CN112274495A - 一种h2o2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法及其应用 - Google Patents

一种h2o2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法及其应用，可有效解决H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备，针对肿瘤进行钙超载、化疗、化学动力学治疗，促进肿瘤细胞凋亡的用药问题，所述的过氧化钙的粒径为50‑100nm、孔径为5‑8nm，将转铁蛋白通过静电吸附装载于过氧化钙的孔内，转铁蛋白带正电，过氧化钙与转铁蛋白的质量比为3‑5:1，再在转铁蛋白表面通过静电吸附负载小分子抗肿瘤药物姜黄素，得载药重量为30%～55%、粒径为55‑105nm的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒，本发明制备方法科学合理，稳定可靠，成本低，制得的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒在制备抗肿瘤药物方面可发挥三重打击交互综合治疗肿瘤的作用，增强抗肿瘤效果。

Description

一种H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法及其 应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是一种H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法及其应用。
背景技术
近年来，基于离子干扰疗法成为研究者们关注的热点，各种离子稳态平衡在人体内部细胞的代谢和增殖中起着举足轻重的作用。有研究表明，Ca2+是细胞的第二信使，参与细胞凋亡信号的传导。若使胞外Ca2+内流或者让胞内钙库释放，都会导致胞内钙超载。据报道，过氧化钙(CaO2)纳米粒可以在肿瘤的弱酸性环境下生成大量的Ca2+和H2O2，导致氧化应激和钙超载。Ca2+的异常累积不仅诱导细胞凋亡，而且还能促进肿瘤病灶区的钙化发展。然而，细胞的钙离子外排机制限制了该策略的应用。
姜黄素(CUR)作为经典的抗癌药物，可促进细胞内质网钙库释放Ca2+，并抑制Ca2+外排。将CUR引入CaO2中，可提高肿瘤细胞钙超载的效率，促进细胞凋亡，对肿瘤细胞起到“内服外用”的协同效果。转铁蛋白(Tf)是血浆中主要的铁传递蛋白，它能够与肿瘤细胞的转铁蛋白受体结合，从而主动靶向至肿瘤细胞。更重要的是，CaO2纳米粒崩解后产生的H2O2可以诱导细胞死亡从而破坏Tf结构，促使Tf中的的Fe3+释放，再与H2O2发生芬顿反应产生活性氧(ROS)对肿瘤进行化学动力学治疗。这样就能达到钙超载、化疗、化学动力学治疗等机制对肿瘤进行三重打击交互综合治疗的效果，但至今未见有H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法及其应用的公开报导。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法及其应用，可有效解决H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备，针对肿瘤进行钙超载、化疗、化学动力学治疗，促进肿瘤细胞凋亡的用药问题。
本发明解决的技术方案是，一种H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法，所述的过氧化钙(CaO2)的粒径为50-100nm、孔径为5-8nm，将转铁蛋白通过静电吸附装载于过氧化钙的孔内，转铁蛋白(Tf)带正电，过氧化钙(CaO2)与转铁蛋白(Tf)的质量比为3-5:1，再在转铁蛋白表面通过静电吸附负载小分子抗肿瘤药物姜黄素，得载药重量为30％～55％、粒径为55-105nm的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒，具体步骤如下：
