CN112741837A - 一种脑靶向性的纳米药物递送系统及其制备方法 - Google Patents
一种脑靶向性的纳米药物递送系统及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112741837A CN112741837A CN202011396762.XA CN202011396762A CN112741837A CN 112741837 A CN112741837 A CN 112741837A CN 202011396762 A CN202011396762 A CN 202011396762A CN 112741837 A CN112741837 A CN 112741837A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pla
- peg
- brain
- delivery system
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 43
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 claims abstract description 39
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 23
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 11
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 45
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 16
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 10
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 10
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 claims description 9
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 7
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 5
- PNYPSKHTTCTAMD-UHFFFAOYSA-K trichlorogadolinium;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Gd+3] PNYPSKHTTCTAMD-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 238000001132 ultrasonic dispersion Methods 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 239000013110 organic ligand Substances 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- RAZLJUXJEOEYAM-UHFFFAOYSA-N 2-[bis[2-(2,6-dioxomorpholin-4-yl)ethyl]azaniumyl]acetate Chemical compound C1C(=O)OC(=O)CN1CCN(CC(=O)O)CCN1CC(=O)OC(=O)C1 RAZLJUXJEOEYAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000000921 Gadolinium Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- -1 diethyl triaminepentaacetic acid Chemical compound 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 39
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 abstract description 28
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 abstract description 9
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 abstract description 6
- 230000008021 deposition Effects 0.000 abstract description 4
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 abstract description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 abstract description 2
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 abstract 1
- 230000019581 neuron apoptotic process Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 9
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 8
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 7
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 7
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 4
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 4
- 238000010175 APPswe/PSEN1dE9 Methods 0.000 description 3
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 3
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 2
- 102000019315 Nicotinic acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 2
- 108050006807 Nicotinic acetylcholine receptors Proteins 0.000 description 2
