CN114588275B - 一种具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于纳米医药技术领域，公开了一种具有脑靶向性的细胞膜仿生药物纳米晶的制备方法及其应用。本发明提出利用细胞膜作为运载平台，加以脑靶向肽修饰，继而包覆药物纳米晶，制备一种生物相容性好、具有长循环特性、高载药量、特异性靶向脑部的的仿生药物递送体系。这种新型仿生载药体系保留了细胞膜和药物纳米晶的优势，不仅能够实现对药物的高效负载，还能够有效延长体内循环时间，靶向脑部、实现在脑部的有效积累，从而提高药物对神经退行性疾病的治疗效果。本发明为脑部疾病的药物精准递送提供了新的思路和平台，具有良好的临床应用前景和开发价值。

Description

一种具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶及其制备方 法与应用
技术领域
本发明属于纳米医药技术领域，涉及一种用于神经退行性疾病治疗的具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶及其制备方法与应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson's disease,PD)是最常见于中老年人群的第二大神经系统变性疾病，临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓及姿态反射障碍等。其主要的病理改变为黑质中多巴胺(Dopamine,DA)能神经元变性坏死，病理性特征标志物是以α-突触核蛋白(Alpha synuclein,α-syn)为主要成分的路易小体(Lewy body,LB)的形成。随着人们生活水平的提高和人口老龄化的加剧，以PD为代表的大脑神经退行性疾病已成为仅次于心血管疾病、恶性肿瘤和中风之后的主要致死疾病，给患者和社会造成严重的负担。无论是从社会学角度还是经济学角度，PD已成为影响我国人口健康水平和生活质量，严重阻碍经济持续发展的社会问题。因此，寻找与开发治疗PD的药物与制剂，对于改善PD患者的生活质量及减轻社会负担有着极其重要的意义。
近年来，中药及其活性成分越来越受到关注，多种中药单体被证实有良好的神经保护作用，在治疗PD的研究取得了重大的进展。某些中药有效成分作用针对性特异性强，能通过抑制PD发病机制中的主要环节，如氧化应激、细胞凋亡和炎症反应、抑制α-syn异常聚集、减少黑质纹状体多巴胺能神经元的损伤和丢失，从而发挥神经保护作用。利用中药及其有效成分用于PD防治具有良好的开发前景，也将是今后PD治疗领域研究的重要方向。
然而，药物水溶性差，很大程度上限制了潜在治疗药物的应用。利用药物纳米晶体(Nanocrystals,NCs)技术，能有效提高药物的溶解度和溶出速率，改善生物利用度，是难溶性药物研究开发过程中最重要的中间途径。理想的PD递药系统须将治疗药物靶向富集于脑内，增加脑内病灶部位的药物浓度，提高疗效，同时降低对脑正常生理功能的影响。脑主动靶向输送体系能通过受体介导的跨膜传输功能，实现药物的跨血脑屏障(Blood-brainbarrier,BBB)输送。但常用的靶向蛋白如转铁蛋白和乳铁蛋白，是人体自有糖蛋白，难以避免产生“自有/外来竞争抑制”，因而“非自体蛋白或多肽配体”，如狂犬病毒多肽RVG29越来越受到关注。递药系统在体内运输过程中面临免疫清除、非特异性分布等难题。受天然细胞的启发，将细胞膜作为药物载体，利用其长循环的特点、优越的生物相容性和可降解性，可以躲避免疫系统对药物的清除，提高药物在体内的循环时间。
发明内容
为解决现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶。
本发明的另一目的在于提供上述具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶，包括红细胞膜(RBCm)和包覆于红细胞膜内的姜黄素纳米晶(Cur-NCs)；所述的红细胞膜为脑靶向肽修饰的红细胞膜；所述的脑靶向肽为狂犬病毒多肽RVG29。
