BR112016015810B1 - Nanopartículas magnéticas funcionalizadas com catecol, produção e uso das mesmas - Google Patents

Abstract

nanopartículas magnéticas funcionalizadas com catecol, produção e uso das mesmas. são descritas nanopartículas magnéticas a superfície das quais é funcionalizada com catecol e construtos compreendendo uma pluralidade de ditas nanopartículas encapsuladas em uma matriz de polímero biocompatível, em que uma molécula com ação terapêutica é opcionalmente dispersa, dita matriz de polímero opcionalmente sendo por sua vez ainda funcionalizada; são ainda descritas células do sistema imune incorporando ditos construtos poliméricos aumentando sua capacidade de projeto.

Description

Campo de invenção

[0001] A presente invenção relaciona-se com o campo de nanopartículas funcionalizadas, a sua produção e sua utilização.

Estado da técnica

[0002] Como é conhecido, a magnetita é um mineral com propriedades ferromagnéticas cuja fórmula química é Fe3O4 (por vezes escrito como também FeO.Fe2O3).

[0003] É bem sabido que a magnetita na forma de nanopartículas, ou seja, com dimensões que variam de alguns nanômetros a poucas dezenas, se imerso em um campo magnético variável no intervalo de ondas de rádio, interage com o campo eletromagnético e, em seguida, liberta energia térmica para o que é em torno dele, dando assim origem ao que é chamado efeito hipertérmico ou hipertermia magnética.

[0004] Em oncologia, hipertermia é explorada para melhorar a eficácia da quimioterapia ou radioterapia; de facto, aumentando a temperatura de um tumor sólido compreendido entre 41 e 45 °C induz a apoptose das células tumorais; geralmente, este é aplicado por meio de lavagem com líquidos trazidos para as temperaturas adequadas e circuladas na vizinhança dos locais afetados por massas tumorais.

[0005] Recentemente, antenas são adotada que, quando inseridas diretamente na massa tumoral, geram microondas e, assim, interagem com as moléculas de dipolo de água, gerando hipertermia.

[0006] Estes tratamentos são geralmente extremamente invasivos e de eficácia pobre (no primeiro caso) e não desprovidos de possíveis efeitos secundários negativos tais como o risco de metástases, necrose dos tecidos, etc., no segundo caso.

[0007] Usando nanopartículas magnéticas que chegam à proximidade imediata dos tecidos tumorais ou que penetram de um modo preferido em células cancerosas, que é possível ultrapassar os problemas acima mencionados e atingir uma elevada eficiência do efeito hipertérmico, localizando-o ao nível celular.

[0008] Especificamente enviar nanoestruturas nas células tumorais de tumores sólidos, ou tecidos patológicos ou locais, tais como placas amilóides de Alzheimer, ou sobre os tecidos danificados de esclerose múltipla, é assim possível transportar, de uma maneira eficiente e livre de efeitos colaterais, múltiplos tratamentos conjugados, tais como o hipertérmico e os farmacológicos.

[0009] Na literatura, existem muitos exemplos de nanopartículas inorgânicas-polímero ou proteína híbrida compreendendo um núcleo de magnetita biocompatível nanopartículas e um revestimento, ou polímero ou proteína, possivelmente carregados com fármacos e funcionalizado sobre a superfície, com agentes de direcionamento adequados.

[0010] Estas nanopartículas são agentes teranósticos potenciais em que a capacidade de gerar calor sob o efeito de um campo EM eletromagnético (efeito hipertérmico), a possibilidade de administração de fármaco (DD) e a capacidade de ser identificada durante a sua ação com técnicas de imagem (MRI) são sinergicamente combinados.

[0011] O Pedido de Patente Internacional WO 2004/071386 descreve compostos que consistem em microcápsulas lipossomais mono- ou bi-lamelares contendo uma nanopartícula magnética e uma molécula biologicamente ativa com o objetivo primário de atingir e tratar tumores no fígado.

[0012] Na patente europeia EP 1 979 365, a Requerente descreveu construtos que consistem em partículas nanométricas magnéticas funcionalizadas com moléculas bifuncionais, em que uma extremidade das referidas moléculas é ligado à superfície da partícula magnética, enquanto o outro está livre e pode portanto ser feita reagir com unidades complexos tais como biopolímeros, ciclodextrinas, anticorpos e fármacos para utilização no campo farmacêutico e de diagnóstico, permitindo que complexos de nanopartículas/aglutinante para ser obtido, em que ocorre um revestimento total e compacto das nanopartículas sem alterações significativas das propriedades dependendo isso (por exemplo, propriedades ópticas ou magnéticas).

[0013] A EP 2 17 1 600 descreve construtos de patente subsequente em que as partículas funcionalizadas semelhantes às descritas na patente EP 1 979 365 acima são revestidas com os polímeros em que uma molécula com propriedades farmacológicas, possivelmente, tendo sido dispersas.

[0014] Também Pedido de Patente Europeia 512 992 2 (para o nome do mesmo Requerente) descreve processos de síntese de poliol, que permitem facilmente a obtenção de nanopartículas de magnetita com o mesmo tamanho e controlado (que, portanto, têm uma eficiência elevada hipertérmica).

[0015] Como pode ser visto, consequentemente, várias soluções têm sido sugeridas na literatura para a solução do problema de dirigir seletivamente dentro das partículas corporais capazes de realizar uma ação terapêutica tanto por aplicação de por si só ou em combinação com drogas tradicionais de hipertermia; no entanto, produtos conhecidos não satisfazem inteiramente a aplicação e precisam conseguir um tratamento eficaz de tumores e outras doenças com nanoestruturas devido a vários problemas ainda não superados. O primeiro problema é a especificidade da nanoestrutura, na verdade, é conhecido a partir da literatura que partículas inorgânicas- polímero/proteína híbrida são rapidamente eliminados do sistema reticuloendotelial quando administrado sistemicamente (células reticulares, macrófagos, células de Kupffer).

[0016] O apuramento das nanoestruturas é, portanto, responsável pela ineficácia de um tratamento nanoteranóstico em um nível sistêmico; numerosas tentativas têm sido feitas para ultrapassar esta dificuldade, incluindo a funcionalização da superfície da nanopartícula de polímero/proteína com unidades de distribuição, tais como anticorpos monoclonais, peptídeos e moléculas ativas (tais como os açúcares, etc.), mas também neste caso, a maior parte das partículas são eliminados pelo sistema reticuloendotelial e apenas uma pequena quantidade atinge as zonas em questão, o tecido de tumor e células cancerosas.

[0017] Um segundo problema, uma consequência da primeira, é que a quantidade de partículas magnéticas que atingem o tumor ou o tecido patológico pode revelar-se insuficiente para realizar um efeito hipertérmico eficiente.

[0018] Finalmente, os sistemas atuais nanoteranóstico têm uma fraca estabilidade em fluidos biológicos e, assim, tendem a formar agregados grandes (até mais de 500-1000 nm) que não são suscetíveis de penetrar na massa do tumor ou excedem uma barreira sangue-cérebro intacta, o que piora o direcionamento específico destes sistemas nas células alvo, o que limita ainda mais a eficiência do tratamento.

[0019] A partir da literatura sabe-se que os linfócitos T dentro do sistema imunológico são os protagonistas principais das respostas anti-tumorais.

[0020] Eles são capazes de reconhecer seletivamente as células de tumor devido ao seu receptor específico, chamado de TCR. A ativação dos linfócitos T pelo respectivo peptídeo antigênico tumoral pode ocorrer apenas se o antígeno é apresentado pelas células representadas por monócitos, macrófagos, células dendríticas, células de Langerhans, a microglia ou também linfócitos B.

[0021] Para uma ativação de linfócitos T eficaz, sinais de membrana e solúveis sinais também são necessárias, para além do antígeno. Entre os sinais solúveis, a maioria dos poderosos fatores de ativação é a interleucina 2 (IL-2), enquanto que entre os sinais de membrana, o mais poderoso é molécula B7.

[0022] Uma vez que o tumor é identificado, ele é destruído pelos linfócitos através de vários mecanismos, entre os quais os principais são: o mecanismo citotóxico ligado a perforina e que ligada a ligante Fas.

[0023] Melanoma foi um dos primeiros tumores a serem associados a uma resposta imune local forte mediada por linfócitos T, e ao longo dos anos, tem sido possível provar que uma forte resposta de linfócitos T está relacionada a um melhor prognóstico.

[0024] Através da utilização de nanopartículas, é possível desenvolver uma nova estratégia anti-câncer personalizado baseado no uso de linfócitos T especializadas em matar um tumor, armados por nanopartículas, pronto para bater o tumor, após ativação por campos eletromagnéticos de laser.

[0025] Além disso, a literatura descreve amplamente o papel desempenhado pelo sistema imune, e em particular pelos linfócitos e células inflamatórias, em doenças do sistema nervoso, tais como a esclerose múltipla, a doença de Alzheimer.

[0026] A esclerose múltipla é de fato o protótipo de doenças auto-imunes na patogênese dos quais um papel crucial é desempenhado por linfócitos T (Elliot M. Frohman, MD, Michael K. Racke, MD, e Cedric S. Raine, N Engl J Med 2006; 354:942-955). Em particular, as células T auxiliares capazes de produzir citocinas inflamatórias importantes, tais como o interferon-gama e linfotoxina, chamadas de células T auxiliares 1 (Th1), mas também de linfócitos T CD8, linfócitos B e células do sistema imunológico da linha de monócitos, são muito importantes. Também na doença de Alzheimer (Henry W. Querfurth, e Frank M. LaFerla, N Engl J Med 2010; 362: 329-344), um papel patogênico importante é realizado por mecanismos inflamatórios relacionados com a produção de interleucina 1, interleucina 6, fator de necrose tumoral α, pela microglia e astrócitos, devido a proteínas amilóides; nanopartículas de acordo com a invenção pode, consequentemente, desempenham um papel importante também no tratamento destas doenças.

Breve descrição das figuras

[0027] A Figura 1 mostra, tirada com um microscópio de varrimento de emissão de campo arma no modo STEM, a formação de aglomerados típica feita por nanopartículas de acordo com a invenção dentro de uma matriz de polímero.

[0028] A Figura 2 mostra um construto de mistura de partículas magnéticas e nano hastes de ouro.

[0029] A Figura 3 mostra esquematicamente um modelo de construto que consiste em nanopartículas de magnetita ou de magnetita e de nano hastes de ouro e revestidas com polímeros de bloco de PLGA-PEG-b-COOH.

[0030] A Figura 4 mostra o esquema do processo de preparação passo a passo do construto nanoestruturado de acordo com a invenção.

[0031] A Figura 5 mostra o esquema do processo para a purificação e seleção dos linfócitos.