- 101900083372 Rabies virus Glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 102000015296 acetylcholine-gated cation-selective channel activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040006409 acetylcholine-gated cation-selective channel activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000006933 amyloid-beta aggregation Effects 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006951 hyperphosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 2
- YOBAEOGBNPPUQV-UHFFFAOYSA-N iron;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Fe].[Fe] YOBAEOGBNPPUQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 2
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 2
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Asn Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O KLALXKYLOMZDQT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 238000011565 Alzheimer-disease animal model Methods 0.000 description 1
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 1
- HGKHPCFTRQDHCU-IUCAKERBSA-N Arg-Pro-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O HGKHPCFTRQDHCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- OOXUBGLNDRGOKT-FXQIFTODSA-N Asn-Ser-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O OOXUBGLNDRGOKT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 229930028154 D-arginine Natural products 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N Glu-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O LXAUHIRMWXQRKI-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- CLNSYANKYVMZNM-UWVGGRQHSA-N Gly-Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N CLNSYANKYVMZNM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N Ile-Phe-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N VEPIBPGLTLPBDW-URLPEUOOSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 208000034530 PLAA-associated neurodevelopmental disease Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- DNCUODYZAMHLCV-XGEHTFHBSA-N Thr-Pro-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O DNCUODYZAMHLCV-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- BOESUSAIMQGVJD-RYQLBKOJSA-N Trp-Met-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N BOESUSAIMQGVJD-RYQLBKOJSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- NZBSVMQZQMEUHI-WZLNRYEVSA-N Tyr-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N NZBSVMQZQMEUHI-WZLNRYEVSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 1
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000264 spin echo pulse sequence Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950004616 tribromoethanol Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
- A61K49/10—Organic compounds
- A61K49/12—Macromolecular compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
- A61K49/10—Organic compounds
- A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Neurology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明涉及一种脑靶向性的纳米药物递送系统及其制备方法，属于生物医药技术领域。本发明通过引入结合位点Mal基团的方式将RVG29耦合在PLA‑PEG纳米颗粒的表面，同时负载利福平和钆纳米颗粒，以构建一种新型的脑靶向纳米药物递送系统，具有良好的生物相容性、脑靶向性和药物控释性，能够促进利福平穿过血脑屏障，实现药物在动物脑部的聚集，提高药物的生物利用度。同时，该纳米递送系统能够减少患有阿尔茨海默病的小鼠脑组织中Aβ的沉积和减少神经元的凋亡，以改善小鼠的认知障碍，为诊断和治疗阿尔茨海默病提供了一种高效和安全的策略。本发明脑靶向性纳米药物递送系统在神经变性疾病及老年医学领域具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种脑靶向性的纳米药物递送系统及其制备方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种神经退行性疾病，主要病理特征为Aβ(β-amyloid protein)沉积和Tau蛋白过度磷酸化。到目前为止，人们尚未研发出从病因学上治疗AD的有效药物。利福平(Rifampicin，RIF)是一种具有抗β-淀粉样蛋白、抗炎、抗凋亡、神经保护等作用的半合成广谱抗生素，因其具有疏水性强、毒性大、半衰期短、生物利用度低和难于跨越血脑屏障的特性,而难以被应用于AD的治疗。近年来，功能纳米材料因其具有较好的生物相容性和药物递送等性能被应用于神经退行性疾病的治疗研究。这些纳米给药系统不仅可以延长药物的血液循环时间，提高药物的生物利用度，还可以降低药物的副作用。
