CN102998444B

CN102998444B - IgG抗体在聚苯乙烯载体表面的立体定向固定方法

Info

Publication number: CN102998444B
Application number: CN201210242914.XA
Authority: CN
Inventors: 杨洪鸣; 唐金宝; 梁淑娟; 陈永
Original assignee: Weifang Medical University
Current assignee: Weifang Medical University
Priority date: 2012-07-15
Filing date: 2012-07-15
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2032-07-15
Also published as: CN102998444A

Abstract

本发明公开了一种IgG抗体立体定向固定技术，可实现聚苯乙烯载体表面所固定IgG抗体是均一、Fab段充分暴露及保持高抗原结合活性的IgG抗体，能有效提高固相免疫分析的灵敏性、特异性与稳定性。本发明构建的IgG抗体特异性立体定向固定具体技术如下：利用化学修饰方法在聚苯乙烯表面接入“金属离子手臂”，并以基因工程技术构建表达带Histag的ZZ亲和肽，基于Histag与金属离子亲和特性介导ZZ亲和肽定向固定在聚苯乙烯表面，进而发挥ZZ亲和肽免疫学性质，特异性结合IgG抗体的Fc段，获得生物亲和模式的金属离子–(ZZ-His)–Fc组装体，实现IgG抗体Fab端的立体定向固定。

Description

IgG抗体在聚苯乙烯载体表面的立体定向固定方法

技术领域

本发明属于免疫分析领域，具体的说是涉及抗体在载体表面的立体定向化固定，以保持其抗原结合位点充分向空间暴露，提高固相免疫分析的灵敏性、特异性与稳定性。

背景技术

固相免疫测定技术是临床免疫学检验的重要组成部分，如经典的酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA ）及免疫传感器、免疫诊断芯片等新技术，其应用基础是将抗原或抗体包被在固相载体上进行免疫测定，一般包被抗体更为常用。抗体在载体表面固定后的空间构型、数量及免疫学活性是影响固相免疫测定技术稳定性、灵敏度和选择性的关键因素，理想的抗体固定化技术是将抗体的Fc段固定在载体表面，使得Fab端从载体的表面充分向空间展示，且抗原结合活性得以完好保持。

目前抗体在固相载体表面固相化方法主要有物理吸附法、化学共价交联法及捕获间接包被法等方法。

物理吸附法：免疫分析体系中蛋白质在无共价键与固相材料结合的情况下，蛋白质分子结构的疏水基团与固相载体表面疏水基团通过物理吸附结合，这种吸附是非特异性的，存在吸附量少且受蛋白质分子量、等电点、浓度等因素影响，蛋白质分子内疏水基团数量不同，其吸附能力存在差异。

化学共价交联法：化学共价法是目前提高固相材料抗体结合能力相对有效的方法，主要是通过对聚苯乙烯（Polystyrene, PS）载体表面的改性或修饰，引入双功能偶联剂、-NH₂等活性基团，或紫外线（UV）、γ 射线（⁶⁰Co）等辐照物理方式处理使PS 微孔板表面生成-OH、-CHO、-COOH 等基团，使生物分子吸附到PS 表面过程由被动的物理吸附变成了共价偶联。共价键依靠不同分子间活性基团的化学反应产生的强相互作用力，理论上只要带有合适的活性基团，大分子、小分子和亲水性生物活性分子都能通过共价键牢固地结合在固相表面，如丹麦NUNC 公司的氨基化PS 微孔板及美国康宁公司的琥珀酰亚胺脂活化酶标板，有效提高了固相抗体（抗原）的结合量。

间接包被法：利用抗原-抗体反应捕获待包被抗体，即将抗-包被抗体的抗体先进行包被；也可采用IgG 亲和蛋白如蛋白A（staphylococcal protein A, SpA），能特异性结合兔、人及小鼠等多种动物IgG 抗体的Fc 段（对山羊IgG、鸡IgY 等无亲和力），其结合力相当于游离抗体与抗原的结合力，结合后对IgG 的活性无影响，在IgG 抗体固定化时，SpA 可作为受体蛋白先吸附在PS 板后，再结合IgG 抗体Fc 段实现捕获法固定IgG。抗体捕获包被法也可以利用亲和素-生物素系统进行，在载体上先预包被亲和素，通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体固相化。

当前抗体固定化技术所面临问题

通过物理吸附作用直接固定在载体表面的抗体分子，其功能域在固相表面趋向向下或趋向侧面时，不利于抗体-抗原的结合，若抗体Fab 端吸附在固相表面，则导致抗体的抗原结合功能域被掩盖而失去结合抗原的能力；并且ELISA 操作中需多次冲洗PS 微孔板，使物理吸附的抗体易脱落和活性降低，致使其灵敏度、重复性及稳定性明显降低。

