CN106565837B - 一种金属螯合功能血清白蛋白及制备方法和在抑制β-淀粉样蛋白聚集的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种金属螯合功能血清白蛋白及制备方法和在抑制β‑淀粉样蛋白聚集的应用。金属螯合功能血清白蛋白是在血清白蛋白表面的氨基上先修饰1,4‑丁二醇二缩水甘油醚，再在1,4‑丁二醇二缩水甘油醚的环氧基上修饰金属螯合剂亚氨基二乙酸，且每个血清白蛋白上的亚氨基二乙酸的平均修饰数目介于2‑40。本发明合成金属螯合功能血清白蛋白，提高了血清白蛋白对金属离子的螯合能力，从而抑制Aβ自聚集以及金属离子诱导下Aβ聚集过程，并降低β‑淀粉样蛋白聚集体的细胞毒性。用于治疗β‑淀粉样蛋白聚集相关的疾病药物。治疗和延缓阿尔兹海默病等疾病。

Description

一种金属螯合功能血清白蛋白及制备方法和在抑制β-淀粉样 蛋白聚集的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别是涉及一种金属螯合功能血清白蛋白及制备方法和在抑制β-淀粉样蛋白聚集的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年痴呆中最主要的发病形式，占全部痴呆症的50％-70％，是目前备受关注的一种神经退行性疾病(Nature 2014,507,448-454)。AD的发病率会随着人类年龄增长而不断增加，随着社会老龄化不断加剧，预计到2050年，AD患者将达到11500万(ACS chemical neuroscience 2014,5,718-730)，成为危害老年人的重大疾病之一。由于至今临床上还没有治疗AD的有效方法(Cell 2005,120,545-555)，因此作为严重影响人类健康的医学和社会问题，预防和治疗AD已成为生物医学和生命科学领域的研究热点。

虽然AD的病因及发病机制尚未完全阐明，但研究发现，其病理学表现形式主要有：tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结和神经细胞外大量的聚集斑沉积(Nature 2014,515,274-278)。聚集斑的主要组成为β淀粉样蛋白(amyloidβ-peptide,Aβ)的聚集沉淀(J.Am.Chem.Soc.,2012,134,6625–6636)。研究表明，Aβ聚集体可通过多种形式对神经细胞造成损害，是AD发病的主要原因(Angew Chem Int Ed Engl 2015,54,6492-6495)。且聚集体对神经细胞的毒性除Aβ聚集的成熟纤维外，可溶性的Aβ寡聚体也有很大的毒性(Angew Chem Int Ed Engl 2015,54,1227-1230)。所以只要抑制Aβ的聚集，就可从根本上消除其引发的神经毒性，从而预防AD的发生。

Aβ是由Aβ前体蛋白经过β、γ分泌酶剪切而成，一般由39-43个氨基酸残基组成(Langmuir 2012,28,6595-6605)。体内含量最多的Aβ变体为Aβ40和Aβ42，其中Aβ42含量较少，但其毒性更大(Bioorganic&medicinal chemistry letters 2015,25,508-513)。Aβ是高疏水性多肽，水溶性较低，容易聚集形成Aβ纤维。

近期研究发现，金属离子在Aβ聚集过程中起重要作用。在大脑中，一些神经元细胞的突触囊泡里储存着高浓度的金属离子(Cu²⁺和Zn²⁺等)，浓度可高达几百微摩尔，甚至达到毫摩尔级别。为了完成信号传递等生理功能，这些金属离子会瞬间释放到神经突触间隙中，从而造成Aβ与高浓度的金属离子共存的现象(J.Am.Chem.Soc.,2013,135,7503-7510)。而体外实验已经证实，Cu²⁺和Zn²⁺与Aβ间存在着极强的亲和力，低浓度的金属离子即可引发Aβ快速聚集，甚至沉淀。另外有研究表明，AD患者大脑内金属离子的浓度会显著升高，而且形成的聚集斑里富含金属离子(J.Am.Chem.Soc.,2008,130:1376-1383)。因此，目前对金属离子在Aβ聚集过程中的作用越来越受到关注，开发一种既可以有效抑制Aβ聚集又可以螯合金属离子的多功能抑制剂显得尤为重要。

当前的Aβ聚集抑制剂主要包括：有机小分子类、蛋白质类、多肽类和纳米颗粒类抑制剂。有机小分子抑制剂具有结构简单、易于获得等特点，但多数小分子抑制剂存在溶解性差、细胞毒性大、特异性低以及生物利用度低等缺陷(Nanoscale,2012.4:1895-1909)。而多肽抑制剂多为Aβ的疏水区段及其衍生肽，如：KLVFF和LPFFD等。虽然多肽抑制剂具有生物相容性好、毒副作用小、分子量小等优点，但其却存在易被降解和易自聚集等严重缺陷(AcsChemical Neuroscience,2010.1:661-678)。近年，纳米颗粒抑制剂以其比表面积大、易穿越血脑屏障等特点，在Aβ聚集抑制剂的开发中显示出很大优势(ACS nano 2014,8,2345-2359)。然而一些纳米颗粒抑制剂存在特异性不高、抑制效果较差和细胞毒性较高等缺陷(Chemical Society reviews 2012,41,2800-2823)。

与上述抑制剂相比，蛋白类抑制剂由于其具有生物相容性好、便于化学修饰等优点，越来越受到重视。其中人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)作为血液中最丰富的蛋白质，因其良好的物化稳定性、生物相容性和较长的体内循环周期等优点，常被用做药物载体，用于治疗癌症和风湿性关节炎等(J.Controlled Release.,2008,132,171-183)。此外，HSA是一种天然的Aβ吸附剂，它可以与Aβ以1:1的化学计量比相结合，解离常数为5-10μΜ(J.Biol.Chem.2012,287,28163-28168)。然而，在生理条件下，脑脊液中HSA的浓度较低，不足以通过单纯的吸附作用抑制Aβ聚集，同时其存在特异性差等缺陷。此外，HSA对金属离子的结合能力也十分有限，对于金属离子存在条件下的Aβ聚集抑制效果不足。因此，通过化学修饰创建金属螯合功能血清白蛋白，是强化对Aβ聚集抑制作用的有效途径。