具有脑靶向的RVG29是一种来自狂犬病毒糖蛋白上的29个氨基酸的肽，已被证明与神经元细胞上的烟碱型乙酰胆碱受体(nAchR)具有特异性结合作用。由于nAchR广泛存在于大脑的神经元细胞和毛细血管的内皮细胞的表面，RVG29与血脑屏障上的特异性受体nAchR结合，通过受体介导的转运机制，能够有效地穿越血脑屏障进入大脑。用RVG肽修饰的可生物降解的聚乙烯亚胺作为神经元细胞的靶向配体可以促进基因向大脑的传递已经得到证明。Kumar等发现嵌合肽与壬二(D-精氨酸)肽和RVG结合可将siRNA结合并传递至中枢神经系统，促使大脑中的异常基因不被表达(Nature.2007,448(7149):39–43)。到目前为止，在治疗神经退行性疾病时，修饰了RVG29的纳米药物递送系统可以转运多种大分子药物穿越血脑屏障并提高药物在脑内的富集。靶向给药系统不仅能够提高药物对病变部位的治疗效率，还有利于减轻药物的副作用。因此，RVG修饰的药物载体为跨血脑屏障的药物递送用于治疗神经系统疾病提供了一种安全且无创的潜在治疗方法。
利福平作为一种广谱的抗生素，是一种预防和治疗的AD潜在性药物。其在细胞水平上证实具有抗炎、保护神经元、减少神经变性等作用(Brain Res,2011,13(1395):12-20)；在AD小鼠内证实具有减少β-淀粉样蛋白沉积、Tau蛋白的过度磷酸化、神经元丢失和促进突触重构等作用(Brain.2016,139(5):1568–1586)；在临床实验中也证实具有改善认知和预防痴呆等作用(J Am Geriatr Soc.2004,52(3):381–387.Dement Geriatr Cogn DisExtra.2017,7:(2):204–214)。利福平是一种水溶性低的脂溶性生物制药，它在肠道的渗透性较低，使得口服的利福平进入体循环的药量较少。此外，由于BBB中的阻拦作用，利福平进入脑内的量减少。
因此，研究开发优化利福平使用的有效方法在AD的预防和治疗上具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种脑靶向性的纳米药物递送系统。
本发明的另一目的在于提供上述脑靶向性的纳米药物递送系统的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述脑靶向性的纳米药物递送系统的应用。
本发明的目的在于制备一种RVG29修饰并负载利福平的脑靶向性纳米药物递送系统，尤其是提供一个用于治疗阿尔茨海默病的纳米药物递送系统及其制备方法。所制备纳米药物递送系统具有良好的生物相容性、脑靶向性和药物控释性，能够促进利福平穿过血脑屏障，以实现药物在脑部的聚集和提高药物的生物利用度。
本发明的另一目的在于借助于利福平的抗炎、抗Aβ、神经保护等作用，通过纳米药物递送系统有效增加脑内的药物浓度，以实现脑靶向性治疗。
本发明的再一目的在于提供含钆的纳米材料负载利福平通过磁共振成像检测淀粉样蛋白沉积，使其具有诊断AD及进行药物疗效评价的性能。
本发明的目的通过下述方案实现：
本发明通过引入结合位点Mal基团的方式将RVG29耦合在PLA-PEG((Poly(lacticacid)-poly(ethylene glycol),PLA-PEG)纳米颗粒的表面，同时掺杂钆(Gad olinium,Gd)在纳米颗粒内部。Gd与有机配体形成的配合物是临床上常用的一种造影剂。Gd-DTPA与β-淀粉样蛋白肽结合形成的配合物与阿尔茨海默病动物模型或人体脑中淀粉样蛋白斑块进行成像，既有助于对AD进行早期诊断，也可以作为药物抗Aβ的疗效的检测方法。因此，本实验以PLA-PEG-Gd/Mal-RVG2 9作为载体，通过对利福平的包封，制备出脑靶向RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG2 9的纳米药物递送系统。
具体而言，本发明是一种脑靶向性的纳米药物递送系统，是由生物可降解的聚乳酸-聚乙二醇、造影剂钆类配合物、药物利福平和靶向分子RVG29构成的纳米粒子；其中，所述的利福平和钆类配合物包裹在聚乳酸-聚乙二醇的内部，所述的RVG29通过共价键连接在聚乳酸-聚乙二醇表面；所述的钆类配合物是由钆与有机配体配位形成的配合物，所述的RVG29是氨基酸序列如下所示的多肽：
YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGC(SEQ ID NO.1)。
所述的有机配体优选为二乙基三胺五乙酸(DTPA)
所述的利福平在纳米药物递送系统中的含量优选为0.01～20wt％；更优选为5～16.4wt％。
所述的纳米药物递送系统的粒径范围在80～1000nm之间。
所述的RVG29可通过固相合成方法或生物表达的方法获得。
本发明中所述的一种脑靶向性的纳米药物递送系统的制备方法，包括以下操作步骤：
S1、将PLA-PEG-NH2溶解在有机溶剂中，加入DTPA、三乙胺，反应；反应结束后，反应液经透析、冷冻干燥，所得产物命名为PLA-PEG-DTPA；
S2、将步骤S1所得PLA-PEG-DTPA和六水合氯化钆溶解在水/二氧六环(DEDO)混合溶剂中，调节体系的pH值至6.0～6.5，在搅拌状态下进行反应；反应结束后，反应液经透析、冷冻干燥，所得产物命名为PLA-PEG-Gd；
S3、将步骤S2所得PLA-PEG-Gd，PLA-PEG-Mal和利福平分别溶解在有机溶剂中，分别得到溶液A，溶液B，溶液C；先将溶液A和溶液B混合，得到混合液X，然后将溶液C边超声边滴加到混合液X中，超声分散；继续在超声状态下逐滴加入水，冰浴超声；反应液经冰浴透析、冷冻干燥，所得产物命名为RIF@PLA-PEG-Gd/Mal；
S4、将步骤S3所得RIF@PLA-PEG-Gd/Mal溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，得到溶液溶液M；将RVG29溶解在磷酸盐缓冲液中，得到溶液溶液N，并在搅拌状态下将溶液N滴加到溶液M中，反应；反应结束后，反应液经冰浴透析、冷冻干燥，所得产物即目标产物，命名为RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29。
所述的制备方法中，PLA-PEG-NH2是指聚乳酸-聚乙二醇-氨基，DTPA是指二亚乙基三胺五乙酸二酐，PLA-PEG-Mal是指聚乳酸-聚乙二醇-马来酰亚胺。
