ES2903387T3

ES2903387T3 - Materiales magnéticos biocompatibles

Info

Publication number: ES2903387T3
Application number: ES19156555T
Authority: ES
Inventors: Wen-Yuan Hsieh; Yuan-Hung Hsu; Chia-Wen Huang; Ming-Cheng Wei; Chih-Lung Chen; Shian-Jy Wang
Original assignee: Megapro Biomedical Co Ltd
Current assignee: Megapro Biomedical Co Ltd
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2019-02-11
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2039-02-11
Also published as: AU2019200753A1; US20220080057A1; DK3524276T3; AU2019200753B2; EP3524276B1; CA3032985A1; CN110157000A; JP7335472B2; KR20190098064A; US20190247522A1; EP3524276A1; TW201936212A; JP2019137674A; CN110157000B; TWI811297B

Abstract

Un material magnético biocompatible, que comprende: una nanopartícula de óxido de hierro-ácido orgánico; y uno o más polímeros biocompatibles, que tienen cada uno la fórmula (I) siguiente, covalentemente unidos a la nanopartícula de óxido de hierro-ácido orgánico: **(Ver fórmula)** en la cual R es H, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C1-C10, arilo, heteroarilo o un grupo carbonilo C1-C10 o un grupo amino C1-C10; L es un conector, x es de 1 a 10; e y es de 5 a 1000, de modo que el óxido de hierro-ácido orgánico contiene 4-10% de iones Fe (II) en relación a los iones de hierro totales.

Description

DESCRIPCIÓN

Materiales magnéticos biocompatibles

Antecedentes

Las nanopartículas de óxido de hierro son útiles como agentes de contraste para la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) debido a su estabilidad química y magnetización adecuada. La magnetita (Fe3O4) y la maghemita (Y-Fe2O3) son dos ejemplos de nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas.

Estas nanopartículas de óxido de hierro son capaces de una conjugación con polímeros biocompatibles para formar materiales magnéticos biocompatibles, por ejemplo, agentes de contraste de MRI.

Convencionalmente, las nanopartículas magnéticas de Fe3O4 se sintetizan usando una mezcla de sales de Fe (II) y Fe (III). En teoría, las nanopartículas magnéticas de Fe3O4 contienen aproximadamente 33% de iones Fe (II) en relación a los iones de hierro totales. De forma diferentes, las nanopartículas magnéticas de y-Fe2O3 contienen 0% de iones de Fe (II).

El FeO4 proporciona un efecto de relajación T²más fuerte, es decir, una mayor relaxividad r2 que el Y-Fe2O3. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de Basti et al., J Colloid Interface Sci., 2010, 341: 248-254; y Li et al., Theranostics, 2013, 3(8): 595-615. Por otra parte, las nanopartículas de Fe3O4 son significativamente más eficaces en la producción de radicales hidroxilo que las nanopartículas de Y-Fe2O3 y, como consecuencia, el Fe3O4 puede inducir una mayor toxicidad en comparación con el Y-Fe2O3 en aplicaciones clínicas. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de Park et al., Arch Toxicol., 2014, 88(8):1607-1618; y Wu et al., Journal of Food and Drug Analysis, 2014, 22, 86-94.

Los documentos EP 2974745 A1, EP 2965754 A1 y WO 2009/129649 A1 describen cada uno un material magnético biocompatible que comprende una nanopartícula de óxido de hierro o uno o más polímeros biocompatibles, con un contenido de 4-15% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales.

Hay una necesidad de desarrollar un nuevo material magnético biocompatible que tenga una relaxividad elevada y una baja toxicidad.

Sumario

La presente invención se refiere a ciertos materiales magnéticos biocompatibles que pueden ser usados en agentes de contraste de MRI con una relaxividad elevada y una baja toxicidad.

En un aspecto de esta invención, se abarcan materiales magnéticos biocompatibles, como se expone en las reivindicaciones anejas, que contienen una nanopartícula de óxido de hierro y uno o más polímeros biocompatibles, que tienen cada uno la fórmula (I) siguiente, covalentemente unidos a la nanopartícula de óxido de hierro:

en esta fórmula, R es H, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C1-C10, arilo, heteroarilo, un grupo carbonilo C1-C10 o un grupo amino C1-C10; L es un conector, x es de 1 a 10; e y es de 5 a 1000.

Apreciablemente, los materiales magnéticos biocompatibles contienen cada uno 4-10% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales.

La nanopartícula de óxido de hierro puede tener un contenido de Fe (II) igual o diferente al contenido en un material magnético biocompatible. La nanopartícula de óxido de hierro puede contener 4-15% (por ejemplo, 4-10% y 4-8%) de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales en la misma.

Haciendo referencia a la fórmula (I) anterior, el conector L puede ser O, S, Si, alquileno C1-C6, un resto carbonilo que contienen dos grupos carbonilo y 2-20 átomos de carbono, o un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas:

en las que cada uno de m, n, p, q y t, independientemente, es 1-6; W es O, S o NRb; cada uno de Li , L3, L5, L7 y L9, independientemente es un enlace O, S o NRc; cada uno de L2, L4, L⁶, L⁸y L10, independientemente, es un enlace O,

S o NRd y V es ORe, SRf o NRgRh, cada uno de Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rg, y Rh alquilo C1-C10, un heteroalquilo C1-C10, un cicloalquilo C3-C10, un heterocicloalquilo C1-C10, arilo o heteroarilo.