(1)、在10-15mL的超纯水中加入1.5-2mg的氯化钙颗粒，1800-2200rpm搅拌使其溶解并过滤，滤液在室温搅拌下加入0.5-1.5M的氨水6-8mL，同时加入80-100mL的PEG800，继续搅拌使其混合均匀，然后向溶液加入5-7mL的质量浓度30％过氧化氢持续搅拌12h，再用氢氧化钠溶液逐步调pH至11.5，10000-15000rpm离心15min，弃去上清，得白色沉淀，白色沉淀用5-8mL无水乙醇洗涤3次，每次5-8min，干燥，得过氧化钙(CaO2)纳米粒；
(2)、将10-20mg过氧化钙(CaO2)纳米粒与5-10mg带正电的转铁蛋白加入20mlpH7.2-7.4的缓冲溶液中，混合搅拌22-26h，使转铁蛋白吸附在过氧化钙孔中，再在10000-15000rpm下离心10min，去除多余的转铁蛋白，用pH7.2-7.4的缓冲溶液10-14mL洗涤三次，每次10-12min，得过氧化钙转铁蛋白复合物(CaO2/Tf)；pH为7.2-7.4的缓冲液为PBS或MES的一种；
(3)、将步骤(2)中所得的5-10mg的过氧化钙转铁蛋白复合物(CaO2/Tf)溶于8-10mL的溶剂中，同时将1-3mg的姜黄素溶于1-3mL的溶剂中，然后将两者混合一起密封避光2000-2400rpm搅拌22-26h，用溶剂8-10mL洗涤三次，每次8-10min，得H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒；所述的溶剂为体积比乙醇︰水＝1-3︰1的溶液。
所述方法制备的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒在制备抗肿瘤的注射剂、口服剂或植入给药剂中的应用。
所述方法制备的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒在制备钙超载、化疗、化学动力学治疗三重打击交互综合治疗肿瘤药物中的应用。
本发明制备方法科学合理，稳定可靠，成本低，制得的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒在制备抗肿瘤药物方面可发挥三重打击交互综合治疗肿瘤的作用，增强抗肿瘤效果，是肿瘤治疗药物上的创新，经济和社会效益巨大。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，由以下实施例给出。
实施例1：
本发明在具体实施中，一种H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)、在12.5mL的超纯水中加入1.8mg的氯化钙颗粒，2000rpm搅拌使其溶解并过滤，滤液在室温搅拌下加入1M的氨水7mL，同时加入90mL的PEG800，继续搅拌使其混合均匀，然后向溶液加入6mL的质量浓度30％过氧化氢持续搅拌12h，再用氢氧化钠溶液逐步调pH至11.5，12500rpm离心15min，弃去上清，得白色沉淀，白色沉淀用7mL无水乙醇洗涤3次,每次7min，干燥，得过氧化钙(CaO2)纳米粒；
(2)、将15mg过氧化钙(CaO2)纳米粒与8mg带正电的转铁蛋白加入20ml pH7.3的PBS缓冲溶液中，混合搅拌24h，使转铁蛋白吸附在过氧化钙孔中，再在12500rpm下离心10min，去除多余的转铁蛋白，用pH7.3的PBS缓冲溶液12mL洗涤三次，每次11min，得过氧化钙转铁蛋白复合物(CaO2/Tf)；
(3)、将步骤(2)中所得的8mg的过氧化钙转铁蛋白复合物(CaO2/Tf)溶于9mL的溶剂中，同时将2mg的姜黄素溶于2mL的溶剂中，然后将两者混合一起密封避光2200rpm搅拌24h，用溶剂9mL洗涤三次，每次9min，得H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒；所述的溶剂为体积比乙醇︰水＝2︰1的溶液。
实施例2：
