。

另外，聚合物马来酰亚胺可能具有整体上为叉状的结构。叉状PEG的例子对应于以下结构：

其中PEG是本发明所述的任何形式的PEG，A是连接键，优选为水解稳定的连接键，例如氧、硫或-C(O)-NH-，F和F’是任选存在的水解稳定的隔离基，其它的变量L和马来酰亚胺(MAL)与上述定义相同。对应于A、F和F’的连接键和隔离基团的例子描述于国际申请PCT/US99/05333中，可用于形成本发明中使用的这种类型的聚合物链段。F和F’是相同或不同的隔离基。在上述的一个具体实施方案中，PEG是mPEG，A相当于-C(O)-NH-，F和F’均为亚甲基或-CH₂-。该类聚合物链段可用来与两种活性剂反应，其中的两种活性剂被定位成按精确的或预定的距离分开，这取决于对F和F’的选择。

一种解释性的支化、叉状PEG具有以下所示的结构，其中的支化部位在左边，分叉部位具有两个从此向右延伸的马来酰亚胺基团。

另外，用于制备本发明的聚合物马来酰亚胺的PEG聚合物链段可以沿PEG链的长度方向而不是在末端具有反应性侧基，从而形成稳定化的聚合物马来酰亚胺，其具有一个或多个通过连接键L连接在PEG链上的马来酰亚胺侧基。

此外，在不太优选的实施方案中，聚合物链段本身可以具有一个或多个可发生水解的弱连接键或可降解连接键。可能存在于聚合物链段中的解释性可降解连接键包括但不限于碳酸酯、亚胺、磷酸酯和腙。

通常，水溶性聚合物链段POLY的标称平均分子量会有所变化。POLY的标称平均分子量通常处于下述一个或多个范围内：约100道尔顿-约100,000道尔顿；约500道尔顿-约80,000道尔顿；约1,000道尔顿-约50,000道尔顿；约2,000道尔顿-约25,000道尔顿；约5,000道尔顿-约20,000道尔顿。水溶性聚合物链段POLY的标称平均分子量的例子包括约1,000道尔顿、约5,000道尔顿、约10,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约40,000道尔顿。低分子量POLY具有约为250、500、750、1000、2000或5000道尔顿的分子量。

对应于聚合物马来酰亚胺的任何上述结构还应包括与其对应的聚合物琥珀酰胺酸，即使没有明确显示。因而，本发明中所有的聚合物马来酰亚胺结构应扩展到这种同样的结构，以下的情况除外：马来酰亚胺环为开环形式，且可进行去轭合(马来酰胺酸)或进行轭合(琥珀酰胺酸轭合物)。

连接键

现在转向连接键部分，本发明的连接键部分或简称“连接键”通常用变量L表示。如果存在的话，本发明的连接键L通常含有约1-约40个原子。连接键是整个聚合物上将聚合物的马来酰亚胺或马来酰胺酸或琥珀酰胺酸部分与聚合物链段进行连接的部分。本发明的连接键可以是单原子，例如氧或硫、两原子或多个原子。连接键本质上通常但不必须是线性的。连接键的总长度通常为1-约40个原子，其中的按长度计是指单链上的原子数，不计取代基。例如，-CH₂-就整个联接长度而言计为一个原子，-CH₂CH₂O-长度计为3个原子。优选连接键具有下述长度且为水解稳定的：约1-约20个原子、或约2-约15个原子、或约1-约6个原子。

本发明的连接键可以是单一官能团，例如酰胺、酯、尿烷、或脲、或可以含有位于单一官能基团任一侧的亚甲基或其它的烷撑基团。另外，连接键可以含有相同的或不同的官能团的组合。另外，本发明的连接键可以是烷撑链，任选地含有一个或多个氧或硫原子(即，醚或硫醚)。优选的连接键是那些水解稳定的连接键。当在本发明的结构范围内进行观察时，连接键是这样一种结构，即当被认为是整个聚合物的一部分时，并不导致整体结构含有过氧键(-O-O-)或-N-O-或-O-N-键。

在结构I、II的范围内，本发明的连接键可以是下述结构中的任一种：-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、C(O)-NH、NH-C(O)-NH、O-C(O)-NH、-C(S)-、-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-O-CH₂-、-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-O-、-O-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-O-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-、-C(O)-NH-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH₂-、-CH₂-C(O)-O-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-O-CH₂-、-C(O)-O-CH₂-CH₂-、-NH-C(O)-CH₂-、-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-、-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-O-C(O)-NH-CH₂-、-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-、-NH-CH₂-、-NH-CH₂-CH₂-、-CH₂-NH-CH₂-、-CH₂-CH₂-NH-CH₂-、-C(O)-CH₂-、-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-C(O)-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-、二价环亚烷基、-N(R⁶)-、-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-、-O-C(O)-NH-[CH₂]_h-(OCH₂-CH₂)_j-和上述任意两个或更多个的组合，其中h为0-6，(j)为0-20，R⁶为H或选自烷基、取代烷基、链烯基、取代链烯基、炔基、取代炔基、芳基和取代芳基的有机基团。

但是，对于本发明目的来说，许多原子在以下情况下不被认为是连接键部分，即当这些原子紧邻聚合物链段POLY且仅仅是使所述连接键部分只代表聚合物链的延伸部分的另一种单体时。例如，假设部分结构为“POLY-L-”，在这种情况下其中的POLY被定义为“CH₃O(CH₂CH₂O)_n-，则连接键部分不是“-CH₂CH₂O-”，因为该定义仅表示聚合物的延伸。也就是说，本发明的连接键并不具有一个或多个邻接的-CH₂CH₂O-部分。例如，连接键可以含有一个或多个通过一个或多个组合的上述解释性连接键而位于一侧或两侧的(CH₂CH₂O)子单元。

在本发明的一个实施方案中，连接键具有以下结构：

在以上连接键中，每种情况下的R¹和R²都各自独立地为H或选自烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、亚烷基环烷基和取代亚烷基环烷基的有机基团。在以上结构中，下标0表示不存在该特定的原子或官能团。