El término “alquilo” en la presente memoria descriptiva se refiere a un resto de hidrocarburo saturado, lineal o ramificado, como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y hexilo. El término “alquenilo” se refiere a un resto de hidrocarburo lineal o ramificado que contienen al menos un enlace doble, como -CH=CH-CH³y -CH=CH-CH2-. El término “alquinilo” se refiere a un resto de hidrocarburo lineal o ramificado que contienen al menos un enlace triple, como -C=C-CH³y -C=C-CH2-. El término “cicloalquilo” se refiere a un resto de hidrocarburo saturado cíclico como ciclohexilo o ciclohexileno. El término “heterocicloalquilo” se refiere a un resto de hidrocarburo saturado cíclico que contiene al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, P, B, S, Si, Sb, Al, Sn, As, Se o Ge, como piperazinilo o piperidinilo.

El término “heteroalquilo” en la presente memoria descriptiva se refiere a un resto alifático que contiene al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O, P, B, S, Si, Sb, Al, Sn, As, Se y Ge. Ejemplos de heteroalquilo incluyen metoximetilo y metilamino etilo.

El término “arilo” en la presente memoria descriptiva se refiere a un sistema de anillos aromáticos monocíclico de C⁶, bicíclico de C10, tricíclico de C14, tetracíclico de C20 o pentacíclico de C24. Ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, fenileno, naftilo, naftileno, antracenilo, antracenileno, pirenilo y pirenileno. El término “heteroarilo” en la presente memoria descriptiva se refiere a un sistema de anillos aromático monocíclico de 5-8 miembros, bicíclico de 8-12 miembros, tricíclico de 11-14 miembros o tetracíclico de 15-20 miembros, que tiene uno o más heteroátomos (como

O, N, S o Se). Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen furilo, furileno, fluorenilo, fluorenileno, pirrolilo, pirrolileno, tienilo, tienileno, oxazolilo, oxazolileno, imidazolilo, imidazolileno, bencimidazolilo, bencimidazolileno, tiazolilo, tiazolileno, piridilo, piridileno, pirimidinilo, pirimidinileno, quinazolilo, quinazolinileno, quinolinilo, quinolileno, isoquinolilo, isoquinolileno, indolilo e indolileno.

Salvo que se especifique otra cosa, los grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, hetoroalquilo, arilo y heteroarilo mencionados en la presente memoria descriptiva incluyen restos tanto sustituidos como sin sustituir. Los posibles sustituyentes en los grupos cicloalquilo, cicloalquileno, cicloalquenilo, cicloalquenileno, cicloalquinilo, cicloalquinileno, heterocicloalquilo, heterocicloalquileno, heterocicloalquenilo, heterocicloalquinelo, arilo y heteroarilo incluyen, pero sin limitación, alquilo (C1-C10) alquenilo C2-C10, alquenilo C2-C10, cicloalquilo C3-C20, cicloalquenilo C3-C20, heterocicloalquilo C3-C20, heterocicloalquenilo C3-C20, alcoxi C1-C10, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, amino, alquilamino C1-C10, dialquilamino C2-C20, arilamino, diarilamino, alquilsulfolinamino C1-C10, arilsulfonilamino, alquilimino C1-C10, arilimino, alquilsulfonimino C1-C10, arilsulfonimino, hidroxilo, halo, tio, alquiltio C1-C10, ariltio, alquilsulfonilo C1-C10, arilsulfonilo, acilamino, aminoacilo, aminotioacilo, amido, amidino, guanidino, uerido tioureido, ciano, nitro, nitroso, azido, acilo, tioacilo, aciloxi, carboxilo y éster carboxílico. Por otra parte, los sustituyentes posibles en los grupos alifáticos, heteroalifáticos, oxialifáticos, alquenilo, alquileno, alquileno, alquenilo, alquenileno, alquinilo y alquinileno incluyen todos los sustituyentes anteriormente citados excepto alquilo C1-C10. Los grupos cicloalquilo, cicloalquileno, cicloalquenilo, cicloalquenileno, heterocicloalquilo, heterocicloalquileno, heterocicloalquenilo, heterocicloalquenileno, arilo y heteroarilo pueden estar también condensados unos con otros.

Está también abarcado por esta invención un método para preparar un material magnético biocompatible, como se describió con anterioridad, como se expone en las reivindicaciones anejas.

El método incluye cuatro etapas: (i) proporcionar una primera solución que contienen una nanopartícula de óxido de hierro en un primer disolvente orgánico, conteniendo la nanopartícula de óxido de hierro 4-15% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales; (ii) proporcionar una segunda solución que contiene un polímero biocompatible de fórmula (I) en un segundo disolvente orgánico; (iii) mezclar la primera solución y la segunda solución para suministrar una solución mixta; (iv) añadir agua a la solución mixta y agitar la solución resultante durante al menos 20 horas para obtener un material magnético biocompatible.

La nanopartícula de óxido de hierro se forma mezclando una solución de un hidróxido con una solución de hierro que contiene una sal de Fe (II) bajo una atmósfera de gas inerte; conteniendo la solución de hierro que una sal de

Fe (II) y una sal de Fe (III), en la que la relación en moles de Fe (III)/Fe (II) es 1,70 o mayor, y en que la nanopartícula de óxido de hierro-ácido orgánico se forma añadiendo ácido oleico en una cantidad de 100 ml o

menos por mol de hierro.

