CN112472672B - 一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药及制备方法和应用 - Google Patents

一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种多肽‑多糖接枝共聚物基铂类纳米前药及制备方法和应用，首先利用碳二亚胺法将二元或三元酰肼接枝于含羧基多糖聚合物分子上，得到酰肼化多糖聚合物；然后再将端环氧化多肽接枝于多糖聚合物上，得到两亲性的酰肼化多肽‑多糖接枝共聚物；最后该共聚物经超声分散于水中形成纳米颗粒，与铂类抗肿瘤药物混合，经离心和冻干过程，即得到多肽‑多糖接枝共聚物基铂类纳米前药。该纳米前药粒径在100纳米至200纳米范围内可控，载药过程简单、制备条件温和，适用于多种铂类抗肿瘤药物，载药率可达20％，可广泛用于各种实体肿瘤的治疗。

Description

一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药及制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药及制备方法和应用。
背景技术
铂类抗肿瘤药物是目前临床肿瘤化疗的基本药物，具有抗肿瘤谱广、效果好、与多种抗肿瘤药物有协同作用等特点。然而，游离态的铂类抗肿瘤药物对正常组织毒副作用大，容易发生肾毒性和神经毒性严重毒副作用，患者需服用利尿剂或细胞保护剂以降低毒性。同时，游离态的铂类抗肿瘤药物易被机体代谢排出，药物浓度波动大，难以充分发挥疗效，并易引起肿瘤细胞多药耐药性的产生，进一步降低治疗效果。因此，如何提高铂类抗肿瘤药物在机体内的稳定性、循环时间和肿瘤积累量，是改善其抗肿瘤效果和降低毒副作用的关键。
近年研究表明，纳米技术和纳米材料在改善药物代谢动力学、提高抗肿瘤药物效果、降低毒副作用等方面展现出独特优势。铂类抗肿瘤药物通常在水中具有一定的溶解性，往往需要在铂类抗肿瘤药物上修饰疏水基团或可发生化学反应的官能团，通过疏水作用、化学键、静电吸附或配位作用等形式载于聚合物纳米粒上，得到铂类纳米前药，可通过EPR效应实现在肿瘤病灶的积累。其中，利用配位作用载于载体上主要适用于顺铂和含羧基的聚合物，它们通过羧基-铂配位作用实现药物装载，可以大大提高药物的溶解度，改善循环时间和稳定性。但这种方法反应时间通常需要2-3天，并且反应效率并不理想。
两亲性接枝共聚物或嵌段共聚物是制备聚合物纳米药物载体的常用材料。这类共聚物纳米粒通常是由合成的油溶性共聚物在水中自组装形成的。多糖聚合物通常具有优异的生物相容性、生物可降解性和非免疫原性等功能。然而，水溶性多糖聚合物往往很难与疏水性高分子制备出两亲性共聚物。近年来，由α-氨基酸-N-羧基内酸酐法合成的多肽具有生物降解性、生物相容性优异、分子结构设计灵活等优点，已成为药物载体材料研究的热点之一。然而，此类多肽不易与多糖聚合物反应形成两亲性共聚物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药及制备方法和应用。本发明的多肽-多糖接枝共聚物纳米颗粒是多肽-多糖接枝共聚物在混合溶剂中自组装形成的，铂类抗肿瘤药物在该纳米粒上搭载所需时间仅为数个小时，且药物装载效率和载药量高，药物释放具有肿瘤微环境响应性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药的制备方法，包括如下步骤：
(1)向含羧基多糖聚合物水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基0.5至2小时，再加入小分子有机酰肼，反应12小时至72小时后进行透析和冻干，得到酰肼化多糖聚合物；
(2)将端氨基多肽溶于有机溶剂制成溶液，加入双环氧类小分子物质，经30至65摄氏度反应12至48小时，经非溶剂沉淀得到端环氧化多肽；
(3)将酰肼化多糖聚合物和端环氧化多肽溶于水-有机混合溶剂中，经25-90摄氏度反应4-24小时，透析，得到多肽-多糖接枝共聚物纳米颗粒悬液；
(4)将纳米颗粒悬液与铂类抗肿瘤药物溶液混合，于37摄氏度摇床中振动0.5-24小时，离心，冻干，得到多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(1)中含羧基多糖聚合物水溶液的浓度为0.1至15毫克/毫升；含羧基多糖聚合物为透明质酸钠、海藻酸钠、肝素、羧甲基壳聚糖、羧基纤维素或羧甲基淀粉；含羧基多糖聚合物的分子量为5000Da至5000kDa。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(1)中的小分子有机酰肼为3,3'-二硫代二丙酰肼、乙二酰肼、己二酸二酰肼或柠檬酸三酰肼。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(1)中的酰肼化多糖聚合物的酰肼化度为3％至60％。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(2)中的端氨基多肽为单端氨基的聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)、聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)、聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)或聚(L-苯丙氨酸)，端氨基多肽的分子量为1000Da至50kDa；有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；将端氨基多肽溶于有机溶剂制成的溶液的质量浓度为1％至20％。