CN112608398B - 一种共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药及其制备方法和应用，首先利用碳二亚胺法将3,3'‑二硫代二丙酰肼键接于多糖聚合物的羧基上，得到酰肼化多糖聚合物，接着将阿霉素经腙键连接到酰肼化多糖聚合物上，经自组装形成纳米颗粒，最后再将铂类药物载于纳米颗粒上，形成共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药。该纳米前药具有核壳结构，粒径在100‑200nm范围内可调，可响应谷胱甘肽和pH双重刺激实现药物的快速释放，可用于杀伤肿瘤细胞。本发明的纳米前药的制备方法具有原料易得、工艺条件温和、纯化过程简单、易于规模化制备等特点，在乳腺癌、肝癌等多种肿瘤治疗中具有应用前景。

Description

一种共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前 药及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是造成人类死亡的主要原因之一，2018年全球因癌症死亡的人数就高达960万人。近年来，新药研发和细胞免疫治疗成为研究热点，但化疗仍然是肿瘤治疗的基础。阿霉素作为最有效的抗癌药物之一，抗瘤谱较广，对包括乳腺癌、肝癌、肺癌在内的多种癌症均有很好的疗效。同时，我国肿瘤的化疗方案中约有70％-80％涉及铂类抗肿瘤药物，铂类抗肿瘤药物主要有顺铂、卡铂、奈达铂、环铂、奥沙利铂、洛铂等。然而，无论是阿霉素还是铂类抗肿瘤药物，基于单一药物的化疗常常因肿瘤细胞多药耐药而失败。很多研究已表明，基于多种药物的联合化疗可有效克服肿瘤细胞的多药耐药性。但是，如何将不同抗肿瘤药物同时高效地递送至肿瘤细胞内是目前研究的重点。
纳米技术使药物靶向递送和多种药物的共同递送成为可能，可有效提高治疗效果和降低对正常组织的毒副作用，在肿瘤治疗领域受到广泛关注。其中，基于聚合物的纳米前药是目前研究的焦点之一。在这类前药中，聚合物扮演着至关重要的角色，不仅要求其具有生物相容性和生物可降解性，还要具有功能性，可用于药物的修饰和改性。多糖聚合物是由醛糖或者酮糖通过糖苷键键接而成的一种天然高分子化合物，在自然界大量存在，具有无毒、价廉、生物相容性和生物可降解性好等优点。更为重要的是，多糖聚合物具有可修饰的功能性基团，可用于键接药物分子，制成形式多样的聚合物前药，可有效避免药物在递送过程中的泄漏问题，并可实现肿瘤特异性可控释放。因此，多糖聚合物在纳米药物递送领域中开发前景广阔，已成为肿瘤微环境敏感性纳米药物的研究热点。然而，能同时装载两种化疗药物并具有还原/pH双重刺激响应性释放行为的多糖聚合物基前药极少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药及其制备方法和应用，该纳米前药具有核壳结构、粒径在100～200nm范围内可调、还原/pH双重刺激响应性药物释放行为等特点，具有制备工艺条件温和、原料来源丰富、纯化过程简单、可批量制备等优点，适用于多种肿瘤的联合化疗。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药的制备方法，先利用碳二亚胺法制备酰肼化多糖聚合物，然后将酰肼化多糖聚合物依次经腙键键接阿霉素和配位键键接铂类药物，得到共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药。
本发明进一步的改进在于，具体过程如下：
(1)将含羧基多糖聚合物溶于水中制成含羧基多糖聚合物水溶液，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH值为5～5.5，搅拌使羧基活化，再加入3,3'-二硫代二丙酰肼，反应8～48小时后进行透析和冷冻干燥，得到酰肼化度为5％～60％的酰肼化多糖聚合物；
(2)在冰浴超声条件下，将阿霉素水溶液滴加入到酰肼化多糖聚合物水溶液中，然后将pH调至6.4～6.8，经0.5～24小时后用PBS缓冲液透析，经冷冻干燥后，得到载阿霉素的多糖基纳米颗粒；