通过在白蛋白表面修饰金属螯合剂的方法，提升HSA对于金属离子的螯合能力，从而理性改造了血清白蛋白表面微环境，有效抑制Aβ自身聚集以及金属离子诱导的聚集过程，这种设计还是首次提出。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抑制β-淀粉样蛋白聚集功能的金属螯合功能血清白蛋白新型抑制剂及制备方法和其在抑制β-淀粉样蛋白聚集中的应用。本发明所述的具有抑制β-淀粉样蛋白聚集功能的金属螯合功能血清白蛋白的制备方法不仅具有制备技术简捷、结构与性质稳定、生物相容性好等特点而且在抑制Aβ蛋白自身聚集、抑制金属离子诱导下Aβ蛋白聚集和降低β-淀粉样蛋白聚集体的细胞毒性等方面具有有益的效果。

本发明是通过下述技术方案加以实现的：

一种金属螯合功能血清白蛋白，在血清白蛋白表面的氨基上修饰亚氨基二乙酸，且亚氨基二乙酸平均修饰数目介于2-40；结构如下：

本发明的金属螯合功能血清白蛋白制备方法：

1)向溶解于硼酸-硼砂缓冲液中的血清白蛋白溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚液体，1,4-丁二醇二缩水甘油醚与血清白蛋白的摩尔比范围为1000～2000：1，然后搅拌反应；

2)除去未反应的1,4-丁二醇二缩水甘油醚后，向第一步反应产物中加入亚氨基二乙酸粉末，亚氨基二乙酸与血清白蛋白的摩尔比范围为5～400：1，然后在搅拌反应；除去游离亚氨基二乙酸得到分子结构稳定的金属螯合功能血清白蛋白(I-HSA)。

优选溶解于硼酸-硼砂缓冲液的血清白蛋白浓度为1～20mg/mL；缓冲液的pH 8.0～9.0。

优选加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚与血清白蛋白的摩尔比范围为1000～2000：1。

优选加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚后的搅拌反应条件是在25℃～50℃条件下搅拌反应8～12h。

优选加入加入亚氨基二乙酸粉末搅拌反应条件是：在25℃～50℃条件下搅拌反应24～48h。

亚氨基二乙酸与血清白蛋白的摩尔比为5～400：1，该摩尔比(即亚氨基二乙酸加入量)直接决定了血清白蛋白表面的螯合剂修饰密度。

本发明的反应式如下：

a)

b)

本发明合成一种表面带有金属螯合剂的血清白蛋白，在血清白蛋白表面修饰了2～40个亚氨基二乙酸分子，增强了其与Aβ的相互作用，等摩尔量的I-HSA可以将Aβ聚集体产生的细胞毒性从36.6％降至12.8％。此外，修饰的金属螯合剂可以有效结合金属离子，从而抑制Aβ和金属离子作用下的聚集过程。在Zn²⁺存在下，等摩尔量的I-HSA可以将Aβ聚集体产生的细胞毒性从47.7％降至13.9％。在Cu²⁺存在下，等摩尔量的I-HSA可以将Aβ聚集体产生的细胞毒性从59.4％降至14.4％。因此，这种带有金属螯合剂的血清白蛋白可以有效抑制Aβ自身聚集以及金属离子作用下的聚集过程。

本发明所述的金属螯合功能血清白蛋白在抑制和预防β-淀粉样蛋白聚集中的应用，有效量的金属螯合功能血清白蛋白可达到抑制Aβ聚集和降低β-淀粉样蛋白聚集体的细胞毒性的效果，因此用于治疗β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病药物。

本发明所述的金属螯合功能血清白蛋白在蛋白质药物中的应用，该蛋白质药物可用于预防、治疗和延缓阿尔兹海默病等疾病。

本发明提供的一种具有抑制β-淀粉样蛋白聚集功能的金属螯合功能血清白蛋白新型抑制剂及制备方法和其在抑制β-淀粉样蛋白聚集中的应用，具有如下的优势：第一，通过在血清白蛋白表面修饰亚氨基二乙酸，合成金属螯合功能血清白蛋白，可以有效增加白蛋白表面的金属离子的螯合能力，并改进血清白蛋白表面微环境，反应温和简便；第二，金属螯合功能血清白蛋白能够有效抑制Aβ42的自身聚集，并可有效抑制金属离子诱导的Aβ42聚集过程；改变了Aβ42聚集体的形貌，阻止并减缓了其向纤维状形貌的转化；第三，金属螯合功能血清白蛋白有效降低了Aβ42聚集体对细胞产生的毒性。金属螯合功能血清白蛋白作为一种潜在的新药，可以有效抑制Aβ42的聚集及其构象变化过程，并降低Aβ42聚集过程中所产生的细胞毒性，是Aβ42聚集的理想抑制剂。

附图说明

图1：实施例1中同浓度血清白蛋白和低修饰密度的金属螯合功能血清白蛋白(I-HSA1)的內源荧光变化图。

图2：实施例2中同浓度血清白蛋白和中等修饰密度的金属螯合功能血清白蛋白(I-HSA2)的內源荧光变化图。

图3：实施例3中同浓度血清白蛋白和高修饰密度的金属螯合功能血清白蛋白(I-HSA3)的內源荧光变化图。

图4：实施例4中不同修饰密度的I-HSA与Aβ42共培养48h后培养物的ThT荧光图。

图5：实施例5中不同浓度的金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42共培养48h后培养物的ThT荧光图。

