CN106068128A - 用儿茶酚功能化的磁性纳米颗粒、其制备和用途 - Google Patents

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Abstract

描述了磁性纳米颗粒，其表面用儿茶酚功能化；和构建体，所述构建体包含封装在生物相容的聚合物基质中的多个所述纳米颗粒，其中具有治疗作用的分子任选地被分散，所述聚合物基质任选地转而被进一步功能化；还描述了免疫系统的细胞，所述免疫系统的细胞并入所述聚合物构建体以引起它们的工程化。

Description

用儿茶酚功能化的磁性纳米颗粒、其制备和用途
发明领域
本发明涉及功能化的纳米颗粒、其制备以及其用途的领域。
现有技术
已知磁铁矿(magnetite)是具有铁磁特性的矿物质，其化学式是Fe3O4(有时也写作FeO·Fe2O3)。
众所周知，呈纳米颗粒形式即具有范围从几纳米到几十纳米的尺寸的磁铁矿，如果被浸没在无线电波范围内的可变磁场中，与电磁场相互作用，且然后向其周围的事物释放热能，因此产生所谓的过热作用或磁过热疗法。
在肿瘤学中，开发过热疗法以改进化学疗法或放射疗法的功效；事实上，将实体瘤的温度升高在41℃和45℃之间诱导了肿瘤细胞的凋亡；通常，这借助于用达到适当温度并且在受到肿瘤块影响的部位附近循环的液体洗涤来应用。
近期，采用了天线，所述天线直接插入到肿瘤块中，产生微波，并且因此与水的偶极分子相互作用，产生过热。
这些治疗通常是极具侵入性的并且具有差的功效(在第一种情况下)，并且在第二种情况下没有避免可能的负面作用诸如转移的风险、组织坏死等。
使用到达紧邻肿瘤组织处或优选地渗透进入癌细胞的磁性纳米颗粒，克服以上问题并且实现高效的过热作用是可能的，所述过热作用以细胞水平被定位。
将纳米结构特定地递送到实体瘤的肿瘤细胞中、或病理组织上或诸如阿尔茨海默病的淀粉样斑块的部位上、或多发性硬化的受损组织上，以有效的方式并且无副作用地传递多个配合的治疗诸如过热疗法和药理学治疗因此是可能的。
在文献中，存在杂化的无机聚合物或蛋白纳米颗粒的许多实例，所述杂化的无机聚合物或蛋白纳米颗粒包含生物相容的纳米颗粒磁铁矿核心以及为聚合物或蛋白的包衣，所述包衣可能装载有药物并且在表面上用合适的靶向剂功能化。
这些纳米颗粒是潜在的治疗诊断剂，其中在电磁EM场的作用下产生热的能力(过热作用)、药物递送(DD)的可能性以及在其与成像技术(MRI)作用期间被识别出的能力被协同地组合。
国际专利申请WO 2004/071386描述了由单层或双层脂质体微胶囊组成的化合物，其含有磁性纳米颗粒和生物活性分子，具有到达并治疗肝脏肿瘤的主要目标。
在欧洲专利EP 1 979 365中，申请人已描述了由用双功能分子功能化的纳米级磁性颗粒组成的构建体，其中所述分子的一端与磁性颗粒的表面结合，而另一端是游离的并且因此能够与用于在制药和诊断领域中使用的复合单元诸如生物聚合物、环糊精、抗体和药物反应，允许获得纳米颗粒/粘合剂复合物，其中存在纳米颗粒的完全且紧实的包衣而不显著改变依赖于其的特性(例如光学或磁性特性)。
随后的专利EP 2 117 600描述了构建体，其中功能化的颗粒与在以上专利EP 1979 365中描述的那些类似，用聚合物包覆，其中具有药理特性的分子可能已被分散。
(姓名为同一申请人的)欧洲专利申请2 512 992还描述了多元醇合成方法，其允许容易地获得具有均匀且受控制的尺寸的磁铁矿纳米颗粒(其因此具有高的过热疗法功效)。
因此，如可以看出的，在文献中已经提出许多解决方案用于解决在体内选择性地指导颗粒的问题，所述颗粒能够通过单独地或与传统药物联合地应用过热疗法而执行治疗作用；但是，已知的产品由于多种尚未克服的问题而未完全满足用纳米结构实现肿瘤和其他疾病的有效治疗的应用需求。
第一个问题是纳米结构的特异性，事实上，从文献已知，杂化的无机聚合物/蛋白颗粒当被全身施用时从网状内皮系统快速消除(网状细胞、巨噬细胞、枯否氏细胞(Kupffercell))。
因此，纳米结构的清除是以全身水平的纳米治疗诊断治疗的无效的原因；已经进行多种尝试来克服该困难，包括用递送单元诸如单克隆抗体、肽和活性分子(诸如糖等等)使纳米颗粒聚合物/蛋白表面功能化，但是还是在这种情况下，大多数颗粒被网状内皮系统消除，且仅少量到达有关部位：肿瘤组织和癌细胞。
第一个问题的结果，第二个问题是到达肿瘤或病理组织的磁性颗粒的量可以证明不足以进行有效的过热作用。
最后，目前的纳米治疗诊断系统在生物流体中具有差的稳定性，并因此趋向于形成不可能渗透至肿瘤块中或逾越完整的血脑屏障的大的聚集体(高至超过500-1000nm)，这使靶细胞中这些系统的特定靶向性变得更差，进一步限制了治疗的效率。
从文献已知的是，免疫系统内的T淋巴细胞是抗肿瘤应答的主要角色。
T淋巴细胞由于它们的被称为TCR的特异性受体而能够选择性地识别肿瘤细胞。只有抗原通过由单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans cell)、小神经胶质细胞或还有B淋巴细胞代表的细胞来呈递时，才可以发生T淋巴细胞通过各自的肿瘤抗原肽的活化。
对于有效的T淋巴细胞活化而言，除了抗原之外，还需要膜信号和可溶性信号。在可溶性信号中，最强有力的活化因子是白细胞介素2(IL-2)，而在膜信号中，最强有力的是分子B7。
肿瘤被识别后，其通过多种机制被淋巴细胞破坏，在这些机制中，主要的机制是：与穿孔素关联的细胞毒性机制(cytotoxic machinery)和与Fas配体关联的细胞毒性机制。
黑素瘤是与由T淋巴细胞介导的强烈的局部免疫应答相关的第一肿瘤之一，并且这些年来，证明强烈的T-淋巴细胞应答与较好的预后相关已成为可能。
通过纳米颗粒的使用，开发一种新的定制的抗癌策略是可能的，该抗癌策略基于专门杀伤肿瘤的装备有纳米颗粒的T淋巴细胞的使用，所述T淋巴细胞在通过激光/电磁场活化后易于击中肿瘤。
此外，文献广泛地描述了在神经系统的疾病诸如多发性硬化、阿尔茨海默病中由免疫系统、并且特别地由淋巴细胞和炎性细胞发挥的作用。
多发性硬化确实是自体免疫性疾病的原型，在其发病机理中，由T淋巴细胞发挥关键作用(Elliot M.Frohman,M.D.,Michael K.Racke,M.D.,和Cedric S.Raine,N Engl JMed 2006；354:942-955)。特别地，能够产生重要的炎性细胞因子诸如干扰素-γ和淋巴毒素的T-辅助细胞(称为I型T-辅助细胞(Th1))，还有T淋巴细胞CD8、B淋巴细胞和单核细胞系的免疫细胞是非常重要的。另外，在阿尔茨海默病中(Henry W.Querfurth，和FrankM.LaFerla,N Engl J Med 2010；362:329-344)，重要的致病作用通过涉及以下的炎性机制来进行：由于淀粉样蛋白通过小神经胶质细胞和星形胶质细胞产生白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α；因此，根据本发明的纳米颗粒还能够在这些疾病的治疗中发挥重要作用。