(3)将载阿霉素的多糖基纳米颗粒分散于纯水中，形成悬浮液，然后将悬浮液与铂类抗肿瘤药物溶液混合均匀，在37℃摇床中反应0.5～72小时后进行透析、冷冻干燥，得到所述的共载阿霉素和铂类药物的多糖基纳米前药。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(1)中，含羧基多糖聚合物为透明质酸、海藻酸钠、肝素、羧甲基淀粉、羧甲基纤维素或羧甲基壳聚糖；所述步骤(1)中，含羧基多糖聚合物的分子量为8kDa～170kDa。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(1)中，含羧基多糖聚合物水溶液的质量浓度为0.1％～10％；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的加入量为含羧基多糖聚合物中羧基物质的量的5％～60％，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的物质的量比为1：(1～1.5)。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(1)中，3,3'-二硫代二丙酰肼与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的物质的量的比为(5～25):1。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(2)中，阿霉素水溶液的浓度为0.5～10mg/mL，酰肼化多糖聚合物水溶液的浓度为1～20mg/mL，阿霉素与酰肼化多糖聚合物上酰肼基团的物质的量的比为1:(1～5)。
本发明进一步的改进在于，所述步骤(3)中，悬浮液的浓度为1～20mg/mL，铂类抗肿瘤药物溶液的浓度0.5～5mg/mL，悬浮液与铂类药物溶液的体积比为(1～10):1；铂类抗肿瘤药物为顺铂、卡铂、奈达铂或洛铂抗肿瘤药物；透析采用的透析袋的截留分子量为1000Da，所述的冷冻干燥条件为：零下20摄氏度，时间为12～48小时。
一种上述方法制备得到的共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药，该纳米前药具有核壳结构，粒径在100～200nm范围内可调，能够响应谷胱甘肽和pH双重刺激实现药物释放。
一种如上述的共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明进一步的改进在于，肿瘤为乳腺癌或/和肝癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明制备的多糖基纳米前药是通过多糖聚合物及载阿霉素后形成的两亲性分子结构自组装形成的，粒径在100～200纳米范围内可调，粒径分布均匀，呈球形多泡状核壳结构；
(2)本发明提供的纳米前药显著增加了阿霉素和铂类药物的溶解性，且阿霉素和铂类药物分别经腙键和配位键键接于多糖聚合物上，既可有效防止药物在递送过程中泄露，又可延长药物的血液循环时间；
(3)本发明的纳米前药结合键为腙键和配位键，且含有二硫键，它们具有pH和还原刺激响应性，可响应肿瘤微环境的弱酸性和高浓度还原性物质如谷胱甘肽而实现肿瘤特异性药物释放，可提高肿瘤治疗效果；
(4)本发明的纳米前药是通过配位键连接铂类药物的，故适合多种铂类抗肿瘤药物如顺铂、卡铂、奈达铂等的装载，可实现阿霉素与不同铂类抗肿瘤药物联合，用于不同肿瘤的联合化疗；
(5)本发明的纳米前药的制备方法具有工艺条件温和、原料来源丰富、药物装载过程简单、易批量制备等优点。
附图说明
图1是实施例1制备的酰肼化透明质酸键接阿霉素后的1H-NMR谱图，*为DMSO-d6的化学位移。
图2是实施例1制备的酰肼化透明质酸载阿霉素后和载阿霉素/顺铂后的粒径分布图。其中，A为酰肼化透明质酸载阿霉素后粒径分布图，B为载阿霉素/顺铂后粒径分布图。
图3是实施例1制备的酰肼化透明质酸载阿霉素后的透射电镜照片。
图4是实施例1制备的酰肼化透明质酸装载阿霉素/顺铂后的透射电镜照片。其中，A为低放大倍数，B为高放大倍数。
图5是实施例1制备的共载阿霉素和顺铂的纳米前药在不同pH值和谷胱甘肽环境中的释放行为。其中，A为阿霉素，B为顺铂。