图6：实施例6中在Zn²⁺存在条件下，不同浓度金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42和共培养48h后培养物的ThT荧光图。

图7：实施例7中在Cu²⁺存在条件下，不同浓度金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42和共培养48h后培养物的ThT荧光图。

图8：实施例8中金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42共培养48h后培养物的透射电镜图。

图9：实施例9中金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42共培养24h后培养物对SH-SY5Y的细胞存活率。

图10：实施例10中在Zn²⁺存在条件下，金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42共培养24h后培养物对SH-SY5Y的细胞存活率。

图11：实施例11中在Cu²⁺存在条件下，金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42共培养24h后培养物对SH-SY5Y的细胞存活率。

图12：实施例12中金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42共培养24h后培养物对SH-SY5Y的细胞活性氧水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

首先在血清白蛋白表面修饰1,4-丁二醇二缩水甘油醚，从而在其表面修饰上环氧基，下一步通过环氧基修饰亚氨基二乙酸，从而提高其金属螯合功能以及其表面的负电荷数量，制备得到金属螯合功能血清白蛋白。多种实验手段证明，金属螯合功能血清白蛋白可以有效抑制Aβ42自身聚集以及金属离子诱导下的Aβ42聚集过程，并能降低Aβ42聚集过程中所产生的细胞毒性。金属螯合功能血清白蛋白抑制Aβ42聚集体生成的能力是通过ThT荧光和透射电镜等方法测定的，其降低Aβ42聚集过程中所产生的细胞毒性的能力是通过MTT细胞毒性实验和ROS实验测定的。

实施例1：亚氨基二乙酸与血清白蛋白的摩尔比为5的金属螯合功能血清白蛋白合成与表征

称取20mg血清白蛋白(HSA)，溶解于20mL硼酸-硼砂缓冲液中(20mmol/L，pH 8.0)，得到浓度为1mg/mL的血清白蛋白溶液，并加入55μL 1,4-丁二醇二缩水甘油醚。上述混合物在120rpm和25℃搅拌反应8h。反应后通过SephadexG-25凝胶过滤色谱柱除去体系中游离的1,4-丁二醇二缩水甘油醚，流动相为硼酸-硼砂缓冲液中(20mmol/L，pH 8.0)。称取0.2mg亚氨基二乙酸粉末，加入到上步得到的溶液中。上述混合物在120rpm和25℃下搅拌反应24h。反应后通过SephadexG-25凝胶过滤色谱柱除去体系中游离的亚氨基二乙酸，流动相为水，得到的产物：低修饰密度金属螯合功能血清白蛋白(I-HSA1)冷冻干燥后保存。

称取HSA和I-HSA1各2mg，分别溶于pH 7.4的2ml HEPES缓冲液(10mmol/L HEPES，100mmol/L NaCl)中；在25℃条件下，通过粒径分析仪(Malvern Instruments)分析修饰前后血清白蛋白分子尺寸的变化；通过电位分析仪(Malvern Instruments)分别测定相同浓度的HSA和I-HSA1的Zeta电势；通过质谱仪分析I-HSA1的分子量，从而确定I-HSA1的平均修饰率。最后，通过荧光分光光度计测定其在280nm激发波长下的內源荧光强度变化，对比修饰前后血清白蛋白分子结构的变化。

表1修饰前后血清白蛋白粒径、Zeta电势和分子量变化情况

由表1可知，HSA粒径为7.9±0.4nm，而I-HSA1的粒径为8.0±0.3nm，说明修饰后血清白蛋白的粒径变化不大，仍然保持为球状结构。在pH 7.4时，I-HSA1的Zeta电势较血清白蛋白稍微降低，说明修饰亚氨基二乙酸后，血清白蛋白表面带有更多的羧基，从而降低了其Zeta电势，使其表面带有更多的负电荷。I-HSA1的分子量为76685.4Da，天然血清白蛋白的分子量为67318.1Da，由于血清白蛋白与1,4-丁二醇二缩水甘油醚反应后的分子量为76419.4Da，所以I-HSA1的平均修饰率为2个亚氨基二乙酸/血清白蛋白。

如图1所示，在280nm激发下HSA和I-HSA1的内源荧光强度和出峰位置基本保持一致，说明酸化修饰后的血清白蛋白空间结构仍保持紧凑，且和天然态基本保持一致。说明这种修饰方法在保证不改变蛋白质空间结构和稳定性的前提下，成功将金属螯合剂亚氨基二乙酸修饰到了血清白蛋白表面，并可以有效的提高其表面所带负电荷，可以广泛的利用到其他蛋白质的修饰上。

实施例2：亚氨基二乙酸与血清白蛋白的摩尔比为50的金属螯合功能血清白蛋白合成与表征

称取200mg血清白蛋白，溶解于20mL硼酸-硼砂缓冲液中(20mmol/L，pH 8.5)中，得到浓度为10mg/mL的血清白蛋白溶液。，并加入825μL 1,4-丁二醇二缩水甘油醚。上述混合物在120rpm和37℃搅拌反应10h。反应后通过SephadexG-25凝胶过滤色谱柱除去体系中游离的1,4-丁二醇二缩水甘油醚，流动相为硼酸-硼砂缓冲液中(20mmol/L，pH 8.5)。称取19.8mg亚氨基二乙酸粉末，加入到上步得到的溶液中。上述混合物在120rpm和37℃下搅拌反应36h。反应后通过SephadexG-25凝胶过滤色谱柱除去体系中游离的亚氨基二乙酸，流动相为水，得到的产物：中等修饰密度金属螯合功能血清白蛋白(I-HSA2)冷冻干燥后保存。