使用单一的马来酰亚胺端基和甲氧基封端物作为代表，以下的结构1-4图解了某种代表性的PEG马来酰亚胺结构。表1中所示的结构L可以被用来形成本发明的马来酰胺酸聚合物和轭合物。结构3-ET所表示的PEG马来酰亚胺被称为“无连接键”，因为马来酰亚胺环仅仅代替了PEG中的端羟基。以下所示的代表性连接键可被用来与上述的任何聚合物链段进行组合；以下有关mPEG的实施方案仅用来进行解释。

表1

连接键缩写    X

AMET          -(CH₂)₂-

AMTR          -(CH₂)₃-

AMPE          -(CH₂)₅-

MCH

TEO

mPH

pPHAL

L2＝-NH-Y-

连接键缩写    Y

BU            -(CH₂)₄-

HE            -(CH₂)₆-

L3＝-O-Z-

连接键缩写    Z

ET            -(CH₂)₂-

PR            -(CH₂)₃-

PRAC          -C(O)-CH₂CH₂-

L4＝-CH2-Q-

连接键缩写    Q

PACA          -C(O)-

PAME          -C(O)-NH-CH₂-

PAET          -C(O)-NH-CH₂CH₂-

BAET          -(CH₂)-C(O)NH-CH₂CH₂-

PAHE          -C(O)-NH-(CH₂)₆-

BAET          -(CH₂)-C(O)NH-(CH₂)₆-

PAOX          -C(O)-NH-CH₂CH₂O-

通常，优选的是能有效地提供一定的未偶联聚合物马来酰亚胺开环水解速率的连接键，所述开环水解速率比不含连接键的同样水溶性聚合物马来酰亚胺有所提高。在优选的实施方案中，连接基团促进了开环，使得室温测定的马来酰亚胺在pH7.5时的开环水解速率的半衰期等于或小于约12小时。在更优选的实施方案中，连接基团促进了开环，使得室温测定的马来酰亚胺在pH9时的开环水解速率的半衰期等于或小于约12小时。可促进开环的优选连接基团包括无连接键的马来酰亚胺，即，那些带有短烷基连接键的基团，如，L₃-PR、那些带有连接在马来酰亚胺环氮原子上的亚乙基或芳基的基团，如，L₁-MCH和L₁-pPHAL、那些在马来酰亚胺氮原子及羰基之间带有短烷基连接键的基团，如，L₁-AMET和所列基团的各种改性物，所述改性物含有可增强从马来酰亚胺环氮吸电子的作用且不对水解形成明显位阻，即，没有对连接在环氮上的连接键原子进行支化取代。优选的连接键在马来酰亚胺的约6个原子上或马来酰亚胺衍生氮上具有吸电子基团，即，在马来酰亚胺的1、2、3、4、5或6个原子上或来酰亚胺衍生氮上，或甚至更优选地在约三个原子上具有吸电子基团。

本发明的聚合物和轭合物包括上述单官能、双官能和多官能的结构。

例如，本发明的聚合物或轭合物的聚合物马来酰亚胺前体可以概括性地用以下结构描述，其中的变量如本发明的其它部分所定义。

在以上的实施方案中，L可以是相同或不同的。在一个具体的实施方案中，聚合物试剂为同双官能性的，也就是说，两个L是相同的。

琥珀酰胺酸轭合物

本发明的轭合物的概括性特征已经在上文中进行了详细描述。共价连接于聚合物琥珀酰胺酸上的活性剂包括多种类型的分子、实体、表面等，以下内容将会使其更为清楚。

目标分子和表面

本发明的聚合物马来酰亚胺(开环和闭环的)可以共价地或非共价地连接在多种实体上，所述实体包括膜、化学隔离物及净化表面、固态载体、金属/金属氧化物表面，例如金、钛、钽、铌、铝、钢及它们的氧化物、氧化硅、大分子和小分子。另外，本发明的聚合物和方法还可以被用于生物传感器、生物电子开关和门电路。本发明的聚合物和方法还可以被用于制备合成肽的载体、制备聚合物涂覆表面和聚合物接枝、制备用于亲合分离的聚合物-配体轭合物、制备交联或非交联的水凝胶和制备用于生物反应器的聚合物-辅因子加合物。

用于提供本发明的轭合物的生物活性剂可以是以下物质中的任意一种或多种。适宜的活性剂可以选自，例如安眠药和镇静剂、心理兴奋剂、镇定剂、呼吸药物、抗惊厥药、肌肉弛缓药、抗帕金森病药剂(多巴胺拮抗物)，止痛剂、消炎药、  抗焦虑药、食欲抑制剂、抗偏头痛药剂、肌肉收缩剂、抗感染药(抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、疫苗)、治风湿药，抗疟药、止吐药、anepileptics、支气管扩张药、细胞因子、生长刺激素、抗癌药、抗血栓形成剂、抗高血压药、心血管药物、抗心律不齐药、抗氧化剂(antioxicants)、抗哮喘药、激素药剂，包括避孕药、类交感神经药剂、利尿剂、脂质调节剂、抗雄激素药剂、抗寄生物药剂、抗凝血剂、肿瘤药物、抗肿瘤药、低血糖药物、营养性药剂和添加剂、生长添加剂、抗肠炎药、疫苗、抗体、诊断剂和对比剂。

更具体来说，该活性剂可属于多种结构类别中的一种，所述结构类别包括但不限于小分子(优选不溶性小分子)、肽、多肽、蛋白质、抗体、多糖、类固醇、核苷、低聚核苷酸、多核苷酸、脂肪、电解质等。优选与聚合物马来酰亚胺偶联的活性剂本身具有天然的氨基或巯基(sulfydryl)，或作为替代方案，经改性而含有至少一个适宜于偶联到聚合物马来酰亚胺上的反应性氨基或巯基。