[0032] A Figura 6 mostra uma fotografia tirada com um microscópio óptico de monócitos/macrófagos carregados com nanopartículas de acordo com a invenção.

[0033] Figura 7 e 8 mostram o 1H-NMR do polímero PLGA-NHS conjugado com NH2-PEG-COOH.

[0034] A Figura 9 mostra o espectro de UV-Vis, de um produto de acordo com a invenção.

[0035] A Figura 10 mostra um teste de BCA sobre um produto de acordo com a invenção.

Sumario da invenção

[0036] São descritas nanopartículas magnéticas a superfície da qual é funcionalizada com catecol e construtos compreendendo uma pluralidade das referidas nanopartículas encapsuladas em uma matriz de polímero biocompatível, em que uma molécula com ação terapêutica está facultativamente dispersa, a referida matriz de polímero opcionalmente ser adicionalmente funcionalizada por sua vez. Verificou-se surpreendentemente que os ditos construtos poliméricos podem ser incorporados em células do sistema imune que dão origem à engenharia dos mesmos.

Descrição detalhada da invenção

[0037] Foi agora surpreendentemente verificado que construtos compreendendo uma pluralidade de nanopartículas magnéticas funcionalizadas com catecol encapsulado em uma matriz de polímero biocompatível pode ultrapassar os problemas acima, garantindo a estabilidade necessária em meios fisiológicos e no sangue humano.

[0038] Além disso, as características estruturais destes construtos ajudam a garantir um efeito hipertérmico implementado em comparação com o mostrado por núcleos inorgânicos monodispersos descritos nas patentes acima referidas; esta vantagem é devido a uma assim chamada "estrutura de cluster" (ver Figura 1) das partículas magnéticas que tendem a combinar em centros múltiplos estruturais de partículas dentro da matriz de polímero a realização de um efeito sinérgico sobre as propriedades hipertermia.

[0039] A funcionalização de partículas magnéticas com catecol, de acordo com a invenção, é essencial para a estrutura de agrupamento acima para ocorrer e, consequentemente, permite a obtenção de construtos muito superiores do que os que são conhecidos no estado da técnica no que se refere propriedades de hipertermia e estabilidade ao longo do tempo.

[0040] Entre as partículas magnéticas, a magnetita é especialmente preferida. Se preferido, os constructos de acordo com a invenção podem ter, para além das nanopartículas magnéticas, conforme descrito acima, uma pluralidade de nano hastes de ouro (ver Figura 2).

[0041] A presença de nano hastes permite um efeito considerável hipertérmico por aplicação de uma radiação laser infravermelho, tal como a gerada pelo laser de CO2, o que vai aumentar ainda mais o efeito hipertérmico transmitido por estruturas de fragmentação de magnetita.

[0042] Isto permite um sistema de laser e as ondas de rádio combinadas que utilizam laser para zonas de superfície ou que podem ser alcançadas através de sonda e as ondas de rádio para zonas profundas.

[0043] As nanopartículas magnéticas podem ser preparadas através do processo de poliol conhecido, como descrito por exemplo no pedido de patente Europeia acima de 2 512 992 que descreve um processo de preparação em que:

[0044] i) uma solução de poliol de Fe'" é preparada a partir de Fe0;

[0045] ii) nanopartículas de magnetita são preparadas em condições de síntese de poliol.

[0046] O passo (I) acima, é a reação bem conhecida e descrita de ataque ácido (também ácidos fracos tais como ácido acético) de ferro de acordo com a equação:

[0047] Depois disso, é possível oxidar completamente a solução de Fe", em polióis de Fe'" (por exemplo etilo) através de uma lavagem de ar e adição de H2O2 no ambiente da reação a uma temperatura inferior a 100 °C.

[0048] Nano hastes de ouro são preparadas de uma maneira conhecida com uma síntese assistida por microondas a partir de ouro na forma iônica na presença de vários aditivos: brometo de alquiltrimetilamônio, CnTAB n = 10-16, cloreto de cetilpiridínio, C16 PC e PVP [a este respeito, ver M . Tsuji, K. Matsumoto, T. Tsuji, H. Kawazumid, Mater. Lett. 59 (2005) 3856] ou por redução de HAuCI4 com ácido ascórbico, na presença de CTAB e AgNO3 (nesta matéria, ver F. Ratto et al. J NANOPARTICLE RESEARCH 2010 e [Ratto F. et al. J NANOPARTICLE RESEARCH 2012)

[0049] As superfícies das partículas magnéticas e/ou magneto-óptica obtidas como descrito acima são funcionalizadas com catecol (grupo bifuncional), explorando a afinidade dos grupos polares OH à superfície das partículas e permitindo que a parte de extremidade não se ligar à superfície da partícula para manter uma reatividade hidrófoba apropriada para a incorporação subsequente em uma matriz de polímero/proteína.

[0050] A matriz de polímero de acordo com a presente invenção é entendida para consistir de copolímeros biodegradáveis e, portanto, é capaz de permitir a libertação do fármaco, o qual deve proceder gradualmente à medida que a matriz se degrada em um ambiente fisiológico.

[0051] Exemplos de copolímeros apropriados para este fim são: nanomicelas biodegradáveis, poliésteres, poliésteres, poliuretanos, policarbonatos e ácido poli(glutâmico), polieteramina e polibenzilglutamato.

[0052] Particularmente preferidos são nanomicelas biodegradáveis, consistindo em copolímeros em bloco de ácido poli(láctico-co-glicólico) e polietileno glicol carboxilato (PLGA-b-PEG-COOH, faixa MnPLGA = 44-10 kDa, MnPEG = 2-3 kDa) que tem a fórmula (EU)

[0053] em que m = [117-330]; n = [117-330]; P = [60-100].

[0054] Este produto é conhecido e já foi empregue em várias outras obras de Drug Delivery também ao nível da clínicos de Fase I para o teste de agentes anti- câncer (ver X. Shuai et al, 2004 e X. Shuai, H. Ai, N. Nasonkla, S. Kim, J. Geo, J. Controlled Release, 2004, 98, 415).

[0055] O polímero de facto tem características que permitem a montagem de sistemas de nanoesféricos com uma zona interior hidrofóbica, garantida por resíduos de PLGA, e uma zona exterior hidrófilo, que é transmitida pelos terminais de PEG-COOH (ver Figura 3).

[0056] Esta dupla funcionalidade permite que as nanoesferas para prender os ingredientes ativos orgânicos na parte hidrofóbica e ser dispersas em solução aquosa, graças à parte hidrofílica.

[0057] Se se desejar, o polímero pode ser misturado com moléculas que têm uma ação terapêutica que é disperso na matriz de polímero de acordo com processos conhecidos e como ilustrado nos exemplos apresentados abaixo.

[0058] Exemplos de moléculas com ação terapêutica de acordo com a invenção são por exemplo drogas anti-câncer (taxanos, gemcitabina, vincristina, etc), removedores de peroxinitrito, inibidores de superóxido dismutase, retinóides (bexaroteno), citocinas tais como a interleucina 10, ligantes TLR, tais como molécula HP-NAP capaz de ativar o TLR2, aspirina.

[0059] Além disso, a funcionalidade de ácido carboxílico do fragmento de PEG-COOH das micelas permite uma ligação estável química com anticorpos monoclonais, proteínas, peptídeos ou moléculas ativas de interesse (por exemplo, e/ou corantes fluorescentes) para o reconhecimento específico por sobre-expressões celulares.

[0060] Entre os anticorpos úteis para a funcionalização de acordo com a invenção podemos mencionar hERG, hEGFR, IgG, moab, etc.

[0061] Os exemplos (veja-se exemplo 0) descreve a funcionalização de cima, em particular, utilizando um anticorpo monoclonal específico hERG1 descrita e reivindicada na patente italiana IT 1, 367,86.

[0062] Em particular, é um anticorpo monoclonal específico contra a porção extra-celular S5-poro de HERG1 proteína produzida por um hibridoma que compreende o produto da fusão de uma célula imortalizada, pertencente à linha de células neoplásicas murino NS0, e uma de linfócitos obtidos pela imunização de um rato com um peptídeo de sequência EQPHMDSRIGWLHN.

[0063] O construto de acordo com a invenção (daqui em diante também referido como "nanobioreator" ou "NBR") contendo nanopartículas magnéticas funcionalizadas com catecol é preparado mediante a realização de um nanoprecipitação, em que dois fluidos:

[0064] - Uma solução orgânica de polímero dissolvido em um solvente, misturou-se com a suspensão de nanopartículas revestidas com ligante orgânico, tanto no mesmo solvente,

[0065] e

[0066] - Uma solução aquosa de Na2HPO4 1 mM)

[0067] são misturados em um fluxo constante em uma célula de mistura em batelada ou síntese contínua. Para a síntese em batelada, a suspensão orgânica contendo o polímero e partículas é injetada com uma seringa na solução aquosa, sem agitação magnética, em um único passo.

[0068] Para a síntese contínua, um duplo sistema de bomba peristáltica é preparado para realizar a adição da solução orgânica para a corrente aquosa (proporção em volume/água orgânico 10/01). Os respectivos tubos atraem a solução diretamente a partir dos pulmões contendo a suspensão orgânico (com partículas funcionalizadas e polímero) e a solução de Na2HPO3 1 mM (pH 7,4).

[0069] Uma vez que a dispersão de partículas híbridas (consistindo de nanopartículas magnéticas funcionalizadas com catecol incluídas no polímero) foi obtida, uma parte do solvente orgânico é removido através de um evaporador rotativo de modo a minimizar a quantidade da fase orgânica nos passos subsequentes de produção.

[0070] A suspensão é então dialisada contra uma solução aquosa de Na2HPO3 para a remoção da fase orgânica e concentrou-se para o volume mínimo possível obter uma concentração de 0,1 a 1% p/p.

[0071] Através de uma segunda concentração que é possível obter um produto muito mais concentrada através de diálise de membrana com um fator de concentração teórico que varia de 5x a 20x, dependendo do uso. O produto é então filtrado com um filtro de 12:22 para remover a carga bacteriana. O produto tem uma excelente eficiência hipertérmica se irradiado durante 30 minutos com o campo magnético alternado de 21 -24 kA/m e uma frequência de 60190 kHz, a sua temperatura aumenta em pelo menos 5 °C.

[0072] O processo aqui descrito permite a preparação de construtos com uma distribuição dimensional centrada em uma faixa de 30 a 60 nm.

[0073] O potencial Ç do produto assim obtido (Malvern Zetasizer Nano-S), medido para ter informação sobre a estabilidade eletrostática da suspensão e a sua força iônica, é menor do que -30 mV, o que significa que as partículas são afetadas pela superfície negativa de repulsão eletrostática produzida pelos grupos carboxílicos em que a pH (fisiológico) 7,4 são parcialmente desprotonados.