化学法的固相化行为由蛋白分子的-NH₂、-COOH、-OH 或-SH 等活性基团与固相载体表面活性基团发生共价键结合，由于上述活性基团在蛋白质分子内的位置不确定性和不唯一性，导致这种共价结合没有固定的结合模式，化学连接往往伴随不同程度的物理吸附现象，当共价键作用于抗体活性位点或附近基团时影响抗体活性；PS 载体的氨基化及琥珀酰亚胺脂活化等固相材料改性手段，仅能增加蛋白吸附量，不能高效保证抗体定向固定及高免疫学活性。

采用间接包被方式能暴露抗体的抗原结合部位，有利于捕捉体系中的抗原，在一定程度上提高了免疫检测的特异性与灵敏度，但第一抗体或受体蛋白（如SpA）仍采用物理吸附法（包括分子涂层膜）化学共价偶联（包括多聚物化学偶联），更为重要是的上述方法仍不能有效实现第一抗体或受体蛋白的定向固定，即包被在载体上的蛋白受包被方法的限制，其抗体结合位点仍不能有效暴露而失去结合抗体的能力。利用亲和素-生物素包被抗体时，除事先包被亲和素外，抗体须先生物素化，当抗体与生物素共价结合的基团位于抗体活性位点附近或参与活性位点时，则会影响抗体与抗原的结合力。

ELISA 是经典的固相免疫测定技术，具有灵敏、简单、快速及易于自动化操作等特点，在生物医学、临床诊断等领域广泛应用，国内外普遍采用聚苯乙烯（Polystyrene, PS）微孔板/管/珠等为固相载体材料。因此，寻找一种好的抗体与PS载体偶联技术，能够解决抗体在载体表面定向展示和有效保持抗体活性的关键技术问题，则会能够显著提高固相免疫检测的特异性及灵敏度。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种IgG抗体的特异性立体定向固定技术。利用本发明的立体定向固定技术，可实现PS载体表面所固定的IgG抗体是均一、Fab段充分暴露及保持高抗原结合活性的IgG抗体，可有效提高固相免疫分析的灵敏性、特异性与稳定性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种IgG抗体在聚苯乙烯载体表面的立体定向固定方法，包括以下步骤：首先，利用化学修饰方法在PS 微孔板表面接入“IDA-Ni²⁺手臂”，并以基因工程技术构建表达C端带His tag的ZZ亲和肽（源于SpA的人工合成序列，可以特异性结合IgG抗体Fc段），基于His tag 与Ni²⁺亲和特性介导ZZ 亲和肽定向固定在PS 表面，进而发挥ZZ 亲和肽免疫学性质，特异性结合IgG抗体的Fc 段，获得生物亲和模式的Fc–(ZZ-His)–Ni²⁺组装体，实现IgG 抗体Fab 端的立体定向固定。

为实现上述目的，本发明采用如下具体技术方案：

（1）在PS对位通过硝化、还原反应引入活性基团-NH₂，以氯代环氧丙烷为桥连试剂与亚氨基二乙酸（IDA）或氨基三乙酸（NTA）反应，利用IDA/NTA与Ni²⁺形成金属螯合物，最终在PS微孔板表面通过化学反应引入Ni²⁺功能手臂。

（2）利用基因工程技术构建重组表达载体pUC-ZZ-His，E.coliDH5α表达C端带有6×His标签的ZZ亲和肽，IMAC（Ni）亲和层析纯化ZZ-His亲和肽。

（3）利用金属亲和原理，通过His tag结合PS微孔板表面Ni²⁺达到ZZ-His亲和肽的定向固定。

（4）利用ZZ-His亲和肽导向IgG抗体Fab端在PS微孔板表面的立体定向固定。

本发明所提供的IDA–Ni²⁺–His-tag 及ZZ亲和肽–IgG之间的结合均以蛋白质自身的生物学特性实现亲和组装，实现了IgG 抗体Fab 端定向向外展示及最大程度保持了固定后的抗体活性，载体表面单位面积内包被的有效抗体分子数增多，可有效提高固相免疫测定的特异性、稳定性与灵敏度。本发明建立的一种IgG 抗体立体定向固定的抗体固相化新方法，有望在临床免疫诊断、免疫传感器及抗体芯片等领域发挥重要作用。