步骤S1中所述的PLA-PEG-NH2的分子量优选为10000～20000；更优选为15000，其中PLA的分子量为10000，PEG的分子量为5000。
步骤S1中所述的PLA-PEG-NH2和DTPA的配比优选为质量比18～25：1；更优选为质量比21：1。
步骤S1中所述的三乙胺的用量优选按PLA-PEG-NH2：三乙胺＝1800～2500mg：1ml计；更优选为2100mg：1ml。
步骤S1中所述的有机溶剂优选为二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)和二甲基亚砜(DMSO)中的任意一种；更优选为二甲基亚砜(DMSO)。
步骤S1中所述的反应的条件优选为：温度40～50℃、时间6～12h；更优选为：温度45℃、时间12h。
步骤S1中所述的透析优选采用截留分子量为3000～4000Da的透析袋实现；更优选采用截留分子量为3500Da的透析袋实现。
步骤S1中所述的透析的时间优选为20～30h；更优选为24h。
步骤S2中所述的PLA-PEG-DTPA、六水合氯化钆的配比优选为质量比1：0.01～2。
步骤S2中所述的水/二氧六环混合溶剂中水和二氧六环以1：2的体积比混合。
步骤S2中所述的水/二氧六环混合溶剂的用量优选按PLA-PEG-DTPA：水/二氧六环混合溶剂＝10mg：1～2mL计；更优选按10mg：1.5mL计。
步骤S2中所述的调节体系的pH值采用的试剂优选NaOH溶液；更优选浓度为0.1mol/L的NaOH溶液。
步骤S2中所述的反应的条件优选为温度45～55℃、时间3～5h；更优选为：温度50℃、时间4h。
步骤S2中所述的透析选采用截留分子量为500～2000Da的透析袋实现；更优选采用截留分子量为1000Da的透析袋实现。
步骤S2中所述的透析的时间优选为20～30h；更优选为24h。
步骤S3中所述的PLA-PEG-Mal的分子量10000～20000；更优选为15000，其中PLA的分子量为10000，PEG的分子量为5000。
步骤S3中溶解聚乳酸-聚乙二醇-钆、聚乳酸-聚乙二醇-马来酰亚胺和利福平所用的有机溶剂优选为二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、二甲基亚砜(DMSO)和四氢呋喃中的任意一种；更优选为四氢呋喃。
步骤S3中所述的PLA-PEG-Gd、PLA-PEG-Mal、利福平的配比优选为质量比1：0.01～1：0.01～1；更优选为1：1：1。
步骤S3中所述的超声分散的时间优选为10～20min；更优选为15min。
步骤S3中所述的水的用量优选按优选按聚乳酸-聚乙二醇-钆：水＝3～5mg:1mL计；更优选按4mg:1mL计。
步骤S3中所述的冰浴超声的时间优选为25～35min；更优选为30min。
步骤S3中所述的冰浴透析优选采用截留分子量为3000～4000Da的透析袋实现；更优选采用截留分子量为3500Da的透析袋实现。
步骤S3中所述的冰浴透析的时间优选为20～30h；更优选为24h。
步骤S4中所述的磷酸盐缓冲液均优选浓度为0.01mol/L、pH＝7.3～7.5的磷酸盐缓冲液；更优选浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。
步骤S4中所述的RIF@PLA-PEG-Gd/Mal和RVG29的用量优选按质量比10：0.01～1配比。
步骤S4中所述的反应的时间优选为3～5h；更优选为4h。
步骤S4中所述的冰浴透析优选采用截留分子量为3000～4000Da的透析袋实现；更优选采用截留分子量为3500Da的透析袋实现。
步骤S4中所述的冰浴透析的时间优选为10～15h；更优选为12h。
上述脑靶向性的纳米药物递送系统在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病药物中的应用。
上述脑靶向性的纳米药物递送系统在制备阿尔茨海默病诊断和/或预后评估试剂中的应用。
本发明中，二甲基亚砜简称DMSO，钆简称Gd，狂犬病毒糖蛋白的29个氨基酸的肽简称RVG29，利福平简称RIF。
一种根据上述方法制备的脑靶向性的纳米药物递送系统。
本发明选用APPswe/PS1dE9双转基因小鼠(简称AD或Tg小鼠)作为研究AD的动物模型，所选用的9-10个月小鼠已在大脑皮层和海马区出现大量的Aβ沉积，C57BL/6J小鼠(简称WT小鼠)作为阴性对照组。
本发明通过CCK8检测法来考察纳米颗粒对细胞的生物毒性。结果显示HT22细胞在纳米药物递送系统溶液的存活率均达到80％以上，说明所制备的纳米药物递送系统具有良好的生物相容性和安全性。
本发明通过活体荧光成像来检测纳米药物递送系统的脑靶向性，经尾部静脉给药后，显示经靶向纳米载体治疗的小鼠其脑内具有更强的荧光信号，说明RVG29修饰的纳米颗粒具有穿透BBB的能力，能够靶向性将药物递送至脑内。
通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明的优势和特征如下：
(1)纳米药物递送系统在制备过程中引入亲水性聚合物PEG来提高纳米颗粒的亲水性，进而改变纳米颗粒在水溶液中的溶解性。同时，由于纳米药物递送系统的表面修饰着大量亲水性的PEG，这有利于降低包裹在内的药物与外界接触，防止其被蛋白质的吸附和避免被单核巨噬细胞的识别和吞噬。
(2)PLA具有良好的生物相容性和生物可降解性，降解产物为CO2和水等小分子。同时，PLA分子链上具有许多疏水性的酯键，使其能较好的包裹疏水性药物。PLA与PEG共聚可以改善纳米颗粒的亲水性，提高药物装载量，延长药物在体内的停留时间，从而发挥纳米颗粒在药物递送中的巨大发展潜力。
(3)将利福平包裹在药物载体内部能有效解决其半衰期短的缺点，改善药物的水溶性和在体循环中的稳定性，通过延缓药物的释放，延长药物在体内的循环时间，进而提高药物的生物利用度。
(4)RVG29修饰的纳米药物递送系统在短时间内富集于脑内，既有利于缩短了药物在外周循环的时间，避免了药物引起的全身不良反应，同时实现药物的靶向性治疗。
(5)所制备的RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29具有良好的生物相容性、脑靶向性和控释药物性。
(6)我们所制备的含Gd的纳米颗粒可通过MR成像检测脑内淀粉样蛋白的沉积，因此说明我们所制备的纳米颗粒通过MR成像检测脑内淀粉样蛋白的沉积从而可能达到诊断AD的作用，也可以通过MR成像检测淀粉样斑块来作为评估药物疗效的指标。
附图说明
图1为实施例1中所制备的PLA-PEG-NH2和PLA-PEG-DTPA的红外谱图。
图2为实施例1中所制备的PLA-PEG-DTPA的1H NMR谱图。
图3为实施例2和实施例4中所制备的两种纳米颗粒的形态分布和粒径分布图；其中，A为实施例2中制备的PLA-PEG-Gd的形态分布图，B为实施例2中制备的PLA-PEG-Gd的粒径分布图，C为实施例4中制备的RIF@PLA-PEG-Gd-RVG29的形态分布图，D实施例4中制备的为RIF@PLA-PEG-Gd-RVG29的粒径分布图。
图4为实施例2在所制备的PLA-PEG-Gd的磁共振成像性能结果图。
图5为实施例4中所制备的RIF@PLA-PEG-Gd-RVG29的药物释放曲线图。
图6为实施例6中所制备的PLA-PEG-MAL和PLA-PEG-RVG29的1H NMR谱图。