图6是实施例1制备的共载阿霉素和顺铂的纳米前药抑制HepG2肝癌细胞增殖的效果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述，但本发明并不限于此。
一种共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药的制备方法，主要过程是先利用碳二亚胺法制备酰肼化多糖聚合物，然后依次经腙键键接阿霉素和配位键键接铂类药物，得到共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药。具体包括如下步骤：
(1)酰肼化多糖聚合物的制备：将含羧基多糖聚合物溶于水中制成质量浓度为0.1％～10％的含羧基多糖聚合物水溶液，然后加入羧基物质的量5％～60％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺，其中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的物质的量比为1：(1～1.5)，用稀盐酸(1mol/L)调节pH值并维持在5～5.5，室温搅拌0.5～4小时以活化羧基，然后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，反应8～48小时后进行透析和冷冻干燥，得到酰肼化度为5％～60％的酰肼化多糖聚合物；
(2)载阿霉素的多糖基纳米颗粒的形成：在冰浴超声条件下，将浓度为0.5～10mg/mL的阿霉素水溶液滴加入到浓度为1～20mg/mL的酰肼化多糖聚合物水溶液中，然后将pH调至6.4～6.8，经0.5～24小时后用PBS缓冲液透析，经冷冻干燥后，得到载阿霉素的多糖基纳米颗粒；
(3)共载阿霉素和铂类药物的多糖基纳米前药的制备：将载阿霉素的多糖基纳米颗粒分散于纯水中，形成浓度为1～20mg/mL的悬浮液，然后与浓度0.5～5mg/mL的铂类药物溶液混合均匀，悬浮液与铂类药物溶液的体积比例为(1～10):1，pH值维持在7.0，经37℃摇床中反应0.5～72小时后进行透析、冷冻干燥，得到所述的共载阿霉素和铂类药物的多糖基纳米前药。
所述步骤(1)中的含羧基多糖聚合物为透明质酸、海藻酸钠、肝素、羧甲基淀粉、羧甲基纤维素或羧甲基壳聚糖等。
所述步骤(1)中的含羧基多糖聚合物的分子量为8kDa～170kDa。
所述步骤(1)中的3,3'-二硫代二丙酰肼与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为(5～25):1。
所述步骤(2)中的阿霉素与酰肼化多糖聚合物上酰肼基团的摩尔比为1:(1～5)。
所述步骤(3)中的铂类抗肿瘤药物与酰肼化多糖聚合物上酰肼基团的摩尔比为1:(1～5)。
所述步骤(3)中的铂类药物为顺铂、卡铂、奈达铂、洛铂等铂类抗肿瘤药物。
所述的步骤(1)改性多糖聚合物的透析的截留分子量为3500Da，所述的步骤(2)和(3)药物的透析的截留分子量为1000Da，所述的步骤(1)和(2)和(3)冷冻干燥条件为零下20摄氏度、时间为12～48小时。
所述步骤(2)和(3)中涉及药物的操作均在避光条件下进行。
一种共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药，该纳米前药具有核壳结构，粒径在100～200nm范围内可调，可响应谷胱甘肽和pH双重刺激实现药物释放，能够在制备用于治疗乳腺癌和肝癌等多种肿瘤药物中应用。
下面为具体实施例。
实施例1
(1)酰肼化透明质酸的制备：将分子量为8kDa透明质酸溶于水中制成质量浓度为1.0％的透明质酸水溶液，加入透明质酸中羧基物质的量42％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺二者物质的量比为1：1.5，用稀盐酸(1mol/L)调节pH值为5.3并维持在5.3，经室温搅拌1小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，反应36小时后，反应物置于截留分子量为3500Da的透析袋中透析48h，零下20摄氏度冷冻干燥得到酰肼化度为40％的酰肼化透明质酸；其中，3,3'-二硫代二丙酰肼与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为5:1。