本发明在具体实施中，一种H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)、在10mL的超纯水中加入1.5mg的氯化钙颗粒，1800rpm搅拌使其溶解并过滤，滤液在室温搅拌下加入0.5M的氨水8mL，同时加入80mL的PEG800，继续搅拌使其混合均匀，然后向溶液加入5mL的质量浓度30％过氧化氢持续搅拌12h，再用氢氧化钠溶液逐步调pH至11.5，10000rpm离心15min，弃去上清，得白色沉淀，白色沉淀用5mL无水乙醇洗涤3次，每次5min，干燥，得过氧化钙(CaO2)纳米粒；
(2)、将10mg过氧化钙(CaO2)纳米粒与5mg带正电的转铁蛋白加入20ml pH7.2的MES缓冲溶液中，混合搅拌22h，使转铁蛋白吸附在过氧化钙孔中，再在10000rpm下离心10min，去除多余的转铁蛋白，用pH7.2的MES缓冲溶液10mL洗涤三次，每次10min，得过氧化钙转铁蛋白复合物(CaO2/Tf)；
(3)、将步骤(2)中所得的5mg的过氧化钙转铁蛋白复合物(CaO2/Tf)溶于8mL的溶剂中，同时将1mg的姜黄素溶于1mL的溶剂中，然后将两者混合一起密封避光2000rpm搅拌26h，用溶剂8mL洗涤三次，每次8min，得H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒；所述的溶剂为体积比乙醇︰水＝1︰1的溶液。
实施例3：
本发明在具体实施中，一种H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)、在15mL的超纯水中加入2mg的氯化钙颗粒，2200rpm搅拌使其溶解并过滤，滤液在室温搅拌下加入1.5M的氨水6mL，同时加入100mL的PEG800，继续搅拌使其混合均匀，然后向溶液加入7mL的质量浓度30％过氧化氢持续搅拌12h，再用氢氧化钠溶液逐步调pH至11.5，15000rpm离心15min，弃去上清，得白色沉淀，白色沉淀用8mL无水乙醇洗涤3次，每次8min，干燥，得过氧化钙(CaO2)纳米粒；
(2)、将20mg过氧化钙(CaO2)纳米粒与10mg带正电的转铁蛋白加入20ml pH7.4的PBS缓冲溶液中，混合搅拌26h，使转铁蛋白吸附在过氧化钙孔中，再在15000rpm下离心10min，去除多余的转铁蛋白，用pH7.4的PBS缓冲溶液14mL洗涤三次，每次12min，得过氧化钙转铁蛋白复合物(CaO2/Tf)；
(3)、将步骤(2)中所得的10mg的过氧化钙转铁蛋白复合物(CaO2/Tf)溶于10mL的溶剂中，同时将3mg的姜黄素溶于3mL的溶剂中，然后将两者混合一起密封避光2400rpm搅拌22h，用溶剂10mL洗涤三次，每次10min，得H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒；所述的溶剂为体积比乙醇︰水＝3︰1的溶液。
要指出的是，以上所述仅为本发明的实施例，是用于说明本发明的具体实施情况，并不是用以限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何等同或等效的修改和替代，在本质上与本发明的技术方案相同，均包含在本发明的保护范围内。
本发明制备方法科学合理，原料易得，易生产制备，方法稳定可靠，产品质量好，并经科学试验，本发明所制得的H2O2自供型过氧化钙/姜黄素纳米粒的制备方法稳定可靠，过氧化钙提供的H2O2增强转铁蛋白的芬顿反应产生活性氧，同时产生大量的钙离子对细胞进行离子干扰，姜黄素的引入协同抑制钙离子外排从而加强癌细胞的钙超载。制备抗肿瘤药物方面可发挥三重打击交互综合治疗肿瘤的作用，与传统化疗相比具有高效、毒副作用小的优势，有关实验资料如下(以实施例1为例)：
一、H2O2自供型过氧化钙/姜黄素纳米粒的表征实验
1、H2O2自供型过氧化钙/姜黄素纳米粒中姜黄素含量的测定：
采用紫外分光光度法，于440nm波长处测定姜黄素的含量，以公式(1)计算样品的载药量，载药量达到30％-55％，实施例1给出的产品，经多次测试，载药量平均达到50％。
Figure BDA0002754665020000041
2、H2O2自供型过氧化钙/姜黄素纳米粒的粒径和电位的测定：
取适量H2O2自供型过氧化钙/姜黄素纳米粒分散于水中，用Nano-ZS90型激光纳米粒度分析仪测得CaO2和CaO2/Tf/CUR的粒径和电位分别为93nm、101nm和-23.5±1.2mV、-5.9±0.3mV。