图7为实施例7中RIF在不同浓度下与紫外可见光谱吸光度的标准曲线图。
图8为实施例7中CCK-8检测不同浓度的PLA-PEG-Gd/Mal、RIF@PLA-PEG-Gd/Mal和RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29对HT22细胞的影响结果图。
图9为实施例8中用共聚焦显微镜观察bEnd.3细胞对靶向与非靶向纳米药物载体的摄取情况结果图。
图10为实施例8中流式细胞术检测bEnd.3细胞对靶向与非靶向纳米药物载体的摄取情况结果图。
图11为实施例9中Cy5.5标记的非靶向和靶向纳米药物载体在脑内的分布结果图；其中，A为RIF@PLA-PEG-Gd/Mal，B为RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29。
图12为实施例10中含Gd的造影剂利用MRI对APP/PS1小鼠脑内淀粉样蛋白的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
下述实施例涉及的部分材料：
PLA-PEG-NH2：购自西安瑞禧生物科技有限公司，分子量为15k，其中PLA的分子量为10k，PEG的分子量为5k。
PLA-PEG-Mal：购自西安瑞禧生物科技有限公司，分子量为15k，其中PLA的分子量为10k，PEG的分子量为5k。
实施例1：
取2100mg PLA-PEG-NH2和100mg DTPA用10ml DMSO溶解。滴加约1ml三乙胺后，在45℃下反应12h。反应结束后，反应溶液用截留分子量3500Da的透析袋透析24h，期间换水6次。最后将袋内透析液冷冻干燥，获得PLA-PEG-DTPA。图1为PLA-PEG-NH2和PLA-PEG-DTPA的红外谱图。图2为PLA-PEG-DTPA的1H NMR谱图。
实施例2：
取200mg六水合氯化钆和实施例1中所制备的100mg PLA-PEG-DTPA用15ml水/二氧六环(1:2v/v)的混合溶剂溶解。然后用0.1M NaOH溶液将原料混合溶液pH值调节至6.0～6.5之间，在50℃下将反应混合物搅拌4h。然后用截留分子量1000Da的透析袋透析反应混合物24h，期间换水6次。将袋内透析液冷冻干燥，获得PLA-PEG-Gd。图3为PLA-PEG-Gd的形态(A)和粒径分布(B)。图4为PLA-PEG-Gd的磁共振成像性能。
实施例3：
取实施例2中所制备的PLA-PEG-Gd、PLA-PEG-Mal各100mg溶解于四氢呋喃中，备用。取利福平100mg溶解于四氢呋喃中，备用。将利福平溶液在超声波细胞粉碎机上边超声边滴加到上述两种PLA-PEG-Gd的PLA-PEG-Mal的混合液中，超声分散15min。其中PLA-PEG-Gd和PLA-PEG-Mal的比例为1：1，添加与PLA-PEG-Gd等质量的利福平。将以上利福平与聚合物的混合液在超声的条件下，逐滴加入25mL的水，冰浴超声30min。将超声后的溶液转移3500Da透析袋冰浴透析24h，期间换水6次。将袋内透析液冷冻干燥，获得RIF@PLA-PEG-Gd/Mal。
实施例4：
取实施例3中所制备的100mg RIF@PLA-PEG-Gd/Mal溶解于PBS(pH＝7.4，0.01M)。取10mg RVG29溶解于PBS(pH＝7.4，0.01M)。用磁子搅拌载药溶液，同时滴加RVG29，反应4h。反应后将所得溶液用截留分子量3500Da的透析袋在冰浴下透析12h，将袋内的透析液进行冷冻干燥，获得RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29。采用测定浸泡药物的透析液中RIF的含量来研究RIF@PLA-PEG-Gd-RVG29在体外的释放行为。具体操作为：将载药样品RIF@PLA-PEG-Gd-RVG29配制成2g/L，转移1mL至截留分子量3500Da的透析袋，将透析袋放入装有10mL PBS(0.01M,pH＝7.4)的离心管中，将离心管放入37℃恒温箱中并在150rpm频率下震荡。取离心管内的透析液用UV-Vis分光光度计检测RIF的含量，并计算累计的RIF含量，每次取样1mL，再补加1mL新鲜缓释溶液，取样时间为：0h、0.15h、0.5h、1h、1.5h、2.5h、3.5h、5h、7h、24h。图5为RIF@PLA-PEG-Gd-RVG29胶束的药物释放曲线。图3显示RIF@PLA-PEG-Gd-RVG29的形态(C)和粒径分布(D)。
实施例5：
按照实施例1-4的方法制备不含Gd的纳米药物递送系统。其区别仅在于，进行实施例3的操作时不添加PLA-PEG-Gd。
按照实施例1-4的方法制备不含利福平的纳米药物递送系统。其区别仅在于，进行实施例3的操作时不添加利福平。
实施例6：
取100mg PLA-PEG-Mal溶解于PBS(pH＝7.4，0.01M)。取10mg RVG29溶解于PBS(pH＝7.4，0.01M)。用磁子搅拌载药溶液，同时滴加RVG29，反应4h。反应后将所得溶液用截留分子量3500Da的透析袋在冰浴下透析12h，将袋内的透析液进行冷冻干燥，获得PLA-PEG-RVG29。图6为PLA-PEG-MAL和PLA-PEG-RVG29的1H NMR谱图。证明PLA-PEG-RVG29已经成功被制备出来。
实施例7：
通过将HT22细胞(市售)与三种纳米颗粒(PLA-PEG-Gd、RIF@PLA-PEG-Gd/Mal和RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29)共培养后，计算细胞存活率来考查纳米颗粒的细胞毒性。选取对数生长期、生长状况良好的HT22细胞，进行洗涤、消化、离心和细胞计数。细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板中，然后将其置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下的培养箱中培养。贴壁过夜后，去除原有的培养基，换上含有不同浓度的纳米药物颗粒的新完全培养基。所选的材料的浓度设置为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL，每个浓度有5个平行复孔。然后在培养箱中培养24h。培养后用PBS将细胞洗涤一次后并向各孔中加入100L的新鲜培养基(含10％CCK-8)。置于培养箱中孵育一段时间后，用酶标仪检测并记录在450nm波长处的吸光度，并通过吸光度来计算细胞存活率。图7为RIF在不同浓度下与紫外可见光谱吸光度的标准曲线。图8为CCK-8检测不同浓度的PLA-PEG-Gd、RIF@PLA-PEG-Gd/Mal和RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29对HT22细胞的影响。结果显示三种纳米颗粒均对HT22细胞无明显毒性作用。
实施例8：