Otras características, objetos y ventajas de las realizaciones serán evidentes a partir de la descripción y las reivindicaciones.

Descripción detallada

Se describe en detalle en la presente memoria descriptiva un material magnético biocompatible que contiene una nanopartícula de óxido de hierro y uno o más polímeros biocompatibles covalentemente unidos a la nanopartícula de óxido de hierro.

La nanopartícula de óxido de hierro puede ser un núcleo superparamagnético que tiene un tamaño de partículas de 1 a 100 nm (por ejemplo, de 2 a 50 nm o de 5 a 25 nm). La preparación de un núcleo superparamagnético es bien conocida en la técnica. Véase la publicación de Laurent et al., Chem. Rev., 2008, 108, 2064-2110.

La nanopartícula de óxido de hierro está formada normalmente por un ácido orgánico o una sal del mismo. Ejemplos del ácido orgánico o sal incluyen, pero sin limitación ácido oleico o una sal del mismo.

Debe apreciarse que la nanopartícula de óxido de hierro contiene preferentemente 4-10% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales en la misma. Otro ejemplo de nanopartícula de óxido de hierro contiene 4-8% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales. El contenido de iones de Fe (II) en una nanopartícula de óxido de hierro es importante para que un material magnético biocompatible ejerza una relaxividad elevada y una baja toxicidad. Más específicamente, un contenido bajo de Fe (II), por ejemplo, de menos de 4% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales, exhibe normalmente una baja relaxividad. Por otra parte, un contenido elevado de Fe (II), por ejemplo, mayor que 15% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales, puede provocar una toxicidad elevada.

El material magnético biocompatible contiene también uno o más polímeros biocompatibles para mejorar su biocompatibilidad. Cada uno de los polímeros biocompatibles tiene la fórmula (I) siguiente:

en la que las variables R, L, x, y, se definen en la sección de sumario.

En un aspecto, la nanopartícula de óxido de hierro está covalentemente unida a uno o más polímeros biocompatibles que tienen cada uno la fórmula siguiente:

en la que R1 es H, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C1-C10, arilo, heteroarilo o un grupo carbonilo C1-C10, o un grupo amino C1-C10; R2 es H, alquilo C1-C6, alquenilo, C2-C6, alquinilo, C2-C6, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo C1-C10, arilo o heteroarilo; x es de 1 a 10 e y es de 5 a 1000.

Preferentemente, R1 es alquilo C1-C6, un grupo carbonilo C1-C10, o un grupo amino C1-C10 y R2 es H o alquilo C1-C6. Por ejemplo. R1 es metilo (-CH3), carboxilo (-COOH) o amino (-NH2) y R2 es H.

Cuando R1 es carboxilo (-COOH) o amino (NH2), el polímero biocompatible terminado en carboxilo o terminado en amina puede estar acoplado a una molécula biológica, por ejemplo, ácido fólico. Por ejemplo, el ácido fólico permite el acoplamiento con un polímero biocompatible terminado en amina, formando una conexión -CONH-.

El material magnético biocompatible de esta invención puede estar acoplado a un agente específico dirigido a diana para aplicaciones biológicas. Ejemplos de un agente específico dirigido a diana incluyen, pero sin limitación, un anticuerpo, una proteína, un péptido, una enzima, un hidrato de carbono, una glicoproteína, un nucleótido o un lípido. En un ejemplo de material magnético biocompatible, R¹está acoplado a un anticuerpo (por ejemplo, My10). Todavía dentro del alcance de esta invención está un método para preparar el material magnético biocompatible anteriormente descrito.

Nuevamente, el método incluye las siguientes etapas: proporcionar una primera solución que contiene una nanopartícula de óxido de hierro en un primer disolvente orgánico, en que la nanopartícula de óxido de hierro contiene 4-15% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales; proporcionar una segunda solución que contiene polímeros biocompatibles de fórmula (I) en un segundo disolvente orgánico, mezclar la primera solución y la segunda solución para suministrar una solución mixta y añadir agua a la solución mixta y agitar la solución resultante durante al menos 20 horas, para obtener un material magnético biocompatible.

La nanopartícula de óxido de hierro usada en el método se forma mezclando una solución de un hidróxido con una solución de hierro que contiene una sal de hierro Fe (II) bajo una atmósfera de gas inerte.

Un ejemplo de solución de hierro contiene una sal de Fe (II) (por ejemplo, FeCb) y una sal de Fe (III) (por ejemplo, FeCb), en la que la relación en moles de Fe (III)/Fe (II) es de 1,70 o más (por ejemplo, 1,75 o más, 1,80 o más y 1,90 o más).

La solución de un hidróxido puede ser una solución de un hidróxido de sodio que tiene una concentración de 2 N o menor (por ejemplo, 1,5 N o menor o 1 N o menor).

Ejemplos del gas inerte incluyen, pero sin limitación, nitrógeno y argón.

A modo de reiteración, la nanopartícula de óxido de hierro puede estar formada por un ácido orgánico o una sal del mismo. Un ejemplo de ácido orgánico o sal es ácido oleico o una sal del mismo. Cuando se usa ácido oleico, puede estar presente en una cantidad de 100 ml o menos (por ejemplo, 90 ml o menos, 70 ml o menos o 50 ml o menos) por mol de hierro.