(2)载阿霉素的透明质酸纳米颗粒的形成：避光条件下，在冰浴超声条件下，将浓度为6.5mg/mL的阿霉素水溶液滴加入浓度为10mg/mL的酰肼化透明质酸水溶液中，然后将pH调至6.5，经1小时后置于截留分子量为1000Da的透析袋用相应pH的PBS缓冲液透析36小时，经零下20摄氏度冷冻干燥后得到载阿霉素的透明质酸纳米颗粒；其中，阿霉素与酰肼化透明质酸中酰肼基团的摩尔比为1:2。
(3)共载阿霉素和顺铂的透明质酸基纳米前药的制备：避光条件下，将载阿霉素的透明质酸纳米颗粒分散于纯水中，形成浓度为12mg/mL的悬浮液，然后与浓度1mg/mL的顺铂溶液混合均匀，悬浮液与顺铂溶液二者体积比例为1:1，pH值维持为7，经37℃摇床中反应12小时后用截留分子量为1000Da的透析袋进行透析、零下20摄氏度冷冻干燥24小时，得到所述的共载阿霉素和顺铂的透明质酸基纳米前药。
该共载阿霉素和顺铂的透明质酸基纳米前药的结构式为：
Figure BDA0002809209770000071
本实施例制备的酰肼化透明质酸键接阿霉素后的1H-NMR谱图见图1。从图1可以看出，各个组分质子的化学位移均得到了很好地鉴定，表明该酰肼化透明质酸键接阿霉素的合成是成功的。
利用本实施例制备的酰肼化透明质酸载阿霉素后和载阿霉素/顺铂后能够在水中自组装形成纳米颗粒，动态光散射法测得的粒径分布图见图2。由图2中A和B可以看出，所制备的酰肼化透明质酸载阿霉素后和酰肼化透明质酸载阿霉素/顺铂后所形成的纳米颗粒粒径分布集中于120nm附近，粒径分布范围窄，比较理想，符合纳米药物对粒径的要求。
本实施例制备的酰肼化透明质酸载阿霉素后和装载阿霉素/顺铂后的透射电镜照片分别见图3和图4。从图3可以看出，酰肼化透明质酸载阿霉素后所形成的纳米颗粒的形貌呈现均匀分布的球形；从图4中A和B可以看出，酰肼化透明质酸装载阿霉素/顺铂后所形成的纳米颗粒呈现均匀分布的球形且具有多腔室核壳结构，且其粒径集中在120nm附近，符合纳米药物对粒径的要求。
体外药物释放行为的研究。采用透析法评估本实施例合成的共载阿霉素和顺铂的透明质酸基纳米前药的体外药物释放能力。具体操作如下：通过超声分散，配制浓度为1mg/mL的载药纳米粒子分散液，分别取5mL分散液装入四个截留分子量为1000Da的透析袋中，将透析袋分别放入100mL含谷胱甘肽的pH＝5.5和pH＝7.4以及单纯pH＝5.5和pH＝7.4的PBS溶液中，置于摇床上振荡。在设定的时间节点，取出2mL透析液，并换入2mL新鲜的PBS缓冲溶液，用紫外及可见光分光光度计测取出液体在480nm处的吸光度，即阿霉素的吸光值，用电感耦合等离子体质谱测其中铂元素的含量。图5表示合成的共载阿霉素和顺铂的透明质酸基纳米前药在不同pH和谷胱甘肽环境下的体外药物释放曲线图；从图5中A和B可以看到，在酸性条件下，腙键断裂使透明质酸基前药纳米粒子被破坏，从而使聚集在纳米粒子内部的阿霉素快速地释放出来。在谷胱甘肽作用下，二硫键断裂使顺铂得到快速释放，说明该合成的共载阿霉素和顺铂的透明质酸基纳米前药具有pH和还原响应性。
共载阿霉素和顺铂的透明质酸基纳米前药的细胞毒性测试。采用常规的四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)来检测本实施例所合成的共载阿霉素和顺铂的透明质酸基纳米前药抑制人肝肿瘤细胞(HepG2)增殖的能力。首先把HepG2细胞接种到96孔培养板上。将其放置于37℃，5％二氧化碳条件下培养12h后加入不同浓度的纳米粒子悬液继续培养24h。在培养板的每个小孔中加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，培养4h后吸走上清液并加入200μL的二甲基亚砜去溶解形成的甲瓒晶体。采用酶标仪检测每个孔在492nm处的吸光度(OD)。测试结果见图6，可以看到本实施例所合成的共载阿霉素和顺铂的透明质酸基纳米前药相较游离药物有很好的肿瘤细胞抑制效果。
实施例2
(1)酰肼化透明质酸的制备：将分子量为8kDa的透明质酸溶于水中制成质量浓度为1.0％的透明质酸水溶液，加入透明质酸中羧基物质的量22％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺二者物质的量比为1：1.5，用稀盐酸(1mol/L)调节pH值为5.0并维持在5.0，经室温搅拌0.5小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，反应48小时后，反应物置于截留分子量为3500Da的透析袋中透析72h，零下20摄氏度冷冻干燥得到酰肼化度为20％的酰肼化透明质酸；其中，3,3'-二硫代二丙酰肼与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为25:1。
(2)载阿霉素的透明质酸纳米颗粒的形成：避光条件下，在冰浴超声条件下，将浓度为10mg/mL的阿霉素水溶液滴加入浓度为20mg/mL的酰肼化透明质酸水溶液中，然后将pH调至6.8，经24小时后置于截留分子量为1000Da的透析袋用相应pH的PBS缓冲液透析48小时，经零下20摄氏度冷冻干燥后得到载阿霉素的透明质酸纳米颗粒；其中，阿霉素与酰肼化透明质酸中酰肼基团的摩尔比为1:5。
(3)共载阿霉素和顺铂的透明质酸基纳米前药的制备：避光条件下，将载阿霉素的透明质酸纳米颗粒分散于纯水中，形成浓度为20mg/mL的悬浮液，然后与浓度1mg/mL的顺铂溶液混合均匀，悬浮液与顺铂溶液二者体积比例为10:1，pH值维持为7，经37℃摇床中反应12小时后用截留分子量为1000Da的透析袋进行透析、零下20摄氏度冷冻干燥48小时，得到所述的共载阿霉素和顺铂的透明质酸基纳米前药。
实施例3
(1)酰肼化透明质酸的制备：将分子量为170kDa透明质酸溶于水中制成质量浓度为1.0％的透明质酸水溶液，加入透明质酸中羧基物质的量22％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺二者物质的量比为1：1.5，用稀盐酸(1mol/L)调节pH值为5.5并维持在5.5，经室温搅拌1小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，反应24小时后，反应物置于截留分子量为3500Da的透析袋中透析24h，零下20摄氏度冷冻干燥得到酰肼化度为20％的酰肼化透明质酸；其中，3,3'-二硫代二丙酰肼与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为10:1。
(2)载阿霉素的透明质酸纳米颗粒的形成：避光条件下，在冰浴超声条件下，将浓度为0.5mg/mL的阿霉素水溶液滴加入浓度为1mg/mL的酰肼化透明质酸水溶液中，然后将pH调至6.6，经0.5小时后置于截留分子量为1000Da的透析袋用相应pH的PBS缓冲液透析48小时，经零下20摄氏度冷冻干燥后得到载阿霉素的透明质酸纳米颗粒；其中，阿霉素与酰肼化透明质酸中酰肼基团的摩尔比为1:3。
(3)共载阿霉素和顺铂的透明质酸基纳米前药的制备：避光条件下，将载阿霉素的透明质酸纳米颗粒分散于纯水中，形成浓度为1mg/mL的悬浮液，然后与浓度1mg/mL的顺铂溶液混合均匀，二者体积比例为5:1，pH值维持中性，经37℃摇床中反应12小时后用截留分子量为1000Da的透析袋进行透析、零下20摄氏度冷冻干燥12小时，得到所述的共载阿霉素和顺铂的透明质酸基纳米前药。
实施例4
(1)酰肼化海藻酸钠的制备：将分子量为80kDa海藻酸钠溶于水中制成质量浓度为0.1％的海藻酸钠水溶液，加入羧基摩尔数5％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺二者物质的量比为1：1，用稀盐酸(1mol/L)调节pH值为5并维持在5，经室温搅拌4小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，反应8小时后，反应物置于截留分子量为3500Da的透析袋中透析48h，零下20摄氏度冷冻干燥得到酰肼化度为5％的酰肼化海藻酸钠；其中，3,3'-二硫代二丙酰肼与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为5:1。