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(2)中的双环氧类小分子物质为1,4-丁二醇缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚或新戊二醇二缩水甘油醚；双环氧类小分子物质的加入量为端氨基多肽中氨基物质的量的5至30倍；非溶剂为甲醇或乙醇。
本发明进一步的改进在于，步骤(3)中，水-有机混合溶剂通过将水与有机溶剂按体积比1:(0.5～3)混合制得。
本发明进一步的改进在于，所述步骤4)中铂类抗肿瘤药物为顺铂、卡铂、奈达铂、乐铂或奥沙利铂；纳米颗粒悬液的溶度为0.5至10毫克/毫升；铂类抗肿瘤药物溶液的浓度为0.2至26毫克/毫升；纳米颗粒悬液与铂类抗肿瘤药物溶液的体积比为1:0.1至1:2。
一种根据上述的方法制备的多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药，其特征在于，该前药粒径范围为100纳米至200纳米，载药率可达20％。
一种如上所述的多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药在制备用于治疗乳腺癌、肝癌和肺癌药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)由两亲性多肽-多糖接枝共聚物的溶液经透析方法逐渐去除有机溶剂，多肽-多糖接枝共聚物自发组装成粒径均匀的核壳结构纳米粒，药物通过配位载于壳层中，对粒径分布无负面影响。制得的纳米前药粒径分布呈现单峰分布，粒径主要位于100纳米至200纳米范围内并可调节，有利于经EPR效应积累于肿瘤组织；
(2)该纳米载体的壳层含有能高效非特异性与铂元素配位的酰肼基团，使得纳米前药适用于临床使用的各种铂类抗肿瘤药物，如顺铂、奥沙利铂、卡铂等；
(3)铂类药物通过配位键与纳米载体结合，该配位键对酸性pH敏感可解离，赋予药物响应性肿瘤酸性微环境而释放的功能；
(4)载体材料为多肽和多糖，可响应体内酶降解，降解产物主要为氨基酸、水、CO2等，具有生物相容性优异、可生物降解、降解产物无毒性等特点；
(5)该纳米前药的载药过程通过配位化学反应实现，室温、水性环境中将纳米载体和药物直接混合即可快速完成。制备方法具有载药效率高、载药周期短、过程简单、条件温和等优点。
附图说明
图1是实施例1合成的聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-透明质酸接枝共聚物的差热分析图。
图2是实施例1合成的聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-透明质酸接枝共聚物的红外光谱图。
图3是实施例1合成的聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-透明质酸接枝共聚物纳米粒的透射电子显微镜照片。
图4是实施例1合成的聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-透明质酸接枝共聚物基铂类纳米前药的透射电子显微镜照片。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述，但本发明并不限于此。
本发明的一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药及制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)酰肼化多糖聚合物的制备：将含羧基多糖聚合物溶于水中形成浓度为0.1至15毫克/毫升的溶液，然后加入羧基摩尔数5％～65％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化羧基0.5至2小时，再加入羧基摩尔数15％～650％小分子有机酰肼，室温下反应12小时至72小时后进行透析和冻干，得到酰肼化多糖聚合物；
(2)端环氧化多肽的合成：将端氨基多肽溶于有机溶剂制成质量浓度为1％至20％的溶液，然后加入氨基摩尔数5至30倍的双环氧类小分子物质，在30至65摄氏度反应12至48小时，经非溶剂沉淀，得到端环氧化多肽；
(3)多肽-多糖接枝共聚物纳米颗粒的合成：将酰肼化多糖聚合物和端环氧化多肽溶于水与有机溶剂体积比为1:0.5～1:3的水-有机溶剂混合物中，经25-90摄氏度反应4-24小时，经透析过程得到多肽-多糖接枝共聚物纳米颗粒悬液。
(4)铂类纳米前药的制备：将浓度为0.5至10毫克/毫升的纳米颗粒悬液与浓度为0.2至26毫克/毫升的铂类抗肿瘤药物溶液按体积比1:0.1至1:2混合，于37摄氏度摇床中振动0.5-24小时，经离心和冻干过程，获得多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药。
所述步骤(1)中的含羧基多糖聚合物为透明质酸钠、海藻酸钠、肝素、羧甲基壳聚糖、羧基纤维素或羧甲基淀粉等。