En un ejemplo, la nanopartícula de óxido de hierro se forma a partir de ácido oleico y una solución de hierro que contiene FeCl²y FeCb, proporcionando una nanopartícula de óxido de hierro-ácido oleico o IO-OA. Este ejemplo de nanopartícula de óxido de hierro puede ser preparado como sigue: mezclar FeCb y FeCb en un disolvente (por ejemplo, agua), añadir una solución de un hidróxido de sodio (por ejemplo, 1 N) bajo nitrógeno a la mezcla anterior y tratar la solución así obtenida con ácido oleico para formar una nanopartícula de ^{I - O a .}

La nanopartícula de óxido de hierro se recoge preferentemente después del tratamiento, con un ácido orgánico o una sal del mismo, separando agua, disolviéndola en tolueno y centrifugando el líquido así obtenido para eliminar algunas partículas grandes.

Volviendo a los polímeros biocompatibles usados en este método, incluyen los propios polímeros, así como sus sales y solvatos si esto es aplicable. Una sal, por ejemplo, puede estar formada entre un anión y un grupo con carga positiva (por ejemplo, amino) en un polímero. Los aniones adecuados incluyen cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, nitrato, fosfato, citrato, metanosulfonato, trifluoroacetato, acetato, malato, tosilato, tartrato, fumarato, glutamato, glucuronato, lactato, glutarato y maleato. Análogamente, una sal puede estar formada también entre un catión y un grupo con carga negativa (por ejemplo, carboxilato) en un polímero. Los cationes adecuados incluyen ión de sodio, ión de potasio, ion de magnesio, ion de calcio e ion de amonio, como ion de tetrametilamonio. Los polímeros pueden incluir también las sales que contienen átomos de nitrógeno cuaternario. Un solvato se refiere a un complejo formado entre un polímero y un disolvente farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de un disolvente farmacéuticamente aceptable incluyen agua, etanol, isopropanol, acetato de etilo, ácido acético y etanolamina. El esquema (I) siguiente muestra un procedimiento para preparar un ejemplo de polímero biocompatible que contiene silano.

Como se muestra en el esquema anterior, el alcoxi-polietilenglicol (peso molecular 2000) reacciona con anhídrido succínico en presencia de una base (por ejemplo, dimetilaminopiridina) para formar mPEG-COOH, que es posteriormente convertido en mPEG-COCl usando cloruro de tionilo. La mezcla de mPEG-COCl con (3-aminopropil)-trietoxisilano proporciona mPEG-silano.

Un experto en la técnica puede modificar el procedimiento mostrado en el esquema (I) para preparar polímeros biocompatibles usando métodos bien conocidos (véase la publicación de Larock, Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers 1989); T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (3rd Ed., John Wiley and Sons 1999); L. Fieser andM. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis (John Wiley and Sons 1994); y L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis (John Wiley and Sons 1995) y ediciones posteriores de las mismas. Las vías específicas que pueden ser usadas para sintetizar los polímeros biocompatibles se pueden encontrar en: (a) Rist et al., Molecules 2005, 10, 1169-1178, (b) Koheler et al., JACS, 2004, 126, 7206-7211; y (c) Zhang et al., Biom mircod 2004, 6:133-40.

Para llevar a cabo el método para preparar un material magnético biocompatible, se forma una primera solución que contiene la nanopartícula de óxido de hierro anteriormente descrita en un primer disolvente orgánico, y se forma una segunda solución que contiene los polímeros biocompatibles anteriormente descritos en un segundo disolvente orgánico.

Cada uno del primer disolvente orgánico y el segundo disolvente orgánico, independientemente, puede ser tolueno, un hidrocarburo alifático, tetrahidrofurano, cetona, alcohol, éster alquílico o una combinación de los mismos. Preferentemente, ambos disolventes orgánicos son tolueno.

Tras la mezcla de la primera solución y la segunda solución para suministrar una solución mixta es importante llevar a cabo la etapa de añadir agua como un catalizador a la solución mixta y agitar la solución resultante durante al menos 20 horas para suministrar un material magnético biocompatible.

Como se describió anteriormente, la nanopartícula de óxido de hierro en el método contiene 4-15% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales en la misma. Después de llevar a cabo el método, el material magnético biocompatible así obtenido contiene normalmente 4-15% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales. El polímero biocompatible sintetizado en el esquema (I) anterior es útil en cuanto puede modificar químicamente la superficie de la nanopartícula de óxido de hierro para aumentar la biocompatibilidad. Además, el polímero biocompatible es útil en cuanto puede etiquetar partículas (por ejemplo, nanopartículas, partículas magnéticas, nanopartículas magnéticas o partículas superparamagnéticas) para hacer que las partículas sean adicionalmente reactivas con respecto a uno o más agentes dirigidos a diana, fluorescentes, terapéuticos o de diagnóstico.