称取HSA和I-HSA2各2mg，分别溶于pH 7.4的2ml HEPES缓冲液中；在25℃条件下，通过粒径分析仪(Malvern Instruments)分析修饰前后血清白蛋白分子尺寸的变化；通过电位分析仪(Malvern Instruments)分别测定相同浓度的HSA和I-HSA2的Zeta电势；通过质谱仪分析I-HSA2的分子量，从而确定I-HSA2的平均修饰率。最后，通过荧光分光光度计测定其在280nm激发波长下的內源荧光强度变化，对比修饰前后血清白蛋白分子结构的变化。

表2修饰前后血清白蛋白粒径、Zeta电势和分子量变化情况

由表2可知，HSA粒径为7.9±0.4nm，而I-HSA2的粒径为8.1±0.2nm，说明修饰后血清白蛋白的粒径变化不大，仍然保持为球状结构。在pH 7.4时，I-HSA2的Zeta电势较血清白蛋白明显降低，说明修饰亚氨基二乙酸后，血清白蛋白表面带有更多的羧基，从而降低了其Zeta电势，使其表面带有更多的负电荷。I-HSA2的分子量为78214.9Da，天然血清白蛋白的分子量为67318.1Da，由于血清白蛋白与1,4-丁二醇二缩水甘油醚反应后的分子量为76419.4Da，所以I-HSA2的平均修饰率为13.5个亚氨基二乙酸/血清白蛋白。

如图2所示，在280nm激发下HSA和I-HSA2的内源荧光强度和出峰位置基本保持一致，说明酸化修饰后的血清白蛋白空间结构仍保持紧凑，且和天然态基本保持一致。说明这种修饰方法在保证不改变蛋白质空间结构和稳定性的前提下，成功将金属螯合剂亚氨基二乙酸修饰到了血清白蛋白表面，并可以有效的提高其表面所带负电荷，可以广泛的利用到其他蛋白质的修饰上。

实施例3：亚氨基二乙酸与血清白蛋白的摩尔比为400的酸化血清白蛋白合成与表征

称取400mg血清白蛋白，溶解于20mL硼酸-硼砂缓冲液中(20mmol/L，pH 9.0)中，得到浓度为20mg/mL的血清白蛋白溶液，并加入2200μL 1,4-丁二醇二缩水甘油醚。上述混合物在120rpm和50℃搅拌反应12h。反应后通过SephadexG-25凝胶过滤色谱柱除去体系中游离的1,4-丁二醇二缩水甘油醚，流动相为硼酸-硼砂缓冲液中(20mmol/L，pH 9.0)。称取316.8mg亚氨基二乙酸粉末，加入到上步得到的溶液中。上述混合物在120rpm和50℃下搅拌反应48h。反应后通过SephadexG-25凝胶过滤色谱柱除去体系中游离的亚氨基二乙酸，流动相为水，得到的产物：高修饰密度金属螯合功能血清白蛋白(I-HSA3)冷冻干燥后保存。

称取HSA和I-HSA3各2mg，分别溶于pH 7.4的2ml HEPES缓冲液中；在25℃条件下，通过粒径分析仪(Malvern Instruments)分析修饰前后血清白蛋白分子尺寸的变化；通过电位分析仪(Malvern Instruments)分别测定相同浓度的HSA和I-HSA3的Zeta电势；通过质谱仪分析I-HSA3的分子量，从而确定I-HSA3的平均修饰率。最后，通过荧光分光光度计测定其在280nm激发波长下的內源荧光强度变化，对比修饰前后血清白蛋白分子结构的变化。

表3修饰前后血清白蛋白粒径、Zeta电势和分子量变化情况

由表3可知，HSA粒径为7.9±0.4nm，而I-HSA3的粒径为8.2±0.5nm，说明修饰后血清白蛋白的粒径变化不大，仍然保持为球状结构。在pH 7.4时，I-HSA3的Zeta电势较血清白蛋白显著降低，说明修饰亚氨基二乙酸后，血清白蛋白表面带有更多的羧基，从而降低了其Zeta电势，使其表面带有更多的负电荷。I-HSA3的分子量为81739.4Da，天然血清白蛋白的分子量为67318.1Da，由于血清白蛋白与1,4-丁二醇二缩水甘油醚反应后的分子量为76419.4Da，所以I-HSA3的平均修饰率为40个亚氨基二乙酸/血清白蛋白。

如图3所示，在280nm激发下HSA和I-HSA3的内源荧光强度和出峰位置基本保持一致，说明酸化修饰后的血清白蛋白空间结构仍保持紧凑，且和天然态基本保持一致。说明这种修饰方法在保证不改变蛋白质空间结构和稳定性的前提下，成功将金属螯合剂亚氨基二乙酸修饰到了血清白蛋白表面，并可以有效的提高其表面所带负电荷，可以广泛的利用到其他蛋白质的修饰上。

实施例4：不同修饰密度的金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42共培养48h后培养物的ThT荧光强度。

首先称取10mg Aβ42粉末，溶解于10mL六氟异丙醇中，得到1mg/mL的Aβ42溶液，超声15min，使Aβ42处于单分散状态，静置1h后对样品进行冷冻干燥，获得Aβ42干粉，于-20℃保存。

称取3.1mg的Aβ42，溶于2.5mL 20mmol/L的NaOH溶液中，超声15min使之充分溶解，得到275μmol/L的Aβ42母液。用HEPES缓冲液(pH 7.4)稀释(其中HEPES浓度为10mmol/L，NaCl浓度为100mmol/L)，得到终浓度为25μmol/L的Aβ42溶液。在4℃，16000g条件下，离心30min，取总体积75％的上清液置于37℃，150rpm条件下进行培养，作为对照实验。