适宜于共价连接到本发明聚合物上的活性剂的具体例子包括但不限于天冬酰胺酶、β-D-2，6-二氨基嘌呤二氧戊环(DAPD)、安泰得、贝卡普明、降血钙素、蓝藻抗病毒蛋白、地尼白介素-毒素连接键、促红细胞生成素(EPO)、EPO激动剂(例如，由长度约为10-40个氨基酸构成且包含一种描述于WO96/40749中的特定核心序列的肽)、α链道酶、红血球生成刺激蛋白(NESP)、凝结因子，例如因子V、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XII、因子XIII、von Willebrand因子；伊米苷(ceredase)、伊米苷酶、α-葡糖苷酶、胶原质、环胞霉素、α防御素、β防御素、exedin-4、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、血栓生成素(TPO)、α-1蛋白酶抑制剂、elcatonin、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、纤维蛋白原、非格司亭、生长激素人生长激素(hGH)、生长激素释放激素(GHRH)、GRO-β、GRO-β抗体、骨成形素蛋白，例如骨成形素蛋白-2、骨成形素蛋白-6、OP-1；酸性纤维原细胞生长因子、碱性纤维原细胞生长因子、CD-40配体、肝磷脂、人血清白蛋白、低分子量肝磷脂(LMWH)、干扰素，例如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素ω、干扰素τ、交感干扰素；白细胞间介素和白细胞间介素受体，例如白细胞间介素-1受体、白细胞间介素-2、白细胞间介素-2融合蛋白、白细胞间介素-1受体拮抗剂、白细胞间介素-3、白细胞间介素-4、白细胞间介素-4受体、白细胞间介素-6、白细胞间介素-8、白细胞间介素-12、白细胞间介素-13受体、白细胞间介素-17受体；乳铁传递蛋白和乳铁传递蛋白链段、促黄体生成激素释放激素(LHRH)、胰岛素、胰岛素原、胰岛素类似物(例如，美国专利No.5、922、675中所述的单酰化胰岛素)、糊精、C-肽、生长激素抑制素、生长激素抑制素类似物，包括奥曲肽、抗利尿激素、促卵泡激素(FSH)、流行性感冒疫苗、类胰岛素生长因子(IGF)、促胰岛素激素、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、血纤维蛋白溶酶原活化因子，例如阿替普酶、尿激酶、瑞替普酶、链激酶、pamiteplase、兰替普酶和teneteplase；神经生长因子(NGF)、护骨素、血小板源生长因子、组织生长因子、转换生长因子-1、血管内皮生长因子、白血病抑制因子、角化细胞生长因子(KGF)、神经胶质生长因子(GGF)、T细胞受体、CD分子/抗原、肿瘤坏死因子(TNF)、单核细胞化学吸引蛋白质-1、内皮生长因子、甲状旁腺激素(PTH)、类胰高血糖素肽、生长激素、胸腺素α1、胸腺素α1IIb/IIIa抑制剂、胸腺素β10、胸腺素β9、胸腺素β4、α-1抗胰蛋白酶、磷酸二酯酶(PDE)化合物、VLA-4(新近的抗原-4)、VLA-4抑制剂、二膦酸盐、呼吸合胞体病毒抗体、囊肿性纤维化横跨膜调节剂(CFTR)基因、脱氧核糖核酸酶(Dnase)、杀菌性/渗透性增强蛋白质(BPI)、和抗CMV抗体。代表性的单克隆抗体包括依那西普(由连接在IgGl的Fc部分的人75kD TNF受体的细胞外配体-结合部分所构成的二聚融合蛋白质)、阿昔单抗(abciximab)、afeliomomab、巴利西单抗(basiliximab)、达利珠单抗(daclizumab)、英利昔单抗(infliximab)、替坦异贝莫单抗(ibritumomab tiuexetan)、tiuexetan、mitumomab、莫罗莫那(muromonab)-CD3、碘131tositumomab轭合物、olizumab、rituximab和曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀)。