bEnd.3细胞(市售)对RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29摄取情况测试。选取对数生长期、生长状态良好的bEnd.3，进行洗涤、消化、离心、细胞计数。将1×105个bEnd.3细胞铺于六孔板中，隔夜贴壁后，将靶向(RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29)及非靶向(RIF@PLA-PEG-Gd/Mal)纳米药物颗粒用DMEM完全培养基稀释至浓度为30μg/ml。在37℃下与细胞孵育4h，以胰酶消化细胞，PBS充分洗涤，再以染色缓冲液(staining buffer)重悬细胞后，使用激光共聚焦显微镜来观察细胞内荧光强度。每种药物重复三次实验，结果用平均荧光强度(Meanfluorescence intensity，MF)法进行统计分析。图9为bEnd.3细胞对靶向与非靶向纳米药物载体的摄取情况。图10为流式细胞术检测bEnd.3细胞对靶向与非靶向纳米药物载体的摄取情况。结果表明bEnd.3细胞对靶向纳米药物载体(RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29)的摄取明显增加。
实施例9：
将RIF@PLA-PEG-Gd/Mal与RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29分别与Cy5.5荧光分子混合，于室温摇床上孵育，结束后过滤掉未与纳米颗粒反应的Cy5.5荧光分子。Cy5.5荧光分子标记的RIF@PLA-PEG-Gd/Mal与RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29通过尾静脉注射(100μl，浓度为1mg/ml)入小鼠体内。分别在0h、0.5h、1h、2h、6h、12h、24h、36h和48h用三溴乙醇麻醉小鼠后，采用活体成像系统(激发光波长660nm，发射光波长710nm)进行荧光成像观察纳米粒在脑内的分布情况。注意剔除头部毛发，以免影响成像效果。采用Living Image软件系统进行图像处理。图11为Cy5.5标记的非靶向和靶向纳米药物载体在脑内的分布，其中A为RIF@PLA-PEG-Gd/Mal，B为RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29，结果显示经过RVG29修饰的纳米粒在脑内明显聚集。
实施例10：
为了证实我们所制备的纳米粒子具有对AD的诊断特性，我们对小鼠进行了磁共振成像。在10月龄的含APP/PS1的转基因小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)和不含淀粉样蛋白的C57BL/6J(或WT)小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)上进行了含Gd造影剂的MR成像。我们在小鼠注射造影剂前先进行磁共振成像，然后再分别给小鼠尾静脉注RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29后1小时进行磁共振扫描。体内MRI实验应用的是9.4T磁共振扫描仪。图像采集为T1自旋回波序列(参数：TR＝300ms,TE＝10ms，层厚＝1mm，矩阵＝256×256，平均＝8个)。在MRI实验期间，将异氟烷(0.75–1.5％)与(95％O2–5％CO2)的混气体对小鼠进行麻醉。磁共振扫描期间监测小鼠的呼吸频率和体温。结果如图12显示，APP/PS1小鼠中，在皮质和海马区可见到低信号影，而无淀粉样斑块的C57BL/6J小鼠未观察到低信号影。通过脑组织Aβ免疫荧光染色证实MR图像上的低密度影为淀粉样斑块。以上结果表明我们所制备的材料具有体内诊断淀粉样斑块的性能，因此我们可以通过MR成像检测淀粉样斑块来作为评估药物疗效的指标。
但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种脑靶向性的纳米药物递送系统及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RVG29氨基酸序列
<400> 1
Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp
1 5 10 15
Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly Cys
20 25 30
Claims (10)
1.一种脑靶向性的纳米药物递送系统，其特征在于：是由生物可降解的聚乳酸-聚乙二醇、造影剂钆类配合物、药物利福平和靶向分子RVG29构成的纳米粒子；其中，所述的利福平和钆类配合物包裹在聚乳酸-聚乙二醇的内部，所述的RVG29通过共价键连接在聚乳酸-聚乙二醇表面；所述的钆类配合物是由钆与有机配体配位形成的配合物，所述的RVG29是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽。
2.按权利要求1所述的脑靶向性的纳米药物递送系统，其特征在于：
所述的有机配体为二乙基三胺五乙酸；
所述的利福平在纳米药物递送系统中的含量为0.01～20wt％；进一步为5～16.4wt％；
所述的纳米药物递送系统的粒径范围在80～1000nm之间。
3.权利要求1或2所述的脑靶向性的纳米药物递送系统的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、将PLA-PEG-NH2溶解在有机溶剂中，加入DTPA、三乙胺，反应；反应结束后，反应液经透析、冷冻干燥，所得产物命名为PLA-PEG-DTPA；
S2、将步骤S1所得PLA-PEG-DTPA和六水合氯化钆溶解在水/二氧六环混合溶剂中，调节体系的pH值至6.0～6.5，在搅拌状态下进行反应；反应结束后，反应液经透析、冷冻干燥，所得产物命名为PLA-PEG-Gd；
S3、将步骤S2所得PLA-PEG-Gd，PLA-PEG-Mal和利福平分别溶解在有机溶剂中，分别得到溶液A，溶液B，溶液C；先将溶液A和溶液B混合，得到混合液X，然后将溶液C边超声边滴加到混合液X中，超声分散；继续在超声状态下逐滴加入水，冰浴超声；反应液经冰浴透析、冷冻干燥，所得产物命名为RIF@PLA-PEG-Gd/Mal；
S4、将步骤S3所得RIF@PLA-PEG-Gd/Mal溶解在磷酸盐缓冲液中，得到溶液溶液M；将RVG29溶解在磷酸盐缓冲液中，得到溶液溶液N，并在搅拌状态下将溶液N滴加到溶液M中，反应；反应结束后，反应液经冰浴透析、冷冻干燥，所得产物即目标产物，命名为RIF@PLA-PEG-Gd/Mal-RVG29；
其中，PLA-PEG-NH2是指聚乳酸-聚乙二醇-氨基，DTPA是指二亚乙基三胺五乙酸二酐，PLA-PEG-Mal是指聚乳酸-聚乙二醇-马来酰亚胺。
4.按权利要求3所述的脑靶向性的纳米药物递送系统的制备方法，其特征在于：
步骤S1中所述的PLA-PEG-NH2的分子量为10000～20000；
步骤S1中所述的PLA-PEG-NH2和DTPA的配比为质量比18～25：1；
步骤S1中所述的三乙胺的用量按PLA-PEG-NH2：三乙胺＝1800～2500mg：1ml计；
步骤S1中所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺和二甲基亚砜中的任意一种；
步骤S1中所述的反应的条件为温度40～50℃、时间6～12h。
5.按权利要求3所述的脑靶向性的纳米药物递送系统的制备方法，其特征在于：