称取I-HSA1，I-HSA2，I-HSA3和HSA各22.1mg，分别溶于12mL的HEPES缓冲液中，获得浓度为27.5μmol/L的不同修饰密度的金属螯合功能血清白蛋白溶液。取浓度为275μmol/L的Aβ42母液，分别用27.5μmol/L的四种蛋白溶液稀释，获得25μmol/L的Aβ42溶液。将四种溶液在37℃，150rpm条件下进行培养。

称取3.19mg的ThT溶于500mL的HEPES溶液，得到终浓度为25μmol/L的ThT溶液。取200μL培养时间48h的Aβ42样品与2mL 25μmol/L的ThT溶液进行混合，在440nm激发波长和480nm发射波长下检测荧光强度，激发和发射缝宽均为5nm，扫描速度为100nm/min，扫描结果均为3次平均值。将480nm处的荧光强度对时间作图。结果如图4所示。

在图4中，可以看出I-HSA1，I-HSA2，I-HSA3对于Aβ42聚集的抑制效果均高于天然血清白蛋白，说明亚氨基二乙酸与血清白蛋白反应摩尔比在5-400范围内，均比天然态血清白蛋白对Aβ42聚集的抑制效果有显著提高，且抑制效果随着反应中加入亚氨基二乙酸的比例增加而增加。

实施例5：不同浓度的金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42共培养48h后培养物的ThT荧光变化

用实施例3中合成的I-HSA3来考察不同浓度金属螯合功能血清白蛋白对Aβ42聚集体ThT荧光强度的影响。

按照与实施例4相同的方法培养Aβ42溶液。将44.2mg的I-HSA3溶于12mL的HEPES缓冲液中，获得浓度为55μmol/L的I-HSA3溶液，并按梯度稀释获得浓度为27.5μmol/L和13.75μmol/L的I-HSA3溶液。取浓度为275μmol/L的Aβ42溶液，分别用不同浓度(55μmol/L，、27.5μmol/L和13.75μmol/L，)的I-HSA3溶液稀释，获得I-HSA3浓度分别为50μmol/L、25μmol/L和12.5μmol/L的Aβ42溶液(此时溶液中Aβ42的终浓度均为25μmol/L)。即三种溶液中Aβ42与I-HSA3的摩尔浓度比分别为1:2、1:1和1:0.5。将三种溶液在37℃，150rpm条件下进行培养。

称取3.19mg的ThT溶于500mL的HEPES溶液，得到终浓度为25μmol/L的ThT溶液。取200μL培养48h的Aβ42样品与2mL 25μmol/L的ThT溶液进行混合，在440nm激发波长和480nm发射波长下检测荧光强度，激发和发射缝宽均为5nm，扫描速度为100nm/min，扫描结果均为3次平均值。将480nm处的荧光强度对时间作图。结果如图5所示。

由图5可知，ThT荧光强度下降程度与I-HSA3的浓度呈正比，即说明I-HSA浓度越高，其抑制Aβ聚集效果越好。同时说明I-HSA有效增强了抑制Aβ42聚集的效果。

实施例6：在Zn²⁺存在条件下，不同浓度金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42和共培养48h后培养物的ThT荧光变化

用实施例3中合成的I-HSA3来考察其Zn²⁺存在条件下，不同浓度金属螯合功能血清白蛋白对Aβ42聚集的影响。

按照与实施例4相同的方法培养Aβ42溶液。将44.1mg的I-HSA3溶于12mL的HEPES缓冲液中，获得浓度为55μmol/L的I-HSA3溶液，并按梯度稀释获得浓度为27.5μmol/L和5.5μmol/L的I-HSA3溶液。将1.5mg的ZnCl₂溶于200mL的HEPES缓冲液中，获得浓度为55μmol/L的Zn²⁺溶液。取浓度为275μmol/L的Aβ42溶液与55μmol/L的Zn²⁺溶液，按照1:5体积混合，随后分别用不同浓度(55μmol/L、27.5μmol/L和5.5μmol/L)的I-HSA3溶液稀释，获得I-HSA3浓度分别为25μmol/L、12.5μmol/L和2.5μmol/L的Aβ42溶液(此时溶液中Aβ42和Zn²⁺的终浓度均为25μmol/L)。即三种溶液中Aβ42，Zn²⁺，I-HSA3的摩尔浓度比分别为1:1:1、1:1:0.5和1:1:0.1。将三种溶液在37℃，150rpm条件下进行培养。

称取3.19mg的ThT溶于500mL的HEPES溶液，得到终浓度为25μmol/L的ThT溶液。取200μL培养48h的Aβ42样品与2mL 25μmol/L的ThT溶液进行混合，在440nm激发波长和480nm发射波长下检测荧光强度，激发和发射缝宽均为5nm，扫描速度为100nm/min，扫描结果均为3次平均值。将480nm处的荧光强度对时间作图。结果如图6所示。

由图6可知，加入Zn²⁺后，Aβ42聚集体的ThT荧光强度显著降低，说明Zn²⁺改变了Aβ42聚集体的结构，形成了不定型的聚集体。加入25μmol/L的HSA，ThT荧光强度有所增强，说明HSA具有一定螯合金属的能力，但效果不显著。加入2.5μmol/L的I-HSA后，ThT荧光强度显著增加，说明低浓度I-HSA即可以有效螯合Zn²⁺，从而降低Zn²⁺对于Aβ42聚集的影响，但其对于Aβ42聚集效果有限。随着I-HSA的浓度增加，I-HSA显著体现出其对于Aβ42聚集的抑制效果，显著降低了ThT荧光强度，即说明I-HSA浓度越高，其抑制Aβ聚集效果越好。同时说明I-HSA在Zn²⁺存在条件下，可以有效抑制Aβ42聚集，且效果显著优于天然血清白蛋白。

实施例7：在Cu²⁺存在条件下，不同浓度金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42和共培养48h后培养物的ThT荧光变化