附图说明

图1为通过化学修饰在PS载体表面引入IDA–Ni²⁺功能手臂。

图2为PS–IDA–Ni²⁺–(ZZ-His)–Fc模式的IgG定向固定示意图。

图3为PS–IDA–Ni²⁺对ZZ-His亲和肽特异性定向固定。

图4为PS–IDA–Ni²⁺–(ZZ-His)–Fc模式的IgG定向固定技术（A）与常规物理吸附（B）ELISA检测结果。

具体实施方式

实施例一、聚苯乙烯微孔板表面引入IDA–Ni ²⁺ 活性官能团

为了在聚苯乙烯微孔板表面通过金属亲和作用结合His-tag的活性Ni²⁺，首先对聚苯乙烯表面活化引入可以鳌合Ni²⁺的化学基团，如图1所示。

1、PS微孔板微孔中加入100 μL含10%HNO₃的冰醋酸溶液，60℃保温3h，移去反应液，去离子水流水冲洗微孔板。

2、PS微孔板微孔中加入100 μL含50%HNO₃的浓H₂SO₄溶液，60℃保温15min，移去反应液，去离子水流水冲洗微孔板。

3、上述1或2处理后的微孔板中加入100 μL含1% Na₂S₂O₄的NaOH (0.1M)溶液，60℃保温3h，移去反应液，去离子水流水冲洗微孔板。

4、每孔加入100 μL NaOH (5 M)/DMSO/环氧氯丙烷(2:4:5, v/v)， 60℃保温2h，移去反应液，先用DMSO后用去离子水流水冲洗微孔板。

5、每孔加入100 μL 含0.2 M 氨基二乙酸（IDA）的Na₂CO₃ （0.8 M），80℃保温2h，移去反应液，去离子水流水冲洗微孔板。

6、每孔加入100 μL 含0.2 M 氨基三乙酸（NTA）的Na₂CO₃ （0.8 M），80℃保温2h，移去反应液，去离子水流水冲洗微孔板。

7、每孔加入100 μL 10 mM NiSO₄，室温放置30 min，先用 0.05% Tween-20 后用 50 mM Tris–HCl （含 500 mM NaCl, pH 7.5）冲洗微孔板。

8、氯代环氧丙烷反应条件的优化：以不同的NaOH（5M）:DMSO:氯代环氧丙烷三者体积比，优化氯代环氧丙烷与-NH₂反应条件，当体积比为2:4:5时，反应较为完全。

9、采用上述1或2处理微孔板，能达到同等水平的硝基化效果。

10、采用上述6或7处理微孔板，能达到同等水平的Ni²⁺鳌合效果。

11、通过上述化学反应，得到表面鳌合金属离子的PS微孔板：PS–IDA–Ni²⁺或PS–NTA–Ni²⁺微孔板。

12、修饰化的PS表面所鳌合的金属离子除Ni²⁺外，还可以是Cu²⁺，Fe³⁺。

实施例二、ZZ-His亲和肽的基因工程技术制备与纯化

1、ZZ亲和肽基因序列的扩增、载体及基因工程菌的构建。设计引物：Primer 1：5'-CCGGAATTCCATGGCGCAACACGATGAAG-3'及

Primer 2：5'-CCCAAGCT TTTTATGATGATGATGATGATGATTCGCGTC-3'；以pEZZ18为模板，上述引物PCR扩增带His tag的ZZ亲和肽基因，克隆至pUC 18载体构建pUC-ZZ-His，转化E.coliDH5α，构建pUC-ZZ-His/E.coliDH5α工程菌。

2、ZZ-His亲和肽的表达与纯化。pUC-ZZ-His/E.coliDH5α工程菌过夜活化，按5%接种量转接于新鲜的LB培养基（氨苄青霉素浓度100μg/mL），37℃振荡培养17-24h，离心收集菌体。以含20mM咪唑的PBS溶液重悬菌体，超声破壁，10000rpm离心分离菌体碎片，上清0.22μm滤膜过滤后，0.5mL/min流通HisTrap层析柱，以含20mM咪唑的PBS溶液冲洗层析柱至A ₂₈₀值不再变化。以含500mM咪唑的PBS洗脱，收集洗脱液，超滤离心管5000rpm离心，脱盐浓缩至合适体积，备用。

实施例三、PS–IDA–Ni ²⁺ 对His tag蛋白定向固定能力分析

1、100 μL/孔的ZZ-His（50 ng/mL，溶剂为含20 mM 咪唑的PBS溶液，pH8.0）加入到PS–IDA–Ni²⁺微孔板，室温摇床震动结合30min，移去孔内溶液，以PBST（含20nm 咪唑）洗涤3次，每次5min，甩干备用。