附图简述
图1示出用以STEM模式的场发射枪扫描显微镜拍摄的、通过在聚合物基质内的根据本发明的纳米颗粒取得的典型的簇形成。
图2示出磁性颗粒和金纳米棒的混合物构建体。
图3示意性地示出由磁铁矿的纳米颗粒或磁铁矿和金纳米棒组成的并且包覆有嵌段聚合物PLGA-b-PEG-COOH的构建体模型。
图4示出根据本发明的纳米结构构建体的逐步制备过程的布局。
图5示出用于纯化和选择淋巴细胞的过程的布局。
图6示出用光学显微镜拍摄的装载有根据本发明的纳米颗粒的单核细胞/巨噬细胞的照片。
图7和图8示出与NH2-PEG-COOH轭合的聚合物PLGA-NHS的1H-NMR。
图9示出根据本发明的产物的UV-Vis光谱。
图10示出对根据本发明的产物进行的BCA测试。
发明概述
描述了磁性纳米颗粒，其表面用儿茶酚功能化；和构建体，所述构建体包含封装在生物相容的聚合物基质中的多个所述纳米颗粒，其中具有治疗作用的分子任选地被分散，所述聚合物基质任选地转而被进一步功能化。惊奇地发现，所述聚合物构建体能够被并入免疫系统细胞中以引起其工程化。
发明详述
现在已经惊奇地发现，包含封装在生物相容的聚合物基质中的用儿茶酚功能化的多个磁性纳米颗粒的构建体能够克服以上问题，确保在生理介质和在人类血液中的必需的稳定性。
此外，与通过在以上专利中描述的单分散的无机核所示的过热作用相比，这些构建体的结构特征帮助确保实施的过热作用；这种优势归因于磁性颗粒的所谓的“簇结构”(参见图1)，所述磁性颗粒倾向于在聚合物基质内的多个颗粒的结构中心中结合，进行对过热特性的协同作用。
根据本发明用儿茶酚使磁性颗粒功能化对于产生以上簇结构是必需的，并因此允许获得关于过热特性和随着时间推移的稳定性的比现有技术中已知的那些构建体优越的多的构建体。
在磁性颗粒中，磁铁矿是特别优选的。如果优选，根据本发明的构建体除了如上所描述的磁性纳米颗粒之外还可以具有多个金纳米棒(参见图2)。
通过施加红外线激光辐射诸如通过CO2激光器产生的红外线激光辐射，纳米棒的存在允许可观的过热作用，该过热作用有助于进一步增强由磁铁矿的簇结构赋予的过热作用。
这使得组合的激光和无线电波系统得以实现，所述系统对表面区域或可以经由探针到达的那些区域使用激光，而对深的区域使用无线电波。
磁性纳米颗粒可以通过已知的多元醇法来制备，如例如在以上的欧洲专利申请2512992中所描述的，所述申请描述了制备方法，在该制备方法中：
i)从Fe0开始制备FeIII的多元醇溶液；
ii)在多元醇合成条件下制备磁铁矿纳米颗粒；
以上步骤(i)是熟知的并且描述的根据以下方程式的酸(还有弱酸诸如乙酸)对铁的攻击的反应：
Fe0+2H+→ Fe2++1/2H2↑
其后，在低于100℃的温度的反应环境中通过吹气和添加H2O2，使FeII在多元醇中的溶液完全氧化成FeIII(例如乙酸盐)是可能的。
金纳米棒以已知的方式在以下多种添加剂的存在下从离子形式的金开始用微波辅助的合成来制备：烷基三甲基溴化铵，CnTAB n＝10-16；氯化十六烷基吡啶，C16PC；和PVP[就此而言，参见M.Tsuji,K.Matsumoto,T.Tsuji,H.Kawazumid,Mater.Lett.59(2005)3856]或通过在CTAB和AgNO3的存在下用抗坏血酸还原HAuCl4来制备(就此而言，参见RattoF.等人J NANOPARTICLE RESEARCH 2010和[Ratto F.等人J NANOPARTICLE RESEARCH2012)。
如上所描述地获得的磁性颗粒和/或磁光颗粒的表面用儿茶酚(双官能团)通过以下功能化：利用极性基团OH对颗粒的表面的亲和力并且允许未结合至颗粒表面的末端部分保持适合于随后并入聚合物/蛋白基质中的疏水性反应性。
根据本发明的聚合物基质被理解为由生物可降解的共聚物组成，并且因此能够允许药物的释放，该释放必须随着基质在生理环境中的降解而逐渐地进行。
用于该目的的合适的共聚物的实例是：生物可降解的纳米胶束、聚酯、聚酯、聚氨酯、聚碳酸酯和聚谷氨酸、聚醚胺和聚谷氨酸苄酯。
特别地优选的是生物可降解的纳米胶束，其由聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚乙二醇羧酸酯的嵌段共聚物(PLGA-b-PEG-COOH，MnPLGA范围＝44-10kDa，MnPEG＝2-3kDa)组成，具有式(I)
其中m＝[117-330]；n＝[117-330]；p＝[60-100]。
该产物是已知的并且在Drug Delivery的多种其他工作中已经被采用，还在临床阶段I(Clinical Phase I)的层面用于测试抗癌剂(参见X.Shuai等人，2004和X.Shuai,H.Ai,N.Nasonkla,S.Kim,J.Geo,J.Controlled Release,2004,98,415)。
事实上，聚合物具有允许组装纳米球系统的特征，具有由PLGA的残基保证的疏水性内部区域和由PEG-COOH的末端赋予的亲水性外部区域(参见图3)。
该双重特征允许纳米球将有机活性成分捕获在疏水性部分且由于亲水性部分在水溶液中被分散。
如果需要的话，聚合物可以与具有治疗作用的分子混合，所述具有治疗作用的分子根据已知的方法且如在下面给出的实施例中阐明的被分散在聚合物基质中。
根据本发明的具有治疗作用的分子的实例是例如抗癌药物(紫杉烷、吉西他滨、长春新碱等等)、过氧亚硝基清除剂、超氧化物歧化酶抑制剂、维甲酸(蓓萨罗丁)、细胞因子诸如白细胞介素10、TLR-配体诸如能够活化TLR2的HP-NAP分子、阿司匹林。
另外，胶束的PEG-COOH片段的羧酸功能允许与单克隆抗体、蛋白、肽或感兴趣的活性分子(例如，荧光染料)的化学稳定键合，用于通过细胞过表达物的特异性识别。
在可用于根据本发明的功能化的抗体中，我们可以提到hERG、hEGFR、IgG、moAb等等。
实施例(参见实施例10)描述了以上的功能化，特别是使用在意大利专利IT 1,367,861中描述和要求保护的特异性单克隆抗体hERG1的功能化。
特别地，hERG1是由杂交瘤产生的针对蛋白HERG1的细胞外部分S5-孔的特异性单克隆抗体，所述杂交瘤包含在属于鼠赘生性细胞系NS0的永生化细胞和通过用序列EQPHMDSRIGWLHN的肽免疫小鼠获得的淋巴细胞之间的融合的产物。
通过进行纳米沉淀来制备根据本发明的构建体(在下文中也被称作“纳米生物反应器”或“NBR”)，该构建体含有用儿茶酚功能化的磁性纳米颗粒，其中通过批量或连续合成在混合池中以恒定流动混合以下两种液体：
-溶解于溶剂中的聚合物的有机溶液，所述溶解于溶剂中的聚合物的有机溶液与用有机粘合剂包覆的纳米颗粒的悬浮液混合，所述聚合物和所述用有机粘合剂包覆的纳米颗粒二者在相同的溶剂中，
和
-Na2HPO4的水溶液(1mM)。