用实施例3中合成的I-HSA3来考察其Cu²⁺存在条件下，不同浓度金属螯合功能血清白蛋白对Aβ42聚集的影响。

按照与实施例4相同的方法培养Aβ42溶液。将44.1mg的I-HSA3溶于12mL的HEPES缓冲液中，获得浓度为55μmol/L的I-HSA3溶液，并按梯度稀释获得浓度为27.5μmol/L和5.5μmol/L的I-HSA3溶液。将1.5mg的CuCl₂溶于200mL的HEPES缓冲液中，获得浓度为55μmol/L的Cu²⁺溶液。取浓度为275μmol/L的Aβ42溶液与55μmol/L的Cu²⁺溶液，按照1:5体积混合，随后分别用不同浓度(55μmol/L、27.5μmol/L和5.5μmol/L)的I-HSA3溶液稀释，获得I-HSA3浓度分别为25μmol/L、12.5μmol/L和2.5μmol/L的Aβ42溶液(此时溶液中Aβ42和Cu²⁺的终浓度均为25μmol/L)。即三种溶液中Aβ42，Cu²⁺，I-HSA3的摩尔浓度比分别为1:1:1、1:1:0.5和1:1:0.1。将三种溶液在37℃，150rpm条件下进行培养。

称取3.19mg的ThT溶于500mL的HEPES溶液，得到终浓度为25μmol/L的ThT溶液。取200μL培养48h的Aβ42样品与2mL 25μmol/L的ThT溶液进行混合，在440nm激发波长和480nm发射波长下检测荧光强度，激发和发射缝宽均为5nm，扫描速度为100nm/min，扫描结果均为3次平均值。将480nm处的荧光强度对时间作图。结果如图7所示。

由图7可知，加入Cu²⁺后，Aβ42聚集体的ThT荧光强度显著降低，说明Cu²⁺改变了Aβ42聚集体的结构，形成了不定型的聚集体。加入25μmol/L的HSA，ThT荧光强度有所增强，说明HSA具有一定螯合金属的能力，但效果不显著。加入2.5μmol/L的I-HSA后，ThT荧光强度显著增加，说明低浓度I-HSA即可以有效螯合Cu²⁺，从而降低Cu²⁺对于Aβ42聚集的影响，但其对于Aβ42聚集效果有限。随着I-HSA的浓度增加，I-HSA显著体现出其对于Aβ42聚集的抑制效果，显著降低了ThT荧光强度，即说明I-HSA浓度越高，其抑制Aβ聚集效果越好。同时说明I-HSA在Cu²⁺存在条件下，可以有效抑制Aβ42聚集，且效果显著优于天然血清白蛋白。

实施例8：金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42共培养48h后培养物的纤维形态

用实施例3中合成的I-HSA3来考察其Zn²⁺、Cu²⁺存在条件下，对Aβ42聚集体形态的影响。

按照与实施例6，7相同的方法制备Aβ42样品。配制4种Aβ42样品，分别为：25μmol/LZn²⁺的Aβ42溶液，25μmol/L Cu²⁺的Aβ42溶液，25μmol/L Zn²⁺、I-HSA3的Aβ42溶液，25μmol/LCu²⁺、I-HSA3的Aβ42溶液，溶液中Aβ42的终浓度为25μmol/L。将上述溶液于37℃，150rpm条件下进行培养。

在培养48h后，取30μL的Aβ42样品，滴加在300目的碳膜铜网上，自然干燥。然后滴加1％的磷钨酸溶液(pH 6.5)染色30s后吸掉多余液体，自然干燥。然后用透射电镜(JEM100CXII)进行观察，检测电压为100kV，选取放大后标尺为200nm的图像进行观察，结果如图8所示。

由图8A可知，加入Zn²⁺后Aβ42形成球状和不定型的聚集体，彼此交联在一起。由图8B可知，加入I-HSA3后，Aβ42形成的球状聚集体消失，变化为分散的不定型聚集体，说明I-HSA可以有效减除Zn²⁺对Aβ42聚集过程的影响，并有效抑制Aβ42自聚，改变了Aβ42聚集体形貌，阻止了其向纤维的转化，形成数量较少的不定型聚集体。

由图8C可知，加入Cu²⁺后Aβ42形成球状和线状的聚集体，一些聚集体会出现交联。由图8D可知，加入I-HSA3后，Aβ42形成较为分散的不定型聚集体，说明I-HSA可以有效减除Cu²⁺对Aβ42聚集过程的影响，并有效抑制Aβ42自聚，改变了Aβ42聚集体形貌，阻止了其向纤维的转化，形成数量较少的不定型聚集体。

实施例9：金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42共培养24h后培养物对SH-SY5Y的细胞存活率

用实施例3中合成的I-HSA3来考察其对Aβ42聚集体细胞毒性的影响。

细胞毒性实验中使用的细胞为人骨髓神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)。首先取SH-SY5Y低分化细胞，用含有20％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基进行培养，并向培养基中加入神经细胞生长因子(nerve growth ractor,NGF)，使其终浓度为50ng/mL，5％CO₂，37℃培养3天。观察到SH-SY5Y细胞在NGF诱导下长出较长的突起，成为高分化细胞后向培养瓶中加入含有0.4％胰酶和0.04％EDTA的溶液对SH-SY5Y高分化细胞进行消化，再用含有20％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基以适当浓度稀释细胞，以5×10³cell/孔的细胞浓度加入到96孔板，每孔90μl。5％CO₂，37℃培养24h后进行细胞毒性实验。

配制I-HSA3浓度为275μmol/L的HEPES溶液，向上述96孔板中加入10μl/孔。之后向96孔板中加入与实施例1相同方法处理的Aβ42溶液10μl/孔。最后空白对照孔中不加I-HSA3和Aβ42溶液，而加入HEPES缓冲液20μl/孔。最终每孔中I-HSA3的终浓度为25μmol/L，Aβ42的终浓度为25μmol/L，即Aβ42与I-HSA3浓度比为1:1。细胞在培养箱中以5％CO₂，37℃条件培养24h后，加入10μL的MTT溶液，使得培养基中MTT的终浓度为0.5mg/ml。在5％CO₂，37℃条件下继续培养4h。

