CN105906816A - 一种键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷及其制备方法，本发明灯盏花乙素与双胺（三胺）修饰的β‑环糊精阳离子聚轮烷通过灯盏花乙素的羧基与双胺（三胺）修饰的β‑环糊精阳离子聚轮烷的胺基形成的酰胺键连接；灯盏花乙素作为一种新型的DNA非共价交联试剂，利用它对DNA大小沟槽的嵌入，键接灯盏花乙素的双胺（三胺）修饰的β‑环糊精阳离子聚轮烷能有效地提高对DNA凝聚效果。另外，键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷毒副作用小、生物生物相容性好，在DNA凝聚和基因治疗领域有着广泛的应用前景；本发明所述的键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷的制备方法，操作简单，原料易得，反应条件温和，有利于放大合成和实际生产应用。
Description
技术领域
本发明属于DNA凝聚及基因治疗领域，特别涉及一种键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷及其制备方法。
背景技术
基因治疗是在基因水平治疗疾病的方法，包括基因置换、基因修正、基因失活、引入新基因等。通常将正常基因导入干细胞或者组织细胞，以纠正特定的遗传性缺陷，阻止病变的发展、杀灭病变细胞，或抑制外源病原体遗传物质的复制，从而达到治疗目的。由于生物体的排异性，单纯的外源基因很难进入到受体细胞中，这就需要一个良好的载体。目前用于基因治疗的载体分为两类，病毒载体和人工合成载体（非病毒载体）。病毒载体具有高效的转染效率，但其安全性低、免疫原性高且制备复杂。与病毒类载体相比，非病毒载体具有低免疫原性、生物相容性好以及令人满意的基因负载能力，因此相关的研究在近几年得到广泛开展。一般来说，良好的DNA凝聚能力是基因转染的前提，开发高效、低毒的DNA凝聚剂一直是基因治疗领域研究的热点。多胺聚轮烷因其生物相容性，且具有多个正电荷位点，可以与负电荷的DNA或RNA结合，达到凝聚的效果，是一种优良的基因载体。但实验证明多胺聚轮烷凝聚DNA所需的药物浓度大，并不高效。DNA或RNA嵌入基团研究证明：含有平面或近平面的芳环结构化合物是DNA或RNA的嵌入剂。其中，以2～4环为宜，又以3环为优。因此，我们选择平面或近平面的芳环结构的低细胞毒性的天然产物灯盏花乙素作为DNA或RNA嵌入基团共价结合在多胺聚轮烷上，具有合成方法简单、低毒、双重协调作用、易调控等优点，是制备高效DNA凝聚剂的一种重要方法。因此，灯盏花乙素与双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷具通过酰胺缩合反应结合起来，构筑了一种具有DNA高效凝聚作用的阳离子聚轮烷。
公开号为CN101613421A 的中国专利采用聚醚胺穿线于蒽酸修饰的β-环糊精上形成假轮烷，利用蒽酸基团对DNA大小沟槽的嵌入，假轮烷能有效的对DNA非共价交联。但是，该假轮烷中的蒽酸基团在高浓度下能产生较大细胞毒性。
因此，找到一种既具有蒽酸基团相似的平面分子，又具有低毒性的天然药物灯盏花乙素对于更好地利用灯盏花乙素嵌入DNA大小沟槽，增加阳离子聚轮烷的凝聚效果，有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术分析和存在问题，提供一种键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷，双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷具有一定的DNA凝聚作用，利用灯盏花乙素与双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷结合，进一步增强DNA凝聚效果。该键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷在双重协同作用下，DNA凝聚效果大大提高，同时生物相容性好，毒副作用小，适合放大合成和实际生产应用。
本发明键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷（FA-2N βCD-SCU-PR、FA-3N βCD-SCU-PR），灯盏花乙素与双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷（FA-2N βCD-PR、FA-3N βCD-PR）通过灯盏花乙素的羧基与阳离子聚轮烷的胺基形成的酰胺键连接，其结构如下，
。
双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷的合成参照已有文献进行[Gong XS, etal. Carbohydrate Research.2015,412:7-14]，该合成步骤包含包接工序、封端工序、胺类修饰工序，反应式如下：
（1）包接工序：碘代环糊精饱和水溶液与聚醚胺制得假轮烷（ΙβCD-PPR），
；
（2）封端工序：假轮烷在N,N’-二环己碳二亚胺、1-羟基苯并三唑的存在下与叶酸反应，得到具有叶酸封端的聚轮烷（FA-ΙβCD-PR），
；
（3）胺类修饰工序：将封端工序得到的聚轮烷分别与乙二胺、二乙烯三胺反应，分别得到双胺、三胺修饰的具有叶酸封端的聚轮烷（FA-2N βCD-PR、FA-3N βCD-PR），
其中m=3、4，n=1、2。
本发明目的是提供的上述键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷的制备方法，在强极性有机溶剂中，灯盏花乙素与双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在下发生酰胺缩合反应，经纯化和精制过程制得键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷。