对于批量合成，在单一步骤中，用注射器将含有聚合物和颗粒的有机悬浮液注射在水溶液中，而不进行磁力搅拌。
对于连续合成，准备双联蠕动泵系统以进行将有机溶液添加到含水的流(有机体积/水的比1/10)。相应的管直接地从含有有机悬浮液(具有功能化的颗粒和聚合物)和Na2HPO3 1mM(pH 7.4)的溶液的呼吸器(lung)中抽取溶液。
获得杂化颗粒(由用包括在聚合物中的儿茶酚功能化的磁性纳米颗粒组成)的分散体后，有机溶剂的一部分经由旋转蒸发器去除以便在后续的制备步骤中使有机相的量最小化。
然后，将悬浮液对水溶液Na2HPO3透析以用于去除有机相并且浓缩到可能获得从0.1％w/w到1％w/w的浓度的最小体积。
通过第二次浓缩，通过膜透析获得更加浓缩的产物是可能的，所述更加浓缩的产物具有取决于用途的范围从5×到20×的理论浓缩系数。然后，用0.22μm的过滤器过滤产物以去除细菌负荷(bacterial load)。如果用21-24kA/m的交变磁场和160-190kHz的频率辐射30分钟，那么产物具有优异的过热效率，其温度升高了至少5℃。
本文描述的方法允许制备具有集中在从30nm到60nm的范围内的尺寸分布的构建体。
测量以掌握关于悬浮液的静电稳定性及其离子强度的信息的由此获得的产物的电势ξ(马尔文纳米粒度电位分析仪-S(Malvern Zetasizer nano-S))低于-30mV，这意味着这些颗粒受到羧基产生的负表面静电斥力的影响，所述羧基在(生理的)pH 7.4下被部分地去质子化。
以上描述的实验条件允许制备具有在稀释到通常用于细胞培养物的培养基(DMEM、RPMI)中之后的良好稳定性的悬浮液，所述悬浮液在因稀释引起的离子强度条件的明显变化后还表现出聚集和沉降的小的趋向性。
获得在表面上利用用于靶向递送和用于在成像技术中使用的单克隆抗体和/或荧光染料(例如等等)功能化的产物需要使用NBR作为前体，然后其经历第二次浓缩过程(参见上文)。
通常地，在此阶段，产物具有约0.05％wt.-0.1％wt.的浓度的无机材料。
初始加工步骤用活化剂诸如EDAC[1-乙基-3-(-3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐](摩尔比EDAC/COOH＝10/1)和磺酸基-NHS(NHS/COOH＝1/1)提供聚合物的末端羧基的活化，该聚合物的末端羧基朝向纳米颗粒的外部部分暴露，与极性相接触，以便促进随后的通过单克隆抗体和/或荧光染料的末端胺基团的酯化的攻击。
在具有λ600-800nm的发射的荧光染料的情况下(适合于体内NIR成像应用)，因为仅NHS酯-末端分子是市场上可得的，所以必需提供中间步骤，在该中间步骤中，添加二氨基-末端连接物用于一方面与荧光染料桥连接(bridge link)，以及另一方面与活化的聚合物的羧基桥连接。
纳米颗粒的表面被活化后，添加抗体和/或氨基-末端染料溶液，并且保持静止。
然后，悬浮液被浓缩并且对含水的Na2HPO3透析，并且取决于用途被浓缩到高至0.2–1.0％wt.的无机相。
然后，用0.22μm的过滤器过滤产物以去除细菌负荷。
本文描述的方法允许制备具有集中在从40nm到70nm的范围内的尺寸分布的构建体。
测量以掌握关于悬浮液的静电稳定性及其离子强度的信息的由此获得的产物的电势ξ(马尔文纳米粒度电位分析仪-S)低于-30mV，但是高于在NBR产物上测量的值，这意味着由初级产物(raw product)的羧基产生的负电荷被结合的抗体/染料部分地中和。
使用测试分析与颗粒结合的抗体的含量：向含有蛋白分析物的溶液添加合适的试剂后，产生Cu2+的络合物，用光谱分析观察到该Cu2+的络合物在562nm的着色，并且使用线性校正从其导出抗体的浓度。
通过本文描述的程序，例如产生用moAb功能化的纳米颗粒是可能的，具有相比于无机相含量在5％wt和30％wt之间的moAb攻击百分比。
纳米生物反应器/亲脂性药物(下文中NBR_PTX)和纳米生物反应器/抗体/亲脂性药物(NBR_hERG_PTX)系统(其中亲脂性药物例如是紫杉醇)的制备与如以上所描述的纳米生物反应器的合成过程完全相同，并且因此提供了将之前用儿茶酚功能化的无机纳米颗粒封装在基于PLGA-b-PEG-COOH的聚合物基质内。该过程的仅有改变提供了特定量的药物在聚合物和功能化的纳米颗粒的悬浮液内的溶解。
然后，使用纳米沉淀方法获得装载有紫杉醇的纳米生物反应器(NBR_PTX)，其中将前面提到的有机溶液剧烈地添加到混合池内的Na2HPO4 1mM的水溶液。从批量合成到连续合成，不存在悬浮液的形态特征的变化。应用的纯化、过滤和浓缩方法与如以上所描述的相同。
对于产物表征，除了确定平均颗粒直径、它们的电势ξ和无机相的浓度之外，封装的活性成分的量也通过高效液相色谱被确定。
然后，由此获得的和表征的产物可以在表面上用靶向单元诸如(hEGR、hEGFR、IgG、...)被进一步功能化。
为了这个目的建立的方法准确地遵循如以上所描述的纳米生物反应器NBR_moAb的靶向程序。
事实上，其提供了用活化剂诸如EDAC和磺酸基-NHS活化存在于聚合物上的羧基的初始步骤和与单克隆抗体反应的步骤，所有步骤根据与在之前关于NBR_moAb描述的程序中列出的相同的比例。
然后进行通常的纯化和表征程序。由此获得的纳米颗粒悬浮液的特征为在45nm和55nm之间的平均流体动力学直径，同时电势ξ远低于-30mV。
根据本发明的另外的实施方案，如以上定义的构建体可以被并入免疫系统的细胞中，作为用蛋白或用抗体的修饰物(decoration)的替代物。
令人意外地，如以上所描述的包含用儿茶酚功能化的且用聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚乙二醇羧酸酯的嵌段共聚物(PLGA-b-PEG-COOH，MnPLGA范围＝44-10kDa，MnPEG＝2-3kDa)包覆的磁铁矿颗粒的簇的构建体容易地被免疫系统的细胞并入而不损害它们的功能和活力。
免疫系统细胞通过引入根据本发明的构建体被工程化后，这些免疫系统细胞可以用于诊断肿瘤疾病、中枢神经系统的退行性疾病(例如阿尔茨海默病)、心脑血管疾病和传染病、移植、自体免疫性疾病，并且还用于治疗肿瘤、心脑血管疾病、退行性疾病(例如阿尔茨海默病)、传染病、移植、肝硬化和涉及纤维发生的其他状况、特征在于多次流产的疾病、子宫内胎儿死亡、新生儿疾病、先天性和获得性凝血功能障碍、遗传疾病、自体免疫性疾病，并且最后用于疼痛缓解。
释放的诱导可以通过不同的方法进行，诸如特定抗原(例如在治疗黑素瘤的情况中的MAGE-3、在治疗多发性硬化中的MOG或髓磷脂抗原等等)，或通过合适的免疫调节物质诸如IL-2、CD40配体、TLR-激动剂、脂质体、免疫刺激复合物(ISCOMS)进行。
应注意，事实上，免疫系统的细胞的重要特性通过它们到达身体的几乎所有区域的能力来体现，因此，它们作为载体以到达特定区域的用途超越了由治疗的低特异性体现的纳米治疗诊断的大的现有局限性，该载体通过根据本发明的构建体携带目的区域(destination)所需的特定产物。