[0074] As condições experimentais descritas acima permitem fazer uma suspensão com uma boa estabilidade após diluição em meio de cultura tipicamente utilizados para culturas de células (DMEM, RPMI), exibindo pouca tendência para a agregação e a sedimentação igualmente depois de uma mudança clara em condições de força iônica devido à diluição.

[0075] A obtenção do produto funcionalizado sobre a superfície com anticorpos monoclonais e/ou corantes fluorescentes (por exemplo Cyanine®, Dylight®, etc.) de uma entrega direcionada e para utilização de técnicas de imagem requer a utilização de NBR como um precursor, antes de ser submetido ao segundo processo de concentração (ver acima).

[0076] Tipicamente, nesta fase, o produto tem uma concentração de cerca de 0,05-0,1% em peso de material inorgânico.

[0077] O passo de processo preliminar proporciona a ativação dos grupos carboxila terminais do polímero expostos em direção à parte externa das nanopartículas, em contato com a fase polar, com ativadores tais como EDAC [1-etil-3(-3- dimetilaminopropil)carbodiimida] (razão molar de EDAC/COOH = 10/1) e sulfo-NHS (NHS/COOH = 1/1), de modo a promover o ataque subsequente por esterificação dos grupos terminais amina do anticorpo monoclonal e/ou do corante fluorescente. No caso de corantes fluorescentes com emissão a À600 - 800 nm (adequado para aplicações de formação de imagem NIR in vivo), uma vez que as moléculas de éster-terminal só NHS estão disponíveis no mercado, é necessário prever uma etapa intermediária onde um diamino-terminal ligante é adicionado para a ponte de ligação, por um lado com o corante fluorescente, e por outro lado com os grupos carboxílicos do polímero ativado.

[0078] Uma vez que a superfície das nanopartículas foi ativada, a solução corante de anticorpo e/ou do terminal amino é adicionado e deixar repousar.

[0079] A suspensão é em seguida concentrada e dialisada contra Na2HPO3 aquoso e concentrou-se a 0,2-1 0,0% em peso da fase inorgânica, dependendo do uso.

[0080] O produto é então filtrado com um filtro de 12:22 para remover a carga bacteriana. O processo aqui descrito permite a preparação de construtos com uma distribuição dimensional centrada em uma gama de 40 a 70 nm.

[0081] O produto potencial Çoç assim obtido (Malvern Zetasizer Nano-S), medido para ter informação sobre a estabilidade eletrostática da suspensão e a sua força iônica seja inferior a -30 mV, mas maior do que o medido no produto NBR, que significa que a carga negativa exercida por os grupos carboxílicos do produto em bruto é parcialmente neutralizada pelo anticorpo ligado/corante.

[0082] Os teores de anticorpo ligado às partículas são analisados usando o teste BCA®: após a adição de reagentes adequados para a solução contendo o analito de proteína, um complexo de Cu2+ desenvolve cuja coloração a 562 nm é observada com a análise espectral e a partir do qual a concentração de anticorpo é derivada utilizando uma calibração linear.

[0083] Com o processo aqui descrito é possível, por exemplo, produzir nanopartículas funcionalizadas com Moab, com a percentagem de ataque moAb entre 5 e 30% em peso em comparação com o teor de fase inorgânica.

[0084] A produção do nanobioreator/fármaco lipofílico (daqui em diante NBR_PTX) e sistema nanobioreator/anticorpo/fármaco lipofílico (NBR_hERG_PTX) (em que o fármaco lipofílico, por exemplo, é paclitaxel) é exatamente o mesmo que o processo de síntese do nanobioreator como descrito acima e, consequentemente, fornece o encapsulamento das nanopartículas inorgânicas, previamente funcionalizados com catecol, dentro de uma matriz de polímero baseada em PLGA-b-PEG-COOH. A única variação deste processo prevê a dissolução da quantidade específica de droga dentro do polímero e a suspensão das nanopartículas funcionalizadas.

[0085] Em seguida, o nanobioreator carregado com paclitaxel (NBR_PTX) é obtido utilizando o método de nanoprecipitação, onde a solução orgânica acima mencionada é vigorosamente adicionada à solução aquosa de Na2HPO4 1 mm dentro de uma célula de mistura. Não há alterações nas propriedades morfológicas da suspensão a partir de uma batelada para uma síntese contínua. Os processos de purificação, filtração e concentração aplicados são os mesmos tal como descrito acima.

[0086] Para a caracterização do produto, para além da determinação do diâmetro da partícula média, o seu potencial :; e a concentração da fase inorgânica, a quantidade de ingrediente ativo encapsulado é também determinada por cromatografia líquida de alta eficiência.

[0087] O produto assim obtido e caracterizado, em seguida, pode ser adicionalmente funcionalizado na superfície com unidades de segmentação, tais como (hEGR, hEGFR, IgG, ...).

[0088] O processo criado para este fim segue com precisão o procedimento de focalização do nanobioreator NBR_moAb como descrito acima.

[0089] Na verdade, este prevê uma etapa preliminar de ativação dos grupos carboxila presentes no polímero, com ativadores tais como EDAC e sulfo-NHS e um passo de reação com o anticorpo monoclonal, tudo de acordo com as mesmas proporções como estabelecido no processo anteriormente descrito para a NBR_moAb.

[0090] Os processos de purificação usual e caracterização são realizados. As suspensões de nanopartículas assim obtidos são caracterizados por um diâmetro hidrodinâmico médio de entre 45 e 55 nm, enquanto o potencial Ç é bem abaixo de -30 mV.

[0091] De acordo com uma outra forma de realização da invenção, os construtos como acima definido, como uma alternativa para a decoração com proteínas ou com anticorpos, pode ser incorporado nas células do sistema imune.

[0092] Surpreendentemente, os construtos que compreendem aglomerados de partículas de magnetita funcionalizados com catecol e revestidos com copolímeros de bloco de ácido poli(láctico-co-glicólico) e polietileno glicol carboxilato (PLGA-b-PEG-COOH, gama MnPLGA = 44-10 kDa, MnPEG = 03/02 kDa), tal como descrito acima, são facilmente incorporados por células do sistema imune, sem comprometer a sua funcionalidade e vitalidade.

[0093] Uma vez que as células do sistema imune são concebidas com a introdução dos construtos de acordo com a invenção, estas podem ser usadas para o diagnóstico de doenças tumorais, doenças degenerativas (por exemplo, doença de Alzheimer), do sistema nervoso central, cardiovascular cerebral e doenças infecciosas, transplantes , doenças autoimunes e também para a terapia de tumores, doenças cardiovasculares cerebrais, doenças degenerativas (por exemplo, doença de Alzheimer), doenças infecciosas, transplantes, cirrose do fígado e outras condições que envolvem fibrogênese, doenças caracterizadas por múltiplos abortos, morte intra-uterina, doenças neonatais, congênita e distúrbios da coagulação adquiridos, doenças genéticas, doenças auto-imunes, e, finalmente, para o alívio da dor.

[0094] A indução da libertação pode ter lugar com diferentes métodos, tais como o antígeno específico (por exemplo, MAGE-3, no caso de tratamento de melanoma, MOG ou antígenos de mielina no tratamento de esclerose múltipla, etc.) ou com substâncias imunomoduladoras adequadas tais como IL-2, ligante de CD40, TLR-agonistas, lipossomas, complexos imunoestimulantes (ISCOMS).

[0095] Deve notar-se, de fato, que uma propriedade importante das células do sistema imune é representada pela sua capacidade para atingir quase todas as zonas do corpo, consequentemente, a sua utilização como um veículo para alcançar distritos específicos, realizando o construto de acordo com a invenção, o produto específico necessário para o destino, ultrapassar a grande limitação de corrente dos nanoteranósticos representados pela baixa especificidade do tratamento.

[0096] As células do sistema imune úteis para a finalidade acima são, por exemplo, selecionadas dentre:

[0097] Os linfócitos T, monócitos, macrófagos, células dendríticas, células assassinas naturais, os linfócitos B, granulócitos neutrófilos, granulócitos eosinófilos, basófilos, granulócitos células gama delta.

[0098] As células são tomadas a partir do mesmo paciente, carregadas com as nanopartículas desejados e, em seguida, re-introduzido no paciente mesmo por via tópica ou por via sistêmica.

[0099] As células do sistema imune irão então ser purificadas, tal como descrito abaixo, e a fim de facilitar o direcionamento seletivo/preferencial dos distritos corporais afetados pela doença em questão, as células podem ser tratadas ex vivo com antígenos relevantes (ou alérgenos), imunomoduladores ou projetadas com imuno potenciador ou moléculas imuno supressoras.

[0100] Uma das maneiras de selecionar as células T para fins de diagnóstico ou terapêuticos é enriquecer o número de linfócitos T específicos para um antígeno particular que pode ser um antígeno de tumor, como descrito acima.

[0101] Os linfócitos, adequadamente concebidos com os construtos da invenção, podem, uma vez no lugar, liberar as partículas por meio de estímulos químicos adequados, as partículas podem, em seguida, sob irradiação de campos eletromagnéticos no intervalo de ondas de rádio exercer hipertermia ou liberar ingredientes ativos, tais como medicamentos antitumorais, catadores de moléculas ativas no estresse oxidativo do tecido cerebral, moléculas anti-inflamatórios, etc. as nanopartículas ainda pode desempenhar as suas funções, mesmo se eles permanecem confinados dentro dos próprios linfócitos.

[0102] As nanopartículas magnéticas pode também executar a função de formação de imagem de ressonância magnética, sendo excelente meio de contraste T2 T2* (ver as patentes acima), nanopartículas contendo nano hastes de ouro podem ser utilizadas em terapia anti-tumoral mediada por laser e identificada através de métodos do tipo espectrometria fotoacústica.

[0103] A purificação e seleção dos linfócitos

[0104] Linfócitos T para utilização contra tumores são purificados a partir do sangue periférico ou do local do tumor ou de nodos linfáticos do paciente, após administração prévia dos antígenos tumorais relevantes, ou de outras regiões do corpo, como considerado relevante, usando métodos normalizados e/ou com o auxílio de métodos MACS® seletivos (Current Protocols in Immunology 2013; D'Elios et al J Immunol 1997; 158: 962-967).

[0105] A fim de selecionar os linfócitos T específicos para o tumor, os linfócitos T são colocadas em cultura com o antígeno tumoral em questão (por exemplo MAGE-3 para o melanoma, com uma concentração de 10 pg/ml) em meio RPMI completo durante cinco dias. Em seguida, IL-2 recombinante humano é adicionado a cada três dias, e em seguida, as células serão carregadas com nanopartículas, lavou-se e, em seguida administrou-se ao doente topicamente e/ou sistemicamente.