适宜用于共价连接到聚合物的附加剂包括但不限于amifostine，amiodarone，氨基己酸，氨基马尿酸钠，氨基苯乙哌啶酮、氨基乙酰丙酸，氨基水杨酸，安吖啶，阿那格雷，阿那曲唑，天冬酰胺酶，蒽环类抗生素，视黄醛(bexarotene)，必卡他胺(bicalutamide)，博来霉素，乙基酰胺，白消安，卡麦角林，卡培他滨，卡铂，卡莫司汀，chlorambucin，西司他丁钠，顺铂、克拉利宾，氯屈膦酸盐，环磷酰胺，环丙孕酮，阿糖胞苷，喜树碱，13-顺视黄酸，全反视黄酸；达卡巴嗪，放线菌素D，红比霉素，去铁胺，氟美松，双氯芬酸，己烯雌酚、多烯紫杉醇，阿霉素，表柔比星，雌氮芥，足叶乙甙，依西美坦，弗克芬德，氟达拉滨氟氢可的松，氟尿嘧啶，氟甲睾酮，氟他米特、吉西他滨、肾上腺素、L-Dopa、羟基脲、黄胆素、异环磷酰胺、伊马替尼、药薯、伊曲康唑、戈舍瑞林、来曲唑、甲酰四氢叶酸、左咪唑、赖诺普利、lovothyroxine钠、环己亚硝脲、二氯甲基二乙胺、甲羟孕酮、甲地孕酮、苯丙氨酸氮芥、巯嘌呤、重酒石酸间羟胺、氨甲喋呤、灭吐灵、脉律定、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、纳络酮、烟碱、尼鲁米特、奥曲肽、奥克赛铂、帕米膦酸盐、戊糖苷、pilcamycin、卟吩姆、强的松、甲基苄肼、普鲁氯嗪、恩丹西酮、雷替曲塞、雷帕霉素、链脲霉素、他克莫司、三苯氧胺、替莫唑胺、替尼泊甙、睾丸激素、四氢大麻醇、反应停、硫鸟嘌呤、噻替派、拓扑替康、维甲酸、valrubicin、长春碱、长春新碱、去乙酰长春酰胺、长春瑞宾、多拉司琼、格拉司琼；营养药、氟替卡松、亮丙瑞林、咪达唑仑、阿普唑仑、两性霉素B、podophylotoxins、核苷抗病毒剂、芳酰基腙、腊粉；大环内酯，例如红霉素、竹桃霉素、醋竹桃霉素、罗红霉素、克拉霉素、环酯红霉素、阿奇霉素、氟红霉素、地红霉素、交沙霉素、螺旋霉素、麦迪霉素、白霉素、美欧卡霉素、罗他霉素、andazithromycin、swinolide A；氟喹诺酮，例如卷须霉素、氧氟沙星、左氧氟沙星、曲氟沙星、阿拉曲伐沙星、莫西沙星、氟哌酸、依诺沙星、格帕沙星、加替沙星、洛美沙星、司帕沙星、替马沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟罗沙星、托氟沙星、普利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙星和西他沙星；氨基糖苷，例如庆大霉素、奈替米星、草履虫素、托普照霉素、氨丁卡霉素、卡那霉素、新霉素、和链霉素、万古霉素、替考拉宁、rampolanin、麦地拉宁、粘菌素，达托霉素、短杆菌肽、甲磺酸粘菌素；多粘菌素。例如多粘菌素B、卷曲霉素、杆菌肽、青霉烯；青霉素，包括青霉素敏感剂，像青霉素G、青霉素V；抗青霉素酶剂，像二甲氧苯青霉素、苯恶洒唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟氯青霉素、乙氧萘；革兰氏阴性微生物活性剂，像氨比西林、阿摩西林、和海他西林、西林和galampicillin；抗假单胞菌青霉素，像羧苄青霉素、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、和哌拉西林；头孢菌素，像头孢泊肟、头孢丙烯、头孢丁烯、头孢唑肟、头孢三嗪、糊头孢菌素、头孢吡硫、头孢氨苄、cephradrine、头孢西丁、头孢羟唑、头孢唑林、头孢利定、氯氨苄青霉素、头孢羟氨苄头孢甘酸、头孢氨呋肟、头孢氨甲苯唑、头孢噻肟、头孢三嗪、氰甲头孢菌素、头孢吡肟、头孢克肟、头孢尼西、头孢哌酮、头孢替坦、头孢美唑、头孢噻甲羧肟、氯碳头孢、和羟羧氧酰胺菌素、单杆菌，像噻肟单酰胺菌素；和氨基甲酰，例如亚胺培南、美罗培南、戊烷脒羟乙基磺酸盐(isethiouate)、舒喘宁硫酸盐、利多卡因、二羟苯基异丙氨基乙醇硫酸盐、氯地米松二丙酸盐(diprepionate)、氟羟脱氢皮质甾醇乙酰胺、布地缩松丙酮化合物、氟替卡松、溴化药薯、氟尼缩松、色甘酸钠、和酒石酸麦角胺；紫杉烷类，例如紫杉醇；SN-38和tyrphostines。

用于偶联到本发明的聚合物马来酰亚胺的优选肽或蛋白质包括EPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、交感IFN、因子VII、因子VIII、因子IX、IL-2、Remicade(infliximab)、Rituxan(rituximab)、Enbrel(etanercept)、Synagis(palivizumab)、Reopro(abciximab)、赫赛汀(trastuzimab)、tPA、Cerizyme(imiglucerase)、B型肝炎疫苗、rDNAse、α-1蛋白酶抑制剂、GCSF、GMCSF、hGH、胰岛素、FSH和PTH。

以上的代表性生物活性剂应包括可应用的其类似物、激动剂、拮抗剂、抑制剂、异构体和制药上可接受的盐。至于肽和蛋白质，本发明意图包括合成的、重组的、原态的、糖基化的及非糖基化形式，以及其生物活性链段。上述的生物活性蛋白质另外还应包括一个或多个氨基酸被取代(例如，半胱氨酸)、被消除等之后的变体，只要所形成的变体蛋白质至少具有其母体(原态的)蛋白质的某种程度的活性。

本发明描述的轭合物和方法还可以被扩展到水凝胶配方。

药物组合物

本发明还包括含有本发明提供的、与药物赋形剂进行组合的轭合物的药物制剂。通常，轭合物本身呈固态(例如，沉淀物)或呈溶液状，可以与固态或液态的适宜药物赋形剂进行组合。

代表性的赋形剂包括但不限于以下物质：碳氢化合物、无机盐、杀菌剂、抗氧剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱及它们的组合。

碳水化合物，例如糖、诸如醛醇、糖醛酸的衍生糖、酯化糖和/或糖聚合物可以作为赋形剂。具体的碳水化合物赋形剂包括，例如单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如蜜三糖、松三糖、麦芽糊精、右旋糖苷、淀粉等；和醛醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)、吡喃山梨糖醇、肌醇等。

该赋形剂还可以包括无机盐或缓冲剂，例如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢钠和它们的组合。

制剂还可以包括用于防止或阻止微生物生长的杀菌剂。适宜于本发明的杀菌剂的非限定性例子包括杀藻胺、氯化苄乙氧铵、苄醇、氯化十六烷吡啶盐、氯代丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、乙基汞硫代水杨酸钠(thimersol)及它们的组合。

制剂中也可以存在有抗氧剂。抗氧剂被用来防止氧化，从而防止制剂中轭合物或其它成分变质。可用于本发明的适宜抗氧剂包括，例如抗坏血酸棕榈酸酯、叔丁对甲氧酚、二叔丁对甲酚、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸钠、偏亚硫酸氢钠及它们的组合。

表面活性剂可以作为赋形剂。代表性的表面活性剂包括：聚山梨醇酯，如″Tween 20″和″Tween 80″，和聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物，如F68和F88(两者均可从BASF，Mount Olive，New Jersey获得)；山梨聚糖酯；脂质，如磷脂。像蛋黄素和其它的卵磷酯、磷脂酰乙醇胺(尽管优选不呈脂质体形态)、脂肪酸和脂肪酸酯；类固醇，如胆固醇；和螯合剂，如EDTA、锌和其它的适宜阳离子。