所述步骤(1)中的含羧基多糖聚合物的分子量为5000Da至5000kDa。
所述步骤(1)中的小分子有机酰肼为3,3'-二硫代二丙酰肼、乙二酰肼、己二酸二酰肼或柠檬酸三酰肼等。
所述步骤(1)中的酰肼化多糖聚合物的酰肼化度为3％至60％。
所述步骤(2)中的端氨基多肽为单端氨基的聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)、聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)、聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)或聚(L-苯丙氨酸)等，其分子量为1000Da至50kDa。
所述步骤(2)中的双环氧类小分子物质为1,4-丁二醇缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚或新戊二醇二缩水甘油醚。
所述步骤(2)中的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃等，所述非溶剂为甲醇或乙醇等。
所述步骤(4)中铂类抗肿瘤药物为顺铂、卡铂、奈达铂、乐铂、奥沙利铂等。
一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药，其粒径范围为100纳米至200纳米，载药率可达20％，可用于制备乳腺癌、肝癌和肺癌等实体瘤治疗药物。
下面为具体实施例。
实施例1
(1)酰肼化透明质酸的制备：将分子量为8000Da的透明质酸钠溶于水中形成浓度为10毫克/毫升的溶液，然后加入羧基摩尔数45％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化羧基1小时，再加入羧基摩尔数180％的3,3'-二硫代二丙酰肼，室温下反应72小时后进行透析和冻干，得到酰肼化度为40％的酰肼化透明质酸；
(2)端环氧化聚(L-谷氨酸-β-苄酯)的合成：将分子量为5000Da的端氨基聚(L-谷氨酸-β-苄酯)溶于N,N-二甲基甲酰胺制成质量浓度为5％的溶液，然后加入氨基摩尔数15倍的1,4-丁二醇缩水甘油醚，在37摄氏度反应24小时，经乙醇沉淀，得到端环氧化聚(L-谷氨酸-β-苄酯)；
(3)聚(L-谷氨酸-β-苄酯)-透明质酸接枝共聚物纳米颗粒的合成：将酰肼化透明质酸和端环氧化聚(L-谷氨酸-β-苄酯)溶于水与N,N-二甲基甲酰胺体积比为1:1的水-N,N-二甲基甲酰胺混合物中，经70摄氏度反应6小时，经透析过程得到接枝共聚物纳米颗粒悬液。
(4)顺铂纳米前药的制备：将浓度为1毫克/毫升的纳米颗粒悬液与浓度为1毫克/毫升的顺铂溶液按体积比1：1混合，于37摄氏度摇床中振动6小时，经离心和冻干过程，获得多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药。
由图1可知，在接枝共聚物的DSC曲线中在11.8摄氏度出现了玻璃化转变温度，这归于聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)成分，该温度略高于纯聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)的玻璃化转变温度9.5摄氏度，而酰肼化透明质酸没有出现玻璃化转变温度，这说明聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-透明质酸接枝共聚物已被成功合成。
由图2可知，与酰肼化透明质酸的红外光谱图相比，聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-透明质酸接枝共聚物的红外光谱图中出现了原本归属于聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)的特征吸收峰，包括3292cm-1、1736cm-1、752cm-1等，进一步证实聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-透明质酸接枝共聚物的成功合成，这也佐证了图1的结果。
由图3中聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-透明质酸接枝共聚物自组装形成的纳米颗粒的透射电子显微镜照片可知，该纳米颗粒的粒径分布范围为50纳米至90纳米，小于激光粒度仪法测试的100纳米至200纳米，这主要是因为透射电子显微镜试样处于干态，而激光粒度仪测试的是水动力学体积；同时，这些纳米颗粒呈现球形或近球形形貌，粒径分布非常均匀。
由图4可知，聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-透明质酸接枝共聚物纳米粒装载顺铂后，纳米颗粒的形貌和粒径分布几乎没有变化，但纳米颗粒的衬度显著增加，表明顺铂已被成功装载于该接枝共聚物纳米粒中。
实施例2
(1)酰肼化透明质酸的制备：将分子量为8kDa的透明质酸钠溶于水中形成浓度为15毫克/毫升的溶液，然后加入羧基摩尔数25％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化羧基2小时，再加入羧基摩尔数100％的乙二酰肼，室温反应72小时后进行透析和冻干，得到酰肼化度为22％的酰肼化透明质酸；