步骤S2中所述的PLA-PEG-DTPA、六水合氯化钆的配比为质量比1：0.01～2；
步骤S2中所述的水/二氧六环混合溶剂中水和二氧六环以1：2的体积比混合；
步骤S2中所述的水/二氧六环混合溶剂的用量按PLA-PEG-DTPA：水/二氧六环混合溶剂＝10mg：1～2mL计；
步骤S2中所述的调节体系的pH值采用的试剂是浓度为0.1mol/L的NaOH溶液；
步骤S2中所述的反应的条件为温度45～55℃、时间3～5h。
6.根据权利要求3所述的脑靶向性的纳米药物递送系统的制备方法，其特征在于：
步骤S3中所述的PLA-PEG-Mal的分子量10000～20000；
步骤S3中溶解聚乳酸-聚乙二醇-钆、聚乳酸-聚乙二醇-马来酰亚胺和利福平所用的有机溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃中的任意一种；
步骤S3中所述的PLA-PEG-Gd、PLA-PEG-Mal、利福平的配比为质量比1：0.01～1：0.01～1；
步骤S3中所述的超声分散的时间为10～20min；
步骤S3中所述的水的用量按聚乳酸-聚乙二醇-钆：水＝3～5mg：1mL计；
步骤S3中所述的冰浴超声的时间为25～35min。
7.根据权利要求3所述的脑靶向性的纳米药物递送系统的制备方法，其特征在于：
步骤S4中所述的磷酸盐缓冲液均是浓度为0.01mol/L、pH＝7.3～7.5的磷酸盐缓冲液；
步骤S4中所述的RIF@PLA-PEG-Gd/Mal和RVG29的用量按质量比10：0.01～1配比；
步骤S4中所述的反应的时间为3～5h。
8.根据权利要求3所述的脑靶向性的纳米药物递送系统的制备方法，其特征在于：
步骤S1中所述的透析采用截留分子量为3000～4000Da的透析袋实现；透析的时间为20～30h；
步骤S2中所述的透析采用截留分子量为500～2000Da的透析袋实现；透析的时间为20～30h；
步骤S3中所述的冰浴透析采用截留分子量为3000～4000Da的透析袋实现；冰浴透析的时间为20～30h；
步骤S4中所述的冰浴透析采用截留分子量为3000～4000Da的透析袋实现；冰浴透析的时间为10～15h。
9.权利要求1或2所述的脑靶向性的纳米药物递送系统在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病药物中的应用。
10.权利要求1或2所述的脑靶向性的纳米药物递送系统在制备阿尔茨海默病诊断和/或预后评估试剂中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011396762.XA CN112741837B (zh) | 2020-12-03 | 2020-12-03 | 一种脑靶向性的纳米药物递送系统及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011396762.XA CN112741837B (zh) | 2020-12-03 | 2020-12-03 | 一种脑靶向性的纳米药物递送系统及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112741837A true CN112741837A (zh) | 2021-05-04 |
| CN112741837B CN112741837B (zh) | 2022-02-18 |
Family
ID=75649001
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011396762.XA Active CN112741837B (zh) | 2020-12-03 | 2020-12-03 | 一种脑靶向性的纳米药物递送系统及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112741837B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114588275A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-06-07 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一种具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶及其制备方法与应用 |
| CN114887067A (zh) * | 2022-04-27 | 2022-08-12 | 广州贝奥吉因生物科技股份有限公司 | 脑靶向石墨烯量子点及其基因复合物、制备方法和应用 |
| CN115813881A (zh) * | 2022-12-05 | 2023-03-21 | 浙江大学 | 脑靶向辛酸纳米颗粒包含其的药物及其制备方法和用途 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050255152A1 (en) * | 2002-04-18 | 2005-11-17 | President And Fellows Of Harvard College | System for enhanced targeted delivery |
| KR20140014579A (ko) * | 2012-07-25 | 2014-02-06 | 광주과학기술원 | 뇌조직에 특이적으로 전달 가능한 뇌조직 표적화 펩티드와 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 뇌표적 나노전달체 |
| CN103655517A (zh) * | 2013-11-19 | 2014-03-26 | 南京医科大学 | 一种Pep-1肽修饰的脑胶质瘤靶向纳米递药系统及其制备方法 |
| CN104491869A (zh) * | 2014-12-09 | 2015-04-08 | 国家纳米科学中心 | 一种脑靶向载药纳米颗粒 |
| CN110092834A (zh) * | 2018-01-29 | 2019-08-06 | 复旦大学 | 一种多功能脑神经元靶向多肽及其在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用 |
-
2020
- 2020-12-03 CN CN202011396762.XA patent/CN112741837B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050255152A1 (en) * | 2002-04-18 | 2005-11-17 | President And Fellows Of Harvard College | System for enhanced targeted delivery |
| KR20140014579A (ko) * | 2012-07-25 | 2014-02-06 | 광주과학기술원 | 뇌조직에 특이적으로 전달 가능한 뇌조직 표적화 펩티드와 키토산이 결합된 플루로닉 고분자를 포함하는 뇌표적 나노전달체 |