酸或碱可以在制剂中作为赋形剂。可采用的酸的非限定性例子包括以下物质：氢氯酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、蚁酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸及它们的组合。适宜碱的例子包括但不限于以下物质：氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、蚁酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾及它们的组合。

药物制剂包括所有类型的配方，特别是那些适用于注射的配方，例如，可以重新形成悬浮液或溶液的粉末。在组合物中，轭合物(即，由上述活性剂和聚合物形成的轭合物)的量根据多种因素而变化，但在组合物贮存于单位剂量的容器(即，药水瓶)中时最好是治疗的有效剂量。另外，药物制剂也可以被收纳在注射器中。为了确定哪种用量能产生预期的临床效果，可以通过按递增的轭合物量反复进行给药来实验性地确定治疗有效剂量。

组合物中任何单独赋形剂的量将根据赋形剂的活性和对组合物的具体要求而变化，通常，任何单独赋形剂的最佳量是通过常规实验来确定的，即，通过以下方式来确定：制备含有各种量的赋形剂(从低到高)的组合物、检查稳定性及其它参数、然后确定可获得最佳性能且没有明显副作用的范围。

但是，通常赋形剂在组合物中的存在量为约1重量％-约99重量％，优选为约5重量％-98重量％，更优选为约15重量％-95重量％，最优选的是浓度小于30重量％。

上述的这些药物赋形剂及其它的赋形剂描述于下述文献中：″Remington：The Science & Practice of Pharmacy″，19th ed.，Williams & Williams，(1995)、″Physician′s Desk Reference″，52nded.，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)和Kibbe，A.H.，Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd Edition，AmericanPharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000。

本发明的药物制剂通常，但不是必须地通过注射给药，因此在即将给药之前通常是溶液或悬浮液。药物制剂可以采取其它的形式，如糖浆、膏状物、软膏、药片、粉末等。还可以包括其它的给药方式，例如肺部给药、直肠给药、透皮给药、经粘膜给药、口服、鞘内给药、皮下给药、动脉内给药等。

如上所述，可以通过静脉注射使轭合物进行肠道外给药，或更不优选地通过肌肉注射或皮下注射进行给药。用于肠胃外给药的适宜配方类型包括即用型注射液、用来在使用前与溶剂进行组合的干粉、准备用于注射的悬浮液、用来在使用前与赋形剂进行组合的干性不溶组合物和用来在给药前进行稀释的乳液或液体浓缩物等。

给药方法

本发明还提供用本发明提供的轭合物向病人进行给药的方法，所述病人患有某种病症且对轭合物的治疗有所反应。该方法包括用治疗有效量的轭合物(优选其作为药物制剂的一部分)进行给药，通常是采用注射。该给药方法可以被用来治疗任何可通过该特定轭合物的给药而得到医治或预防的病症。本领域的普通技术人员了解哪些病症是特定的轭合物可以进行有效治疗的。进行给药的实际剂量将根据以下条件而改变：患者的年龄、重量及总体条件、以及所进行治疗的病症的严重性、卫生保健专业人员的判断和进行给药的轭合物。治疗有效剂量对于本领域技术人员来说是已知的和/或被描述于有关的参考正文及文献中。通常，治疗有效剂量为约0.001mg-100mg，优选的剂量为0.01mg/天-75mg/天，更优选的剂量为0.10mg/天-50mg/天。

任何给定轭合物(再次优选作为药物制剂的一部分)的单位剂量可按多种给药计划进行给药，这取决于临床医生的判断、病人的需要等。具体的给药计划是本领域的技术人员已知的或可以使用常规方法进行实验确定。代表性的给药计划包括但不限于每天给药五次、每天给药四次、每天给药三次、每天给药两次、每天给药一次、每周给药三次、每周给药两次、每周给药一次、每月给药两次、每月给药一次以及它们的任意组合。一旦达到了临床效果，就停止组合物的给药。

用本发明的轭合物进行给药的一个优点是各个的水溶性聚合物部分可以被分解掉。当由于聚合物的尺寸而使从体内清除成为潜在问题时，这种结果就是有利的。最佳的情况是每个水溶性聚合物部分的分解可以通过使用能够生理性分解和/或可酶促降解的连接键而得到促进，所述的连接键例如有尿烷、酰胺、碳酸酯或含酯的连接。从而，轭合物的清除(即各个水溶性聚合物部分的分解)可以通过选择聚合物分子尺寸以及将会提供预期清除性能的官能团的类型而得到调节。本领域的普通技术人员就可以确定聚合物的适当分子尺寸及可分解的官能团。例如，本领域中的一个普通技术人员采用常规实验、按下述方式可以确定适当分子尺寸及可分解的官能团：首先制备具有不同分子量和可分解官能团的各种聚合物衍生物，然后通过用这些聚合物衍生物向病人给药并获取定期性的血和/或尿的样品而得到清除曲线(例如，通过血或尿定期取样)。一旦获得了每种被测轭合物的一系列清除曲线，就可以识别出适宜的轭合物。

本发明中所涉及的所有文章、书籍、专利、专利出版物及其它出版物是通过整体引用而引入的。

                          实施例

应该理解的是，尽管已结合某些具体的优选实施方案对本发明进行了描述，以上的描述及下面的实施例是用来进行解释而不是限定本发明的范围。属于本发明范围内的其它方面、优点和改进对本发明所属领域的技术人员来说是显而易见的。

缩写

DCM：      二氯甲烷

NMR：      核磁共振

DI：       去离子的

r.t.       室温

anh.       无水的

Da         道尔顿

GPC        凝胶渗透色谱

材料和方法

除非另有说明，在所附实施例中提到的所有化学试剂都是可商购的。

在所附实施例中提到的所有PEG试剂可从Nektar，Huntsville，AL获得。所有的¹HNMR数据都是在Bruker制造的300或400MHz NMR光谱仪上产生的。