(2)端环氧化聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)的合成：将分子量为4000Da的端氨基聚(L-谷氨酸-β-苄酯)溶于四氢呋喃制成质量浓度为5％的溶液，然后加入氨基摩尔数10倍的1,4-丁二醇缩水甘油醚，在37摄氏度反应18小时，经甲醇沉淀，得到端环氧化聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)；
(3)聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-透明质酸接枝共聚物纳米颗粒的合成：将酰肼化透明质酸和端环氧化聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)溶于水与四氢呋喃体积比为1:1.5的水-四氢呋喃混合物中，经60摄氏度反应8小时，经透析过程得到聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-透明质酸接枝共聚物纳米颗粒悬液。
(4)顺铂纳米前药的制备：将浓度为2毫克/毫升的纳米颗粒悬液与浓度为1毫克/毫升的顺铂溶液按体积比1:1.5混合，于37摄氏度摇床中振动8小时，经离心和冻干过程，获得聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-透明质酸接枝共聚物基顺铂纳米前药。
实施例3
(1)酰肼化透明质酸钠的制备：将分子量为8000Da的透明质酸钠溶于水中形成浓度为12毫克/毫升的溶液，然后加入羧基摩尔数23％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化羧基1小时，再加入羧基摩尔数100％的3,3'-二硫代二丙酰肼，室温反应24小时后进行透析和冻干，得到酰肼化度为20％的酰肼化透明质酸；
(2)端环氧化聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)的合成：将分子量为10kDa的端氨基聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)溶于二甲基亚砜制成质量浓度为6％的溶液，然后加入氨基摩尔数15倍的乙二醇二缩水甘油醚，在30摄氏度反应18小时，经甲醇沉淀，得到端环氧化聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)；
(3)聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)-透明质酸接枝共聚物纳米颗粒的合成：将酰肼化透明质酸和端环氧化聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)溶于水与二甲基亚砜体积比为1:2的水-二甲基亚砜混合物中，经55摄氏度反应24小时，经透析过程得到接枝共聚物纳米颗粒悬液。
(4)卡铂纳米前药的制备：将浓度为5毫克/毫升的纳米颗粒悬液与浓度为5毫克/毫升的卡铂溶液按体积比1:1混合，于37摄氏度摇床中振动4小时，经离心和冻干过程，获得多肽-多糖接枝共聚物基卡铂纳米前药。
实施例4
(1)酰肼化羧甲基壳聚糖的制备：将分子量为10kDa的羧甲基壳聚糖溶于水中形成浓度为3毫克/毫升的溶液，然后加入羧基摩尔数35％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化羧基2小时，再加入羧基摩尔数140％的3,3'-二硫代二丙酰肼，室温反应24小时后进行透析和冻干，得到酰肼化度为29％的酰肼化羧甲基壳聚糖；
(2)端环氧化聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)的合成：将分子量为5000Da的端氨基聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)溶于二甲基亚砜制成质量浓度为10％的溶液，然后加入氨基摩尔数15倍的1,4-丁二醇缩水甘油醚，在65摄氏度反应48小时，经乙醇沉淀，得到端环氧化聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)；
(3)聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)-羧甲基壳聚糖接枝共聚物纳米颗粒的合成：将酰肼化羧甲基壳聚糖和端环氧化聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)溶于水与二甲基亚砜体积比为1:1的水-二甲基亚砜混合物中，经85摄氏度反应4小时，经透析过程得到多肽-多糖接枝共聚物纳米颗粒悬液。
(4)乐铂纳米前药的制备：将浓度为10毫克/毫升的纳米颗粒悬液与浓度为10毫克/毫升的乐铂溶液按体积比1:1混合，于45摄氏度摇床中振动16小时，经离心和冻干过程，获得乐铂纳米前药。
实施例5
(1)酰肼化海藻酸钠的制备：将分子量为100kDa的海藻酸钠溶于水中形成浓度为1毫克/毫升的溶液，然后加入羧基摩尔数35％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化羧基2小时，再加入羧基摩尔数140％的乙二酰肼，室温反应24小时后进行透析和冻干，得到酰肼化度为3％的酰肼化海藻酸；