[0106] As células T para utilização como produto de diagnóstico, por exemplo para a esclerose múltipla com a tecnologia de ressonância magnética, são selecionadas pela sua especificidade para antígenos de mielina ou MOG (10 pg/ml) ou outros antígenos, como, preferencialmente, capazes de alcançar as estruturas do SNC.

[0107] Para este fim, elas são cultivadas com um ou mais antígenos de cinco dias, em seguida expandidas com IL-2, e, em seguida, carregadas com a NP.

[0108] O mesmo procedimento pode ser utilizado para outras doenças neurológicas, tais como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, acidente vascular cerebral e outras doenças cerebro-cardiovasculares que utilizam antígenos relevantes adequadas.

[0109] As células dendríticas (altamente eficientes para a sua capacidade para apresentar o antígeno de linfócitos T, e, assim, grandemente capazes de ativar linfócitos T) são obtidas utilizando métodos normalizados tradicionais e/ou com o auxílio de métodos seletivos Macs® (Current Protocols in Immunology 2013; Codolo et al. Arthr Rheum 2008; 58: 3609-17). Elas serão incubadas durante 3644 horas com o antígeno desejado, em seguida, carregado com a NP, lavou-se e reinfundido no paciente para fins terapêuticos ou de diagnóstico (ver o diagrama de processo na Figura 5).

[0110] Células assassinas naturais e/ou linfócitos gama delta, com atividade citotóxica forte, são obtidos utilizando métodos padronizados tradicionais e/ou com a ajuda de métodos seletivos MACS® (Current Protocols in Immunology, 2013), eles são então carregados com a NP desejado como bem como, eventualmente, com outros compostos imunomoduladores, lavados e reintroduzidas no doente para fins terapêuticos (por exemplo, anti-tumoral) ou também fins de diagnóstico.

[0111] Os granulócitos neutrófilos são obtidos utilizando métodos normalizados tradicionais e/ou com o auxílio de métodos seletivos Macs® (Current Protocols in Immunology, 2013), que são, em seguida, carregados com o NP desejado, bem como, eventualmente, com outros compostos imunomoduladores, lavou-se e reintroduziu no paciente para fins de diagnóstico (por exemplo, para identificar a presença de qualquer focos de infecção no corpo, que não pode ser identificada por outras técnicas) ou também fins terapêuticos. Também outros tipos de células podem ser selecionados para utilização em diagnóstico e/ou terapêutico (tais como células efetoras para ser utilizado para a terapia de tumores, doenças autoimunes, infecções, doenças degenerativas), tais como linfócitos B, eosinófilos, basófilos, os quais são obtidos usando métodos padronizados tradicionais e/ou com a ajuda de métodos MACS® seletivos (Current Protocols in Immunology 2013).

[0112] Eles são, em seguida, carregados com o NP desejado ou, possivelmente, com outros compostos imunomoduladores, lavados e re-introduzidos no paciente.

[0113] Células imunes carregadas com as nanopartículas podem ser usadas para exibir distritos com técnicas de imagem apropriadas do corpo que são um local da doença.

[0114] As células T e as células de Jurkat são otimamente preenchidas com NP após 4 horas.

[0115] Os monócitos/macrófagos, células dendríticas, células J774A.1 são capazes de incorporar as nanopartículas com um método de acordo com a invenção em que os monócitos/macrófagos, células dendríticas, células J774A.1 são carregadas com as nanopartículas (NP), a uma concentração de 0,05 % em um meio de cultura adequado específico (meio). Para formar o meio contendo NP, o NP é primeiro dispensado e, em seguida, o meio de cultura específico.

[0116] O meio consiste em: DMEM COMPLETA 10% FBS DMEM completo: . DMEM alta concentração de glicose (DME/HIGH). (Euroclone) (código: ECB750 L). . L-glutamina, 200 mM de solução (100X). (Euroclone) (código: BCE 3000D) . Solução de penicilina-estreptomicina (100X). (ATCC) (código: 30-2300) soro bovino fetal FBS 10%: Soro fetal bovino, qualificado. (Sigma-Aldrich) (código: F6178-100mL)

[0117] Sempre que necessário soro autólogo do paciente ou meios na ausência de soro vai ser usado em vez de soro fetal de bovino.

[0118] Os monócitos/macrófagos, células dendríticas, células J774A.1 são otimamente preenchidos com NP após 2 horas, mas o fenômeno de incorporação é ativo após 15' até 24h.

[0119] A Figura 6 mostra uma foto tirada com um microscópio óptico dos monócitos/macrófagos carregados com nanopartículas.

[0120] A invenção será mais e melhor compreendida à luz dos exemplos dados abaixo, também notar as Figuras 4 e 5 que resumem esquematicamente os vários passos para a preparação da construto e engenharia das células do sistema imune.

[0121] Exemplo 1

[0122] Preparação de acetato de ferro em dietilenoglicol °

[0123] Reagentes:

[0124] 40g Fe (Fe < 99% < 212 mm) igual a 0,716 mol; 800 g de água; 800 g CH3COOH (80%) igual a 10,67 mol; 46,64 g de água oxigenada (30%) igual a 0,41 mol; 0,12 g de HCl concentrado; DEG (dietileno glicol) 3850 g.

[0125] Síntese:

[0126] Ferro, o ácido acético e uma solução de água e o ácido clorídrico foram carregados para um balão de 5000 ml de 4 tubuladuras e sob corrente de nitrogênio e a temperatura foi trazida até 90 °C e mantida durante 6 horas. O sistema foi deixado a arrefecer, sob N2, e a solução foi filtrada para remover o Fe não dissolvido. A água oxigenada é adicionada gota a gota à solução límpida colocados em um frasco utilizando um gotejador, mantendo a temperatura a 35 °C durante 1 h, obtendo-se uma solução límpida igual a 1628,3 g com um título de ferro de 2,40% p/p. Ácidos em excesso são, em seguida, retirados por uma primeira destilação sob vácuo a T de 40 °, uma recirculação de parte da seco com água e remoção por destilação duas vezes (duas lavagens consecutivas) e uma extração final no T de cerca de 50 °. 3850 g ° são adicionados para a seco de modo a trazer a título de ferro teórico para o valor de 1,01% p/p de Fe.

[0127] Exemplo 2

[0128] Preparação de nanopartículas em Fe 3O4 dietilenoglicol

[0129] Reagentes:

[0130] 1.50 g de Fe0 (Fe0, <99%, <212 mm) Fe0 ) 0,179 mol; 150 g DEG; 1, 1,2g solução em DEG 1/10 HCl conc. 37%; 300,00 g FeAc3 em DEG(1,01% P/P de Fe'").

[0131] O ferro metálico e DEG foram colocados em um balão de 500 ml de 4 tubuladuras sob N2 e a temperatura foi levada a 150 °C. A solução de DEG de ácido clorídrico foi adicionada ao sistema e deixada sob agitação durante 5 minutos. Ferro de etilo é então adicionado em 10 alíquotas equivalentes, utilizando uma seringa, de modo a assegurar o correto crescimento das partículas, levando a temperatura até 170 °C, a reação termina dentro de 24-36 horas.

[0132] O produto foi deixado a arrefecer até 60 °C e decantou-se em um copo, magneticamente retendo o ferro de metal que não reagiu e depois filtrou-se sobre uma fibra de vidro de 0,45 μm.

[0133] 450 g de uma nanossuspensão de magnetita em dietileno glicol possuindo um título em Fe iônica igual a 0,91 ± 0,05%, que expresso em Fe3O4 corresponde a 1,253% + 0,05. A hipertermia foi medida nesta amostra e os valores foram como se mostra na tabela

[0134] SARM: Taxa d e absorção específica expressa em relação à massa de metais (Fe)

[0135] Exemplo 3

[0136] Preparação de ligante orgânico N- dodecanamida (3,4dihidroxifenetil) (DDA)

[0137] PM = 335,48 g/mol

[0138] Reagentes:

[0139] 25 g de cloridrato de dopamina igual a 0,1318 mol; 1 L de THF; 45 mL Trietilamina 0,32 mol; 31 0,20 mL de cloreto de lauroíla 0,135 mol;

[0140] Purificação e Cristalização

[0141] 400 THF mL (Aldrich 401757-2L- Lot STBC4923V)

[0142] 935 mL de acetato de etila (Aldrich Lote 34972-2.5L- 57BC011 AV)

[0143] 315 mL de éter de petróleo (Aldrich Lote 77379-2.5L- BCBG7367V)

[0144] Síntese:

[0145] Para um balão de 5L de 4 tubuladuras, cloridrato de dopamina e, em seguida THF (1 L) são colocados sob atmosfera de nitrogênio e, em seguida, é adicionada a trietilamina, e o sistema é mantido sob agitação durante cerca de 20 'para se obter uma suspensão branca.

[0146] A um balão de 3 L com um fundo plano, THF (1 L) e o agente de acilação são adicionados. A solução é agitada e adicionou-se os reagentes contidos no balão de 5 L utilizando uma bomba peristáltica a um caudal de aproximadamente 2 ml/min ao longo de 9 h, obtendo-se uma solução de cor amarela-laranja com algum sólido branco no fundo.

[0147] Purificação:

[0148] A fase orgânica que contém o produto de síntese é então purificada e este último é recuperado a partir do sub-produto formado durante a reação. A purificação é realizada através da remoção do solvente através de evaporador rotativo com dois de recirculação (2x200 mL). Por outro lado, sobre o resíduo sólido, e sobre os vestígios residuais nos frascos de síntese, de extração aquosa e tratamento com acetato de etila são realizados em uma ampola de decantação. As fases orgânicas são combinadas, secas com Na2SO4 e finalmente levadas até à secura em um rotavapor. 57 g de um produto oleoso cor de laranja são obtidos.

[0149] Cristalização:

[0150] 450 ml de uma mistura de éter de petróleo: acetato de etila = 7: 3 são adicionados ao produto. A suspensão foi colocada em água fria e um sólido branco começou a cristalizar. O sistema foi deixado um dia para descansar.

[0151] O sólido foi filtrado em um Buckner, lavou-se com licor mãe e secou-se utilizando uma bomba de óleo. Cerca de 39 g foram obtidos (44 g teórica - rendimento 88,6%).

[0152] O licor mãe resultante da cristalização (2.45g- laranja sólido castanho) e das lavagens foram levados à secura (PRIME 27,13g- marrom escuro sólido).