                        实施例1

            连接的PEG马来酰亚胺实例的水解速率

对平均分子量为5000道尔顿的一系列代表性的甲氧基-PEG马来酰亚胺进行合成和研究。通过测定每种溶于pH值约为7.5的50mM磷酸盐缓冲液中的浓度为5mg/mL的mPEG马来酰亚胺溶液在297nm处的紫外线吸收，确定以下每种结构的马来酰亚胺环的水解反应动力学。聚合物马来酰亚胺的通用结构示于下面。上述表1中提供了对应于每种连接键的确切结构(L₁、L₂和L₃)。

表2，通过在297nm处的紫外线吸收测定的溶于50mM磷酸盐缓冲液(pH～7.5)的mPEG(5k-Da)马来酰亚胺(5mg/mL)的水解速率

结构           半衰期        相对速率

               (小时)

L₁-AMTR        8.8           3.66

L₁-AMPE        19.4          1.66

L₁-MCH         16.3          1.98

L₂-BU          19.6          1.65

L₂-HE          32.3          1.00

L₃-ET          8.1           4.01

L₃-PR          11.5          2.82

如表2中所示数据，解释性聚合物马来酰亚胺的水解速率随结构而变化。在该组结构中，HE连接键是最耐水解的，而ET连接键显示出最快的水解速率，这说明了其马来酰亚胺环甚至在较温和pH值下也有水解倾向。

以上数据说明用于促进开环的优选连接基团包括那些在紧邻(最优选约3个原子以内)马来酰亚胺取代基，即紧邻马来酰亚胺环上的氮的位置具有强吸电子基团EWG的连接基团。L₃-ET连接键、-O-乙撑-在距马来酰亚胺氮约3个原子内具有吸电子原子氧，可看出其对获得更高的水解速率有所贡献。最优选的是最好在距马来酰亚胺氮1、2、3或4个原子内具有EWG的连接键。

                      实施例2

支化的连接的聚合物马来酰亚胺，mPEG2-MAL-40K的水解

发上绘制的聚合物马来酰亚胺，mPEG2-MAL-40K是由Nektar(Huntsville，AL)获得的。该聚合物衍生物的马来酰亚胺环在某种条件下经过了有限程度的水解，形成了下述的对应马来酰胺酸衍生物。

通过用HPLC观察母马来酰亚胺百分比随时间的降低，来分析监测水解反应。在以下条件下确定水解反应动力学：pH值约为5.5，采用约25℃的HEPES缓冲溶液。

通过绘制马来酰胺酸或马来酰亚胺浓度对数随时间变化的图线(后者示于图3)，可获得线性关系。

然后使用该数据确定水解反应的半衰期，计算后的测试条件下的半衰期约为34天。因而，在这些条件下，该具体的马来酰亚胺是耐开环的。但是，在非缓冲性的水中，仍然在25℃下和在更高的pH下用同样的方法进行测定时，mPEG2-MAL-40K的水解被确定为具有约2.1天的半衰期。

                          实施例3

           聚合物琥珀酰亚胺轭合物水解速率的研究

对代表性蛋白质和小分子模型轭合物的水解速率进行研究以检测聚合物封端的马来酰亚胺本身与其轭合物的开环趋势的关系。

由于诸如蛋白质的大型生物分子组分对连接分子在通常的液相色谱柱中的保留具有显著的影响，与聚合物本身相比，通常更难于测定马来酰亚胺轭合物的动力学。在这种分析中，马来酰胺酸的开环酸形式不能从未开环或闭环形式截然分离。但是，基于尺寸排除色谱(HPLC-SE)和蛋白质分析电泳(SDS-PAGE)的组合分析法已经被成功地用来评估聚合物马来酰亚胺蛋白质轭合物及用非蛋白质模型化合物制成的轭合物的开环特性。

在该研究中，对以下进行了概括性表示的两种PEG-球状蛋白轭合物进行研究，以检测其开环特性。

图中，“Glob Protein”表示球状蛋白。

最上方的结构是球状蛋白2的PEG-马来酰亚胺轭合物，其中的球状蛋白2是分子量约为48kDa的蛋白质。球状蛋白2被连接在PEG马来酰亚胺上，所述PEG马来酰亚胺衍生自MW为30kDa的PEG丙酸并进一步包括中等长度的连接键，其中的连接键被插入于聚合物的丙酸衍生部分和马来酰亚胺端基之间。最上方结构中的连接键是-C(O)-NH(CH₂)₂-NH-C(O)-CH₂CH₂-。

下方的结构是球状蛋白1的PEG-马来酰亚胺轭合物，其中的蛋白质具有约为11kDa的分子量。该轭合物是采用无连接键且分子量约为20kDa的马来酰亚胺(mPEG-MAL)而制备的。对应的PEG-马来酰亚胺结构为3-ET。

在pH8.5和室温条件下，下方的结构(球状蛋白2)在24小时后发生了完全开环，从而表明该种类型的马来酰亚胺基封端聚合物是不稳定的。因此，该聚合物轭合物对于促进开环反应并从而提供化学稳定组合物，即处于平衡的组合物来说是较好的选择，所述组合物包含聚合物琥珀酰胺酸轭合物。但是，相对于无连接键的形式来说，最上方结构(球状蛋白1)的连接键看起来妨碍了开环，因为最上方轭合物的环结构直到17小时后才完全开环，反应条件是在pH9下、升温到50℃，进行17小时。

                          实施例4

             模型PEG-琥珀酰亚胺轭合物的开环特性

测定某种连接到模型化合物2-巯基乙醇上的解释性聚合物马来酰亚胺的水解速率，以评价该轭合物的开环趋势并从而评价其用于本发明所提供的开环方法时的适用性。

与上述用于未连接的马来酰亚胺的方式相同，对具有以下所示结构的轭合物的水解速率进行研究，其中的连接键包括命名为TRI、PEN和MCH的部分。所示的半衰期是由在两个不同pH值下取得的数据计算出的。与未连接的马来酰亚胺类似，数据表明当pH值随开环的提高而下降时，反应速率下降。与进行研究的其它轭合物相比，与邻近琥珀酰亚胺环的最短烃链(即，TRI)相连的连接键是最快被打开的。