将96孔板以1500rpm的速度离心10min，离心后移除96孔板中溶液，每孔加入100μL的DMSO摇床震荡10min，检测570nm处吸光值。将培养基中不含Aβ42和I-HSA3的孔作为空白对照组，记为SH-SY5Y细胞活性为100％，然后将其作为对照计算加药组的细胞存活率(图9)。实验中每个实验组设置6个复孔。

由图9可知，25μmol/L I-HSA3对于SH-SY5Y细胞是无毒的，说明I-HSA3在实验条件下，生物相容性很好，通过化学修饰，没有降低其生物相容性。Aβ42单独存在时，细胞存活率为63.4％。加入25μmol/L HSA后，细胞存活率提高到75.4％，而加入25μmol/L I-HSA后，细胞存活率提高到87.2％，这说明I-HSA能够有效抑制Aβ42自身聚集所产生的细胞毒性。

实施例10：在Zn²⁺存在条件下，金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42共培养24h后培养物对SH-SY5Y的细胞存活率。

用实施例3中合成的I-HSA3来考察其对Aβ42聚集体细胞毒性的影响。

按照与实施例9相同的方法培养细胞，以5×10³cell/孔的细胞浓度加入到96孔板，每孔80μl。5％CO₂，37℃培养24h后进行细胞毒性实验。

配制I-HSA3浓度为275μmol/L的HEPES溶液，向上述96孔板中加入10μl/孔。之后向96孔板中加入与实施例1相同方法处理的Aβ42溶液10μl/孔。配置275μmol/L的ZnCl₂溶液，向上述96孔板中加入10μl/孔。最后空白对照孔中只加入HEPES缓冲液30μl/孔。最终每孔中I-HSA3的终浓度为25μmol/L，Zn²⁺的终浓度为25μmol/L，Aβ42的终浓度为25μmol/L，即Aβ42与Zn²⁺和I-HSA3浓度比为1：1:：1。细胞在培养箱中以5％CO₂，37℃条件培养24h后，加入10μL的MTT溶液，使得培养基中MTT的终浓度为0.5mg/ml。在5％CO₂，37℃条件下继续培养4h。

将96孔板以1500rpm的速度离心10min，离心后移除96孔板中溶液，每孔加入100μL的DMSO摇床震荡10min，检测570nm处吸光值。将培养基中仅含HEPES缓冲液的孔作为空白对照组，记为SH-SY5Y细胞活性为100％，然后将其作为对照计算加药组的细胞存活率(图10)。实验中每个实验组设置6个复孔。

由图10可知，Aβ42单独存在时，细胞存活率为67.4％。加入25μmol/L Zn²⁺后，细胞存活率降为52.3％，说明Zn²⁺可以显著增加Aβ42聚集体的细胞毒性。加入25μmol/L HSA后，细胞存活率提高到71.9％，而加入25μmol/L I-HSA后，细胞存活率提高到86.1％，这说明I-HSA在Zn²⁺存在条件下，能够有效抑制Aβ42聚集所产生的细胞毒性，体现了I-HSA对于金属的螯合功能。

实施例11：在Cu²⁺存在条件下，金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42共培养24h后培养物对SH-SY5Y的细胞存活率。

用实施例3中合成的I-HSA3来考察其对Aβ42聚集体细胞毒性的影响。

按照与实施例9相同的方法培养细胞，以5×10³cell/孔的细胞浓度加入到96孔板，每孔80μl。5％CO₂，37℃培养24h后进行细胞毒性实验。

配制I-HSA3浓度为275μmol/L的HEPES溶液，向上述96孔板中加入10μl/孔。之后向96孔板中加入与实施例1相同方法处理的Aβ42溶液10μl/孔。配置275μmol/L的CuCl₂溶液，向上述96孔板中加入10μl/孔。最后空白对照孔中只加入HEPES缓冲液30μl/孔。最终每孔中I-HSA3的终浓度为25μmol/L，Cu²⁺的终浓度为25μmol/L，Aβ42的终浓度为25μmol/L，即Aβ42与Cu²⁺和I-HSA3浓度比为1：1:：1。细胞在培养箱中以5％CO₂，37℃条件培养24h后，加入10μL的MTT溶液，使得培养基中MTT的终浓度为0.5mg/ml。在5％CO₂，37℃条件下继续培养4h。

将96孔板以1500rpm的速度离心10min，离心后移除96孔板中溶液，每孔加入100μL的DMSO摇床震荡10min，检测570nm处吸光值。将培养基中仅含HEPES缓冲液的孔作为空白对照组，记为SH-SY5Y细胞活性为100％，然后将其作为对照计算加药组的细胞存活率(图11)。实验中每个实验组设置6个复孔。

由图11可知，Aβ42单独存在时，细胞存活率为67.4％。加入25μmol/L Cu²⁺后，细胞存活率降为40.6％，说明Cu²⁺可以显著增加Aβ42聚集体的细胞毒性。加入25μmol/L HSA后，细胞存活率提高到71.7％，而加入25μmol/L I-HSA后，细胞存活率提高到85.6％，这说明I-HSA在Cu²⁺存在条件下，能够有效抑制Aβ42聚集所产生的细胞毒性，体现了I-HSA对于金属的螯合功能。