(2)载阿霉素的海藻酸钠纳米颗粒的形成：避光条件下，在冰浴超声条件下，将浓度为10mg/mL的阿霉素水溶液滴加入浓度为3mg/mL的酰肼化海藻酸钠水溶液中，然后将pH调至6.4，经5小时后置于截留分子量为1000Da的透析袋用相应pH的PBS缓冲液透析36小时，经零下20摄氏度冷冻干燥后得到载阿霉素的海藻酸钠纳米颗粒；其中，阿霉素与酰肼化海藻酸钠中酰肼基团的摩尔比为1:1。
(3)共载阿霉素和洛铂的海藻酸钠基纳米前药的制备：避光条件下，将载阿霉素的海藻酸钠纳米颗粒分散于纯水中，形成浓度为4mg/mL的悬浮液，然后与浓度5mg/mL的洛铂溶液混合均匀，悬浮液与洛铂溶液二者体积比例为1:1，pH值维持为7，经37℃摇床中反应0.5小时后用截留分子量为1000Da的透析袋进行透析、零下20摄氏度冷冻干燥24小时，得到共载阿霉素和洛铂的还原/pH敏感型海藻酸钠基纳米前药。
实施例5
(1)酰肼化肝素的制备：将分子量为20kDa肝素溶于水中制成质量浓度为10％的肝素水溶液，加入羧基摩尔数60％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺二者物质的量比为1：1.2，用稀盐酸(1mol/L)调节pH值为5.1并维持在5.1，经室温搅拌2小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，反应20小时后，反应物置于截留分子量为3500Da的透析袋中透析48h，零下20摄氏度冷冻干燥得到酰肼化度为60％的酰肼化肝素；其中，3,3'-二硫代二丙酰肼与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为10:1。
(2)载阿霉素的肝素纳米颗粒的形成：避光条件下，在冰浴超声条件下，将浓度为1mg/mL的阿霉素水溶液滴加入浓度为6mg/mL的酰肼化肝素水溶液中，然后将pH调至6.5，经10小时后置于截留分子量为1000Da的透析袋用相应pH的PBS缓冲液透析36小时，经零下20摄氏度冷冻干燥后得到载阿霉素的肝素纳米颗粒；其中，阿霉素与酰肼化肝素中酰肼基团的摩尔比为1:4。
(3)共载阿霉素和洛铂的肝素基纳米前药的制备：避光条件下，将载阿霉素的肝素纳米颗粒分散于纯水中，形成浓度为4mg/mL的悬浮液，然后与浓度2mg/mL的洛铂溶液混合均匀，悬浮液与洛铂溶液二者体积比例为3:1，pH值维持为7，经37℃摇床中反应72小时后用截留分子量为1000Da的透析袋进行透析、零下20摄氏度冷冻干燥24小时，得到共载阿霉素和洛铂的还原/pH敏感型肝素基纳米前药。
实施例6
(1)酰肼化羧甲基淀粉的制备：将分子量为50kDa羧甲基淀粉溶于水中制成质量浓度为0.5％的羧甲基淀粉水溶液，加入羧基摩尔数11％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺二者物质的量比为1：1.3，用稀盐酸(1mol/L)调节pH值为5.2并维持在5.2，经室温搅拌3小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，反应15小时后，反应物置于截留分子量为3500Da的透析袋中透析48h，零下20摄氏度冷冻干燥得到酰肼化度为10％的酰肼化羧甲基淀粉；其中，3,3'-二硫代二丙酰肼与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为15:1。
(2)载阿霉素的羧甲基淀粉纳米颗粒的形成：避光条件下，在冰浴超声条件下，将浓度为3mg/mL的阿霉素水溶液滴加入浓度为12mg/mL的酰肼化羧甲基淀粉水溶液中，然后将pH调至6.7，经17小时后置于截留分子量为1000Da的透析袋用相应pH的PBS缓冲液透析36小时，经零下20摄氏度冷冻干燥后得到载阿霉素的羧甲基淀粉纳米颗粒；其中，阿霉素与酰肼化羧甲基淀粉中酰肼基团的摩尔比为1:5。
(3)共载阿霉素和卡铂的羧甲基淀粉基纳米前药的制备：避光条件下，将载阿霉素的羧甲基淀粉纳米颗粒分散于纯水中，形成浓度为5mg/mL的悬浮液，然后与浓度3mg/mL的卡铂溶液混合均匀，悬浮液与卡铂溶液二者体积比例为4:1，pH值维持为7，经37℃摇床中反应30小时后用截留分子量为1000Da的透析袋进行透析、零下20摄氏度冷冻干燥24小时，得到共载阿霉素和卡铂的还原/pH敏感型羧甲基淀粉基纳米前药。