可用于以上目的的免疫系统的细胞例如选自：
T-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、B-淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、γδ细胞。
细胞从单个患者获取、用所需的纳米颗粒装载并且然后局部地或全身地重新引入同一患者中。
然后，免疫系统的细胞将如以下所描述的被纯化，并且为了促进受到所讨论的疾病影响的身体区域的选择性/优先靶向，细胞可以用相关的抗原(或过敏原)、免疫调节药物离体处理，或用免疫增强或免疫抑制分子工程化。
选择用于诊断或治疗目的的T细胞的方式之一是富集特定抗原特异性的T淋巴细胞的数目，该特定抗原可以是如以上所描述的肿瘤抗原。
用本发明的构建体适当地工程化的淋巴细胞一旦就位就可以借助于合适的化学刺激物释放颗粒，然后，所述颗粒可以在处于无线电波范围内的电磁场的辐射下发挥过热疗法或释放活性成分诸如抗肿瘤药物、在脑组织的氧化应激中活跃的分子的清除剂、抗炎性分子等等。即使纳米颗粒保持局限在淋巴细胞自身内，它们仍可以执行它们的功能。
磁性纳米颗粒还可以执行MRI成像功能，是优异的T2T2*造影剂(参见上文的专利)，含有金纳米棒的纳米颗粒可以在激光介导的抗肿瘤疗法中使用，并且通过光声光谱型的方法来识别。
淋巴细胞的纯化和选择
用于针对肿瘤的T淋巴细胞使用标准化的方法和/或在选择性方法的辅助下从外周血或从肿瘤部位或从预先施用相关肿瘤抗原之后的患者的淋巴结、或从身体的如视为相关的其他区域来纯化(Current Protocols in Immunology 2013；D’Elios等人JImmunol 1997；158:962-967)。
为了选择肿瘤特异性T淋巴细胞，将T淋巴细胞与相关的肿瘤抗原(例如对于黑素瘤的MAGE-3，以10μg/ml的浓度)一起放置在完全的RPMI培养基中培养持续五天。然后，每三天添加重组人类IL-2，并且然后将使细胞装载有纳米颗粒、洗涤并且然后局部地和/或全身地施用至患者。
用作诊断产品，例如用于通过核磁共振技术的多发性硬化的诊断产品的T细胞，针对它们对髓磷脂抗原或MOG(10μg/ml)或如优选地能够获得CNS的结构的其他抗原的特异性被选择。
为了这个目的，将它们与一个或更多个抗原一起培养持续五天，然后用IL-2扩大，并且然后用NP装载。
使用合适的相关抗原，相同的程序可以用于其他神经疾病，诸如阿尔茨海默病、帕金森病、中风和其他心脑血管疾病。
使用传统的标准化的方法和/或在选择性方法的辅助下，获得树突细胞(对于它们将抗原呈递至T淋巴细胞的能力是高效的，并因此很大程度上能够活化T-淋巴细胞)(Current Protocols in Immunology 2013；Codolo等人Arthr Rheum 2008；58:3609-17)。它们将与所需的抗原一起孵育36-44小时，然后用NP装载、洗涤并且重新注入到患者中用于治疗或诊断目的(参见图5中的过程布局)。
使用传统的标准化的方法和/或在选择性方法的辅助下获得具有强的细胞毒性活性的自然杀伤细胞和/或γδ淋巴细胞(Current Protocols in Immunology,2013)，然后用所需的NP和可能地用其他免疫调节化合物装载它们、洗涤并且重新引入到患者中用于治疗(例如抗肿瘤)目的或也用于诊断目的。
使用传统的标准化的方法和/或在选择性方法的辅助下获得嗜中性粒细胞(Current Protocols in Immunology,2013)，然后将用所需的NP和可能地用其他免疫调节化合物装载它们、洗涤并且重新引入患者内用于诊断(例如以鉴定身体中不能通过其他技术鉴定出的任何感染病灶的存在)目的或也用于治疗目的。
另外，可以针对诊断用途和/或治疗用途(诸如即将用于治疗肿瘤、自体免疫性疾病、感染、退行性疾病的效应细胞)选择其他细胞类型，诸如B淋巴细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞，所述细胞使用传统的标准化的方法和/或在选择性方法的辅助下获得(Current Protocols in Immunology,2013)。
然后，用所需的NP或可能地用其他免疫调节化合物装载它们、洗涤并且重新引入到患者中。
装载有纳米颗粒的免疫细胞可以用于利用合适的成像技术显示为疾病的位置的身体区域。
在4小时后，T细胞和Jurkat细胞最佳地填充有NP。
单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、J774A.1细胞能够并入根据本发明的方法的纳米颗粒，其中单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、J774A.1细胞装载有以在合适的特定培养基(培养基)中0.05％的浓度的纳米颗粒(NP)。为了形成含有NP的培养基，首先分配NP，并且然后分配特定培养基。
培养基由以下组成：
完全的DMEM 10％FBS
完全的DMEM：
·DMEM高葡萄糖(DME/HIGH)。(EUROCLONE)(代码：ECB7501L)
·L-谷氨酰胺，溶液200mM(100×)。(EUROCLONE)(代码：ECB 3000D)
·青霉素-链霉素溶液(100×)。(ATCC)(代码：30-2300)
·10％胎牛血清FBS：胎牛血清，合格的。(Sigma-Aldrich)(代码：F6178-100mL)
当需要时，将使用患者的自体血清或缺乏血清的培养基代替胎牛血清。
在2小时后，单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、J774A.1细胞最佳地填充有NP，但是在15’直到24h后并入现象是活跃的。
图6示出用光学显微镜拍摄的装载有纳米颗粒的单核细胞/巨噬细胞的照片。
鉴于下面给出的实施例，本发明将被更多且更好地理解，还注意，图4和图5，它们示意性地概括了用于构建体的制备和免疫系统的细胞的工程化的多个步骤。
实施例1
在二甘醇DEG中制备乙酸铁
试剂：
40g Fe(Fe<99％<212mm)，等于0.716mol；800g水；800g CH3COOH(80％)，等于10.67mol；46.64g含氧水(30％)，等于0.41mol；0.12g浓HCl；DEG(二甘醇)3850g。
合成：
在氮气流下，将铁、乙酸和水溶液以及盐酸装载到5000mL 4-颈烧瓶，并且将温度升高到90℃并且维持6小时。使体系在N2下冷却，并过滤溶液以去除未溶解的Fe。使用滴注器将含氧水逐滴添加到放置在烧瓶中的澄清溶液中，保持温度在35℃，持续1h，获得具有2.40％w/w的铁滴度(iron titer)的等于1628.3g的澄清溶液。然后，过量的酸通过在40℃的T的第一次真空蒸馏、干燥部分用水再循环并且通过蒸馏两次(两次连续的洗涤)去除以及在约50℃的T的最终汽提来汽提。将3850g DEG添加到干燥部分以使理论铁滴度达到1.01％w/w Fe的值。
实施例2
在二甘醇中制备Fe3O4纳米颗粒
试剂：
1.50g Fe0(Fe0<99％,<212mm)Fe0＝0.179mol；150g DEG；DEG中1/10HCl浓度37％的1.2g溶液；在DEG中的300.00g FeAc3(1.01％w/w FeIII)。
在N2下将金属铁和DEG放置在500mL 4-颈烧瓶中，并且将温度升高到150℃。将盐酸在DEG中的溶液添加到体系并且保持在搅拌下持续5分钟。然后，使用注射器以10当量的等分试样添加乙酸铁，以确保颗粒的适当生长，将温度升高到170℃，使反应在24-36小时内终止。
将产物冷却到60℃并且倾注在烧杯中，以磁力保留未反应的金属铁，并且然后在0.45μm玻璃纤维上过滤。
450g的磁铁矿在二甘醇中的纳米悬浮液具有等于0.91％±0.05的离子铁的滴度，该离子铁的滴度用Fe3O4表示相当于1.253％±0.05。对该样品测量过热并且值如表中所示。
SARM：针对金属(Fe)质量表示的比吸收率
实施例3
有机粘合剂N-(3,4-二羟基苯乙基)十二酰胺(DDA)
MW＝335.48g/mol
试剂：
25g盐酸多巴胺，等于0.1318mol；1L THF；45mL三乙胺0.32mol；31.20mL十二酰氯0.135mol；
纯化和结晶
400mL THF(Aldrich 401757-2L-Lot STBC4923V)
935mL乙酸乙酯(Aldrich 34972-2.5L-Lot 57BC011AV)
315mL石油醚(Aldrich 77379-2.5L-Lot BCBG7367V)
合成：
在氮气气氛下将盐酸多巴胺并且然后THF(1L)放置至5L 4-颈烧瓶，并且然后添加三乙胺，并且在搅拌下保持系统持续约20’以得到白色悬浮液。
向3L平底烧瓶添加THF(1L)和酰化剂。搅拌溶液，并且使用蠕动泵以约2mL/min的速率历时9h将溶液添加到包含在5L烧瓶中的试剂，获得黄-橙色的溶液，底部具有些许白色固体。
纯化：
然后，纯化含有合成产物的有机相，并且从在反应期间形成的副产物中回收合成产物。通过以下进行纯化：经由旋转蒸发器通过两次循环(2×200mL)去除溶剂。在另一方面，在独立的漏斗中对固体残渣、和在合成烧瓶中的痕量残渣进行水提取和用乙酸乙酯处理。完全合并有机相，用Na2SO4干燥，并且最终在旋转蒸发器中达到干燥。得到57g橙色油状产物。
结晶：
将450mL的石油醚:乙酸乙酯＝7:3的混合物添加到产物中。将悬浮液置于冷水下，并且白色固体开始结晶。使体系静置1天。
固体在Buckner上过滤、用母液洗涤并且使用油泵干燥。获得约39g(理论值44g-产率88.6％)。
使从结晶(2.45g-橙棕色固体)和从洗涤得到的母液干燥(PRIME27.13g-深棕色固体)。
实施例4
Fe3O4纳米颗粒(在THF中)的表面功能化：
试剂：
40.0g Fe3O4分散体，等于2.164·10-3mol；1089mg DAA，等于3.247·10-3mol；120mL EtOH；80.0g THF。
在250mL烧瓶中使1089mg DDA在120mL EtOH中溶解；用60ml注射器将由此制备的溶液添加到磁铁矿中。然后，在超声浴中对其进行声处理，持续1h。使样品静置几分钟，并且然后添加60mL H2O，且NP沉降在钕磁体(magnet)上；分离上清液，并且使纳米颗粒再次分散在80.0g THF中。将4滴三乙胺添加至分散体(在约10分钟之后，颗粒分散)。
表征
DLS
样品 PDI Z-平均值 Dv1 ％V1
Fe3O4-DDA 0.142 34.9(±0.4) 27.1(±0.5) 100
实施例5
Fe3O4纳米颗粒(在丙酮中)的表面功能化：
试剂：
4.0g Fe3O4分散体，等于0.2·10-3mol；108.0mg DAA，等于0.3·10-3mol；12.0mLEtOH；13.6mL丙酮。
在超声浴中对磁铁矿的悬浮液进行声处理，持续1h，然后用25mL注射器将其添加到108mg DDA在12.0mL EtOH中的溶液中。然后，使其进行声处理，持续30min。使样品静置持续几分钟。添加6mL H2O，且NP沉降在钕磁体上，然后分离上清液，并且使NP再次分散在13.6mL丙酮中。将2滴三乙胺添加至分散体(颗粒立即分散)。
表征
DLS
样品 PDI Z-平均值 Dv1 ％V1
Fe3O4-DDA 0.218 34.5(±0.2) 22.4(±0.5) 100
实施例6
聚合物PLGA-b-PEG-COOH 43-3kDa的合成
为了合成嵌段共聚物PLGA-b-PEG-COOH，使用二环己基碳二亚胺(DCC)的偶联化学用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使前体PLGA-COOH(MW44-10kDa)活化，并且然后，如以下所描述的，使加合物与二氯甲烷(DCM)中的氨基-官能部分PEG-NH2(MW 2-3kDa)化合：
步骤1：用NHS活化羧基官能团
试剂
程序
在氮气条件下向5L四-颈烧瓶添加PLGA-COOH和600mL二氯甲烷。在聚合物溶解后，添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)并且然后添加N,N二环己基碳二亚胺(DCC-每次约0.25g)；在惰性气氛中使体系在搅拌下保持约40h。使用120mL二氯甲烷从固体洗涤漏斗，以便不损失原始材料。
将黄色悬浮液过滤到2L有尾烧瓶中，以便去除二环己脲。用250mL(×3)和190mlCH2Cl2洗涤5L烧瓶。
产物在1L烧瓶中通过旋转蒸发器浓缩到约400mL体积(50ml干DCM洗涤)：获得稠密的微黄色悬浮液。
PLGA-NHS使用400mL(×4)的冷二乙醚来沉淀。对于每次洗涤，滗析白色固体并去除上清液。随后，使用油泵干燥固体，持续约2h30’。
步骤2：PLGA-NHS与NH2-PEG-COOH的轭合
PLGA-NHS
CHCl3
CH2Cl2-PM＝119.38
DIPEA N-乙基二异丙胺[(CH3)2CH]2NC2H5–PM＝129.24
COOH-PEG-NH2 HCl x NH2-PEG-O-C3H6-COOH-PM PEG＝3000da
试剂
PLGA-NHS(反应中间物)
程序
在配备有机械搅拌器的2L 3-颈烧瓶中，在氮气流下，使得到的中间物溶解在1L氯仿中。使用注射器向体系添加1.2mL DIPEA，并且随后添加7g COOH-PEG-NH2(少量添加)。在惰性气流下，使体系在搅拌下保持约90h。
将黄色溶液从3-颈烧瓶转移到2L 1-颈烧瓶中，并且用100mL氯仿洗涤。
借助于旋转蒸发器将产物浓缩到约550ml(蒸馏液体积CHCl3＝650ml)。将产物从2L烧瓶中转移到1L 1-颈烧瓶(用250mL CHCl3洗涤)。
沉淀聚合物并且用250mL(×5)的冷二乙醚洗涤：在开始时，必须缓慢地添加悬浮液并用玻璃棒摇动以防止过饱和。在每次洗涤时，将体系置于冰浴中，并且然后去除上清液(含有季盐和未反应的有机杂质的乳白色悬浮液)。
用250mL(×5)去离子水洗涤橡胶状外观的白色固体以去除痕量的未反应的COOH-PEG-NH2。
将体系置于真空(首先为液环泵，且其后为油泵)，交替真空干燥(油泵-阱，在-30℃)，瓦解聚合物以促进干燥，并且在冰箱中储存过夜。重复该程序直到不再观察到重量损耗。
将产物储存在冰箱中。
回收到86.80g的聚合物(产率为约83％)。
实施例7
合成(PLGA-b-PEG-COOH 12-3kDa)
步骤1：用NHS活化羧基官能团
试剂技术规格：
试剂
7g PLGA-COOH 7000-17000(50:50聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)，羧酸酯末端基团)→0.582mmol
150mL CH2Cl2(二氯甲烷-＞99.9％)，用于PLGA-COOH的溶解
0.27g NHS(N-羟基琥珀酰亚胺-98％)，用30mL CH2Cl2洗涤→2.34mmol
0.51g DCC(N,N二环己基碳二亚胺-99％)，用50mL CH2Cl2洗涤→2.493mmol
70mL CH2Cl2(二氯甲烷＞99.9％，用于在Buckner上过滤前洗涤500mL烧瓶
550mL 二乙醚(Aldrich≥99.8％)
在氮气条件下向500mL烧瓶添加PLGA-COOH和150mL二氯甲烷。在聚合物溶解后，添加NHS(用于漏斗洗涤的30mL CH2Cl2)，并且然后添加DCC-连续添加(用于漏斗洗涤的50mLCH2Cl2)。
在惰性气氛中，使体系在搅拌下保持约24小时。
在Buckner上过滤无色溶液(具有在悬浮液中的白色固体)到1L有尾烧瓶中，以便去除二环己脲。用70ml CH2Cl2洗涤500mL烧瓶。
将产物转移到梨形1-颈烧瓶，并且通过Buchi旋转蒸发器浓缩，在约1h后，获得稠的白色悬浮液。
步骤2：PLGA-NHS与NH2-PEG-COOH的轭合
试剂
在稠的悬浮液中的PLGA-NHS(反应中间物)
程序
在氮气条件下，在500mL烧瓶中溶解中间物100(×2)和60mL CHCl3。使用注射器，向体系添加0.35mL DIPEA，并且随后添加具有20mL漏斗洗涤的CHCl3的1.82g COOH-PEG-NH2。在惰性气流下，体系在搅拌下保持96h。
由于棕色和白色残余物的存在而在Buckner上过滤的悬浮液从4-颈烧瓶转移到500mL 1-颈烧瓶，用几mL氯仿洗涤。
产物借助于旋转蒸发器来浓缩(体积CHCl3蒸馏液＝170mL)。向黄色溶液添加120mL冷的二乙醚(白色悬浮液-用玻璃棒摩擦-冰浴)、60mL(白色悬浮液-冰浴)、80mL(沉淀的开始-冰浴)、60mL(冰箱持续约1小时)。产物用100mL(×2)冷的二乙醚洗涤。在每次洗涤时，将体系置于冰箱中，并且然后去除上清液(含有季盐和未反应的有机杂质的乳白色悬浮液)。使在醚中的三个级分干燥(1.20g)。
用100mL(×3)去离子水(冰浴)洗涤橡胶状外观的白色固体以去除痕量的未反应的COOH-PEG-NH2。
将共聚物(18.10g)置于真空条件下Buchi旋转蒸发器中并且然后与油泵连接(乙醇-干冰阱)持续约4h(7.78g-干燥与瓦解交替)。产物经历瓦解，且然后被放置在真空下，使干燥、瓦解和冷冻的阶段交替。重复该程序直到不再观察到重量损耗。
产物储存在冰箱中。
回收到7.52g的聚合物(产率为88％-86％)。
(2g)P.M.:11300g/mol-0.1769mmol
(5g)P.M.:15400g/mol-0.3246mmol
mmol PLGA COOH:0.5015
g PLGA PEG COOH(mol 2g*P.M.2g)+(mol 5g*P.M.5g)＝2.529+5.972＝8.5g
用PM＝12000进行计算。预测8.74g PLGA PEG COOH
实施例8
建立纳米生物反应器(NBR)
试剂：
40.0g Fe3O4-DDA，等于9.5e-04mol Fe3O4；220.0mg PLGA-b-PEG-COOH，等于5e-06mol聚合物；400ml磷酸盐缓冲液1mM。
在已将220.0mg聚合物溶解在5mL THF中后，在有机溶液中注入40.0g Fe3O4-DDA。使用60mL注射器，在旋转蒸发器中浓缩产物以去除存在的THF。当不再存在有机蒸汽的形成和凝结时，终止过程。
然后浓缩产物，并且根据以下的过程用具有Pellicon 2mini 100kDa膜的CogentM系统透析：
系统已经排干水后，引入以1.5的理论因子浓缩的且然后用2000mL UP水缓冲的10-3M透析的NBR的悬浮液。
在将系统保持在NaOCl 1:10中持续30分钟后，将悬浮液在具有500kDa膜的Pellicon XL系统中进一步浓缩到100mL的体积。
已达到20×的理论浓缩系数(无机物的理论浓缩：1.0％)后，终止过程。
然后，悬浮液用Millipore Sterivex 0.22μm PES过滤器过滤。将其储存在冰箱中。
表征
DLS
Z电势
ICP
样品 Fe％ ％Fe3O4 毫摩尔浓度
NBR 0.735 1.015 43.84
在培养基中的稳定性
样品在DMEM+10％FBS+谷氨酰胺+抗生素中稀释到1:20(0.05％wt无机相)：它是澄清的，无聚集体。
DLS
实施例9
连续的纳米生物反应器制备(NBR)
试剂：
200mg PLGA-b-PEG-COOH，等于4.4e-06mol聚合物；52.6g THF；36.4g Fe3O4-DDA，等于8.6e-04mol Fe3O4；具有在pH 7.4＝10-3M的磷酸盐缓冲液的1000mL H2O MilliQ。
向100mL爱伦美氏(Erlenmeyer)烧瓶添加0.2g聚合物PLGA-b-PEG-COOH和52.6gTHF，搅拌直到完全溶解(几分钟)。最后，添加36.4g Fe3O4-DDA。
合成：
在校准后设置双联蠕动泵系统以执行将有机溶液添加到含水的流中(THF/水体积比＝1/10)。相应的管直接地从含有THF溶液(具有PLGA-b-PEG-COOH和颗粒)和在2.5L瓶中制备的磷酸盐缓冲溶液的呼吸器抽取溶液。
产物首先在旋转蒸发器中汽提以去除THF，并且然后使其干燥；挥发性组分已经蒸发后，回收产物。
然后浓缩产物，并用具有Pellicon 2mini 100kDa膜的Cogent M系统透析：
清空系统，回收到254.5g产物。
理论浓缩系数：4.7×
理论浓度：0.078％
浓缩和透析所需的时间：20’。
产物在具有500kDa膜的Pellicon XL中进一步浓缩。最终浓缩所需的时间：1h。
回收的：扣除膜内的约1-2mL的死体积，11.5g。
理论浓度(考虑V死1.5mL)：14％
表征
DLS
**用于在血清中以0.05％的稳定性测试(理论)
ICP
样品 Fe％ ％Fe3O4 毫摩尔浓度
NBR 1.078 1.490 64.35
实施例10
建立具有moAb的靶向纳米生物反应器(NBR_hERG)
试剂：
40.38mL NBR，等于0.533μmol-COOH；2.32mL磺酸基-NHS 0.23mM溶液，等于0.533μmol；190μL EDAC*HCl 28mM溶液，等于0.053mmol；2.64mL 1.52mg/mL hERG溶液，等于4.0mghERG(2.7e-08mol)；1500mL Na2HPO3的水溶液，＝10-3M。
向无菌的250mL容器添加40.38mL NBR并且然后添加0.19mL EDAC(0.028M)和2.32mL磺酸基-NHS。在40’(静置)后，用15.52mL磷酸盐缓冲液1mM稀释2.64mL的hERG1溶液(1.52mg/mL＝4.0mg)，并且将其添加到42.89mL活化的NBR中。(V终＝61.05mL；Fe3O4＝0.056％)。使其静置过夜。
设置系统用于使用Pellicon XL 500kDa PES膜透析产物。将系统用300mL H2OMilliQ洗涤，流动400mL的0.5％的次氯酸钠，并且然后使系统灭菌持续约30min。然后，将其用400mL缓冲液1mM洗涤。
然后，将产物浓缩到22mL的体积，将泵速设置为约15mL/min(P＝0.27巴)。第一透析渗透液(permeate)还经由测试分析。
产物用100mL(4体积)的缓冲液1mM以15mL/min(P＝0.27巴)的速度透析，并且浓缩到4.7mL的体积。
最后，产物用0.22μM PES过滤器过滤。将其储存在冰箱中。
如此获得的产物在以0.05％wt稀释在培养基中后表现出良好的稳定性；不存在肉眼可见的聚集体形式或絮凝的固体形式。
表征
DLS
样品 PDI Z-平均值 V-平均值 ％(体积峰) 备注
NBRhERG 0.157 66.14(±0.30) 50.79(±0.32) 100 终产物
Z电势
样品 Z电势 ％(Z峰) 备注
NBR_hERG -40.0 100 终产物
ICP
样品 Fe％ ％Fe3O4 毫摩尔浓度
NBR_hERG 0.226 0.312 13.465
稳定性：
DLS
样品 PDI Z-平均值 V-平均值 ％(体积峰) 备注
NBR_hERG 0.179 136.7(±0.7) 137.6(±8.4) 100 终产物
BCA测试
为了执行BCA测试，NBR_hERG的浓度相对于相应的无抗体(NBR)的浓度标准化，因此无抗体(NBR)充当空白。通过添加相关试剂显现染色后，通过UV-vis分光光度计分析样品，然后将吸光度值内推到之前(使用BSA标准品)制备的校准曲线上，并且外推出当量moAb浓度。存在于NBR_hERG上的抗体的净量通过从对应于NBR_hERG的样品的moAb值减去在洗脱液中和在空白(NBR)中发现的moAb值来计算。参见下面的等式：
CmoAb(NBR_moAb)净＝CmoAb(NBR_moAb)-CmoAb(NBR)-CmoAb(洗脱液)
以下是测量的实验值：
mAb洗脱液＝45μg/mL
mAb NBR＝435μg/mL
mAb NBR_hERG＝863μg/mL
实际的mAb(mAb NBR_hERG-mAb NBR)＝428μg/mL
比mAb/Fe3O4＝0.14
实施例11
建立具有Fluo-染料(NBR_Fluo)的靶向纳米生物反应器
试剂技术规格：
试剂：
Fluo-NH2溶液的制备
将荧光团用770μL DMSO溶解，获得1nmol/μL的溶液。在12mL小瓶中，添加4950μL1mM磷酸盐缓冲液并添加50μL的荧光团Alexa Fluor 750溶液(50nmol)。然后，将其置于磁力搅拌下，并且然后添加100μL的132μg/mL的1,4-二氨基丁烷溶液(相当于150nmol＝13.2g)。在黑暗中和在氮气流条件下，使溶液反应持续24h。如此获得的NH2-末端荧光团将用于随后的合成步骤，而无需纯化。
磺酸基-NHS溶液(0.23mM)的制备
准确称量5.0mg的磺酸基-NHS并且然后使用1mM磷酸盐缓冲液溶解在100mL烧瓶中。
EDAC溶液(0.028mM)的制备
向4mL小瓶添加2.7mg EDAC和0.5mL 1mM缓冲液。加盖并摇动以促进混合。该溶液必需在临反应前制备。
合成：
向100mL容器添加30.00mL NBR DF并且添加0.14mL EDAC(0.028M)和1.72mL磺酸基-NHS(0.23mM)。
总体积：30.00mL+0.14mL+1.72mL＝31.86mL
在40’(静置)后，添加2.64mL的Alexa Fluor 750溶液(10nmol/mL)。
使其静置持续4h。
进行对照DLS(NBR_Fluo TQ)。
纯化：
设置系统用于使用Pellicon XL 500kDa PES膜和具有容易装载的II头部的蠕动泵Masterflex L/S透析产物。然后，系统通过使0.5％的次氯酸钠流动并且使反应持续约30分钟来灭菌。在用无菌的MilliQ水洗涤并且用1mM磷酸盐缓冲液(也是无菌的)设置系统后，将泵速设置为约12mL/min(P＝0.25毫巴)，将产物浓缩到10mL的体积(收集23ml的渗透液)。保留第一渗透液的比率用于UV-VIS分析。然后用40mL(4体积)的缓冲液1mM对产物透析，以12mL/min(P＝0.25毫巴)的速度工作。此时，产物被浓缩到6mL的体积。
回收的：5.00g
理论合成浓缩系数：5.8×
相比于NBR的理论浓缩系数：5×
过滤：
产物用0.22μM Millex PES过滤器过滤。为了纯化全部的产物，需要一个过滤器。将产物储存在冰箱中。
回收的NBR_27_Fluo_01DF＝4.49g
表征
DLS
R0366/2013；R0368/2013
Z电势
R0368/2013
ICP
R0368/2013
样品 Fe％ ％Fe3O4 毫摩尔浓度
NBR_Fluo 0.243 0.336 14.532
UV-Vis
R0368/2013
样品 吸光度 ε 浓度(nmol/L) 连接的％
洗脱液NBR_Fluo 0.125575 242000 558 27.1
实施例12
建立具有Fluo-染料的靶向纳米生物反应器(NBR_Fluo)
试剂技术规格：
试剂：
Fluo-NH2溶液的制备
向12mL小瓶添加5mL 1mM磷酸盐缓冲液、50nmol(1瓶)花菁5、NHS酯，并且然后添加150nmol(13.2g)1,4-二氨基丁烷。在黑暗中、在磁力搅拌和氮气流条件下，使溶液反应持续24h。由此获得的NH2-末端荧光团将用于随后的合成步骤，而无需纯化。
磺酸基-NHS溶液(0.23mM)的制备
准确称量5.0mg的磺酸基-NHS，并且然后使用1mM磷酸盐缓冲液溶解在100mL烧瓶中。