该键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷在强极性有机溶剂中，灯盏花乙素与阳离子聚轮烷发生酰胺缩合反应制得。
所述的强极性有机溶剂为N,N’-二甲基酰胺、N,N’-二乙基酰胺或二甲基亚砜。
本发明所述灯盏花乙素与双胺修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷或三胺修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷的摩尔比为10～15:1，且优选为10:1。
本发明所述制备方法所述酰胺缩合反应为先在冰浴条件下反应1~2h，然后在室温条件下反应48~60h，灯盏花乙素的羧基与双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷的胺基发生酰胺缩合反应，生成灯盏花乙素阳离子聚轮烷(FA-2N βCD-SCU-PR、FA-3N βCD-SCU-PR)。
本发明所述制备方法还包括灯盏花乙素阳离子聚轮烷进行纯化步骤。
由于双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷溶于水，灯盏花乙素水溶性较差，在水中难溶，而本发明所述键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷的灯盏花乙素与双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷通过酰胺键连接，具有许多亲水性基团，水溶性好，易溶于水。因此本发明所述纯化为将反应液过滤后，澄清液缓慢滴入快速搅拌的丙酮中，搅拌后抽滤取滤饼；然后将滤饼溶解于蒸馏水中，搅拌混合后，过滤；将滤液加入快速搅拌的甲醇中，搅拌后抽滤取滤饼，将所得滤饼真空干燥后于透析袋中透析，所得液冷冻干燥得到键接灯盏花乙素纯品。其中，所述的过滤除杂除去未反应的灯盏花乙素。
有机溶剂沉淀法分离制得的灯盏花乙素阳离子聚轮烷的原理为有机溶剂中能降低溶液的介电常数，减少溶剂的极性，从而削弱溶剂分子与灯盏花乙素阳离子聚轮烷分子间的相互作用力，溶解度降低而沉淀。
作为优选，所述有机溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇。
本发明所述制备方法还包括对灯盏花乙素阳离子聚轮烷进行精制步骤。
作为优选，所述精制为在截留分子量范围为3500～8000Da的透析袋中连续透析3～5天，所得溶液冷冻干燥，且优选为3500的透析袋中连续透析3天，所得溶液冷冻干燥。
在具体实施方案中本发明通过核磁共振确定键接灯盏花乙素的聚轮烷的结构。键接灯盏花乙素的聚轮烷1HNMR图显示CH3 of NH2-PPG-NH2(δ 1.03),1-H of CD (δ 4.83),3-H and 3’,5’-H of SCU(6.99-6.75),2’,6’-H of SCU (δ 7.94)四个特征峰的积分比可以得出结论，即在一个PPG分子上，穿上10～12个环糊精，键接上8～9个灯盏花乙素分子。因为灯盏花乙素是极易溶于甲醇的，所以判断灯盏花乙素不是游离的，应该是和双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷发生酰胺缩合反应。然后，通过2D NMR(ROESY)对叶酸碘代β环糊精聚轮烷的结构作二维ROESY分析，可以看出轮烷骨架上的PPG和环糊精内部氢原子3-H和5-H都产生关系，说明PPG是穿在环糊精的内部。
本发明另一目的是将键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷应用在DNA凝聚中，键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷中灯盏花乙素可以有效地提高双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷与DNA的凝聚效果，增加双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷/DNA复合物的稳定性，作为一种新型的基因治疗试剂。
本发明的优点是：键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷具有高效的DNA凝聚能力，毒副作用小，在基因治疗领域有着广阔的应用前景；其制备方法简单，有利于放大合成和实际生产应用。
附图说明
图1为实施例1制备的叶酸碘代β-环糊精聚轮(FA-ΙβCD-PR)2D NMR(ROESY)谱图；
图2为灯盏花乙素与双胺修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷连接的(FA-2N βCD-SCU-PR)核磁氢谱图(1HNMR)；
图3为FA-2N βCD-PR/DNA(4a)、FA-2N βCD-SCU-PR/DNA(4b)、FA-3N βCD -PR/DNA(5a)、FA-3N βCD-SCU-PR/DNA(5b)的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为FA-2N βCD–PR、FA-2N βCD-SCU-PR凝聚质粒DNA的原子力显微镜图；