(2)端环氧化聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)的合成：将分子量为5000Da的聚(L-天冬氨酸-γ-苄酯)溶于二甲基亚砜制成质量浓度为1％的溶液，然后加入氨基摩尔数15倍的1,6-己二醇二缩水甘油醚，在65摄氏度反应48小时，经乙醇沉淀，得到端环氧化聚(L-天冬氨酸-γ-苄酯)；
(3)聚(L-天冬氨酸-γ-苄酯)-羧甲基壳聚糖接枝共聚物纳米颗粒的合成：将酰肼化海藻酸和端环氧化聚(L-天冬氨酸-γ-苄酯)溶于水与二甲基亚砜体积比为1:0.5的水-二甲基亚砜混合物中，经90摄氏度反应4小时，经透析过程得到多肽-多糖接枝共聚物纳米颗粒悬液。
(4)奥沙利铂纳米前药的制备：将浓度为0.5毫克/毫升的纳米颗粒悬液与浓度为0.2毫克/毫升的奥沙利铂溶液按体积比1:2混合，于37摄氏度摇床中振动10小时，经离心和冻干过程，获得奥沙利铂纳米前药。
实施例6
(1)酰肼化羧甲基壳聚糖的制备：将分子量为400kDa的羧甲基壳聚糖溶于水中形成浓度为1毫克/毫升的溶液，然后加入羧基摩尔数35％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化羧基2小时，再加入羧基摩尔数140％的己二酸二酰肼，室温反应24小时后进行透析和冻干，得到酰肼化度为60％的酰肼化羧甲基壳聚糖；
(2)端环氧化聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)的合成：将分子量为8000Da的聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)溶于N,N-二甲基甲酰胺制成质量浓度为20％的溶液，然后加入氨基摩尔数5倍的乙二醇二缩水甘油醚，在30摄氏度反应48小时，经乙醇沉淀，得到端环氧化聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)；
(3)聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)-羧甲基壳聚糖接枝共聚物纳米颗粒的合成：将酰肼化羧甲基壳聚糖和端环氧化聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)溶于水与N,N-二甲基甲酰胺体积比为1:3的水-二甲基亚砜混合物中，经55摄氏度反应24小时，经透析过程得到多肽-多糖接枝共聚物纳米颗粒悬液。
(4)乐铂纳米前药的制备：将浓度为10毫克/毫升的纳米颗粒悬液与浓度为15毫克/毫升的乐铂溶液按体积比5:1混合，于37摄氏度摇床中振动24小时，经离心和冻干过程，获得乐铂纳米前药。
实施例7
(1)酰肼化羧基纤维素的制备：将分子量为100kDa的羧基纤维素溶于水中形成浓度为5毫克/毫升的溶液，然后加入羧基摩尔数35％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化羧基2小时，再加入羧基摩尔数140％的柠檬酸三酰肼，室温反应24小时后进行透析和冻干，得到酰肼化度为10％的酰肼化羧基纤维素；
(2)端环氧化聚(L-谷氨酸-β-苄酯)的合成：将分子量为5000Da的聚(L-谷氨酸-β-苄酯)溶于四氢呋喃制成质量浓度为5％的溶液，然后加入氨基摩尔数30倍的新戊二醇二缩水甘油醚，在40摄氏度反应35小时，经乙醇沉淀，得到端环氧化聚(L-谷氨酸-β-苄酯)；
(3)聚(L-谷氨酸-β-苄酯)-羧基纤维素接枝共聚物纳米颗粒的合成：将酰肼化羧基纤维素和端环氧化聚(L-谷氨酸-β-苄酯)溶于水与四氢呋喃体积比为1:2的水-二甲基亚砜混合物中，经50摄氏度反应22小时，经透析过程得到多肽-多糖接枝共聚物纳米颗粒悬液。
(4)奈达铂纳米前药的制备：将浓度为3毫克/毫升的纳米颗粒悬液与浓度为8毫克/毫升的奈达铂溶液按体积比2:1混合，于37摄氏度摇床中振动0.5小时，经离心和冻干过程，获得奈达铂纳米前药。
实施例8
(1)酰肼化羧甲基淀粉的制备：将分子量为40kDa的羧甲基淀粉溶于水中形成浓度为8毫克/毫升的溶液，然后加入羧基摩尔数35％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化羧基2小时，再加入羧基摩尔数140％的3,3'-二硫代二丙酰肼，室温反应24小时后进行透析和冻干，得到酰肼化度为50％的酰肼化羧甲基淀粉；
(2)端环氧化聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)的合成：将分子量为4000Da的端氨基聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)溶于二甲基亚砜制成质量浓度为10％的溶液，然后加入氨基摩尔数20倍的1,4-丁二醇缩水甘油醚，在50摄氏度反应20小时，经甲醇沉淀，得到端环氧化聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)；
(3)聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)-羧甲基淀粉接枝共聚物纳米颗粒的合成：将酰肼化羧甲基淀粉和端环氧化聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)溶于水与二甲基亚砜体积比为1:1的水-二甲基亚砜混合物中，经70摄氏度反应10小时，经透析过程得到多肽-多糖接枝共聚物纳米颗粒悬液。
(4)乐铂纳米前药的制备：将浓度为5毫克/毫升的纳米颗粒悬液与浓度为26毫克/毫升的乐铂溶液按体积比3:1混合，于37摄氏度摇床中振动16小时，经离心和冻干过程，获得乐铂纳米前药。
本发明首先利用碳二亚胺法将二元或三元酰肼接枝于含羧基多糖聚合物分子上，得到酰肼化多糖聚合物；然后再将端环氧化多肽接枝于多糖聚合物上，得到两亲性的酰肼化多肽-多糖接枝共聚物；最后该共聚物经超声分散于水中形成纳米颗粒，与铂类抗肿瘤药物混合，经离心和冻干过程，即得到多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药。该纳米前药粒径在100纳米至200纳米范围内可控，载药过程简单、制备条件温和，适用于多种铂类抗肿瘤药物，载药率可达20％，可广泛用于各种实体肿瘤的治疗。

Claims (10)

1.一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向含羧基多糖聚合物水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基0.5至2小时，再加入小分子有机酰肼，反应12小时至72小时后进行透析和冻干，得到酰肼化多糖聚合物；
(2)将端氨基多肽溶于有机溶剂制成溶液，加入双环氧类小分子物质，经30至65摄氏度反应12至48小时，经非溶剂沉淀得到端环氧化多肽；其中，端氨基多肽为单端氨基的聚(L-天冬氨酸-β-苄酯)、聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)、聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)或聚(L-苯丙氨酸)；双环氧类小分子物质为1,4-丁二醇缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚或新戊二醇二缩水甘油醚；
(3)将酰肼化多糖聚合物和端环氧化多肽溶于水-有机混合溶剂中，经25-90摄氏度反应4-24小时，透析，得到多肽-多糖接枝共聚物纳米颗粒悬液；
(4)将纳米颗粒悬液与铂类抗肿瘤药物溶液混合，于37摄氏度摇床中振动0.5-24小时，离心，冻干，得到多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药。
2.根据权利要求1所述的一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中含羧基多糖聚合物水溶液的浓度为0.1至15毫克/毫升；含羧基多糖聚合物为透明质酸钠、海藻酸钠、肝素、羧甲基壳聚糖、羧基纤维素或羧甲基淀粉；含羧基多糖聚合物的分子量为5000Da至5000kDa。
3.根据权利要求1所述的一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的小分子有机酰肼为3,3'-二硫代二丙酰肼、乙二酰肼、己二酸二酰肼或柠檬酸三酰肼。
4.根据权利要求1所述的一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的酰肼化多糖聚合物的酰肼化度为3％至60％。
5.根据权利要求1所述的一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药的制备方法，其特征在于，端氨基多肽的分子量为1000Da至50kDa；有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；将端氨基多肽溶于有机溶剂制成的溶液的质量浓度为1％至20％。
6.根据权利要求1所述的一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药的制备方法，其特征在于，双环氧类小分子物质的加入量为端氨基多肽中氨基物质的量的5至30倍；非溶剂为甲醇或乙醇。
7.根据权利要求1所述的一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，水-有机混合溶剂通过将水与有机溶剂按体积比1:(0.5～3)混合制得。
8.根据权利要求1所述的一种多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中铂类抗肿瘤药物为顺铂、卡铂、奈达铂、乐铂或奥沙利铂；纳米颗粒悬液的溶度为0.5至10毫克/毫升；铂类抗肿瘤药物溶液的浓度为0.2至26毫克/毫升；纳米颗粒悬液与铂类抗肿瘤药物溶液的体积比为1:0.1至1:2。
9.一种根据权利要求1-8中任意一项所述的方法制备的多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药，其特征在于，该前药粒径范围为100纳米至200纳米，载药率可达20％。
10.一种如权利要9所述的多肽-多糖接枝共聚物基铂类纳米前药在制备用于治疗乳腺癌、肝癌和肺癌药物中的应用。
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