| CN103655517A (zh) * | 2013-11-19 | 2014-03-26 | 南京医科大学 | 一种Pep-1肽修饰的脑胶质瘤靶向纳米递药系统及其制备方法 |
| CN104491869A (zh) * | 2014-12-09 | 2015-04-08 | 国家纳米科学中心 | 一种脑靶向载药纳米颗粒 |
| CN110092834A (zh) * | 2018-01-29 | 2019-08-06 | 复旦大学 | 一种多功能脑神经元靶向多肽及其在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 刘洋 等: "纳米药物递释系统的脑靶向研究进展", 《药学学报》 * |
| 周泳芬等: "利福平防治神经退行性疾病的基础及临床研究进展", 《海南医学》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114588275A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-06-07 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一种具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶及其制备方法与应用 |
| CN114588275B (zh) * | 2022-02-21 | 2024-03-12 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一种具有脑靶向性的细胞膜仿生修饰药物纳米晶及其制备方法与应用 |
| CN114887067A (zh) * | 2022-04-27 | 2022-08-12 | 广州贝奥吉因生物科技股份有限公司 | 脑靶向石墨烯量子点及其基因复合物、制备方法和应用 |
| CN114887067B (zh) * | 2022-04-27 | 2024-03-15 | 广州贝奥吉因生物科技股份有限公司 | 脑靶向石墨烯量子点及其基因复合物、制备方法和应用 |
| CN115813881A (zh) * | 2022-12-05 | 2023-03-21 | 浙江大学 | 脑靶向辛酸纳米颗粒包含其的药物及其制备方法和用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112741837B (zh) | 2022-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112741837B (zh) | 一种脑靶向性的纳米药物递送系统及其制备方法 | |
| JP4936312B2 (ja) | 新規な両親媒性物質、それを用いた薬剤搬送システム及び分子イメージングシステム | |
| Li et al. | Development of a reactive oxygen species (ROS)-responsive nanoplatform for targeted oral cancer therapy | |
| Cao et al. | A triple modality BSA-coated dendritic nanoplatform for NIR imaging, enhanced tumor penetration and anticancer therapy | |
| CN107789632A (zh) | 一种t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统及其制备方法 | |
| CN107184987B (zh) | 一种硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体及其制备方法和应用 | |
| WO2017063542A1 (zh) | 稳定化a7r多肽及其在构建肿瘤靶向诊治递药系统中的用途 | |
| CN108164584B (zh) | Vap多肽及其在制备靶向诊疗肿瘤药物中的应用 | |
| CN113004536A (zh) | 一种金属-氨基酸/肽配位聚合物及其应用 | |
| Zhang et al. | Enhanced fluorescence/magnetic resonance dual imaging and gene therapy of liver cancer using cationized amylose nanoprobe | |
| Tian et al. | Dextran-doxorubicin prodrug nanoparticles conjugated with CD147 monoclonal antibody for targeted drug delivery in hepatoma therapy | |
| US20230330136A1 (en) | Blood-brain barrier-penetrating nanotheranostics for acute and chronic neurodegenerative diseases and the like | |
| CN109422801B (zh) | 多功能靶向多肽rap及其在制备肿瘤靶向递送系统中的用途 | |
| CN111514316B (zh) | 一种炎症靶向及微环境响应性纳米系统及制备方法与应用 | |
| CN113384554A (zh) | 一种药物递送载体及其制备方法和应用 | |
| Jia et al. | Specific modification and self-transport of porphyrins and their multi-mechanism cooperative antitumor studies | |
| KR100943043B1 (ko) | 산화철 나노입자가 봉입된 수용성 키토산-소수성 리놀레산복합체 자기-조립 나노입자, 이의 제조방법 및 이를포함하는 간질환 진단용 조영제 | |
| CN107028882B (zh) | 一种物理包裹的肿瘤靶向纳米递药系统及制备方法和应用 | |
| KR101675948B1 (ko) | 동맥경화 진단용 키토산 나노입자 복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조영제 조성물 | |
| CN108939089B (zh) | 群体感应多肽及其在制备肿瘤靶向诊治递药系统中的用途 | |
| CN111067865A (zh) | 一种tpgs2000-dox纳米胶束及其制备方法 | |
| CN116531524B (zh) | 一种脑靶向纳米粒及其制备方法和应用 | |
| CN113214353B (zh) | 两亲性寡肽结构物质 | |
| Shah et al. | Self-assembled peptides and proteins for biomedical applications | |
| KR101685379B1 (ko) | 레반 나노입자의 제조 및 이의 생의학적 응용 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |