CN1376919A - 一种用醋酸纤维丝制备金属螯合亲和色谱介质的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用醋酸纤维丝制备金属螯合亲和色谱介质的方法。将醋酸纤维丝基材浸入浓度为0.5～1M的碱溶液中,加环氧氯丙烷或1,4－丁二醇二缩水甘油醚、再加硼氢化钠,制成活化液,室温反应18～30小时,洗涤至pH值为中性;加浓度1.0～12M的碳酸盐,加配亚氨基二乙酸制成偶联液,55～65℃下反应10～24小时,洗涤至pH值为中性;再加入40～60mM硫酸铜溶液或氯化铜溶液,室温下吸附30min～20小时,洗涤4～6次。它价格低、负载量高、生物相容性好、可反复利用。
Description
本发明涉及亲和色谱，具体地说是一种用醋酸纤维丝制备金属螯合亲和色谱介质的方法。
在现有技术中，在基因工程产品的生产中，分离纯化的费用常常占生产成本中的主要部分，采用亲和色谱，可以大大降低基因工程产品的费用，提高产品的纯度和收率。亲和色谱是进行蛋白质及多肽、糖类、抗原抗体、生化药物、基因工程产品纯化分离的最有效的手段，作为金属螯合亲和色谱的介质，目前主要有琼脂糖，颗粒状的纤维素，交联琼脂糖，聚丙烯或聚丙烯酰胺，玻璃中空纤维微孔滤膜，分析滤纸等，文献1：乔·利西恩·等，固定化金属离子亲和色谱中配体密度对分离人生长激素的影响，《色谱杂志A》，764：27-33，1997(J.Liesieneet al.，Immobilized metal affinity chromatography of human growth hormone-Effect ofligand density.J.Chromatogr，A，764：27-33，1997)公开报道了一种利用琼脂糖(Sepharose FF)固定化金属亲和介质，螯合铜离子，纯化重组人生长激素(Somatotropin)的方法。文献2：魏琪，姚汝华，鲍时祥，固定化金属螯合亲和膜色谱柱制备及纯化铜锌超氧化物酶的研究，《色谱》18(4)：361-363，2000，公开报道了一种纤维素分析滤纸为介质，螯合铜离子，亲和纯化溶菌酶的技术路线。文献3：奥·维·帕特沃德汗和马·墨·阿特艾，固定化金属离子亲和色谱中结合位点和pH对牛血清白蛋白亲和容量的影响，《色谱杂志A》，767：11-23，1997(A.V.Patwardhan M.M.Ataai.，Site accessibility and the pH dependence of thesaturation capacity of a highly cross-linked matrix immobilized metal affinitychromatography of bovine serum albumin on chelating superose..J.Chromtogr.A，767：11-23，1997)，公开报道了一种用Sepharose FF固定化金属亲和介质，螯合铜离子，研究该介质对牛血清白蛋白的亲和能力。根据西格马《生化试剂与一般试剂》2000-2001(Sigma，“Biochemicals and Reagents”，2000-2001)报道，采用Pharmacia公司生产的琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B为基质材料，经环氧氯丙烷活化、偶联亚氨基二乙酸，螯合金属铜离子，其铜离子负载量为50～100微摩尔/克介质；A.V.Patwardhan等利用Sepharose FF固定化金属亲和介质，螯合铜离子，研究了该介质对牛血清白蛋白的亲和能力，在pH5～7范围内，饱和吸附量为140毫克/克介质。然而，目前一般使用的介质或是价格昂贵，或是负载量低。
本发明的目的是提供一种价格低、负载量高、生物相容性好、可反复利用的用醋酸纤维丝制备金属螯合亲和色谱介质的方法。
本发明的技术方案是按如下步骤操作：
(1)取醋酸纤维丝基材，对其进行活化：将醋酸纤维丝基材，浸入浓度为0.5～1M的碱溶液中，加入环氧氯丙烷或1，4-丁二醇二缩水甘油醚、再加入硼氢化钠，制成活化液，室温下反应18～30小时，或55～65℃情况下反应1～4小时，来活化醋酸纤维丝上的羟基，洗涤至pH值为中性；其中醋酸纤维丝基材与加入的活化液重量比例为0.1～10∶10～50；
(2)制备醋酸纤维丝金属螯合介质：加入偶联金属螯合剂，用浓度1.0～12M的碳酸盐，加配亚氨基二乙酸或亚氨基三乙酸制成偶联液，55～65℃下反应10～24小时，洗涤至pH值为中性；其中醋酸纤维丝基材与偶联液重量比例为0.1～10∶10～50；
(3)制备醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质：将上述中间产品醋酸纤维丝金属螯合介质，加入40～60mM硫酸铜溶液或氯化铜溶液，室温下吸附30min～20小时，洗涤4～6次即可，其中：醋酸纤维丝金属螯合介质与硫酸铜溶液或氯化铜溶液的重量比例为0.1～10∶10～50；
所述醋酸纤维丝基材为醋酸纤维丝本身、醋酸纤维丝的填充物、醋酸纤维丝经物理加工制成的滤棒、滤饼、滤纸、滤膜；
所述活化液中碱溶液与环氧氯丙烷或1，4-丁二醇二缩水甘油醚的体积百分比为：10～30％环氧氯丙烷或1，4-丁二醇二缩水甘油醚，余量为碱溶液，再加入活化液重量的0.1～0.3％硼氢化钠；所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾；
所述偶联液中碳酸盐与亚氨基二乙酸或亚氨基三乙酸的摩尔比例为20～30∶1～3；所述碳酸盐为碳酸钾、碳酸钠或碳酸氢钠。
本发明原理如下：
本发明所述环氧氯丙烷或1，4-丁二醇二缩水甘油醚首先与醋酸纤维丝上的羟基共价连接，形成含有单环氧环的介质，然后再与亚氨基二乙酸或亚氨基三乙酸上的亚氨基共价反应，形成稳定的共价交联介质；本发明所述醋酸纤维丝滤棒：醋酸纤维素制成，成型时加固化剂以使粘附，并提高吸附力，易润湿于水溶液中。长100毫米，直径7.7毫米，重0.615克，吸阻2100～2300帕。横断剪开，纤维不松散，无毛刺，相互缠绕，但经5M NaOH浸泡3天，产生大量小纤维，松散。
本发明具有如下优点：
1.生物相容性好。采用本发明方法，以醋酸纤维丝为基材制成的金属螯合亲和色谱介质，对铜离子的负载量高达92.1微摩尔/克介质，与现有技术中的负载量相当；对牛血清白蛋白进行了亲和能力的考察，亲和吸附量可达59毫克/克介质。
2.采用本发明方法制成的金属螯合亲和色谱介质成本低，每克成本低于1元，而每克琼脂糖凝胶大于需20元，可反复利用。
3.应用范围广。采用本发明方法所得的金属螯合亲和色谱介质，是一种带通用型配基的亲和色谱介质，它利用铜、锌、钴、镍等金属离子与蛋白质或多肽表面上的组氨酸、半胱氨酸或色氨酸的配位螯合作用，达到亲和纯化的效果，因此可用来纯化蛋白质，它不仅可应用于牛血清白蛋白、天然蛋白质、天然多肽、天然含组氨酸、半胱氨酸或色氨酸的生物物质的亲和纯化，还可应用于亲和色谱操作，其对象是基因工程蛋白质、基因工程多肽、含组氨酸、半胱氨酸或色氨酸的基因工程小肽，或含组氨酸、半胱氨酸或色氨酸的基因工程生物物质。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
取醋酸纤维丝基材，对其进行活化：取四份香烟过滤嘴的醋酸纤维丝滤棒，每份重0.126克，加入15毫升活化液(含0.6M氢氧化钠13毫升，1，4-丁二醇二缩水甘油醚2毫升，活化液重量的0.2％硼氢化钠)的锥形瓶中，室温下振荡10小时，来活化醋酸纤维丝上的羟基；滤棒用大量蒸馏水洗涤至pH中性；
制备醋酸纤维丝金属螯合介质：加入15毫升偶联金属螯合液，具体为：用2M碳酸钾15毫升，加入0.20克亚氨基二乙酸，60℃反应24小时，滤棒用大量蒸馏水洗涤至pH中性；
制备醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质：将上述中间产品醋酸纤维丝金属螯合介质，加入50mM硫酸铜溶液20毫升，室温下振荡过夜，吸附10小时；滤棒经蒸馏水洗涤5次后，即得到醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质。
将上述方法所得的醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质1份，经0.2M pH5.0柠檬酸缓冲液洗脱铜离子，采用2-[(5-溴-2-吡啶)偶氮]-5-二乙氨基苯酚显色、560nm吸光度法测定铜离子的含量，结果表明：醋酸纤维丝上螯合的铜离子的量为66.7微摩尔/克介质；
用上述方法所得的醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质1份进行亲和纯化：经0.02M pH7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(含0.5M氯化钠)洗涤一次，加入5毫升2毫克/毫升的牛血清白蛋白溶液，室温下放置过夜，用0.02M pH7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(含0.5M氯化钠)洗涤六次，以6毫升50mM乙二胺四乙酸钠(0.02M pH7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，0.5M氯化钠)洗脱，采用考马斯亮兰染色法、在595nm测定洗脱液中牛血清白蛋白的含量。经计算，所述醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质对牛血清白蛋白的亲和吸附量为54.4毫克/克介质。
其操作方式为间歇式，所采用的亲和色谱装置为填充柱。
实施例2
取醋酸纤维丝基材，对其进行活化：取四份香烟过滤嘴的醋酸纤维丝滤棒，每份重0.120克，加入含14毫升活化液(含0.5M氢氧化钾12.5毫升，环氧氯丙烷1.5毫升，活化液重量的0.1％硼氢化钾)的锥形瓶中，室温下振荡20小时，来活化醋酸纤维上的羟基；滤饼用大量蒸馏水洗涤至pH中性；
制备醋酸纤维丝金属螯合介质，加入15毫升偶联金属螯合液：用浓度5M的碳酸钠15毫升，加入0.20克亚氨基三乙酸，60℃反应24小时，滤棒用大量蒸馏水洗涤至pH中性；
制备醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质：将上述中间产品醋酸纤维金属螯合介质，加入50mM硫酸铜溶液20毫升，室温下振荡过夜，滤棒经蒸馏水洗涤5次后，即得到醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质。
将上述方法所得的醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质1份，经0.2M pH5.0柠檬酸缓冲液洗脱铜离子，采用2-[(5-溴-2-吡啶)偶氮]-5-二乙氨基苯酚显色、560nm吸光度法测定铜离子的含量，结果表明：醋酸纤维丝上螯合的铜离子的量为92.1微摩尔/克介质；
用上述方法所得的醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质1份进行亲和纯化：经0.02M pH7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(含0.5M氯化钠)洗涤一次，加入5毫升2毫克/毫升的天然蛋白质溶液，室温下放置过夜，用0.02M pH7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(含0.5M氯化钠)洗涤六次，以6毫升50mM乙二胺四乙酸钠(0.02M pH7.0磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，0.5M氯化钠)洗脱，采用考马斯亮兰染色法、在595nm测定洗脱液中牛血清白蛋白的含量。经计算，所述醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质对牛血清白蛋白的亲和吸附量为59毫克/克介质。
其操作方式为连续式，所采用的亲和色谱装置为过滤器。
实施例3
与实施例1不同之处在于：
取醋酸纤维丝基材，对其进行活化：取香烟过滤嘴的醋酸纤维丝滤棒，重5克，加入含50毫升活化液(含1.0M氢氧化钾45毫升，环氧氯丙烷5毫升，活化液重量的0.1％硼氢化钾)的锥形瓶中，55℃下反应1小时，来活化醋酸纤维上的羟基；滤饼用大量蒸馏水洗涤至pH中性；
制备醋酸纤维金属螯合介质，加入50毫升偶联金属螯合液：用浓度5M的碳酸钠50毫升，加入5克亚氨基三乙酸，65℃反应20小时，滤棒用大量蒸馏水洗涤至pH中性；