El agente dirigido a diana es acoplado preferentemente al polímero biocompatible a través de enlaces covalentes. Los agentes dirigidos a diana comúnmente usados incluyen un anticuerpo, una proteína, un péptido, una enzima, un hidrato de carbono, una glicoproteína, un nucleótido o un lípido. El material magnético biocompatible puede tener un diámetro de aproximadamente 3-500 nm después de un acoplamiento con el agente dirigido a diana. Los expertos en la técnica pueden unir cualquiera de los agentes dirigidos a diana adecuados sobre la nanopartícula, para proporcionar una especifidad a la misma. Por ejemplo, se puede usar ácido fólico para especificar células de cáncer de mamas con un receptor de folato. La estructura del ácido fólico permite un acoplamiento con un polímero biocompatible terminado en amina o terminado en hidrato de carbono. Por ejemplo, el ácido fólico permite un acoplamiento con el polímero biocompatible terminado en amina formando una conexión -CONH-.

Sin consideraciones adicionales, se cree que un experto en la técnica, basándose en la descripción de la presente memoria descriptiva, puede utilizar las presentes realizaciones hasta su alcance más amplio.

Ejemplo 1: Preparación de materiales magnéticos biocompatibles

Se prepararon dos materiales magnéticos biocompatibles siguiendo los procedimientos descritos a continuación. Preparación de nanopartículas de óxido de hierro-ácido oleico (IO-OA)

Una mezcla de FeCl2-4H2O (900 g, 4,53 moles), FeCbAI-hO (1327 g, 8,18 moles) y agua (23,6 l) se agitó a 150-200 rpm en un reactor de vidrio de 100 l a 25°C. Se añadió una solución de un hidróxido de sodio (1 N) bajo nitrógeno al reactor a una velocidad de 0,2, 0,3 kg/min, dando lugar al pH de 11-12. Posteriormente, se añadió ácido oleico (800 ml, 63 ml por mol de hierro) y la mezcla resultante se agitó durante 60 minutos adicionales, formando así nanopartículas de IO-OA en forma de una pasta oscura en una solución acuosa. El agua se separó después de que el pH de la solución se ajustó a un valor del pH de 1 a 2 con ácido clorhídrico (3N). Seguidamente se añadieron 12 l de tolueno a la pasta oscura resultante, para poner en suspensión nanopartículas de IO-OA en bruto en la solución de tolueno. Las nanopartículas de IO-OA en bruto en tolueno se centrifugaron a 6000 rpm durante 15 minutos, para obtener nanopartículas de IO-OA en tolueno.

Preparación de polímeros biocompatibles mPEG-silano 750 y mPEG-silano-2000

Se preparó un polímero biocompatible mPEG-silano-750 como sigue. Una mezcla de 300 g (0,4 moles) de metoxi-PEG(mPEG, peso molecular 750), anhídrido succínico (48 g, 0,48 moles) y 4-dimetilamino-piridina (DMAP, 19,5 g, 0,159 moles) se dejó asentar en un matraz de fondo redondeado de 1000 ml bajo vacío (0,027 bares) durante 2 horas. Se añadieron 600 ml de tolueno a la mezcla, que seguidamente se agitó a 30° C durante un día para formar mPEG-COOH. Posteriormente, se añadieron 36 ml (0,48 moles) de cloruro de tionilo a un caudal de 1 ml/min y la mezcla se agitó durante 2-3 horas. Posteriormente, se añadieron 333,8 ml (2,4 moles) de trietilamina a una velocidad de 1 ml/min para obtener un pH de aproximadamente 6-7. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla que contenía mPEG-CO-Cl se hizo reaccionar con 94,5 ml (0,4 moles) de 3-aminopropil-trietoxisilano a temperatura ambiente durante al menos 8 horas, para producir mPEG-silano-750 en bruto. El mPEG-silano-750 en bruto se precipitó después de que se añadieran 9 l de isopropil-éter a la mezcla de reacción. Se recogió un producto sólido por filtración, se volvió a disolver en 500 ml de tolueno y se centrifugó a 5.000 rpm durante 5 minutos para recoger la materia sobrenadante, a la que se añadieron 9 l de isopropil-éter. Se separó un líquido aceitoso marrón del isopropil-éter y se secó bajo vacío para obtener el polímero biocompatible mPEG-silano-750.

Se preparó un polímero biocompatible mPEG-silano-2000 como sigue. Se añadió metoxi-PEG (mPEG, peso molecular 2000) (3 kg) a un recipiente de reacción de 20 l, equipado con un colector Dean-Stark. Se añadieron 15 l de tolueno al recipiente de reacción y la mezcla de reacción se agitó a 150 ± 20 rpm con un agitador mecánico. La reacción se realizó a 120° C y se llevó a reflujo durante 60 minutos. Seguidamente se añadieron anhídrido succínico (SA, 180 g) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 70 g) al recipiente de reacción y la reacción se continuó durante 20 horas a 65° C para formar mPEG-COOH. Posteriormente, se añadieron 170 g de cloruro de tionilo (SOCb) al recipiente de reacción, con un manto gaseoso de N²sobre la reacción y la reacción se continuó durante 3 horas. Posteriormente, se añadió trietilamina (TEA, 436 g) al recipiente de reacción y se agitó a 250 rpm. Después de enfriar a temperatura ambiente la mezcla que contenía mPEG-COCl, se hizo reaccionar con 300 g de 3-aminopropiltrietoxisilano a temperatura ambiente durante al menos 8 horas, para producir mPEG-silano-2000 en bruto. El material en bruto así obtenido, seguidamente se filtró para separar sales y proporcionar una solución marrón clara de mPEG-silano-2000.

Preparación de polímeros biocompatibles COOH-PEG-silano-750 y COOH-PEG-silano-2000

Se colocaron 300 g (0,4 moles) de PEG (peso molecular: 750) y 600 ml de N-metil-2-pirrolidona en un matraz de fondo redondeado de 1000 ml y se calentó a 60° C bajo vacío (0,027 bares) durante más de 2 horas. Se añadieron 88 g (0,88 moles) de anhídrido succínico y 19,5 g (0,16 moles) de 4-dimetilamino-piridina (DMAP) para una reacción a 30°C durante dos días, obteniéndose así PEG terminado en dicarboxi (COOH-PEg ).

Se añadieron 36 ml (0,48 moles) de cloruro de tionilo a una velocidad de 1 ml/min y se agitó durante 2-3 horas. Posteriormente, se añadieron 133,8 ml (0,96 moles) de trietilamina a una velocidad de 1 ml/min. Seguidamente se añadieron 94,5 ml (0,4 moles) de 3-aminopropil-trietoxisilano a la reacción durante al menos 12 horas. La mezcla de reacción se añadió a 9 l de isopropil-éter frío para una nueva precipitación y los precipitados resultantes se recogieron y se volvieron a disolver en 100 ml de diclorometano. La mezcla así obtenida se añadió nuevamente a 9 l de isopropil-éter frío para una nueva precipitación. Se recogió un precipitado blanco apagado y se secó bajo vacío durante 2 días, Obteniéndose así un polímero biocompatible, es decir, COOH-PEG-silano-750.

Se preparó un polímero biocompatible COOH-mPEG-silano-2000 siguiendo el mismo procedimiento descrito con anterioridad, usando una mezcla de 800 g (0,4 moles) de PEG (PEG, peso molecular 2000), anhídrido succínico (88 g, 0,88 moles) y 4-dimetilamino-pripidina (DMAP; 19,5 g; 0,16 moles).

Preparación de un material magnético biocompatible con mPEG-silano-2000

Se preparó un material magnético biocompatible conjugando mPEG-silano-2000 con una nanopartícula de óxido de hierro, es decir, nanopartícula de IO-OA, en tolueno, como sigue.

Una solución en tolueno de nanopartícula de IO-OA (6 mg de Fe/ml, 700 ml) y una solución en tolueno de mPEG-silano-2000 (160 mg/ml, 500 ml) se mezclaron en un matraz de fondo redondeado de 2 l con adición de agua a la solución resultante. Después de 24 horas de reacción, las nanopartículas de óxido de hierro conjugadas con mPEG-silano-2000 se extrajeron con agua y se filtraron para separar partículas grandes y proporcionar una solución acuosa clara. La solución acuosa resultante se purificó y se concentró con un dispositivo de ultrafiltración para obtener un material magnético biocompatible etiquetado como IO-OA/ mPEG-silano-2000.

Preparación de un material magnético biocompatible con COOH-PEG-silano-2000

Se añadieron 250 g de COOH-mPEG-silano-2000 a 1-1,2 l de solución en tolueno que contenía 10 g de Fe de nanopartícula IO-OA. La mezcla resultante se sometió a ultrasonidos durante 2-3 horas. Después de la adición de 1,5 l de agua desionizada, la mezcla se purificó por medio de un dispositivo de ultrafiltración y se concentró hasta 100 ml para obtener un material magnético biocompatible etiquetado como IO-OA/COOH-PEG- silano-2000.

Ejemplo 2: Caracterización de nanopartículas de óxido de hierro y materiales magnéticos biocompatibles

Se realizó un estudio para caracterizar un material magnético biocompatible preparado en el ejemplo 1, Así como algunas partículas de óxido de hierro, como sigue.

Determinación de iones de Fe (II)

Se midieron las relaciones de iones de Fe (III) de nanopartículas de óxido de hierro y materiales magnéticos biocompatibles por medio de un estuche de ensayo de hierro (Spectroquant 1.00796.0001, Merck). El reactivo en el estuche del ensayo, es decir, 1,10-fenantrolina, era sensible al ion Fe (II), pero no al ion Fe (III). En un medio tamponado, se hicieron reaccionar iones de Fe (II) con 1,10-fenantrolina para formar un complejo rojo que se determinó fotométricamente. Las nanopartículas de óxido de hierro o materiales magnéticos biocompatibles se degradaron en primer lugar a iones de hierro, añadiendo ácido sulfúrico, y el pH de la solución resultante se ajustó de 2 a 8 usando NaHCO30,8 M. Se observó que los iones de Fe (II) no se convirtieron en iones de Fe (III) durante el procedimiento. Sin la adición de ácido ascórbico, se midió el contenido de solamente iones de Fe (II). Los iones de hierro totales se midieron adicionalmente añadiendo ácido ascórbico, para convertir todos los iones de hierro en iones de Fe (II). El contenido de iones de Fe (II) se determinó que era de aproximadamente 4-15% en relación a los iones de hierro totales. Los resultados detallados se muestran en la Tabla 1 siguiente. Debe apreciarse que esta Tabla incluye también el contenido de Fe (II) de 1,26% para Feraheme, un agente comercial.

Tabla 1. Medición de los contenidos de Fe (II)

Estos resultados indican que los materiales magnéticos biocompatibles de esta invención exhibieron inesperadamente un contenido de Fe (II) muy superior en comparación con Feraheme.