实施例7
(1)酰肼化羧甲基纤维素的制备：将分子量为135kDa羧甲基纤维素溶于水中制成质量浓度为4％的羧甲基纤维素水溶液，加入羧基摩尔数32％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺二者物质的量比为1：1.5，用稀盐酸(1mol/L)调节pH值为5.5并维持在5.5，经室温搅拌1.5小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，反应40小时后，反应物置于截留分子量为3500Da的透析袋中透析48h，零下20摄氏度冷冻干燥得到酰肼化度为30％的酰肼化羧甲基纤维素；其中，3,3'-二硫代二丙酰肼与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为20:1。
(2)载阿霉素的羧甲基纤维素纳米颗粒的形成：避光条件下，在冰浴超声条件下，将浓度为5mg/mL的阿霉素水溶液滴加入浓度为15mg/mL的酰肼化羧甲基纤维素水溶液中，然后将pH调至6.8，经20小时后置于截留分子量为1000Da的透析袋用相应pH的PBS缓冲液透析36小时，经零下20摄氏度冷冻干燥后得到载阿霉素的羧甲基纤维素纳米颗粒；其中，阿霉素与酰肼化羧甲基纤维素中酰肼基团的摩尔比为1:2。
(3)共载阿霉素和顺铂的羧甲基纤维素基纳米前药的制备：避光条件下，将载阿霉素的羧甲基纤维素纳米颗粒分散于纯水中，形成浓度为5mg/mL的悬浮液，然后与浓度1mg/mL的顺铂溶液混合均匀，悬浮液与顺铂溶液二者体积比例为2:1，pH值维持为7，经37℃摇床中反应50小时后用截留分子量为1000Da的透析袋进行透析、零下20摄氏度冷冻干燥24小时，得到共载阿霉素和顺铂的还原/pH敏感型羧甲基纤维素基纳米前药。
实施例8
(1)酰肼化羧甲基壳聚糖的制备：将分子量为150kDa羧甲基壳聚糖溶于水中制成质量浓度为2％的羧甲基壳聚糖水溶液，加入羧基摩尔数52％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基琥珀酰亚胺；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺二者物质的量比为1：1，用稀盐酸(1mol/L)调节pH值为5.5并维持在5.5，经室温搅拌1小时后加入3,3'-二硫代二丙酰肼，反应30小时后，反应物置于截留分子量为3500Da的透析袋中透析48h，零下20摄氏度冷冻干燥得到酰肼化度为50％的酰肼化羧甲基壳聚糖；其中，3,3'-二硫代二丙酰肼与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为17:1。
(2)载阿霉素的羧甲基壳聚糖纳米颗粒的形成：避光条件下，在冰浴超声条件下，将浓度为8mg/mL的阿霉素水溶液滴加入浓度为18mg/mL的酰肼化羧甲基壳聚糖水溶液中，然后将pH调至6.4，经13小时后置于截留分子量为1000Da的透析袋用相应pH的PBS缓冲液透析36小时，经零下20摄氏度冷冻干燥后得到载阿霉素的羧甲基壳聚糖纳米颗粒；其中，阿霉素与酰肼化羧甲基壳聚糖中酰肼基团的摩尔比为1:3。
(3)共载阿霉素和奈达铂的羧甲基壳聚糖基纳米前药的制备：避光条件下，将载阿霉素的羧甲基壳聚糖纳米颗粒分散于纯水中，形成浓度为3mg/mL的悬浮液，然后与浓度5mg/mL的奈达铂溶液混合均匀，悬浮液与铂类药物溶液二者体积比例为4:1，pH值维持为7，经37℃摇床中反应61小时后用截留分子量为1000Da的透析袋进行透析、零下20摄氏度冷冻干燥24小时，得到共载阿霉素和奈达铂的还原/pH敏感型羧甲基壳聚糖基纳米前药。
本发明中经腙键和配位键装将阿霉素和铂类抗肿瘤药物键接于多糖分子上，获得同时具有还原/pH双重刺激响应性释放药物功能的多糖基前药。该前药能显著改善药物溶解性，增加稳定性和降低毒副作用，通过纳米前药被动靶向功能和肿瘤微环境刺激响应性药物释放行为，可望显著改善肿瘤细胞的多药耐药性和肿瘤治疗效果。

Claims (7)