3、H2O2自供型过氧化钙/姜黄素纳米粒的孔径测定：
取适量CaO2粉末均匀的分散于水中，用ASAP 2020型全自动比表面及孔隙度分析仪并通过BJH算法测得其孔径为6.8nm。
二、H2O2自供型过氧化钙/姜黄素纳米粒在体外产生钙离子实验
选择对数生长期的4T1鼠乳腺癌细胞，调整细胞数为3×105/ml接种于6孔培养板，每孔2ml，细胞贴壁生长24h后加药，依次为空白组、CaO2组、CUR组、CaO2/Tf/CUR组，其中CaO2终浓度设为50μg/ml，培养24h后，弃去旧培养液，每孔用新鲜的PBS洗2～3遍，每孔加1ml钙离子探针培养基，37℃培养1h后，用新鲜的PBS洗2～3遍，在显微镜下观察，结果发现除空白组外，其余组均检测到绿色的钙离子荧光信号，尤以CaO2/Tf/CUR组结果最亮，该结果与文献报道一致，CaO2可释放大量的钙离子，而CUR也可抑制钙离子外排从而增加胞内钙离子水平，CaO2/Tf/CUR结合两者的效应从而检测到强烈的荧光。
三、H2O2自供型过氧化钙/姜黄素纳米粒的细胞摄取实验
选择对数生长期的4T1鼠乳腺癌细胞，调整细胞数为3×105/ml接种于6孔培养板，每孔2ml，贴壁生长24h后加药，依次为CUR组、CaO2/Tf/CUR组，药物终浓度设为3μg/ml，孵育时间设为0.5h，1h，4h，加药后在37℃，5％CO2条件下培养后，将孔内含药培养基弃去，每孔用1ml PBS洗2～3遍，加入500μl不含EDTA的胰酶消化细胞，加1ml新鲜培养基终止消化，直至细胞与壁分离，将细胞悬液移入10ml离心管中，离心弃去上清，加PBS重悬，用流式细胞仪测定，发现4T1鼠乳腺癌细胞0.5h对CUR、CaO2/Tf/CUR的摄取量分别为：38.6％、20.1％；1h时的摄取量分别为：84.3％、37.9％；4h时的摄取量分别为：99.0％、95.9％。结果表明，小分子原料药CUR细胞摄取最快，1h时细胞对其摄取量几近饱和；而CaO2/Tf/CUR纳米制剂的分子量较大，细胞摄取较慢，4h时4T1鼠乳腺癌细胞对CUR和CaO2/Tf/CUR摄取量基本相同。
四、H2O2自供型过氧化钙/姜黄素纳米粒的细胞增殖抑制实验
采用MTT法，选择对数生长期的4T1鼠乳腺癌细胞，调整细胞数为5×104/ml接种于96孔培养板，细胞贴壁生长24h后加药，依次为空白组、CaO2组、CUR组、CaO2/Tf/CUR组，其中药物终浓度设为65μg/ml；加过药的细胞在37℃，5％CO2的环境中孵育24h后，每孔加入25μl新鲜配制并过滤后的5mg/mL的MTT，放入培养箱避光孵育4h后取出，吸出孔内全部液体甩干，每孔加入150μl的DMSO，放入摇床微振荡，在37℃以100rpm微震荡10min后，于酶标仪490nm波长处测每个小孔的OD值，计算肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％，计算得到CaO2组、CUR组、CaO2/Tf/CUR组细胞生长抑制率分别为：32.5％，36.2％，82.0％。结果表明，CaO2和CUR组对细胞有一定的毒性，但两者结合以后增加抗肿瘤效应，不仅如此，随着Tf的加入会产生芬顿反应，抗肿瘤效应也更强，该实验说明CaO2/Tf/CUR组可极大的发挥抗肿瘤效应，是钙超载、化疗、化学动力学治疗作用的协同治疗结果。
五、H2O2自供型过氧化钙/姜黄素纳米粒的药效学研究实验
购买4-6周龄的雌性Balb/c小鼠，在小鼠的右上肢背部皮下接种4T1鼠乳腺癌细胞，7天后测量肿瘤体积，取肿瘤体积≥100mm3且肿瘤体积和体重相似的小鼠，将其随机分为4组，每组6只，具体分组如下：生理盐水组、CaO2组、CUR组、CaO2/Tf/CUR组；各组小鼠的给药方式均采用尾静脉注射，每两天一次，共给药7次，整个实验过程中保证小鼠每日正常饮食，每两天称量每只小鼠的体重，并使用数显游标卡尺测量荷瘤小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积V＝A×B2/2计算肿瘤体积。记录的数据显示，CaO2组、CUR组、CaO2/Tf/CUR组的抑瘤率分别为26.54％，29.72％，83.75％。结果表明，CaO2/Tf/CUR组的药效显著，可极大抑制肿瘤生长。该实验证明了该肿瘤靶向给药系统的基于钙超载、化疗、化学动力学治疗相结合协同治疗效果。
按上述方法，对本发明实施例2-3进行了实验，均取得了相同或相近似的结果，这里不再一一列举。
由以上可以清楚的看出，本发明方法稳定可靠，产品质量好，载药量高达50％左右，与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：
(1)、本发明提供的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒，选择转铁蛋白(Tf)带正电，静电吸附保证物理连接的稳定，并与过氧化钙产生的过氧化氢发生芬顿反应提高活性氧的量；
(2)、本发明提供的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒将化疗、钙超载、以及化学动力学疗法集合在一起，针对肿瘤进行三重打击交互综合治疗，增强抗肿瘤治疗效果，疗效高达83％以上，远优于现有同类产品的疗效，是肿瘤治疗药物上的创新，经济和社会效益巨大。

Claims (6)

1.一种H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的过氧化钙（CaO2）的粒径为50-100nm、孔径为5-8nm，将转铁蛋白通过静电吸附装载于过氧化钙的孔内，转铁蛋白（Tf）带正电，过氧化钙（CaO2）与转铁蛋白（Tf）的质量比为3-5:1，再在转铁蛋白表面通过静电吸附负载小分子抗肿瘤药物姜黄素，得载药重量为30%～55%、粒径为55-105nm的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒，具体步骤如下：
（1）、在10-15mL的超纯水中加入1.5-2mg的氯化钙颗粒，1800-2200rpm搅拌使其溶解并过滤，滤液在室温搅拌下加入0.5-1.5M的氨水6-8mL，同时加入80-100mL的PEG800，继续搅拌使其混合均匀，然后向溶液加入5-7mL的质量浓度30%过氧化氢持续搅拌12h，再用氢氧化钠溶液逐步调pH至11.5，10000-15000rpm离心15min，弃去上清，得白色沉淀，白色沉淀用5-8 mL无水乙醇洗涤3次，每次5-8 min，干燥，得过氧化钙（CaO2）纳米粒；
（2）、将10-20mg过氧化钙（CaO2）纳米粒与5-10mg带正电的转铁蛋白加入20ml pH7.2-7.4的缓冲溶液中，混合搅拌22-26h，使转铁蛋白吸附在过氧化钙孔中，再在10000-15000rpm下离心10min，去除多余的转铁蛋白，用pH7.2-7.4的缓冲溶液10-14 mL洗涤三次，每次10-12 min，得过氧化钙转铁蛋白复合物（CaO2/Tf）；pH为7.2-7.4的缓冲液为PBS或MES的一种；
（3）、将步骤（2）中所得的5-10mg的过氧化钙转铁蛋白复合物（CaO2/Tf）溶于8-10mL的溶剂中，同时将1-3mg的姜黄素溶于1-3mL的溶剂中，然后将两者混合一起密封避光2000-2400rpm搅拌22-26h，用溶剂8-10 mL洗涤三次，每次8-10 min，得H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒；所述的溶剂为体积比乙醇︰水=1-3︰1的溶液。
2.根据权利要求1所述的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、在12.5mL的超纯水中加入1.8mg的氯化钙颗粒，2000rpm搅拌使其溶解并过滤，滤液在室温搅拌下加入1M的氨水7mL，同时加入90mL的PEG800，继续搅拌使其混合均匀，然后向溶液加入6mL的质量浓度30%过氧化氢持续搅拌12h，再用氢氧化钠溶液逐步调pH至11.5，12500rpm离心15min，弃去上清，得白色沉淀，白色沉淀用7 mL无水乙醇洗涤3次,每次7min，干燥，得过氧化钙（CaO2）纳米粒；