图5 为FA-2N βCD-SCU-PR、FA-3N βCD-SCU-PR对人胚肾293T细胞的MTT毒性实验结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替代和改动对本领域技术人员来说都是显而易见的，它们都被视为包括本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本发明所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所述的键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷，灯盏花乙素与双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷通过灯盏花乙素的羧基与双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷的胺基形成的酰胺键连接，其结构如下所示，
。
该键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷由在强极性有机溶剂中，灯盏花乙素与双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷发生酰胺缩合反应，经纯化和精制制得。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷的制备
参照已有文献[Gong XS, et al. Carbohydrate Research.2015,412:7-14]按如下方法进行：
（1）包接工序：I-CD（4.0g，6.2mmol）溶解于400mL水中制成饱和水溶液；将聚醚胺（NH2-PPG，3.2g，6.2mmol）溶液缓慢滴加入到I-CD的饱和水溶液中，机械搅拌36h；置于5～10℃情况下静置24h；析出白色沉淀，抽滤取滤饼，使用100mL纯水和100mL丙酮反复交替冲洗3遍，得到的滤饼于40℃下真空干燥得黄色产物假轮烷(ΙβCD-PPR)；
（2）封端工序：叶酸(FA，0.20g，0.23mmol)溶于DMF溶液(40mL)中；充分溶解后加入N,N’-二环己碳二亚胺(DCC，0.2g，0.92mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBT，0.14g，0.102mmol)于冰浴下搅拌1h，N2保护并注意避光，将ΙβCD-PPR(7.2g，0.24mmol)缓慢的加入反应，于10～15℃下搅拌48小时，N2保护并注意避光；反应液缓慢滴入快速搅拌的丙酮中，搅拌1.5h后抽滤取滤饼，使用40mL纯水和40mLDMF依次冲洗滤饼，再用200mL丙酮冲洗，得粗品；粗品于40℃下真空干燥，将粗品加入600mL水中，超声20min，形成均匀混悬液；于冰箱中静置过夜，抽滤，滤饼再用200mL水相同方法操作2次；得纯产品黄色产物(FA-ΙβCD-PR)，其2D NMR(ROESY)谱图如图1所示；
（3）胺类修饰工序：（a）聚轮烷(FA-ΙβCD-PR)(6.0g，0.32mmol)溶解于乙二胺溶液(24mL)中，加入少量的DMF助溶直到溶液澄清，再加入K2CO3(0.18g，1.58mmol)避光搅拌24h，将反应液缓慢滴入快速搅拌的丙酮中，抽滤取滤饼，得到的滤饼于40℃真空干燥箱中，得粗品；再反复用丙酮沉淀3次，得纯品黄色产物(FA-2N βCD-PR)，产率约为18%；
（b）聚轮烷(FA-ΙβCD-PR)(6.0g，0.32mmol)溶解于二乙烯三胺胺溶液(30mL)中，加入少量的DMF助溶直到溶液澄清，再加入K2CO3(0.22g，1.58mmol)避光搅拌24h；将反应液缓慢滴入快速搅拌的丙酮中，抽滤取滤饼；得到的滤饼于40℃真空干燥箱中，得粗品；再反复用丙酮沉淀3次，得纯品黄色产物（FA-3N βCD-PR），产率约为19%。
实施例2：键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷的制备
将灯盏花乙素(0.46 g，0.70 mmol)溶于N,N’-二乙基酰胺溶液(20 mL)中，充分溶解后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDCI，0.27 g，1.40 mmol)，冰浴下搅拌15min，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.16 g，1.4mmol)，反应物在冰浴下搅拌1.5h，N2保护并注意避光；然后将FA-2NβCD-PR(1.27g ,0.07mmol)或FA-3N βCD-PR(1.4g ,0.07mmol)缓慢加入到反应液中，再加入适量三乙胺溶液调节pH至7.0左右，N2保护并注意避光，然后在室温条件下反应55h；将反应液过滤后，澄清液缓慢滴入快速搅拌的丙酮中，搅拌1h后抽滤取滤饼；然后将滤饼溶解于蒸馏水中，搅拌混合后，过滤；将滤液快速搅拌的甲醇中，搅拌30min后抽滤取滤饼，将所得滤饼在50℃下真空干燥24h后于截留分子量为3500Da
的透析袋中透析3天，所得液冷冻干燥，得到淡黄色灯盏花乙素阳离子聚轮烷(FA-2N βCD-SCU-PR、FA-3N βCD-SCU-PR)，产率分别为32%、27%。
图3为N/P比为0～15的条件下，不同组分下质粒DNA琼脂糖凝胶电泳实验，通过比较可知，对比不同N/P比下DNA滞留胶孔的情况可以看出：FA-2N βCD-SCU-PR、FA-3N βCD-SCU-PR在N/P比为11的时候就能将DNA滞留在胶孔里面，而FA-2N βCD–PR、FA-3N βCD –PR在N/P比为15的时候仍然能见到DNA的在胶上迁移。凝胶电泳图表明，在灯盏花乙素、双胺（三胺）修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷在双重协同作用下，其凝聚能力大大增强，能够非常有效地凝聚DNA。