表3.mPEG(5k-Da)马来酰亚胺轭合物的水解半衰期

连接键，D                       实验确定的半衰期

                                pH9.06    pH8.11

TRI；三亚甲基                   31.4小时  17.6天

PEN；五亚甲基                   --        28.5天

MCH： 43.3小时      --

                        实施例5

     未含连接键的mPEG-马来酰亚胺在各种pH值下的水解

采用与上述相同的方法，对通过模型化合物、2-巯基乙醇与mPEG-5K-马来酰亚胺的反应所形成的轭合物进行水解研究。以下的表4中汇总了该轭合物在各种pH值下的水解反应动力学。

表4.M-PEG(5K)-MAL与2-巯基乙醇的加合物的水解研究

pH	半衰期，分钟
		12	＜5
11	＜15
		10	30
9	600

A、mPEG-5K-马来酰亚胺与2-巯基乙醇的加合物(mPEG-MAL-ME)的合成

向mPEG(5000Da)-马来酰亚胺(3.0g，0.0006摩尔，Nektar，Huntsville，Alabama)的乙腈(60ml)溶液中加入2-巯基乙醇(0.15g，0.0190摩尔)，并在氩气氛和室温下搅拌该混合物一整夜。然后减压蒸出溶剂。将残留物溶解在二氯甲烷(7.5ml)中并加入异丙醇。过滤出深沉产物并减压干燥。产率：2.80g。NMR(d6-DMSO)：2.78ppm(bm，-S-CH₂CH₂OH，2H)，3.24ppm(s，-OCH₃，3H)，3.51ppm(s，PEG链段)，4.03ppm(m，-CH-S-，1H)，4.85ppm(7，-OH，1H)。

B、在pH9下的水解

将mPEG-MAL-ME(0.2g)溶解在4ml蒸馏水中并将所形成的溶液加入到4ml 0.1M的磷酸盐缓冲液(pH＝9.3)。通过加入0.01M的NaOH立刻将pH值调节到9.0。按1小时的间隔提取0.25ml的溶液样品并用HPLC进行分析。测量中，通过定期地添加0.01M的NaOH使溶液的pH值保持在8.95-9.05的范围内。

C、琥珀酰胺酸的分离

按上述的方式进行水解反应，从pH9和pH12下进行的反应中分离产物。在每种情况下产物都是相同的。形成两种水解产物，即2位加合物和3位加合物。通过光谱模拟来确定产物的分配。NMR分析表明2位加合物和3位加合物的摩尔比为71∶29。

得益于上述说明书和附图的教导，本发明所属领域的技术人员可以想到本发明的许多改进和实施方案。因此，应该理解的是本发明并不局限于所公开的具体实施方案，并且这些改进及其它的实施方案都应包括在所附权利要求的范围内。尽管本发明中使用了具体的术语，但它们只是以类属和说明性的意义使用的而不是为了进行限定。

Claims (65)

1、一种用于制备聚合物轭合物的方法，所述方法包含：

(a)提供包含马来酰亚胺基团的水溶性聚合物，

(b)使所述聚合物在能有效地使含有亲核基团的活性剂和水溶性聚合物通过Michael加成反应进行偶联的条件下与所述活性剂进行反应，以形成聚合物-琥珀酰亚胺-连接的活性剂轭合物，和

(c)在能有效地强制打开所述琥珀酰亚胺环的条件下处理(b)中得到轭合物，从而形成包含聚合物-琥珀酰胺酸-轭合物的聚合物-轭合物组合物。

2、权利要求1的方法，其中所述的处理步骤包含水解。

3、权利要求2的方法，其中所述的处理是在水溶液中或有机溶剂中实施的。

4、权利要求1的方法，其中所述的处理步骤是在碱存在下实施的。

5、权利要求4的方法，其中所述的碱选自金属或非金属氢氧化物、季铵碱、钠(Na°)和钾(K°)。

6、权利要求4的方法，其中所述的碱存在于固态载体上或溶液中。

7、权利要求1的方法，其中所述的处理步骤是在pH为约6-12的条件下实施的。

8、权利要求7的方法，其中所述的处理步骤是在pH为约7.5-11的条件下实施的。

9、权利要求1的方法，其中所述的处理步骤是在缓冲剂中实施的。

10、权利要求1的方法，其中所述的处理是在能够有效地提供化学稳定组合物的条件下实施的。

11、权利要求1的方法，进一步包含确定所述组合物中的所述琥珀酰亚胺环开环程度的步骤。

12、权利要求11的方法，其中所述的处理进行到至少形成约15％的聚合物-琥珀酰胺酸-轭合物。

13、权利要求11的方法，其中所述的处理进行到至少形成约35％的所述聚合物-琥珀酰胺酸-轭合物。

14、权利要求11的方法，其中所述的处理进行到至少形成约80％的所述聚合物-琥珀酰胺酸-轭合物。

15、权利要求11的方法，其中所述的处理进行到至少形成约95％的所述聚合物-琥珀酰胺酸-轭合物。

16、权利要求11的方法，其中所述的处理进行到至少形成约98％的所述聚合物-琥珀酰胺酸-轭合物。

17、权利要求1的方法，其中所述的亲核基团是巯基(硫羟基)或氨基。

18、权利要求1的方法，其中所述的活性剂是蛋白质或肽。

19、权利要求1的方法，进一步包含从组合物中回收所述的聚合物琥珀酰胺酸轭合物。

20、权利要求19的方法，其中所述的回收步骤包含沉淀所述的聚合物琥珀酰胺酸轭合物。

21、权利要求19的方法，其中所述的回收步骤进一步包含纯化所述的聚合物琥珀酰胺酸轭合物。

22、权利要求21的方法，其中所述的纯化步骤包含通过色谱纯化所述的聚合物琥珀酰胺酸轭合物。

23、权利要求22的方法，其中所述的色谱选自SDS-PAGE、凝胶渗透色谱和离子交换色谱。

24、权利要求1的方法，其中所述的水溶性聚合物选自聚(亚烷基氧)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰基吗啉)和聚(乙氧基化多元醇)。