制备醋酸纤维金属螯合亲和色谱介质：将上述中间产品醋酸纤维金属螯合介质，加入40mM硫酸铜溶液50毫升，室温下吸附20小时，滤棒经蒸馏水洗涤6次后，即得到醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质。
实施例4
与实施例1不同之处在于：
(1)取醋酸纤维丝为基材，对其进行活化：取香烟过滤嘴的醋酸纤维丝滤饼，重10克，加入含50毫升活化液(含0.6M氢氧化钾35毫升，1，4-丁二醇二缩水甘油醚15毫升，活化液重量的0.3％硼氢化钾)的锥形瓶中，50℃反应4小时，来活化醋酸纤维上的羟基；滤膜用大量蒸馏水洗涤至pH中性；
(2)制备醋酸纤维金属螯合介质：加入50毫升偶联金属螯合液，具体为：用浓度12M的碳酸钾50毫升，加入8克亚氨基二乙酸，55℃反应11小时，滤棒用大量蒸馏水洗涤至pH中性；
(3)制备醋酸纤维金属螯合亲和色谱介质：将上述中间产品醋酸纤维金属螯合介质，加入60mM氯化铜溶液50毫升，室温下，吸附30分钟，滤棒经蒸馏水洗涤4次后，即得到醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质。
另外，本发明所述醋酸纤维丝基材还可以是醋酸纤维丝本身或其他醋酸纤维丝的填充物、醋酸纤维丝经物理加工制成的滤纸、滤膜；本发明制备醋酸纤维金属螯合介质时也可在加入偶联金属螯合剂使用碳酸氢钠；本发明还可用于天然蛋白质、天然多肽、天然含组氨酸、半胱氨酸或色氨酸的生物物质的亲和纯化；采用所述的醋酸纤维丝金属螯合介质进行亲和色谱操作，其对象还可以是基因工程蛋白质、基因工程多肽、含组氨酸、半胱氨酸或色氨酸的基因工程小肽，或含组氨酸、半胱氨酸或色氨酸的基因工程生物物质；其操作方式还可以为半连续式，所采用的亲和色谱装置还可以为过滤板或含有上述介质的其它容器。
Claims (6)
1.一种用醋酸纤维丝制备金属螯合亲和色谱介质的方法，其特征在于按如下步骤操作：
(1)取醋酸纤维丝基材，对其进行活化：将醋酸纤维丝基材，浸入浓度为0.5～1M的碱溶液中，加入环氧氯丙烷或1，4-丁二醇二缩水甘油醚、再加入硼氢化钠，制成活化液，室温下反应18～30小时，或55～65℃情况下反应1～4小时，来活化醋酸纤维丝上的羟基，洗涤至pH值为中性；其中醋酸纤维丝基材与加入的活化液重量比例为0.1～10∶10～50；
(2)制备醋酸纤维丝金属螯合介质：偶联金属螯合剂，用浓度1.0～12M的碳酸盐，加配亚氨基二乙酸或亚氨基三乙酸制成偶联液，55～65℃下反应10～24小时，洗涤至pH值为中性；其中醋酸纤维丝基材与偶联液重量比例为0.1～10∶10～50；
(3)制备醋酸纤维丝金属螯合亲和色谱介质：将上述中间产品醋酸纤维丝金属螯合介质，加入40～60mM硫酸铜溶液或氯化铜溶液，室温下吸附30min～20小时，洗涤4～6次即可，其中：醋酸纤维丝金属螯合介质与硫酸铜溶液或氯化铜溶液的重量比例为0.1～10∶10～50。
2.按照权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述醋酸纤维丝基材为醋酸纤维丝本身、醋酸纤维丝的填充物、醋酸纤维丝经物理加工制成的滤棒、滤饼、滤纸、滤膜。
3.按照权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述活化液中碱溶液与环氧氯丙烷或1，4-丁二醇二缩水甘油醚的体积百分比为：10～30％环氧氯丙烷或1，4-丁二醇二缩水甘油醚，余量为碱溶液，再加入活化液重量的0.1～0.3％硼氢化钠。
4.按照权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述偶联液中碳酸盐与亚氨基二乙酸或亚氨基三乙酸的摩尔比例为20～30∶1～3。
5.按照权利要求4所述制备方法，其特征在于：所述碳酸盐为碳酸钾、碳酸钠或碳酸氢钠。
6.按照权利要求1或3所述制备方法，其特征在于：所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾。
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