[0153] Exemplo 4

[0154] Funcionalização da superfície de nanopartículas Fe3O4 (em THF):

[0155] Reagentes:

[0156] 40,0 g Dispersão de Fe3O4 igual a 2,164 mol -10-3; 1089 mg DAA igual a 3,247.10-3 mol; 120 mL de EtOH; 80,0 g de THF.

[0157] 1,089 mg de DDA em 120 mL de EtOH são solubilizados em um frasco de 250 ml; a solução assim preparada é adicionada a magnetita com uma seringa de 60 ml. Em seguida, é submetida a ultrassons durante 1 h, em um banho de ultrassom. A amostra é deixada em repouso durante alguns minutos e, em seguida, 60 mL H2O são adicionados e a NP são resolvidos no ímã de neodímio; o sobrenadante é separado e nanopartículas são novamente dispersas em 80,0 g de THF. 4 gotas de trietilamina são adicionados à dispersão (dispersar as partículas após cerca de 10 minutos). Caracterização DLS

[0158] Exemplo 5

[0159] Funcionalização da superfície de nanopartículas Fe3O4 (em acetona):

[0160] Reagentes:

[0161] 4,0 g de dispersão Fe3O4 igual a 0,2.103 mol; 108,0 mg DAA igual a 0,3 .10-3 mol; 12,0 ml de EtOH; 13,6 mL de acetona.

[0162] A suspensão de magnetita é sonicada em um banho de ultrassom durante 1 h, em seguida, ele é adicionado a uma solução de 108 mg de DDA em 12,0 mL de EtOH com uma seringa de 25 ml. Em seguida, é colocada a sonicar durante 30 min. A amostra é deixada em repouso durante alguns minutos. 6 mL H2O são adicionados e NP são resolvidos no ímã de neodímio, em seguida, o sobrenadante é separado e a NP novamente dispersa em 13,6 mL de acetona. 2 gotas de trietilamina são adicionados à dispersão (as partículas dispersam imediatamente). Caracterização DLS

[0163] Exemplo 6

[0164] Síntese de polímero PLGA-PEG-b-COOH 43- 3 kDa

[0165] Para a síntese do copolímero de bloco de PLGA-PEG-b-COOH, o precursor de PLGA-COOH (PM 44-10 kDa) foi ativado com N-hidroxissuccinimida (NHS), utilizando a química de acoplamento de diciclohexilcarbodiimida (DCC), e em seguida combinando o aduto com a parte amino-funcional PEG-NH2 (MW 03/02 kDa) em diclorometano (DCM) como descrito a seguir:

[0166] Passo 1: A ativação da funcionalidade carboxílica com NHS

[0167] Reagentes 98 g PLGA-COOH (50:50 de poli (DL-lactido- co-glicolido), carboxilato Fim Grupo 1,037g NHS (N-hidroxisuccinimida 98%) 720 mL DCM (Diclorometano > 99,9%) 1,98 g DCC (N, N-diciclo-hexilcarbodiimida 99%) 990 ml DCM (Diclorometano> 99,9%) 1600 ml éter dietílico (> 99,8)

[0168] Processo

[0169] PLGA-COOH e 600 mL de diclorometano foram adicionados a um balão de 5 L com quatro tubuladuras sob atmosfera de nitrogênio. Após solubilização do polímero, N-hidroxissuccinimida (NHS) e N, em seguida, foram adicionados N diciclohexilcarbodiimida (DCC- sobre 0,25 g de cada vez); o sistema foi deixado sob agitação durante cerca de 40 horas em uma atmosfera inerte. 120 mL de diclorometano foram usados para lavar o funil a partir dos sólidos de modo a não perder as matérias-primas.

[0170] A suspensão amarela foi filtrada para um balão de 2L atado, a fim de eliminar a diciclo- hexilureia. O balão de 5 L foi lavado com 250 mL (X3) e CH2Cl2 190ml. O produto foi concentrado até um volume de aproximadamente 400 ml por um evaporador rotativo, em um balão de 1 L (50 mL de DCM seco lavar): uma suspensão densa amarelada foi obtido.

[0171] O PLGA-NHS foi precipitado utilizando 400 ml (X4) de éter dietílico frio. Para cada lavagem, o sólido branco foi decantado e o sobrenadante foi removido. Subsequentemente, o sólido é seco durante cerca de 2h30 'usando a bomba de óleo. Passo 2: Conjugação de PLGA-NHS com NH2-PEG-COOH PLGA-NHS CHCl3 CH2Cl2 - PM = 119.38 DIPEA N-etildiisopropilamina [(CH3)2CH]2NC2H5 - PM = 129,24 COOH-PEG-NH2 HCl x NH2-PEG-O-C3H6-COOH- PEG PM = 3000da

[0172] Reagentes PLGA-NHS (intermediário de reação) 1 L (síntese), CHCl3 (clorofórmio> 99,5) 100 mL + 250 mL (lavagens) CHCl3 (clorofórmio > 99% facada, com 0,75% de etanol) 1,2 ml de DIPEA (N,N-di-isopropiletilamina 99,5%) 7g COOH-PEG-NH2 (razão da forma polímero-cloridrato) 1250 ml de éter de dietila (> 99,8%) 1250 ml de água deionizada

[0173] Processo

[0174] Em um balão de 2L de 3 tubuladuras equipado com um agitador mecânico, sob fluxo de nitrogênio, o intermediário resultante foi dissolvido em 1 L de clorofórmio. 1,2 mL de DIPEA foram adicionados ao sistema, utilizando uma seringa e, subsequentemente, 7g COOH-PEG-NH2 (pequenas adições). O sistema foi deixado sob agitação sob fluxo inerte durante cerca de 90h.

[0175] A partir do balão de 3 tubuladuras, a solução amarela é transferida para um balão de 2L de 1 tubladura e lavou-se com 100 mL de clorofórmio.

[0176] O produto foi concentrado até cerca de 550 ml (volume de destilado CHCl3 = 650 ml) por meio de um rotavapor. O produto é transferido a partir do frasco de 2 L ao frasco de 1 L de 1 tubladura (lavagem com 250mL CHCl3).

[0177] O copolímero foi precipitado e lavou-se com 250 mL (X5) de éter dietílico frio: no início, a suspensão deve ser adicionada lentamente e agitou-se com uma vareta de vidro para evitar o excesso de saturação. Em cada lavagem, o sistema foi repousou em um banho de gelo e, em seguida, o sobrenadante foi removido (suspensão opalescente contendo sais quaternários e impurezas orgânicas que não reagiram).

[0178] O sólido branco de aspecto semelhante a borracha foi lavado com 250 mL (X5) de água deionizada para remover os vestígios de que não reagiu COOH-PEG-NH2.

[0179] O sistema foi colocado sob vácuo (bomba de anel líquido em primeiro lugar e depois da bomba de óleo), alternando secagem a vácuo (bomba de óleo-armadilha a -30 °C), a desintegração do polímero para facilitar a secagem e a armazenagem em um congelador durante a noite. O procedimento é repetido até que não haja mais perda de peso é observada.

[0180] O produto é armazenado em um congelador.

[0181] 86,80g de polímero foram recuperados (rendimento de cerca de 83%).

[0182] Exemplo 7

[0183] Síntese (PLGA-b-PEG-COOH 12-3 kDa)

[0184] Passo 1: A ativação da funcionalidade carboxílica com NHS

[0185] Especificações técnicas do reagente:

[0186] Reagentes 7 g de PLGA-COOH 7000-17000 (50:50 de poli(DL- lactido-co-glicolido), carboxilato Grupo Final) 0,582 mmol 150 mL de CH2Cl2 (Diclorometano-> 99,9%) para a solubilização de PLGA-COOH 0,27 g de NHS (N- hidroxisuccinimida- 98%) foi lavado com 30 mL de CH2Cl2 2,34 mmol 0,51 g de DCC (N,N Diciclohexilcarbodiimida- 99%), lavada com 50mL CH2Cl2 2,493 mmol 70 mL de CH2Cl2 (Diclorometano > 99,9% para lavar o frasco de 500 ml antes da filtração em Buckner 550ml de éter dietílico (Aldrich > 99,8%)

[0187] PLGA-COOH e 150 mL de diclorometano foram adicionados a um balão de 500 sob atmosfera de nitrogênio. Após solubilização do polímero, o NHS foi adicionado (30 mL CH2Cl2 para a lavagem do funil) e, em seguida, adicionou-se DCC - adições consecutivas - 50 mL de CH2Cl2 para lavagem funil).

[0188] O sistema foi deixado sob agitação durante cerca de 24 horas em uma atmosfera inerte.

[0189] A solução incolor (com sólido branco em suspensão) foi filtrada em Buckner para um balão de 1L atado, a fim de eliminar a diciclo-hexilureia. O balão de 500 mL foi lavado com 70ml de CH2Cl2.

[0190] O produto foi transferido para um balão de 1 tubladura em forma de pêra e concentrada por evaporador rotativo Buchi a, depois de cerca de 1 h, obteve-se uma suspensão branca espessa.

[0191] Passo 2: Conjugação de PLGA-NHS com NH2-PEG-COOH

[0192] Reagentes PLGA-NHS (intermediário de reação) em suspensão espessa 260 mL de CHCl3 (Clorofórmio-Aldrich > 99,5% - Cat) por intermediário 20 mL de CHCl3 para lavar amino PEG COOH 0,35 mL de DIPEA (N,N-di-isopropiletilamina 99,5%) 1,82 g de PEG-COOH-NH2 (razão de forma polímero- cloridrato) 0,6066 mmol 520 ml de éter dietílico (> 99,8%) 300mL de água Deionizada

[0193] Processo

[0194] Em um balão de 500 mL sob nitrogênio, o Intermediário 100 (X2) e 60 mL de CHCl3 foram solubilizados. 0,35 ml de DIPEA foram adicionados ao sistema, utilizando uma seringa e em seguida 1,82 g de PEG- COOH-NH2 com o funil 20 mL de lavar CHCl3). O sistema foi deixado sob agitação sob fluxo inerte durante 96 h.

[0195] A partir do balão de 4 tubuladuras a suspensão, filtrada em Buckner para a presença de resíduos de castanho e branco, foi transferido para um balão de lavagem com um balão de 500mL de 1 tubladura com poucos mL de clorofórmio.

[0196] O produto é concentrado (volume destilado CHCl3 = 170mL) por meio de um rotavapor. 120mL de éter etílico frio (suspensão branca-borracha de banho de gelo-haste de vidro), 60 mL (suspensão branca-banho de gelo), 80 mL (início da precipitação- banho de gelo), 60 mL (congelador por cerca de 1 hora) são adicionados à solução amarela. O produto foi lavado com 100 mL (X2) de éter dietílico frio. Em cada lavagem, o sistema foi poupado no congelador e, em seguida, o sobrenadante foi removido (suspensão opalescente contendo sais quaternários e impurezas orgânicas que não reagiram). As três frações de éter foram secas (1,20 g).

[0197] O sólido branco de aspecto semelhante a borracha foi lavado com 100mL (X3) água deionizada (banho de gelo) para remover vestígios de que não reagiu COOH-PEG- NH2.

[0198] O copolímero (18,10g) foi colocado sob vácuo no evaporador rotativo Bucchi e foi então ligado à bomba de óleo (armadilha de etanol-gelo seco) para cerca de 4 h (7,78g- secagem alternada com desintegração). O produto foi submetido a desintegração e, em seguida, colocado sob vácuo, alternando as fases de secagem, a desintegração e congelador.

[0199] O procedimento é repetido até que perda de peso não seja mais observada.

[0200] O produto é armazenado em um congelador.

[0201] 7,52g de polímero foram recuperados (rendimento de 88% -86%).

[0202] (2g) P.M.:11300 g/mol - 0,1769 mmol

[0203] (5g) P.M.:15400 g/mol - 0,3246 mmol

[0204] mmol PLGA COOH: 0,5015

[0205] g PLGA PEG COOH (mol2 g * P.M.2g) + (mol5 g * P.M.sg) = 2,529 + 5.972 = 8,5 g

[0206] Cálculos com PM = 12000. 8,74g esperado PLGA PEG COOH

[0207] Exemplo 8

[0208] Configuração do nanobioreator (NBR)

[0209] Reagentes:

[0210] 40,0 g Fe3O4-DDA igual a 9,5e-04 mol Fe3O4; 220,0 mg de PLGA-PEG-b-COOH polímero igual a 5e-06 mol; 400 ml de tampão de fosfato 1 mM

[0211] Depois de ter polímero solubilizado 220,0 mg em 5 mL de THF, 40,0 g de Fe3O4-DDA foram injetados na solução orgânica. Utilizando uma seringa de 60 mL, o produto é concentrado em um rotavapor para remover o THF presente. O processo é parado quando deixa de haver formação e da condensação de vapores orgânicos.

[0212] O produto é, em seguida, concentrou-se e dialisou-se com o sistema de Cogent M com uma membrana Pellicon 2mini 100 kDa, de acordo com o procedimento seguinte:

[0213] Uma vez que o sistema tenha sido drenado, é introduzida uma suspensão de NBR, concentrou-se por um fator de 1,5 teórico e, em seguida, dialisado com água 2000 mL UP tamponada 10-3M é introduzido.

[0214] É adicionalmente concentrado para um volume de 100 mL em sistema Pellicon XL com uma membrana de 500 kDa depois de manter o sistema em NaOCl 1: 10 durante 30 minutos.

[0215] O processo é parado uma vez que o fator de concentração teórico de 20X foi atingido (conc teórica, de inorgânico: 1,0%).

[0216] Depois filtrou-se com Millipore Sterivex 0,22 pm filtros em PES. É armazenado em frigorífico. Caracterização DLS Potencial z ICP

[0217] Estabilidade em meio de cultura:

[0218] a amostra é diluída a 1: 20 em (0,05% em peso de fase inorgânica)

[0219] DMEM + 10% FBS + glutamina + antibiótico: é claro, sem agregados.

[0220] DLS

[0221] Exemplo 9

[0222] Produção de nanobioreator contínuo (NBR)

[0223] Reagentes:

[0224] 200 mg de PLGA-PEG-6-COOH polímero igual a 4,4e-06 mol; 52,6 g THF; 36,4 g Fe3O4-DDA igual a 8,6e-04 mol FE30; 1000 mL de H2O MilliQ com tampão de fosfato a pH 7,4 = 10-3M.

[0225] A um balão de Erlenmeyer de 100 mL, 0,2 g de polímero PLGA-b-PEG- COOH e 52,6 g de THF são adicionados, agitando até dissolução completa (vários minutos). Finalmente, 36,4 g Fe3O4-ADD são adicionados.

[0226] Síntese:

[0227] Um sistema de bomba peristáltica dupla foi criado após a calibração para realizar a adição da solução orgânica na corrente aquosa (proporção em volume de THF/água = 10/1). Os respectivos tubos atraem a solução diretamente a partir dos pulmões contendo a solução de THF (com PLGA-b-PEG-COOH e partículas) e a solução tampão de fosfato preparada em frasco de 2,5 L.

[0228] O produto é primeiramente retirado em um evaporador rotativo para remover o THF e depois levada até à secura; uma vez que o componente volátil foi evaporado, o produto é recuperado. O produto é, em seguida, concentrou-se e dialisou-se com o sistema de Cogent M com membrana Pellicon 2mini 100 kDa.

[0229] Esvaziar o sistema, 254,5 g do produto são recuperados.

[0230] Fator de concentração teórico: 4,7X

[0231] Concentração teórica: 0,078%

[0232] O tempo necessário para a concentração e diálise: 20'.

[0233] O produto é adicionalmente concentrado em Pellicon XL com 500 kDa da membrana. O tempo necessário para a concentração final: 1H.

[0234] Recuperado: 11,51 g líquido do volume morto dentro da membrana de cerca de 1-2 mL. Conc. Teór. (considerando o Vmorto 1 -5 mL): 14% Caracterização DLS Para testes de estabilidade no soro a 0,05% (teórico) ICP

[0235] Exemplo 10

[0236] Criação de nanobioreator alvo de Moab (NBR_hERG)

[0237] Reagentes:

[0238] 40,38 mL NBR igual a 0,533 μmol -COOH; solução de 2,32 mL de sulfo-NHS 0,23 mM igual a 0,533 mmol; 190 μL EDAC * HCl solução 28mm igual a 0,053mmol; 2,64 mL 1,52 mg/mL de solução de hERG igual a 4,0 mg de hERG (2.7e- 08 mol); 1500 ml de solução aquosa Na2HPO3 = 10-3M

[0239] A um recipiente de 250 ml estéril, 40,38mL NBR são adicionados e, em seguida, 0,19 mL ED AC (0,028 M) e 2,32 mL de sulfo-NHS são adicionados. Após 40' (em repouso), 2,64 mL de solução a hERG1 (1,52 mg/mL = 4,0 mg) são diluídos com 15,52 mL de tampão fosfato 1 mM e este é adicionado a 42,89 ml ativado NBR. (Vfinal = 61,05 mL; Fe3O4 = 0,056%). Ele fica em repouso durante a noite.

[0240] O sistema está configurado para a diálise do produto utilizando a membrana Pellicon XL 500 kDa no PES. O sistema é lavado com 300 mL H20 MilliQ, 400 mL de 0,5% de hipoclorito de sódio são percorridos e o sistema é deixado para esterilizar por cerca de 30min. Em seguida, é lavado com 400 ml de tampão de 1 mM.

[0241] O produto é, em seguida, concentrado até um volume de 22 ml, ajustando a velocidade da bomba de cerca de 15 mL/min (P = 0,27 bar). Além disso, o primeiro permeado de diálise é analisado através do teste BCA®.

[0242] Ele é dialisado com 100 mL (4 volumes) de tampão de 1 mM a uma velocidade de 15 mL/min (P = 0,27 bar) e concentrado até um volume de 4,7 mL.

[0243] Finalmente, o produto é filtrado com filtros de 0,22 μM em PES. É armazenado em frigorífico. O produto obtido deste modo exibe uma boa estabilidade após diluição em meio de cultura a 0,05% em peso; não existem agregados ou em formas sólidas floculação visível a olho nu. Caracterização DLS Potencial z ICP Estabilidade: DLS Teste BCA

[0244] Para a realização do ensaio de BCA, a concentração de NBR_hERG é normalizada em relação à do (NBR), a qual, consequentemente, serve como um branco isento de anticorpo correspondente. Uma vez que a coloração desenvolveu-se a adição do reagente relevante, as amostras são analisadas por espectrofotometria de UV-VIS, em seguida, os valores de absorbância são interpolados na curva de calibração previamente preparada (utilizando um padrão de BSA) e as concentrações equivalentes MoAb é extrapolada. A quantidade de líquido presente no anticorpo NBR_hERG é calculada subtraindo os valores de Moab encontrados no eluato e no branco (NBR) da correspondente ao da amostra de NBR_hERG. Veja equação abaixo: CmoAb (NBR_moAb) líquido = CmOAb(NBR_moAb) - CmOAb(NBR) - CmoAb (eluato)

[0245] A seguir estão os valores experimentais medidos: O eluato mAb = 45 μg/mL mAb NBR = 435 μg/mL mAb NBR_hERG = 863 μg/mL mAb real (mAb NBR_hERG - mAb NBR) = 428 pg/mL Razão mAb/Fe3O4 = 0,14

[0246] Exemplo 11

[0247] Criação de nanobioreator alvejado com Fluo-Corantes (NBR_Fluo)

[0248] Especificações técnicas do Reagente: NBR [Fe3O4] = 0,081% [PLGA-b-PEG- COOH] = 0,061% * 1, 4-diaminobutano MW = 88,15 g/mol d = 0,877 g/mL Alexa Fluor® 750 (750 nm) PM = 1300 g/mol tampão de fosfato em H2O UP C = 1 M; pH 7,4

[0249] Reagentes:

[0250] 30,00 mL NBR (0,40 pmol PPGC43-3.1)

[0251] 1 mg de Alexa Fluor 750 (em 770 μL ^ [1 mM])

[0252] 1500mL H2O MilliQ com tampão de fosfato a 7,4 = 10-3 M

[0253] Sulfo-NHS PM = 217,13 g/mol

[0254] EDAC HCl PM = 191,7 g/mol

[0255] Preparação de solução de Fluo-NH2

[0256] O fluoróforo é solubilizado com 770 μL de DMSO a obtenção de uma solução de 1 nmol/μL.

[0257] Em um frasco de 12 ml, 4,950 μL tampão de fosfato 1 mM são adicionados e 50 μL de solução de fluoróforo Alexa Fluor 750 (50 nmol) são adicionados. Em seguida, é colocada sob agitação magnética e depois 100 μL de solução de 132 pg/mL de 1, 4-diaminobutano são adicionados (correspondendo a 150 nmol = 13,2 g). A solução é deixada a reagir durante 24 h, no escuro e sob fluxo de nitrogênio. O fluoróforo NH2-terminal assim obtido vai ser usado para o passo de síntese subsequente sem ser purificado.

[0258] Preparação da solução de Sulfo-NHS (0,23 mM)

[0259] Pesar exatamente 5,0 mg de Sulfo-NHS e solubilizar em um frasco de 100 ml usando 1 mM de tampão de fosfato.