Difracción de polvo de rayos X (XRPD)

Se investigaron las estructuras de algunas nanopartículas de óxido de hierro y materiales magnéticos biocompatibles a través de XRPD, como sigue.

Las muestras de ensayo se secaron para proporcionar formas de polvos para mediciones de XRPD. Las figuras siguientes, es decir, las figuras 1-2, muestran modelos de XRPD para IO-OA (tanda 4) y IO-OA/mPEG-silano-2000 (tanda 2).

Figura 2. El modelo de XRPD de IO-OA/mPEG-silano-2000 (tanda 2) Como las diferencias entre Y-Fe2O3 y Fe3O4 en XRPD no son discernibles, estas figuras muestran que las estructuras cristalinas de IO-OA (tanda 4) y IO-OA/mPEG-silano-2000 (tanda 2) podrían ser de Fe3O4, Y-Fe2O3 o la mezcla de Fe3O4 y Y-Fe2O3

Ejemplo 3: Mediciones de la relaxividad

Se realizó un estudio para medir la relaxividad de un material magnético biocompatible preparado en el ejemplo 1, así como para Feraheme, como sigue.

Se prepararon soluciones de óxido de hierro a diversas concentraciones (0,1, 0,2, 0,3, 0,4 y 0,5 mM). El tiempo de relajación T2 de cada solución se midió por medio de un dispositivo Minispec mq 20 de la entidad Bruker Corporation. Se estableció una relación lineal entre la reciprocidad del tiempo de relajación en el eje de ordenadas y la concentración de la solución en el eje de abscisas. La pendiente de la relación lineal se determinó como la relaxividad r2. Los resultados se muestran en la Tabla 2 siguiente.

Tabla 2. Medición de la relaxividad r2

Inesperadamente, como se muestra en la Tabla 2 anterior, el IO-OA/mPEG-silano-2000 (tanda 2), que contiene 6,29% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales, exhibió un valor de la relaxividad r2 de 173 (iriM-s)'1. De forma muy diferente, el Feraheme, que contiene 1,26% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales, exhibió un valor de la relaxividad r2 de 69 (mMS)'1.

Estos resultados indican que los materiales magnéticos biocompatibles de esta invención exhiben inesperadamente una relaxividad r2 mucho mayor en comparación con Feraheme.

Ejemplo 4: Acoplamiento con un agente específico dirigido a diana

Se describen a continuación protocolos para acoplar un material magnético biocompatible de esta invención a un agente específico dirigido a diana.

Acoplamiento con folato

Se colocaron 226 pl de solución en folato (folato/dimetilsulfóxido: 10 mg/ml) en un matraz de fondo redondeado amarronado de 50 ml. Se añadieron a la solución 5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y 176,5 pl de solución de diciclohexilcarbodiimida (diciclohexilcarbodihimida/DMSO: 5 mg/ml) y se agitó durante una hora. Posteriormente se añadieron 98,5 pl de solución de NHS (N-hidroxisuccinimida/DMSO: 5 mg/ml) y se agitó durante una hora adicional. Seguidamente se añadieron 289 pl de etilenodiamina para proporcionar una solución A.

Se colocaron 1 ml de IO-OA/COOH-PEG-silano-2000 (4,48 mg de Fe/ml) y 10 ml de DMSO en un matraz de fondo redondeado de 50 ml bajo vacío. Se añadieron 176,5 pl de solución de diciclohexilcarbodiimida (diciclohexilcarbodiimida/DMSO: 5 mg/ml) a la solución y se agitó durante una hora. Posteriormente, se añadieron 98,5 pl de solución de NHS (N-hidroxisuccinimida/DMSO: 5 mg/ml) y se agitó durante una hora adicional para proporcionar una solución B.

Se añadieron 289 pl de solución A a la solución B y la solución resultante se agitó durante 8 horas. La solución resultante se añadió a una membrana de diálisis (PM: 3000) y se usó agua destilada para la diálisis. La solución resultante se concentró seguidamente hasta 2 ml por medio de un dispositivo de ultrafiltración, para obtener un material magnético biocompatible acoplado a un agente dirigido a diana, es decir, IO-OA conjugado a folato/COOH-PEG-silano-2000.

Acoplamiento a un anticuerpo

Se mezcló IO-OA/COOH-PEG-silano-2000 (4,48 mg de Fe/ml) con 5 ml de agua desionizada y se mantuvo en un baño con hielo. Se añadió 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (10‘6 moles) a la solución y se agitó durante 30 minutos. Seguidamente se añadió N-hidroxisuccinimida (10‘6 moles) a la mezcla y se agitó durante otros 30 minutos. Se añadió anticuerpo My10 (1 ml, 2 pg/ml) a la mezcla resultante y se hicieron reaccionar durante 2 horas. La solución así obtenida se purificó haciéndola pasar a través de un dispositivo de clasificación magnética para obtener un material magnético biocompatible acoplado a un anticuerpo, es decir, IO-OA/COOH-PEG-silano-2000 acoplado a My10.