2、为确定固定在微孔板上的蛋白是否为定向固定，即IgG抗体Fc段结合能力，100 μL/孔的兔抗HRP抗体（200ng/mL）加入到ZZ-His/PS–IDA–Ni²⁺微孔板，37℃温育1h，以PBST洗涤3次后，加入100 μL/孔的HRP（200ng/mL），37℃温育1h，以PBST洗涤3次后，HRP底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色。对照试验为相同浓度的ZZ-His物理吸附未经修饰的微孔板。结果表明，在ZZ-His/PS–IDA–Ni²⁺微孔模式中结合的兔抗HRP抗体高于物理吸附结合的兔抗HRP抗体，说明ZZ-His利用本发明定向固定技术固定化，其IgG结合活性位点充分暴露，有利于结合体系中的兔抗HRP抗体，如图2所示。

3、为进一步确定ZZ-His亲和肽在PS–IDA–Ni²⁺微孔板的固定是由His tag与Ni²⁺相互作用所介导的固定，在TMB底物显色前，100 μL/孔500mM的咪唑或500mM的EDTA加入到已结合ZZ-His的PS–IDA–Ni²⁺微孔板，室温摇床震动30min，移去孔内溶液，以PBST（含20nm 咪唑）洗涤3次，每次5min，甩干后底物显色。结果如图3所示，A ₄₅₀值分别减少84%、80%，结果证明ZZ-His亲和肽在PS–IDA–Ni²⁺微孔板的固定是由His tag与Ni²⁺相互作用所介导的固定。

实施例四、PS–IDA–Ni ²⁺ –(ZZ-His) 导向IgG抗体Fab端在PS微孔板表面的立体定向固定

2、浓度为500 ng/mL的鼠-抗IgY单克隆抗体（IgG2a亚类）按100 μL/孔加入到上述微孔板，37℃温育1h，以PBST洗涤3次，100 μL系列浓度的IgY（0–400 ng/mL）加入到孔内，37℃温育1h，以PBST洗涤3次，100 μL/孔HRP标记的山羊-抗IgY抗体（1:2000）加入到孔内，37℃温育1h，以PBST洗涤3次，TMB底物显色。

3、对照实验：100 μL/孔的ZZ-His 亲和肽(100 ng/mL)加入到未修饰的微孔板，4℃过夜包被，以PBST洗涤3次，每次5min，甩干；浓度为500 ng/mL的鼠-抗IgY单克隆抗体（IgG2a）按100 μL/孔加入到上述微孔板，37℃温育1h，以PBST洗涤3次，100 μL系列浓度的IgY（0–400 ng/mL）加入到孔内，37℃温育1h，以PBST洗涤3次，100 μL/孔HRP标记的山羊-抗IgY抗体（1:2000）加入到孔内，37℃温育1h，以PBST洗涤3次，TMB底物显色。

4、两种不同固定方式的结果如图4所示，本发明定向固定技术对IgY检测线性范围为0.2–200 ng/mL，检测灵敏度为0.1 ng/mL；对照试验即被动吸附固定模式的检测线性范围为2–100 ng/mL，检测灵敏度为1 ng/mL。本发明定向固定技术具有更宽的检测线性范围，灵敏度提高10倍。

Claims

1.一种IgG抗体在聚苯乙烯载体表面的立体定向固定方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)在聚苯乙烯对位通过硝化、还原反应引入活性基团-NH₂，以环氧氯丙烷为桥连试剂与亚氨基二乙酸或氨基三乙酸反应，利用IDA/NTA与金属离子形成金属螯合物，最终在聚苯乙烯微孔板表面通过化学反应引入金属离子功能手臂；

(2)利用基因工程技术构建重组表达载体pUC-ZZ-His，E.coli DH5α表达C端带有6×His标签的ZZ-His亲和肽，IMAC Ni亲和层析纯化ZZ-His亲和肽；

(3)利用金属亲和原理，通过His tag结合聚苯乙烯微孔板表面金属离子，使ZZ-His亲和肽定向固定到聚苯乙烯微孔板上；所述金属离子为Ni²⁺、Cu²⁺或Fe³⁺；

(4)利用ZZ-His亲和肽特异性结合IgG抗体Fc端，即获得生物亲和模式的Fc–(ZZ-His)–金属离子组装体；

所述步骤(1)具体如下：

①向聚苯乙烯微孔板微孔中加入100μL含10％HNO₃的冰醋酸溶液，60℃保温3h，移去反应液，去离子水流水冲洗微孔板；或：向聚苯乙烯微孔板微孔中加入100μL含50％HNO₃的浓H₂SO₄溶液，60℃保温15min，移去反应液，去离子水流水冲洗微孔板；所述含10％HNO₃的冰醋酸溶液中，10％的单位为m/v；所述含50％HNO₃的浓H₂SO₄溶液中，50％的单位为m/v，浓H₂SO₄溶液的浓度为98％，单位为m/v；