[0260] Preparação da solução de EDAC (0,028 mM)

[0261] Para um frasco de 4 ml, 2,7 mg de EDAC e 0,5 ml de tampão de 1 mM são adicionados . Tampa e agite para facilitar a mistura. Esta solução deve ser preparada imediatamente antes da reação.

[0262] Síntese:

[0263] A um recipiente de 100 ml, 30,00 ml NBR e DF são adicionados 0,14 mL de EDAC (0,028 M) e 1,72 mL de sulfo-NHS (0,23 mM) são adicionados.

[0264] O volume total: 30,00 mL + 0,14 mL + 1,72mL = 31,86 mL

[0265] Após 40' (em repouso), 2,64 ml de solução a 750 Alexa Fluor (10 nmol/ml) são adicionados.

[0266] Deixa-se repousar durante 4 horas.

[0267] A DLS controle é realizado (NBR_Fluo TQ).

[0268] Purificação:

[0269] O sistema está configurado para a diálise do produto utilizando uma membrana Pellicon XL 500 kDa no PES e uma bomba peristáltica Masterflex L/S com a cabeça fácil de carga II. O sistema é então esterilizado escoando hipoclorito de sódio a 0,5% e deixando-se reagir durante cerca de 30 min. Depois de se lavar com água MilliQ estéril e ajustando-se o sistema com 1 mM de tampão de fosfato (também estéril), o produto é concentrado para um volume de 10 mL (recolher 23 ml de permeado) definindo o número de rotações até cerca de 12 mL/min (P = 0,25 mbar). A taxa do primeiro permeado é retida para a análise de UV- VIS. É então dialisada com 40 mL (4 volumes) de tampão de 1 mM de trabalho a uma velocidade de 12 mL/min (P = 0,25 mbar). Neste momento, concentra-se até um volume de 6 ml.

[0270] Recuperado: 5,00 g

[0271] Fator de concentração síntese Teórico: 5,8x

[0272] Fator de concentração teórica em relação a NBR: 5X

[0273] Filtração:

[0274] O produto é filtrado com filtros de 0,22 μM Millex em PES. Para a purificação de todo o produto, é necessário um filtro. É armazenado em frigorífico.

[0275] NBR_27_Fluo_01 DF recuperado= 4,49 g Caracterização DLS R0366/2013; R0368/2013 Potencial Z R0368/2013 ICP R0368/2013 UV-Vis R0368/2013

[0276] Exemplo 12

[0277] Criação de nanobioreator alvejado com Corantes de Fluo (NBR_Fluo) Especificações técnicas do Reagente: NBR [Fe3O4] = 0,081% [PPGC43-3.1] = 0,061% * 1, 4-diaminobutano PM = 88,15 g/mol d = 0,877 g/mL Alexa Fluor 750 (750 nm) PM = 1300 g/mol Tampão de fosfato em H2O UP C = H; pH 7,4 Reagentes: 30,00 mL NBR (0,40 pmol PPGC43-3.1) 50,00 nmol Cianina 5-1, 4-diaminobutano (5,0 ml em ^ [10 μM]) 1500 mL de H2O MilliQ com tampão de fosfato a 7,4 = 10 "3M Sulfo-NHS PM = 217,13 g/mol EDAC HCl PM = 191,7 g/mol

[0278] Preparação de solução de Fluo-NH2

[0279] A um frasco de 12 mL, 5 mL de 1 mM de tampão fosfato, 50 nmol (1 frasco) Cianina 5, NHS-éster e em seguida 150 nmol (13,2 g) de 1, 4-diaminobutano são adicionados. A solução é deixada a reagir durante 24 h, no escuro, sob agitação magnética e fluxo de nitrogênio. O fluoróforo NH2-terminal assim obtido vai ser usado para o passo de síntese subsequente sem ser purificado.

[0280] Fluxo de nitrogênio. O fluoróforo NH2- terminal assim obtido vai ser usado para o passo de síntese subsequente sem ser purificado.

[0281] Preparação da solução de Sulfo-NHS (0.23mm)

[0282] Pesar exatamente 5,0 mg de Sulfo-NHS e solubilizar em um frasco de 100 ml usando 1 mM de tampão de fosfato.

[0283] Preparação da solução de EDAC (0,028mM)

[0284] A um frasco de 4 ml, 2,7 mg de EDAC e 0,5 ml de tampão 1 mM são adicionados . Tampe e agite para facilitar a mistura. Esta solução imediatamente antes da reação.

[0285] Síntese:

[0286] A um recipiente deve ser preparada de 50 mL estéril, 30,00mL NBR são adicionados e 0,14 mL de EDAC (0,028 M) e 1,72 mL de sulfo-NHS (0,23 mM) são adicionados.

[0287] O volume total: 30,00 mL + 0,14 mL + 1,72mL = 31,86 mL

[0288] Após 40' (em repouso), 2,64 ml de solução de cianina-5-NH2 (10 nmol/ml) são adicionados. Deixa-se repousar durante 4 horas.

[0289] Purificação:

[0290] O sistema está configurado para a diálise do produto utilizando a membrana Pellicon XL 500 kDa no PES.

[0291] Neste ponto, o produto é concentrado para um volume de 10 mL (coleta de 23 mL de permeado). Definir a velocidade da bomba a cerca de 12 mL/min (P = 0,25 mbar); t = 4' Manter uma taxa do primeiro permeado para a análise de UV-VIS.

[0292] Dialisar com 40 mL (4 volumes) de tampão de 1 mM. v 12 ml/min (P = 0,25 mbar); t = 11'

[0293] Neste momento, concentra-se até um volume de 6 ml; t = 5'.

[0294] Recuperado: 4,29 g

[0295] Fator de concentração síntese teórica: 5,5x

[0296] Fator de concentração teórica em relação a NBR: 4,8x

[0297] Filtração:

[0298] O produto é filtrado com filtros de 0,22 μM Millex em PES. Para a purificação de todo o produto, é necessário um filtro. É armazenado em frigorífico.

[0299] NBR_Fluo recuperado = 4,1 g

[0300] Exemplo 13

[0301] Produção de nanobioreator alvo de Moabe e Fluo-Corantes (NBR_hERG-Fluo)

[0302] Especificações técnicas do reagente: NBR [Fe3O4] = 0,821% [PPGC43-3.1] = 0,616% 1, 4-diaminobutano PM = 88,15 g/mol d = 0,877 g/mL Cianina 5-NHS éster (650nm) Tampão de fosfato em H2O UP C = 1 M; pH 7,4 Sulfo-NHS PM = 217,13 g/mol EDAC HCl PM = 191,7 g/mol hERG1 PM = 15000 g/mol

[0303] Reagentes: 4,79 mL de NBR (0,64 pmol PPGC43-3.1) 25 nmol de Cianina éster 5-NHS (em 2,5 mL ^ [10 μM]) 2,7 mg EDAC 5,0 mg de Sulfo-NHS 4,8 mg de hERG (3,2 mL ^ 1500 pg/ml) 1500 mL de H2O MilliQ com tampão de fosfato a pH 7,4 [] = 10-3 M

[0304] Preparação de solução de Fluo-NH2

[0305] A um frasco de 12 mL, 5 mL de tampão de fosfato 1 mM, 50 nmol (1 frasco) Cianina 5 NHS-éster são adicionados, coloca-se sob agitação magnética e depois adiciona-se 100 L de 13,2 mg/100 ml de solução de 1, 4- diaminobutano (correspondendo a 150 nmol = 13,2 pg). A solução é deixada a reagir durante 24 h, no escuro e sob fluxo de nitrogênio. O fluoróforo NH2-terminal assim obtido vai ser usado para o passo de síntese subsequente sem ser purificado.

[0306] Preparação da solução de Sulfo-NHS (0,23mm)

[0307] Pesar exatamente 5,0 mg de Sulfo-NHS e solubilizar em um balão de 100 mL usando 1 mM de tampão de fosfato.

[0308] Preparação da solução de EDAC (0,028 mM)

[0309] A um frasco de 4 ml, 2,7 mg de EDAC e tampão são adicionados 0,5 ml 1 mM. Tampe e agite para facilitar a mistura. Esta solução deve ser preparada imediatamente antes da reação.

[0310] Síntese:

[0311] A um recipiente de 100 ml estéril, 7,95 mL de tampão de 1 mM e, em seguida, 4,79 mL de NBR são adicionados. A mistura é agitada suavemente para misturar e, em seguida, 2,29 mL de EDAC (0,028 M) e

[0312] 2,79 mL de sulfo-NHS (0,23 mM) são adicionados.

[0313] O volume total: 7,95 mL + 4,79 mL + 2: 29 mL + 2.79mL = 17,83 mL

[0314] Após 40' (em repouso), 2,5 ml da solução de éster de cianina 5-NH5 (10 nmol/ml) são adicionados. 3,2 mL da solução hERG1 (1,5 mg/mL = 4,8 mg) são em seguida diluídos em 52,32 mL de tampão fosfato 1 mM e adicionou-se a suspensão contendo NBR ativado e fluoróforo. Ele fica em repouso durante a noite.

[0315] Purificação:

[0316] O sistema está configurado para a diálise do produto utilizando a membrana kDa Pellicon XL 500 em PES já utilizado para NBR_19. Lava-se com 300 mL de H2O MilliQ, seguido de fluxo com 400 ml de 0,5% de hipoclorito de sódio e deixar em hipoclorito durante cerca de 30 min. Lavar o sistema com 400 ml de tampão de 1 mM.

[0317] Neste ponto, o produto é concentrado para um volume de 20 mL (coleta de 50 mL de permeado). Definir a velocidade da bomba a cerca de 14 mL/min (P = 0,2 mbar); t = 15 'Manter uma taxa do primeiro permeado para o teste BCA.

[0318] Dialisar com 80 mL (4 volumes) de tampão de 1 mM. v 14 ml/min (P = 0,2 mbar); t = 16'

[0319] Neste momento, concentra-se até um volume de 10 mL; t = 4'.

[0320] Recuperado: 6,46 g

[0321] Fator de diluição teórico em relação a NBR: 1,3X

[0322] Filtração:

[0323] O produto é filtrado com filtros de 0,22 µΜ Millex em PES. Para a purificação de todo o produto, é necessário um filtro. É armazenado em frigorífico.