Otras realizaciones

La totalidad de las características descritas en esta memoria descriptiva pueden ser combinadas en cualquier combinación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un material magnético biocompatible, que comprende:

una nanopartícula de óxido de hierro-ácido orgánico; y

uno o más polímeros biocompatibles, que tienen cada uno la fórmula (I) siguiente, covalentemente unidos a la nanopartícula de óxido de hierro-ácido orgánico:

en la cual

R es H, alquilo C¹-C⁶, alquenilo C²-C⁶, alquinilo C²-C⁶, cicloalquilo C³-C¹⁰, heterocicloalquilo C¹-C¹⁰, arilo, heteroarilo o un grupo carbonilo C¹-C¹⁰o un grupo amino C¹-C¹⁰;

L es un conector,

x es de 1 a 10; e

y es de 5 a 1000,

de modo que el óxido de hierro-ácido orgánico contiene 4-10% de iones Fe (II) en relación a los iones de hierro totales.

2. El material magnético biocompatible de la reivindicación 1, en el que la nanopartícula de óxido de hierro-ácido orgánico contiene 4-8% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales.

3. El material magnético biocompatible de la reivindicación 1, en el que la nanopartícula de óxido de hierro- ácido orgánico es una nanopartícula de óxido de hierro-ácido oleico.

4. El material magnético biocompatible de la reivindicación 1, en el que el conector es O, S, Si, alquileno C¹-C⁶, un resto carbonilo que contienen dos grupos carbonilo y 2-20 átomos de carbono, o un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas:

en las que cada uno de m, n, p, q y t, independientemente, es 1-6; W es O, S o NRb; cada uno de L1 , L3, L5, L7 y L9, independientemente, es un enlace, O, S o NRc; cada uno de L2, L4, L⁶Ls y L10, independientemente, es un enlace O, S o NRd y V es ORe, SRf o NRgRh, cada uno de Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rg, y alquilo C1-C10, un heteroalquilo C1-C10, un cicloalquilo C3-C10, un heterocicloalquilo C1-C10, arilo o heteroarilo.

5. El material magnético biocompatible de la reivindicación 1, en el que la nanopartícula de óxido de hierro-ácido orgánico está covalentemente unida a uno o más polímeros biocompatibles, que tienen cada uno la siguiente fórmula:

en la cual

Ri es H, alquilo C¹-C⁶, alquenilo C²-C⁶, alquinilo C²-C⁶, cicloalquilo C³-C¹⁰, heterocicloalquilo C¹-C¹⁰, arilo, heteroarilo o un grupo carbonilo C¹-C¹⁰, o un grupo amino C¹-C¹⁰;

R²es H, alquilo C¹-C⁶, alquenilo, C²-C⁶, alquinilo, C²-C⁶, cicloalquilo C³-C¹⁰, heterocicloalquilo C¹-C¹⁰, arilo o heteroarilo;

x es de 1 a 10; e

y es de 5 a 1000.

6. El material magnético biocompatible de la reivindicación 1, en el que R¹es alquilo C¹-C⁶, un grupo carbonilo C¹-C¹⁰o un grupo amino C¹-C¹⁰y R²es H o alquilo C¹-C⁶; y en el que R¹es opcionalmente metilo, carboxilo o amino y R²es opcionalmente H.

7. El material magnético biocompatible de la reivindicación 5, en el que R¹está acoplado a un agente específico dirigido a diana seleccionado entre el grupo que consiste en un anticuerpo, una proteína, un péptido, una enzima, un hidrato de carbono, una glicoproteína, un nucleótido o un lípido; y en el que el agente específico dirigido a diana es opcionalmente un anticuerpo.

8. El material magnético biocompatible de la reivindicación 1, en el que la nanopartícula de óxido de hierro- ácido orgánico está covalentemente unida a uno o más polímeros biocompatibles que tienen cada uno la fórmula siguiente:

en la que R¹es metilo o carboxilo, R²es H, x es de 1 a 10 e y es de 5 a 1000.

9. Un método para preparar un material magnético biocompatible de la reivindicación 1, método que comprende: proporcionar una primera solución que contienen una nanopartícula de óxido de hierro-ácido orgánico en un primer disolvente orgánico, conteniendo la nanopartícula de óxido de hierro-ácido orgánico 4-10% de iones de Fe (II) en relación a los iones de hierro totales;

proporcionar una segunda solución que contiene un polímero biocompatible de fórmula (I) en un segundo disolvente orgánico;

mezclar la primera solución y la segunda solución para suministrar una solución mixta; y

añadir agua a la solución mixta y agitar la solución resultante durante al menos 20 horas para obtener un material magnético biocompatible; en que la nanopartícula de óxido de hierro-ácido orgánico se forma mezclando una solución de un hidróxido con una solución de hierro que contiene una sal de Fe (II) bajo una atmósfera de gas inerte; conteniendo la solución de hierro una sal de Fe (II) y una sal de Fe (III), de modo que la relación en moles de Fe ((III)/Fe (II) es de 1,70 o más; y de modo que la nanopartícula de óxido de hierro-ácido orgánico se forma añadiendo ácido oleico en una cantidad de 100 ml o menos por mol de hierro.

10. El método de la reivindicación 9, en el que cada uno del primer disolvente orgánico y el segundo disolvente orgánico, independientemente, es tolueno, un hidrocarburo alifático, tetrahidrofurano, una cetona, un alcohol, un éster alquílico o una combinación de los mismos y en el que el gas inerte es opcionalmente nitrógeno o argón.