②上述处理后的微孔板，每孔中加入100μL含1％Na₂S₂O₄的NaOH溶液，60℃保温3h，移去反应液，去离子水流水冲洗微孔板；所述含1％Na₂S₂O₄的NaOH溶液中，1％的单位为m/v；所述NaOH溶液的浓度为0.1M；

③上述处理后的微孔板，每孔加入100μL的NaOH溶液、DMSO和环氧氯丙烷的混合物，其中，NaOH溶液、DMSO、环氧氯丙烷三者的体积比为：2：4：5，60℃保温2h，移去反应液，先用DMSO后用去离子水流水冲洗微孔板；所述NaOH溶液的浓度为5M；

④上述处理后的微孔板，每孔加入100μL含0.2M氨基二乙酸或0.2M氨基三乙酸的Na₂CO₃溶液，80℃保温2h，移去反应液，去离子水流水冲洗微孔板；所述Na₂CO₃溶液的浓度为0.8M；

⑤上述处理后的微孔板，每孔加入100μL10mM NiSO₄溶液或10mM CuSO₄溶液或10mM Fe₂(SO₄)₃溶液，室温放置30min，先用0.05％Tween-20后用50mM Tris–HCl冲洗微孔板，即得到表面鳌合金属离子的聚苯乙烯微孔板：PS–IDA–Ni²⁺或PS–NTA–Ni²⁺微孔板或PS–IDA–Cu²⁺或PS–NTA–Cu²⁺或PS–IDA–Fe³⁺或PS–NTA–Fe³⁺；所述0.05％Tween-20中，0.05％的单位为m/v；所述Tris–HCl中，含500mM NaCl，pH7.5。

2.根据权利要求1所述的IgG抗体在聚苯乙烯载体表面的立体定向固定方法，其特征在于：所述步骤(2)具体如下：

①设计引物Primer1：5'-CCGGAATTCCATGGCGCAACACGATGAAG-3及Primer2：5'-CCCAAGCT TTTTATGATGATGATGATGATGATTCGCGTC-3'，以pEZZ18为模板，上述引物PCR扩增带His tag的ZZ亲和肽基因，克隆至pUC18载体构建pUC-ZZ-His，转化E.coli DH5α，构建pUC-ZZ-His/E.coli DH5α工程菌；

②pUC-ZZ-His/E.coli DH5α工程菌过夜活化，按5％接种量转接于含氨苄青霉素浓度为100μg/mL的新鲜的LB培养基，37℃振荡培养17-24h，离心收集菌体；

③以含20mM咪唑的PBS溶液重悬菌体，超声破壁，10000rpm离心分离菌体碎片，上清0.22μm滤膜过滤后，0.5mL/min流通HisTrap层析柱，以含20mM咪唑的PBS溶液冲洗层析柱至A280值不再变化,以含500mM咪唑的PBS洗脱，收集洗脱液，超滤离心管5000rpm离心，脱盐浓缩至合适体积，即得。

3.根据权利要求1所述的IgG抗体在聚苯乙烯载体表面的立体定向固定方法，其特征在于：所述步骤(3)具体如下：

①100μL/孔的ZZ-His加入到PS–IDA–Ni²⁺微孔板，室温摇床震动结合30min；所述ZZ-His的浓度为50ng/mL，溶剂为含20mM咪唑的PBS溶液，pH8.0；

②移去孔内溶液，以含20mM咪唑的PBST洗涤3次，每次5min，使ZZ-His亲和肽定向固定到PS–IDA–Ni²⁺微孔板上。

4.根据权利要求1所述的IgG抗体在聚苯乙烯载体表面的立体定向固定方法，其特征在于：所述步骤(4)具体如下：

①浓度为500ng/mL的鼠-抗IgY单克隆抗体按100μL/孔加入到已结合ZZ-His亲和肽的孔内，37℃温育1h，以PBST洗涤3次，即得生物亲和模式的Fc–(ZZ-His)–金属离子组装体；所述鼠-抗IgY单克隆抗体属于IgG2a亚类；

②100μL系列浓度的IgY加入到孔内，37℃温育1h，以PBST洗涤3次，100μL/孔HRP标记的山羊-抗IgY抗体加入到孔内，37℃温育1h，以PBST洗涤3次，TMB底物显色；所述系列浓度是指0–400ng/mL；所述山羊-抗IgY抗体为按体积比1:2000稀释的抗体溶液。

5.权利要求1～4中任一项所述的方法所制备得到的生物亲和模式的Fc–(ZZ-His)–金属离子组装体。