[0324] NBR_hERG-Fluo recuperado = 7,79 g

[0325] Caracterização

[0326] DLS Potencial Z ICP

[0327] Exemplo 14

[0328] Produção de nanobioreator carregado com princípio ativo (NBR_PTX e N B R_hERG_PTX)

[0329] Especificações técnicas do reagente:

[0330] PPGC43-3.1 (batelada 5-A) 50:50 PM = 43000; PEG PM 3000

[0331] Fe3O4-ADD [Fe3O4] = 0,55%

[0332] PTX Discovery Fine Chemicals

[0333] Fosf. tampão de 1 mM pH = 7,4

[0334] THF d = 0,89

[0335] Reagentes:

[0336] 35,6 g Fe3O4-DDA (40,0 mL) (195,8 mg Fe3O4) 490 mg/L (em água)

[0337] 212,6 mg PPGC43-3.1 490 mg/L (em água)

[0338] 21,2 mg PTX

[0339] 400 ml de fosf. tampão 1 mM (real: 440 mL)

[0340] Seringa de 60 mL agulha 25G

[0341] Preparação da solução de THF [com PLGA- PEG (5,5 mg/g), a PTX (0,55 mg/g) e Fe3O4 (5,5 mg/g)]

[0342] 212,6 mg PPGC43-3.1 são solubilizados em 4 ml (frasco de 4 ml) de THF e 21,2 mg de PTX em 2,12 ml de THF (4 mL frasco) e este é adicionado a 35,6 g de Fe3O4- ADD em um frasco de 100 mL

[0343] Síntese:

[0344] A solução de THF é colocada em 400 ml de tampão de fosfato 1 mM usando uma seringa de 60 ml com uma agulha 25G.

[0345] NBR PTX obtido: 455,8 g

[0346] Decapagem

[0347] O produto é tratado em um rotavapor para remover o THF presente. Para este fim, ele é movido para um mL frasco de 1000 e as seguintes condições são definidas:

[0348] Banho T 40 °

[0349] Pressão: 154 mbar

[0350] Revoluções: 80 rpm

[0351] Depois de 1 h, uma vez que a evaporação do componente volátil tenha terminado, o produto é recuperado e pesado.

[0352] NBR PTX Rotavap recuperado = 418,22 g (37,58 g de THF removido)

[0353] Diálise e concentração:

[0354] O produto é concentrado e dialisado com sistema AMICON com uma membrana de 50 kDa, de acordo com o procedimento seguinte:

[0355] 1) lava-se com 50 mL de H2O osmotizada para remover as impurezas na membrana

[0356] 2) lavagem do sistema com a solução com 50 mL de tampão fosfato em H2O UP, 10-3 M. Uma vez que o sistema tenha sido drenado, NBR PTX é adicionado e concentrou-se para cerca de 100 mL

[0357] Depois disso, 4 lavagens são realizadas com 150 mL lustre. 1 mM. Finalmente, é concentrado para 75 ml 45 ml descartando eluato.

[0358] Esvaziar o sistema, 59,40 g de produto (NBR_PTX) são recuperados.

[0359] Fator de concentração teórico = 7,7X

[0360] Filtração:

[0361] O produto é filtrado com um filtro Millipore Sterivex 0,22 μM em filtros cilíndricos (PES).

[0362] Caracterização

[0363] DLS

[0364] ICP

[0365] Estabilidade:

[0366] A amostra de concentrado diluída 1: 8 em DMEM + FBS a 10% + glutamina + antibiótico: é límpida sem agregados

[0367] DLS

[0368] R0211/2013

[0369] Análise PTX

[0370] Exemplo 15

[0371] Produção de nanobioreator carregado com princípio ativo (NBR_PT-X e NBR_hERG_PTX)

[0372] Especificações técnicas do reagente: NBR_PTX [Fe3O4] = 0,48% [PPGC43-3.1] 0,36%* Tampão de fosfato em H2O UP C = 1 M; pH 7,4 Sulfo-NHS PM = 217,13 g/mol EDAC PM = 155,24 g/mol d = 0,877 g/mL hERG PM = 150000 g/mol

[0373] Reagentes: 4,26 mL NBR_PTX_p10 DF (3,33*10-4 μmol PPGC43- 3.1) 5,0 mg de sulfo-NHS (em 100 mL ^ [0,23 mm]) 20 μL EDAC (em 4 mL ^ [28 mM] ) 2,5 mg de hERG (0,833 mL * 3 mg/ml) 1500 mL de tampão fosfato a pH 7,4 [] = 10-3 M

[0374] Preparação da solução de Sulfo-NHS (0,23 mM)

[0375] Pesar 5,0 mg de Sulfo-NHS e solubilizar em um frasco de 100 ml usando 1 mM de tampão de fosfato.

[0376] Preparação da solução de EDAC (0,028 mM)

[0377] A um frasco de 4 ml, 2,7 mg de EDAC e 0,5 ml de tampão 1 mM são adicionados. Tampe e agite para facilitar a mistura. Esta solução deve ser preparada imediatamente antes da reação.

[0378] Síntese:

[0379] A um recipiente de 40 mL estéril, 2,36 mL de tampão de 1 mM e, em seguida, 4,26 mL NBR_PTX são adicionados. A mistura é agitada suavemente para misturar e, em seguida, 1,19 mL de EDAC (0,028 M) e 1 0,45 mL de sulfo-NHS são adicionados.

[0380] O volume total: 2,36 mL + 4,26 mL + 1,19 mL + 1,45 mL = 9,26 mL

[0381] Após 40' (em repouso), a solução obtida por diluição HERG1 0,833 ml da solução hERG1 (3 mg/mL) com 27,25 ml de tampão é adicionado 1 mM. (Vfinal = 37,34 mL; Fe3O4 = 0,056%).

[0382] É deixada para descansar durante a noite.

[0383] Purificação:

[0384] O sistema está configurado para a diálise do produto utilizando a membrana Pellicon XL 500 kDa no PES. Lava-se com 300 mL de H2O MilliQ, seguida de fluxo com 400 ml de 0,5% de hipoclorito de sódio e deixar em hipoclorito de cerca de 30 min. Lavar o sistema com 400 ml de tampão de 1 mM.

[0385] Neste ponto, o produto é concentrado para um volume de 13 mL (25 mL de permeado recolher). Definir a velocidade da bomba a cerca de 13 mL/min (P = 0,2 mbar); t = 5'

[0386] Manter uma taxa do primeiro permeado para o teste BCA.

[0387] Dialisar com 60 mL (4 volumes) de tampão 1 mM. v 13 ml/min (P = 0,2 mbar); t = 14'

[0388] Neste momento, concentra-se até um volume de 10 mL; t = 10'.

[0389] Recuperado: 7,40 g

[0390] Fator de concentração síntese teórico: 5,5x

[0391] Fator de diluição teórico comparação com NBR_PTX: 2.8X

[0392] Filtração:

[0393] O produto é filtrado com filtros de 0,22 pm Sterivex em PES. Para a purificação de todo o produto, é necessário um filtro. É armazenado em frigorífico.

[0394] NBR PTX recuperado = 6,88 g Caracterização DLS Potencial Z ICP

[0395] Rendimento real do processo

[0396] Exemplo 16

[0397] Incorporação de NBR em linfócitos

[0398] células T e células Jurkat são capazes de incorporar as partículas nano com um método desenvolvido pelos requerentes. As células T/células de Jurkat são carregadas com a NP, a uma concentração de 0,05% em um meio de cultura adequado específico (meio). A fim de formar o meio contendo a NP, o NP são dispensados em primeiro lugar e, em seguida, o meio de cultura específico. O meio é composto como se segue: • meio RPMI 1640, com 2,0 g/L de NaHC03 - w/o L- Glutamina. (Biochrom) (código: F1215) - 500 mL adicionadas com: • L-glutamina, 200 mM de solução (100X). (Euroclone) (código: BCE 3000D) - 5,5 mL sem diluição • piruvato de sódio, 100 mM (100X). (Gibco) (código: 11.360-039) - 5,5 mL sem diluição • MEM NEAA Meio Essencial Mínimo aminoácidos não essenciais (100X). (Gibco) (código: 11140-035) -5,5 mL sem diluição • GENTOMIL (gentamicina) 80 mg/2ml (AIC N ° 029314059) - um frasco de 2 ml • 2-mercaptoetanol. (Merck) (código: 444203) - usar 5,5 mL 2-mercaptoetanol como se segue: 3 7 μL de 2- mercaptoetanol em 99,963 mL de H2O estéril (final de 100 ml em volume) • 10% FBS soro fetal bovino: de soro fetal bovino, Qualificado. (Sigma-Aldrich) (código: F6178)

[0399] Sempre que necessário, soro autólogo do paciente ou meios na ausência de soro serão usados em vez de soro fetal de bovino.

Claims (13)

1. Constructo caracterizado pelo fato de que compreende uma pluralidade de nanopartículas magnéticas cuja superfície é funcionalizada com catecol possuindo grupos polares OH que aderem à superfície das partículas e à extremidade, não ligados às superfícies das partículas, apresentando reatividade hidrofóbica, permitindo sua subsequente incorporação em um polímero/matriz polimérica, e em que as referidas nanopartículas magnéticas consistem em partículas nanométricas de magnetita, encapsulados em uma matriz polimérica biocompatível.

2. Constructo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula possuindo ação terapêutica é dispersa na referida matriz polimérica biocompatível.

3. Constructo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma pluralidade de nano hastes de ouro.

4. Constructo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma pluralidade de nano hastes de ouro.

5. Constructo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a referida matriz polimérica biocompatível consiste em polímeros biodegradáveis.

6. Constructo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os referidos polímeros biodegradáveis são selecionados a partir de: copolímero, poliuretanos, policarbonatos, ácido poli(glutâmico), polieteramina e polibenzilglutamato.

7. Constructo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os referidos polímeros biodegradáveis são poliésteres.

8. Constructo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito polímero biodegradável consiste em ácido poli(láctico-co-glicólico) e carboxilato de polietilenoglicol (PLGA-b-PEG-COOH), possuindo fórmula (I) em que m = [117-330]; n = [117-330]; p = [60- 100].

9. Constructo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as ditas moléculas com ação terapêutica são selecionadas a partir de: agentes anticâncer, sequestrantes de peroxinitrito, inibidores de superoxidismutase, retinoides, citocinas, aspirina.

10. Constructo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o grupo carboxila terminal do fragmento de PEG-COOH do copolímero é funcionalizado adicionalmente com proteínas, peptídeos ou corantes fluorescentes para o reconhecimento específico pela superexpressões celulares.

11. Constructo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as referidas proteínas são selecionadas a partir de: hEGR, hEGFR, IgG e anticorpos monoclonais.

12. Processo para preparar um constructo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que: uma solução orgânica de polímero dissolvido em um solvente, contendo em suspensão nanopartículas revestidas com ligante orgânico e - uma solução aquosa de Na2HPO4 1 mM são misturados em um fluxo constante em uma célula de mistura com síntese em batelada ou contínua.

13. Processo para preparar construtos, conforme definido na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o grupo carboxila terminal do fragmento de PEG-COOH é ativado de modo a promover o ataque subsequente por esterificação de grupos amino terminais.