（2）、将15mg过氧化钙（CaO2）纳米粒与8mg带正电的转铁蛋白加入20ml pH7.3的PBS缓冲溶液中，混合搅拌24h，使转铁蛋白吸附在过氧化钙孔中，再在12500rpm下离心10min，去除多余的转铁蛋白，用pH7.3的PBS缓冲溶液12 mL洗涤三次，每次11 min，得过氧化钙转铁蛋白复合物（CaO2/Tf）；
（3）、将步骤（2）中所得的8mg的过氧化钙转铁蛋白复合物（CaO2/Tf）溶于9mL的溶剂中，同时将2mg的姜黄素溶于2mL的溶剂中，然后将两者混合一起密封避光2200rpm搅拌24h，用溶剂9 mL洗涤三次，每次9 min，得H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒；所述的溶剂为体积比乙醇︰水=2︰1的溶液。
3.根据权利要求1所述的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、在10mL的超纯水中加入1.5mg的氯化钙颗粒，1800rpm搅拌使其溶解并过滤，滤液在室温搅拌下加入0.5M的氨水8mL，同时加入80mL的PEG800，继续搅拌使其混合均匀，然后向溶液加入5mL的质量浓度30%过氧化氢持续搅拌12h，再用氢氧化钠溶液逐步调pH至11.5，10000rpm离心15min，弃去上清，得白色沉淀，白色沉淀用5 mL无水乙醇洗涤3次，每次5min，干燥，得过氧化钙（CaO2）纳米粒；
（2）、将10mg过氧化钙（CaO2）纳米粒与5mg带正电的转铁蛋白加入20ml pH7.2的MES缓冲溶液中，混合搅拌22h，使转铁蛋白吸附在过氧化钙孔中，再在10000rpm下离心10min，去除多余的转铁蛋白，用pH7.2的MES缓冲溶液10 mL洗涤三次，每次10 min，得过氧化钙转铁蛋白复合物（CaO2/Tf）；
（3）、将步骤（2）中所得的5mg的过氧化钙转铁蛋白复合物（CaO2/Tf）溶于8mL的溶剂中，同时将1mg的姜黄素溶于1mL的溶剂中，然后将两者混合一起密封避光2000rpm搅拌26h，用溶剂8 mL洗涤三次，每次8 min，得H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒；所述的溶剂为体积比乙醇︰水=1︰1的溶液。
4.根据权利要求1所述的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、在15mL的超纯水中加入2mg的氯化钙颗粒，2200rpm搅拌使其溶解并过滤，滤液在室温搅拌下加入1.5M的氨水6mL，同时加入100mL的PEG800，继续搅拌使其混合均匀，然后向溶液加入7mL的质量浓度30%过氧化氢持续搅拌12h，再用氢氧化钠溶液逐步调pH至11.5，15000rpm离心15min，弃去上清，得白色沉淀，白色沉淀用8 mL无水乙醇洗涤3次，每次8min，干燥，得过氧化钙（CaO2）纳米粒；
（2）、将20mg过氧化钙（CaO2）纳米粒与10mg带正电的转铁蛋白加入20ml pH7.4的PBS缓冲溶液中，混合搅拌26h，使转铁蛋白吸附在过氧化钙孔中，再在15000rpm下离心10min，去除多余的转铁蛋白，用pH7.4的PBS缓冲溶液14 mL洗涤三次，每次12 min，得过氧化钙转铁蛋白复合物（CaO2/Tf）；
（3）、将步骤（2）中所得的10mg的过氧化钙转铁蛋白复合物（CaO2/Tf）溶于10mL的溶剂中，同时将3mg的姜黄素溶于3mL的溶剂中，然后将两者混合一起密封避光2400rpm搅拌22h，用溶剂10 mL洗涤三次，每次10 min，得H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒；所述的溶剂为体积比乙醇︰水=3︰1的溶液。
5.权利要求1-4任一项所述方法制备的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒在制备抗肿瘤的注射剂、口服剂或植入给药剂中的应用。
6.权利要求1-4任一项所述方法制备的H2O2自供型过氧化钙负载姜黄素纳米粒在制备钙超载、化疗、化学动力学治疗三重打击交互综合治疗肿瘤药物中的应用。
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