优选地，所述的姜黄素纳米晶通过如下方法制备得到：将姜黄素(Cur)溶解于丙酮中制得有机相，以聚维酮PVP K90水溶液为水相，采用反溶剂沉淀法，在搅拌状态下将有机相注入水相中，制得姜黄素纳米晶。
更优选地，所述的水相中聚维酮PVP K90的浓度为0.2～1mg/mL；进一步优选为0.8mg/mL。
更优选地，所述的搅拌为磁力搅拌，转速为400～1500rpm/min；进一步优选为1000rpm/min。
更优选地，所述的将有机相注入水相中，有机相和水相的体积比为1:30～50；进一步优选为1:50。
优选地，所述的姜黄素纳米晶的粒径控制在10～300nm；进一步优选为10～80nm。
优选地，所述的脑靶向肽修饰的红细胞膜通过如下方法制备得到：将马来酰亚胺修饰的磷脂分子与巯基修饰的RVG29进行反应，制备RVG29修饰磷脂分子；将RVG29修饰磷脂分子与红细胞膜在PBS缓冲液中充分混合，孵育，制得RVG29修饰红细胞膜(RVG29-RBCm)。
更优选地，所述的马来酰亚胺修饰的磷脂分子为DSPE-PEG-MAL，PEG的分子量范围为1000～2000；进一步优选为2000。
更优选地，所述的RVG29修饰磷脂分子的具体制备方法为：取DSPE-PEG2000-MAL溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入RVG29多肽溶解完全，室温下搅拌反应，随后将反应液于纯水中透析纯化，收集透析液，冷冻干燥，即得RVG29修饰磷脂分子。
更优选地，所述的DSPE-PEG2000-MAL与N,N-二甲基甲酰胺的配比为30～50mg:1mL；进一步优选为40mg:1mL；所述的搅拌反应的时间为12～36h；进一步优选为24h；所述的透析袋的截留分子量为2000～8000kDa；进一步优选为3500kDa；所述的透析纯化的时间为12～36h；进一步优选为24h。
优选地，所述的孵育的条件为25～45℃，进一步优选为37℃水浴振荡。
优选地，制得RVG29修饰红细胞膜后，通过离心去除游离的RVG29修饰磷脂分子，离心的条件为转速6000～12000×g，时间6～10min；进一步优选为转速9000×g，时间8min。
上述具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶的制备方法，是将脑靶向肽修饰的红细胞膜与姜黄素纳米晶混合，超声处理，通过脂质体挤出仪挤出，得到红细胞膜包覆姜黄素纳米晶。
优选地，所述的脑靶向肽修饰的红细胞膜与姜黄素纳米晶的体积比例为1:4～10；进一步优选为1:4。
优选地，所述的超声的条件为频率50～90kHZ、时间5～10min；进一步优选为频率60kHZ、时间8min。
优选地，所述的通过脂质体挤出仪挤出是指通过脂质体挤出仪分别通过400nm、200nm、100nm的聚碳酸酯膜挤出8～15次。
上述具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。
所述的神经退行性疾病包括但不限于帕金森病。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供的具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶，姜黄素纳米晶的稳定性和可控释性显著提高；可以有效地阻止巨噬细胞的非特异性摄取，对在药物在体内的长循环具有积极作用；可以改善神经细胞对姜黄素的摄取，促进姜黄素的内化；可以显著提高MPP+毒性损伤的神经母瘤细胞的细胞活力；具有脑靶向性，可以改善药物在脑部的积累，具有精准递药的优越性，其应用前景良好。
本发明采用的材料来源于天然细胞膜，具有优越的生物相容性，安全性高。
本发明工艺过程简单，制备速度快，适用于工业化生产。
附图说明
图1为实施例1中所得纳米制剂的粒径分布及透射电镜图；其中，A为姜黄素纳米晶(Cur-NCs)，B为红细胞膜包覆姜黄素纳米晶(RBCm/Cur-NCs)，C为脑靶向肽RVG29修饰的红细胞膜包覆姜黄素纳米晶(RVG29-RBCm/Cur-NCs)。
图2为实施例1中所得纳米制剂的体外释放曲线。
图3为实施例1中所得纳米制剂与RAW264.7细胞共孵育的摄取结果。
图4为实施例1中所得纳米制剂与bEnd.3细胞共孵育的摄取结果。
图5为实施例1中所得纳米制剂与MPP+诱导损伤的SH-SY5Y细胞共孵育后细胞存活率图。
图6为实施例1中所得纳米制剂在血浆和脑组织内的药代动力学曲线图；其中，A为血浆，B为脑组织。
图7为实施例1中所得纳米制剂标记Cy5后在脑部的荧光成像图。
图8为实施例1中所得纳米制剂在体内的药效学评价结果图；其中，A为TH阳性神经元的免疫荧光成像，B为中脑组织中TH和α-syn的表达。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1脑靶向性细胞膜仿生修饰药物纳米晶的制备与表征
(1)姜黄素纳米晶的制备：
水相中稳定剂的筛选：候选的水相稳定剂包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K90、K29/32，普朗尼克F68、F127，羟丙甲纤维素(HPMC)E5、E15、E50和十二烷基硫酸钠(SDS)。上述稳定剂按初始浓度0.2mg/mL制备为水相，在1000rpm/min转速下按有机相：水相体积比为1:50的比例将有机相快速注入水相中制成Cur-NCs。在稳定剂初始浓度为0.2mg/mL时，F68、F127和SDS所制备的Cur-NCs最先出现沉淀；稳定性观察至第4天时，PVP K29/32中出现絮凝，HPMC系列均发生明显的浑浊现象，而以PVP K90制备的Cur-NCs仍保持澄清。分别配制0.2、0.4、0.6、0.8和1mg/mL的PVP K90，与Cur有机相制备成Cur-NCs，在PVP K90浓度为0.8mg/mL时，72h内Cur-NCs的粒径保持在70nm左右，具有良好的稳定性。
将姜黄素(Cur)溶解于丙酮中制得浓度为20mg/mL的有机相，水相为0.8mg/mL的聚维酮PVP K90，采用反溶剂沉淀法，在1000rpm/min磁力搅拌速度下按有机相：水相为1:50的体积比将有机相快速注入水相中，得到姜黄素纳米晶(Cur-NCs)。
(2)红细胞膜(RBCm)的提取：C57BL/6小鼠眼眶静脉丛取全血，800×g条件下4℃离心20min，弃去血浆和白细胞层；加入4倍体积预冷的PBS溶液充分吹打，800×g条件下4℃离心6min，弃上清，重复上述操作至上层液体为浅红色；洗净的红细胞，加入4倍体积低渗0.25×PBS溶液冰浴裂解1h(每隔10min上下颠倒一次)；9000×g条件下4℃离心10min，弃上清，再加入4倍体积低渗0.25×PBS溶液反复清洗直到上清无色，制得红细胞膜。
(3)DSPE-PEG-RVG29的制备：称取200mg DSPE-PEG2000-MAL溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入RVG29多肽溶解完全，室温下搅拌反应12h。随后将反应液转移至透析袋(截留分子量为3500)中，于纯水中透析纯化24h，收集透析液，冷冻干燥即得DSPE-PEG-RVG29产物。
(4)RVG29修饰RBCm的制备：取DSPE-PEG-RVG29(分散于PBS，37℃条件下为胶束溶液)与RBCm充分混合，于37℃水浴振荡槽中孵育4h，9000×g离心8min去除游离DSPE-PEG-RVG29，制得RVG29修饰后的RBCm(RVG29-RBCm)。
(5)红细胞膜包覆姜黄素纳米晶的制备：将RBCm或RVG29-RBCm与Cur-NCs按膜与纳米晶的体积比例为1:4在60kHZ下共超声8min，随后通过脂质挤出仪分别通过400nm、200nm、100nm的聚碳酸酯膜共11次，得到RBCm/Cur-NCs或RVG29-RBCm/Cur-NCs。
对上述纳米制剂进行粒径测定与透射电镜成像，结果如图1所示。Cur-NCs的平均粒径大小为71.3nm，呈类球形的形态。经RBCm包覆后，表面有明显的膜结构；由于RBCm的包覆，RBCm/Cur-NCs粒径增加至82.7nm，制备过程中的反复挤压操作使其形态更加接近圆球形。RVG29-RBCm/Cur-NCs和RBCm/Cur-NCs具有相似的粒径和形态，其粒径的分布更集中。
实施例2脑靶向性细胞膜仿生修饰药物纳米晶的体外释放试验
取制备好的1mL Cur-NCs、RBCm/Cur-NCs和RVG29-RBCm/Cur-NCs分别加入到截留分子量为3500kDa的透析袋中，然后将透析袋完全浸入10mL释放外液(PBS缓冲液，pH＝7.4，含0.5％吐温80，v/v)，并置于(37±0.5)℃避光水浴中，分别于0、1、2、4、8、10、12、24、48h取出10mL释放外液，并补加10mL等温新鲜外液。用紫外分光光度计检测释放液在427nm吸光度，根据Cur标准曲线计算Cur的累积释放量。
结果如图2所示。游离Cur(Cur混悬于PBS中，图示为Free)溶解度很低，48h内释放不足6％。而Cur溶液组(Cur溶于丙酮，图示为Solution)表现出快速释放的特征。Cur与PVPK90的物理混悬液(图示为PM)释放仅为7.49％，表明Cur和稳定剂PVP K90的混合并不能改善其释放行为。Cur-NCs在48h内的累积释放量达69.25％，说明了纳米晶提高了Cur的溶解度，并呈现出较快的释放。RBCm/Cur-NCs和RVG29-RBCm/Cur-NCs在48h内的累积释放量分别为46.20％和47.37％，在改善Cur溶解度的同时显现良好的缓释效果。这些结果表明RBCm的包覆增加了Cur-NCs的稳定性和可控释性。
实施例3脑靶向性细胞膜仿生修饰药物纳米晶的细胞摄取试验
将RAW264.7细胞(ATCC)和bEnd.3细胞(ATCC)接种于12孔板专用圆形爬片中，培养24h后，吸出培养液，加入含有100μmol/L Cur的Cur-NCs、RBCm/Cur-NCs和RVG29-RBCm/Cur-NCs。置于37℃，5％CO2培养箱中避光共培养后，弃去培养基，用PBS清洗3遍。加入4％多聚甲醛固定15～20min，用PBS清洗3遍。随后加入DAPI继续避光培养10min对细胞核染色，弃去染液，PBS冲洗3遍后，用抗荧光淬灭剂封片，在共聚焦激光扫描显微镜下观察细胞的摄取情况。
RAW264.7细胞的摄取结果如图3所示。与Cur-NCs组相比，RBCm/Cur-NCs和RVG29-RBCm/Cur-NCs处理的RAW264.7细胞显示出较少的荧光信号。这表明RBCm的包覆可以有效地阻止巨噬细胞的非特异性摄取，对在药物在体内的长循环具有积极作用。
bEnd.3细胞摄取结果如图4所示。Cur和PVP K90的物理混合物难以被摄取；Cur-NCs改善了bEnd.3细胞对Cur的摄取，RBCm/Cur-NCs在bEnd.3细胞内的荧光蓄积强于Cur-NCs；RVG29-RBCm/Cur-NCs组都呈现出最强的荧光，说明RVG29靶向肽的修饰可以促进Cur的内化。
实施例4脑靶向性细胞膜仿生修饰药物纳米晶的体外神经保护作用
SH-SY5Y细胞(ATCC)以每孔8×103个细胞的密度接种于96孔板中，用不同浓度(1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L)Cur的Cur、Cur-NCs、RBCm/Cur-NCs和RVG29-RBCm/Cur-NCs预处理2h，然后用2mmol/L MPP+孵育24h，用MTT法测定细胞活力。
结果如图5所示。Cur-NCs、RBCm/Cur-NCs和RVG29-RBCm/Cur-NCs在1～10μmol/L范围内均能显著提高MPP+毒性损伤的SH-SY5Y的细胞活力。RVG29-RBCm/Cur-NCs处理后的细胞活力明显高于RBCm/Cur-NCs和Cur-NCs，这可能与RVG29的修饰有关。在SH-SY5Y细胞上表达nAchR受体，RVG29-RBCm/Cur-NCs能通过受体介导的途径被SH-SY5Y细胞摄取，从而发挥神经保护作用。
实施例5脑靶向性细胞膜仿生修饰药物纳米晶的药代动力学研究
健康的C57BL/6J小鼠经尾静脉注射，给予不同的Cur纳米制剂(以Cur计2mg/kg)。分别于给药后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72h采集小鼠血浆和脑组织。随后，采用LC-MS/MS法测定所有样品中的Cur浓度。利用DAS2.0软件进一步估计药代动力学参数，参数包括Cur峰值浓度(Cmax)、消除半衰期(T1/2)、血浆/大脑中Cur水平曲线下面积(AUC0-t)和平均停留时间(MRT0-t)。
结果如图6和表1所示。RVG29-RBCm/Cur-NCs显著延长了Cur在血浆和脑中的半衰期和平均保留时间，提高了达峰浓度和生物利用度。这些结果证实，由于RVG29的修饰，RVG29-RBCm/Cur-NCs不仅在体内循环时间更长，而且允许靶向药物从血液传递到大脑。
表1血浆和脑组织的药动参数
*p<0.05and**p<0.01vstheCur group.#p<0.05and##p<0.01vsthe RBCm/Cur-NCsgroup.
实施例6脑靶向性细胞膜仿生修饰药物纳米晶的脑靶向特性研究
制备脂质插入Cy5荧光的Cy5@RBCm/Cur-NCs和Cy5@RVG29-RBCm/Cur-NCs。将C57BL/6雄性小鼠小鼠随机分为3组：①Cy5组，②Cy5@RBCm/Cur-NCs组，③Cy5@RVG29-RBCm/Cur-NCs组。各组小鼠通过尾静脉给予等剂量Cy5，于4h、6h、8h和18h取全脑在活体成像仪下进行荧光成像。
结果如图7所示，游离Cy5在脑中的积累很少，而细胞膜仿生修饰药物纳米晶在脑中的蓄积增加，这可能与RBCm的长循环和免疫逃避特性有关。重要的是，在各时间点的成像中，Cy5@RVG29-RBCm/Cur-NCs组均显示出最强烈的荧光分布。这一现象表明，RVG29的引入促使了仿生纳米系统在大脑定位，增强了它在神经元中的积累，提示RVG29修饰的RBCm/Cur-NCs可以有效地通过血脑屏障(BBB)。
实施例7脑靶向性细胞膜仿生修饰药物纳米晶在体内抗帕金森病的药效学评价
将C57BL/6雄性小鼠小鼠随机分为6组：①Control组，②MPTP组，③Cur组，④Cur-NCs组，⑤RBCm/Cur-NCs组，⑥RVG29-RBCm/Cur-NCs组。将MPTP·HCl溶解于0.9％氯化钠注射液中，用剂量为25mg/kg的MPTP连续腹腔注射小鼠5天进行PD造模。所有Cur组别剂量以Cur为2mg/kg计，通过尾静脉注射相应药物，隔1天给药1次，共给药8次。给药结束后，收集小鼠中脑组织冰冻切片对DA神经元标志物酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元进行免疫荧光染色；通过Western Blot检测中脑内TH和α-syn的表达水平。
结果如图8所示。与对照组相比，MPTP组TH+神经元明显缺失，Cur-NCs、RBCm/Cur-NCs和RVG29-RBCm/Cur-NCs可提高TH+神经元水平。其中，RVG29-RBCm/Cur-NCs表现出更有效的TH数量恢复。MPTP诱导的PD小鼠的TH表达水平降低且α-syn水平升高。经RVG29-RBCm/Cur-NCs给药后，小鼠的中脑中TH的表达量显著增高，这与在TH+神经元免疫荧光结果一致。对于高表达的α-syn，RVG29-RBCm/Cur-NCs能显著减少在中脑中异常升高的α-syn水平，其表达水平趋于正常组。这些结果表明，RVG29-RBCm/Cur-NCs的作用针对PD发病中的关键环节—TH减少和病理α-syn升高，从而发挥神经保护作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶，其特征在于：包括红细胞膜和包覆于红细胞膜内的姜黄素纳米晶；所述的红细胞膜为脑靶向肽修饰的红细胞膜；所述的脑靶向肽为狂犬病毒多肽RVG29；