实施例12：金属螯合功能血清白蛋白与Aβ42共培养24h后培养物对SH-SY5Y的细胞活性氧水平变化。

用实施例3中合成的I-HSA3来考察其对Aβ42聚集体细胞毒性的影响。

按照与实施例9相同的方法培养细胞，以5×10³cell/孔的细胞浓度加入到96孔板，每孔80μl。5％CO₂，37℃培养24h后进行细胞毒性实验。

配制I-HSA3浓度为275μmol/L的HEPES溶液，向上述96孔板中加入10μl/孔。之后向96孔板中加入与实施例1相同方法处理的Aβ42溶液10μl/孔。配置275μmol/L的CuCl₂溶液，向上述96孔板中加入10μl/孔。最后空白对照孔中只加入HEPES缓冲液30μl/孔。最终每孔中I-HSA3的终浓度为25μmol/L，Cu²⁺的终浓度为25μmol/L，Aβ42的终浓度为25μmol/L，即Aβ42与Cu²⁺和I-HSA3浓度比为1：1:：1。细胞在培养箱中以5％CO₂，37℃条件培养24h。然后去掉上清液，加入100μl DCFH-DA(浓度为10μmol/L)，在培养箱中以5％CO₂，37℃条件培养30分钟。随后去掉上清液，用HEPES缓冲液反复洗涤细胞，去除细胞外的DCFH-DA，最后在488nm的激发波长，535nm的吸收波长下，检测细胞的荧光强度。将培养基中仅含HEPES缓冲液的孔作为空白对照组，记为SH-SY5Y细胞活性为100％，然后将其作为对照计算细胞的活性氧水平(图12)。实验中每个实验组设置6个复孔。

由图12可知，25μmol/L的I-HSA对细胞不会产生活性氧，是生物安全的。Aβ42单独存在时，细胞活性氧水平增加至124.8％。加入25μmol/L I-HSA后，细胞的活性氧水平减至107.9％，说明I-HSA可以有效抑制Aβ42自身聚集，从而降低其聚集所产生的活性氧水平。加入Aβ42和Cu²⁺的混合样品后，细胞活性氧水平显著增加至194.6％，说明Cu²⁺与Aβ42的作用过程中，可以显著增加Aβ42聚集产生的活性氧水平，从而增加Aβ42聚集产生的细胞毒性。加入25μmol/L I-HSA后，细胞活性氧水平降为138.4％，这说明I-HSA可以有效螯合Cu²⁺，从而降低Cu²⁺对于Aβ42聚集的影响，降低Aβ42聚集过程产生的活性氧水平，进一步降低所产生的细胞毒性。

本发明涉及了在血清白蛋白表面氨基上，通过化学修饰的方法修饰亚氨基二乙酸，从而提高其对于金属离子的螯合能力，制备得到金属螯合功能血清白蛋白的技术。公开了金属螯合功能血清白蛋白在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物的用途。多种实验手段证明，金属螯合功能血清白蛋白的空间结构和稳定性与天然血清白蛋白类似，说明这种修饰方法是一种温和有效的方法。此外多种实验手段证明金属螯合功能血清白蛋白不仅能够有效抑制Aβ42的自身聚集，还可以有效抑制金属离子存在下的Aβ42聚集；并能改变Aβ42的聚集路径以及聚集体的形态，并有效抑制Aβ42聚集体对细胞产生的毒性。金属螯合功能血清白蛋白作为一种潜在的新药，可以有效抑制Aβ42的自身聚集以及金属离子存在下的聚集过程，并降低Aβ42聚集过程中所产生的细胞毒性作用，是Aβ42聚集的理想抑制剂。

本发明提出了在血清白蛋白的基础上，通过化学修饰的方法，使其带有金属螯合功能，并带有更多的负电荷，制备得到金属螯合功能血清白蛋白，拥有良好的稳定性和生物相容性。并提出了金属螯合功能血清白蛋白在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物等方面的用途，并将其应用于Aβ42的构象变化、聚集和细胞毒性抑制实验，已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替代和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (10)

1.一种金属螯合功能血清白蛋白，其特征在于，在血清白蛋白表面的氨基上修饰1,4-丁二醇二缩水甘油醚，进而修饰亚氨基二乙酸，亚氨基二乙酸平均修饰数目介于2-40；结构如下：

2.权利要求1所述的金属螯合功能血清白蛋白制备方法，其特征在于：向溶解于硼酸-硼砂缓冲液中的血清白蛋白溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚液体，1,4-丁二醇二缩水甘油醚与血清白蛋白的摩尔比范围为1000～2000：1，然后再搅拌反应；除去未反应的1,4-丁二醇二缩水甘油醚后，向第一步反应产物中加入亚氨基二乙酸粉末，亚氨基二乙酸与血清白蛋白的摩尔比范围为5～400：1，然后再搅拌反应；除去游离亚氨基二乙酸得到分子结构稳定的金属螯合功能血清白蛋白。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：溶解于硼酸-硼砂缓冲液的血清白蛋白浓度为1～20mg/mL；缓冲液的pH 8.0～9.0。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚后的搅拌反应条件是在25℃～50℃条件下搅拌反应8～12h。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于加入亚氨基二乙酸粉末搅拌反应条件是在25℃～50℃条件下搅拌反应24～48h。

6.权利要求1所述的金属螯合功能血清白蛋白在制备抑制β-淀粉样蛋白自身聚集的药物中的 应用。

7.权利要求1所述的金属螯合功能血清白蛋白在制备抑制金属离子存在条件下β-淀粉样蛋白聚集的药物中的应用。

8.权利要求1所述的金属螯合功能血清白蛋白在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集、降低β-淀粉样蛋白聚集体的细胞毒性的药物中的 应用。

9.权利要求1所述的金属螯合功能血清白蛋白在制备治疗因β-淀粉样蛋白聚集的相关疾病的药物的应用。

10.权利要求1所述的金属螯合功能血清白蛋白在制备治疗因β-淀粉样蛋白聚集的阿尔兹海默病的药物的应用。

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