25、权利要求24的方法，其中所述的水溶性聚合物为聚(亚烷基氧)。

26、权利要求25的方法，其中所述的水溶性聚合物是聚(乙二醇)。

27、权利要求26的方法，其中所述的聚(乙二醇)包含封端部分。

28、权利要求27的方法，其中所述的封端部分选自烷氧基、取代烷氧基、链烯氧基、取代链烯氧基、炔氧基、取代炔氧基、芳氧基和取代芳氧基。

29、权利要求28的方法，其中所述的封端部分选自甲氧基、乙氧基和苄氧基。

30、权利要求26的方法，其中所述的聚(乙二醇)具有约100道尔顿-约100,000道尔顿的标称平均分子量。

31、权利要求30的方法，其中所述的聚(乙二醇)具有约1,000道尔顿-约80,000道尔顿的标称平均分子量。

32、权利要求31的方法，其中所述的聚(乙二醇)具有约2,000道尔顿-约50,000道尔顿的标称平均分子量。

33、权利要求26的方法，其中所述的聚(乙二醇)具有选自线性、支化、叉状和多臂的结构。

34、权利要求26的方法，其中所述的聚(乙二醇)包含结构：

                  Z-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-，

其中n为约10-约4,000，Z包含选自以下基团的部分：羟基、氨基、酯、碳酸酯、醛、水合醛、缩醛、酮、水合酮、缩酮、链烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、砜、硫羟基、羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰肼、脲、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、烷氧基、苄氧基、硅烷、类脂、磷脂、生物素和荧光素。

35、权利要求1的方法，其中所述的水溶性聚合物包含连接键L，该连接键插入于所述水溶性聚合物和所述马来酰亚胺基团之间。

36、权利要求35的方法，其中所述的连接键可以有效地使所述水溶性聚合物在室温及pH9.0的磷酸盐缓冲剂条件下测得的开环水解半衰期为约12小时或更短。

37、权利要求26的方法，其中所述的聚乙二醇聚合物直接连接在所述马来酰亚胺基团的氮原子上。

38、按照权利要求1的方法制备的聚合物轭合物组合物。

39、一种组合物，其包含任选地通过插入的连接键而共价连接于马来酰胺酸基团上的水溶性聚合物。

40、一种组合物，其包含至少50重量％的任选地通过插入的连接键而共价连接于马来酰胺酸基团上的水溶性聚合物。

41、权利要求39的组合物，该组合物是化学稳定的。

42、权利要求39的组合物，该组合物是耐水解的。

43、权利要求39的组合物，其中所述的水溶性聚合物选自聚(亚烷基氧)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰基吗啉)和聚(乙氧基化多元醇)。

44、权利要求39的组合物，其中所述的马来酰胺酸基团共价连接于活性剂的亲核基团上，从而形成了对应的琥珀酰胺酸衍生物。

45、一种化学稳定的组合物，包含：

或

其中：

POLY为水溶性聚合物链段，

L为任选的连接键，且

“Nu-活性剂”表示包含亲核基团“Nu”的活性剂。

46、权利要求45的组合物，其中所述的Nu为硫醇或、硫醇盐或硫醇酯。

47、权利要求46的组合物，其中所述的Nu为包含在半胱氨酸中的硫羟基或、硫醇盐或硫醇酯，且所述活性剂为蛋白质或肽。

48、权利要求45的组合物，其中所述的Nu为氨基。

49、利要求45的组合物，其中所述的Nu为包含在赖氨酸中的氨基或端基胺，并且所述活性剂为蛋白质或肽。

50、权利要求45的组合物，其呈粉末形式。

51、权利要求45的组合物，其呈溶液形式。

52、权利要求45的组合物，其包含至少约15重量％的V和IV组合结构，基于含POLY的组分计。

53、权利要求45的组合物，其包含至少约35重量％的V和IV组合结构，基于含POLY的组分计。

54、权利要求45的组合物，其包含至少约80重量％的V和IV组合结构，基于含POLY的组分计。

55、权利要求45的组合物，其包含至少约95重量％的V和IV组合结构，基于含POLY的组分计。

56、权利要求45的组合物，其包含至少约98重量％的V和IV组合结构，基于含POLY的组分计。

57、权利要求45的组合物，其中的L是能有效地提供未偶联的水溶性聚合物马来酰亚胺的马来酰亚胺基开环水解速率的连接键，所述聚合物马来酰亚胺是V或IV的前体，所述开环水解速率比不含连接键的同样的水溶性聚合物马来酰亚胺前体有所提高。

58、权利要求45的组合物，其中的L是能有效地使在室温和pH9的磷酸盐缓冲剂的条件下测定的未偶联水溶性聚合物马来酰亚胺的开环水解的半衰期为约12小时或更短的连接键，其中的聚合物马来酰亚胺是V或IV的前体。

59、权利要求45的组合物，其中的POLY包含聚乙二醇且结构V和IV不含连接键。

60、权利要求59的组合物，其中的POLY为线性聚乙二醇。

61、权利要求45的组合物，其中所述的连接键在距所述琥珀酰胺酸的氮原子约6个碳原子的长度内包含吸电子基团(EWG)。

62、权利要求61的组合物，其中所述的连接键在距所述琥珀酰胺酸的氮原子约3个碳原子的长度内包含吸电子基团(EWG)。

63、权利要求45的组合物，其中所述的活性剂是生物活性剂。

64、包含权利要求63的组合物的单位剂量形式。

65、用水溶性聚合物衍生的蛋白质，其中的聚合物通过共价连接在半胱氨酸巯基或赖氨酸氨基上的琥珀酰亚胺基而偶联在蛋白质上，并且基本上所有的琥珀酰亚胺基都以开环形式存在。

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