所述的姜黄素纳米晶通过如下方法制备得到：将姜黄素溶解于丙酮中制得有机相，以聚维酮PVP K90水溶液为水相，采用反溶剂沉淀法，在搅拌状态下将有机相注入水相中，制得姜黄素纳米晶；
所述的脑靶向肽修饰的红细胞膜通过如下方法制备得到：将马来酰亚胺修饰的磷脂分子与巯基修饰的RVG29进行反应，制备RVG29修饰磷脂分子；将RVG29修饰磷脂分子与红细胞膜在PBS缓冲液中充分混合，孵育，制得RVG29修饰红细胞膜；
所述的马来酰亚胺修饰的磷脂分子为DSPE-PEG-MAL，PEG的分子量范围为1000～2000。
2.根据权利要求1所述的具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶，其特征在于：
所述的水相中聚维酮PVP K90的浓度为0.2～1mg/mL；
所述的搅拌为磁力搅拌，转速为400～1500rpm/min；
所述的将有机相注入水相中，有机相和水相的体积比为1:30～50。
3.根据权利要求2所述的具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶，其特征在于：
所述的水相中聚维酮PVP K90的浓度为0.8mg/mL；
所述的搅拌的转速为1000rpm/min；
有机相和水相的体积比为1:50。
4.根据权利要求1所述的具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶，其特征在于：
所述的RVG29修饰磷脂分子的具体制备方法为：取DSPE-PEG2000-MAL溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入RVG29多肽溶解完全，室温下搅拌反应，随后将反应液于纯水中透析纯化，收集透析液，冷冻干燥，即得RVG29修饰磷脂分子；
所述的DSPE-PEG2000-MAL与N,N-二甲基甲酰胺的配比为30～50 mg:1mL；所述的搅拌反应的时间为12～36 h；所述的透析的截留分子量为2000～8000 kDa；所述的透析纯化的时间为12～36 h；
所述的孵育的条件为25～45℃。
5.根据权利要求4所述的具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶，其特征在于：
所述的DSPE-PEG2000-MAL与N,N-二甲基甲酰胺的配比为40mg:1mL；所述的搅拌反应的时间为24h；所述的透析的截留分子量为3500kDa；所述的透析纯化的时间为24h；
所述的孵育的条件为37℃水浴振荡。
6.权利要求1～5任一项中所述的具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶的制备方法，其特征在于：将脑靶向肽修饰的红细胞膜与姜黄素纳米晶混合，超声处理，通过脂质体挤出仪挤出，得到红细胞膜包覆姜黄素纳米晶；
所述的脑靶向肽修饰的红细胞膜与姜黄素纳米晶的体积比例为1:4～10；
所述的超声的条件为频率50～90 kHZ、时间5～10min；
所述的通过脂质体挤出仪挤出是指通过脂质体挤出仪分别通过400 nm、200 nm、100nm的聚碳酸酯膜挤出8～15次。
7.权利要求1～5任一项中所述的具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的神经退行性疾病为帕金森病。
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