图4（a）为单纯质粒DNA的原子力显微镜；图b为FA-2N βCD–PR与质粒DNA的作用的原子力显微镜；图c为FA-2N βCD-SCU-PR与质粒DNA的作用的原子力显微镜，图中表明：与FA-2N βCD–PR对质粒DNA的凝聚效果相比，FA-2N βCD-SCU-PR可以更有效地将质粒DNA从松散的线状型凝聚成粒径更小且均一的聚集体。
图5为FA-2N βCD-SCU-PR、FA-3N βCD-SCU-PR对人胚肾293T细胞的MTT毒性实验，结果表明：当FA-2N βCD-SCU-PR、FA-3N βCD-SCU-PR的浓度为125mg/mL，细胞存活率可达到75%，由此可以说明该键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷的细胞毒性较低。
实施例3：键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷的制备
将灯盏花乙素(0.46 g，0.70 mmol)溶于N,N’-二甲基酰胺溶液(20 mL)中，充分溶解后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDCI，0.27 g，1.40 mmol)，冰浴下搅拌15min，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.16 g，1.4mmol)，反应物在冰浴下搅拌1 h，N2保护并注意避光；然后将FA-2NβCD-PR(0.98g，0.054mmol)或FA-3N βCD-PR(1.08g，0.054mmol)缓慢加入到反应液中，再加入适量三乙胺溶液调节pH至7.0左右，N2保护并注意避光，然后在室温条件下反应48h；将反应液过滤后，澄清液缓慢滴入快速搅拌的丙酮中，搅拌1h后抽滤取滤饼；然后将滤饼溶解于蒸馏水中，搅拌混合后，过滤；将滤液加入快速搅拌的甲醇中，搅拌30min后抽滤取滤饼，将所得滤饼在50℃下真空干燥24h后于截留分子量为5000Da的透析袋中透析3天，所得液冷冻干燥，得到淡黄色灯盏花乙素阳离子聚轮烷(FA-2NβCD-SCU-PR、FA-3N βCD-SCU-PR)，产率分别为27%、18%。
实施例4：键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷的制备
将灯盏花乙素(0.46 g，0.70 mmol)溶于N,N’-二乙基酰胺溶液(20 mL)中，充分溶解后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDCI，0.27 g，1.40 mmol)，冰浴下搅拌15min，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.16 g，1.4mmol)，反应物在冰浴下搅拌2h，N2保护并注意避光；然后将FA-2NβCD-PR(0.87g， 0.048mmol)或FA-3N βCD-PR(0.96g，0.048mmol)缓慢加入到反应液中，再加入适量三乙胺溶液调节pH至7.0左右，N2保护并注意避光，然后在室温条件下反应60h；将反应液过滤后，澄清液缓慢滴入快速搅拌的丙酮中，搅拌1h后抽滤取滤饼；然后将滤饼溶解于蒸馏水中，搅拌混合后，过滤；将滤液快速搅拌的甲醇中，搅拌30min后抽滤取滤饼，将所得滤饼在50℃下真空干燥24h后于截留分子量为8000Da的透析袋中透析4天，所得液冷冻干燥，得到淡黄色灯盏花乙素阳离子聚轮烷(FA-2NβCD-SCU-PR、FA-3N βCD-SCU-PR)，产率分别为25%、16%。
Claims (8)
1.结构式如式Ⅰ所示的键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷：
。
2.一种制备如权利要求1所述键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷的方法，其特征在于：在强极性有机溶剂中，灯盏花乙素与式Ⅱ所示的双胺修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷或三胺修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在下发生酰胺缩合反应，经纯化和精制得键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷，
其中m=3、4，n=1、2。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：强极性有机溶剂为N,N’-二甲基酰胺、N,N’-二乙基酰胺或二甲基亚砜。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：灯盏花乙素与双胺修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷或三胺修饰的β-环糊精阳离子聚轮烷的摩尔比为10～15:1。
5.根据权利2中所述的制备方法，其特征在于：酰胺缩合反应条件是先在冰浴条件下反应1~2h，然后在室温条件下反应48~60h。
6.根据权利2中所述的制备方法，其特征在于：纯化采用有机溶剂沉淀法。
7.根据权利2中所述的制备方法，其特征在于：精制采用截留分子量为3500～8000Da的透析袋连续透析3～5天，然后将透析袋中溶液冷冻干燥。
8.权利要求1所述的键接灯盏花乙素阳离子聚轮烷在DNA凝聚中应用。
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