1.一种共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药的制备方法，其特征在于，先利用碳二亚胺法制备酰肼化多糖聚合物，然后将酰肼化多糖聚合物依次经腙键键接阿霉素和配位键键接铂类药物，得到共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药；该纳米前药具有核壳结构，粒径在100～200nm范围内可调，能够响应谷胱甘肽和pH双重刺激实现药物释放；酰肼化多糖聚合物通过以下过程制得：将含羧基多糖聚合物溶于水中制成含羧基多糖聚合物水溶液，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH值为5～5.5，搅拌使羧基活化，再加入3,3'-二硫代二丙酰肼，反应8～48小时后进行透析和冷冻干燥，得到酰肼化度为5％～60％的酰肼化多糖聚合物；含羧基多糖聚合物为透明质酸、海藻酸钠、肝素、羧甲基淀粉、羧甲基纤维素或羧甲基壳聚糖；
将酰肼化多糖聚合物依次经腙键键接阿霉素和配位键键接铂类药物，得到共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药的具体过程如下：
在冰浴超声条件下，将阿霉素水溶液滴加入到酰肼化多糖聚合物水溶液中，然后将pH调至6.4～6.8，经0.5～24小时后用PBS缓冲液透析，经冷冻干燥后，得到载阿霉素的多糖基纳米颗粒；
将载阿霉素的多糖基纳米颗粒分散于纯水中，形成悬浮液，然后将悬浮液与铂类抗肿瘤药物溶液混合均匀，在37℃摇床中反应0.5～72小时后进行透析、冷冻干燥，得到所述的共载阿霉素和铂类药物的多糖基纳米前药；
铂类抗肿瘤药物为顺铂、卡铂、奈达铂或洛铂抗肿瘤药物；
3,3'-二硫代二丙酰肼与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的物质的量的比为(5～25):1；
阿霉素与酰肼化多糖聚合物上酰肼基团的物质的量的比为1:(1～5)。
2.根据权利要求1所述的一种共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药的制备方法，其特征在于，含羧基多糖聚合物的分子量为8kDa～170kDa。
3.根据权利要求2所述的一种共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药的制备方法，其特征在于，含羧基多糖聚合物水溶液的质量浓度为0.1％～10％；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的加入量为含羧基多糖聚合物中羧基物质的量的5％～60％，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的物质的量比为1：(1～1.5)。
4.根据权利要求2所述的一种共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药的制备方法，其特征在于，阿霉素水溶液的浓度为0.5～10mg/mL，酰肼化多糖聚合物水溶液的浓度为1～20mg/mL。
5.根据权利要求2所述的一种共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药的制备方法，其特征在于，悬浮液的浓度为1～20mg/mL，铂类抗肿瘤药物溶液的浓度0.5～5mg/mL，悬浮液与铂类药物溶液的体积比为(1～10):1；透析采用的透析袋的截留分子量为1000Da，所述的冷冻干燥条件为：零下20摄氏度，时间为12～48小时。
6.一种根据权利要求1-5中任意一项所述方法制备得到的共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药，其特征在于，该纳米前药具有核壳结构，粒径在100～200nm范围内可调，能够响应谷胱甘肽和pH双重刺激实现药物释放。
7.一种根据权利要求1-5中任意一项所述方法制备得到的共载阿霉素和铂类药物的还原/pH敏感型多糖基纳米前药在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用；肿瘤为乳腺癌或/和肝癌。
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