EDAC溶液(0.028mM)的制备
向4mL小瓶添加2.7mg EDAC和0.5mL缓冲液1mM。加盖并摇动以促进混合。该溶液必需在临反应前制备。
合成：
向50mL无菌容器添加30.00mL NBR并且添加0.14mL EDAC(0.028M)和1.72mL磺酸基-NHS(0.23mM)。
总体积：30.00mL+0.14mL+1.72mL＝31.86mL。
在40’(静置)后，添加2.64mL的花青苷-5-NH2溶液(10nmol/mL)。
使其静置持续4h。
纯化：
设置系统用于使用Pellicon XL 500kDa PES膜透析产物。
此时，产物被浓缩到10mL的体积(收集23mL渗透液)。将泵速设置到约12mL/min(P＝0.25毫巴)；t＝4′
保留第一渗透液的比率用于UV-VIS分析。
用40mL(4体积)的缓冲液1mM透析。v 12mL/min(P＝0.25毫巴)；t＝11’。
此时，产物被浓缩到6mL的体积；t＝5’。
回收的：4.29g
理论合成浓缩系数：5.5×
相比于NBR的理论浓缩系数：4.8×
过滤：
产物用0.22μM Millex PES过滤器过滤。为了纯化全部的产物，需要一个过滤器。将产物储存在冰箱中。
回收的NBR_Fluo＝4.11g
实施例13
具有moAb和Fluo-染料的靶向纳米生物反应器(NBR_hERG-Fluo)的制备
试剂技术规格：
试剂：
Fluo-NH2溶液的制备
向12mL小瓶添加5mL 1mM磷酸盐缓冲液、50nmol(1瓶)花菁5NHS-酯，置于磁力搅拌下并且然后添加100μL的13.2mg/100mL的1,4-二氨基丁烷溶液(相当于150nmol＝13.2μg)。在黑暗中且在氮气流条件下，使溶液反应持续24h。由此获得的NH2-末端荧光团将用于随后的合成步骤，而无需纯化。
磺酸基-NHS溶液(0.23mM)的制备
准确称量5.0mg的磺酸基-NHS，并且使用1mM磷酸盐缓冲液溶解在100mL烧瓶中。
EDAC溶液(0.028mM)的制备
向4mL小瓶添加2.7mg EDAC和0.5mL缓冲液1mM。加盖并摇动以促进混合。该溶液必需在临反应前制备。
合成：
向无菌的100mL容器添加7.95mL缓冲液1mM并且然后添加4.79mL NBR。温和搅拌混合物以混合，并且然后添加2.29mL EDAC(0.028M)和2.79mL磺酸基-NHS(0.23mM)。
总体积：7.95mL+4.79mL+2.29mL+2.79mL＝17.83mL。
在40’(静置)后，添加2.5mL的花青苷5-NH2酯溶液(10nmol/mL)。然后将3.2mL的hERG1溶液(1.5mg/mL＝4.8mg)在52.32mL磷酸盐缓冲液1mM中稀释并且添加到含有活化的NBR和荧光团的悬浮液中。使其静置过夜。
纯化：
设置系统用于使用已经用于NBR_19的Pellicon XL 500kDa PES膜透析产物。用300mL H2O MilliQ洗涤，然后使400mL的0.5％次氯酸钠流动，并且保留在次氯酸盐中持续约30分钟。用400mL缓冲液1mM洗涤系统。
此时，产物被浓缩到20mL的体积(收集50mL渗透液)。将泵速设置为约14mL/min(P＝0.25毫巴)；t＝15’。
保留第一渗透液的比率用于BCA测试。
用80mL(4体积)的缓冲液1mM透析。v 14mL/min(P＝0.2毫巴)；t＝16’。
此时，产物被浓缩到10mL的体积；t＝4’。
回收的：6.46g
相比于NBR的理论稀释系数：1.3×
过滤：
产物用0.22μM Millex PES过滤器过滤。为了纯化全部的产物，需要一个过滤器。将产物储存在冰箱中。
回收的NBR_hERG-Fluo＝7.79g
表征
DLS
Z电势
ICP
样品 Fe％ ％Fe3O4 毫摩尔浓度
NBR_hERG1-Fluo 0.320 0.442 19.081
实施例14
装载有活性成分的纳米生物反应器(NBR_PTX和NBR_hERG_PTX)的制备
试剂技术规格：
试剂：
35.6g Fe3O4-DDA(40.0mL)(195.8mg Fe3O4) 490mg/L(在水中)
212.6mg PPGC43-3.1 490mg/L(水中)
21.2mg PTX
400ml磷酸盐缓冲液1mM(实际值：440mL)
60mL注射器25G针头
THF溶液[具有PLGA-PEG(5.5mg/g)、PTX(0.55mg/g)和Fe3O4(5.5mg/g)]的制备
将212.6mg PPGC43-3.1溶解于4mL(4mL小瓶)THF中，并且将21.2mg PTX溶解在2.12mL THF(4mL小瓶)中，且然后将其添加到100mL烧瓶中的35.6g Fe3O4-DDA。
合成：
使用具有25G针头的60mL注射器，将THF溶液堆积在400ml的磷酸盐缓冲液1mM中。
获得的NBR_PTX：455.8g
汽提
将产物在旋转蒸发器中处理以去除存在的THF。为了该目的，将产物移到1000mL烧瓶并且设置以下条件：
浴T 40°
压力：154毫巴
转速：80rpm
在1h后，完成挥发性组分的蒸发后，回收产物并且称重。
回收的NBR_PTX旋转蒸发物(Rotavap)＝418.22g(37.58g去除的THF)
透析和浓缩：
产物根据以下的程序用具有50kDa膜的AMICON系统浓缩和透析。
1)用50mL渗透的(osmotized)H2O洗涤以去除膜中的杂质。
2)用具有在H2O UP中的50mL磷酸盐缓冲液10-3M的溶液洗涤系统。
系统排干水后，添加NBR_PTX并且浓缩到约100mL。
其后，用150mL缓冲液1mM进行4次洗涤。最后，浓缩到75mL，弃掉45mL洗脱液。
清空系统，回收到59.40g的产物(NBR_PTX)。
理论浓缩系数＝7.7×
过滤：
产物用Millipore Sterivex 0.22μM PES过滤器(圆柱形过滤器)过滤。
表征
DLS
ICP
样品 Fe％ ％Fe3O4 毫摩尔浓度
NBR_PTX 0.347 0.480 20.716
稳定性：
在DMEM+10％FBS+谷氨酰胺+抗生素中以1:8稀释的浓缩的样品是透明的，无聚集体。
DLS
R0211/2013
PTX分析
样品 PTX:PLGA-PEG比 FWR％ LC％ LE％ PTX mg/mL
NBR_PTX_10 1:10 5.5 2.1 40.0 142.57
实施例15
装载有活性成分的纳米生物反应器(NBR_PT-X和NBR_hERG_PTX)的制备
试剂技术规格：
试剂：
pH 7.4的1500mL磷酸盐缓冲液[]＝10-3M
磺酸基-NHS溶液(0.23mM)的制备
称量5.0mg的磺酸基-NHS并且使用1mM磷酸盐缓冲液溶解在100mL烧瓶中。
EDAC溶液(0.028mM)的制备
向4mL小瓶添加2.7mg EDAC和0.5mL缓冲液1mM。加盖并摇动以促进混合。该溶液必需在临反应前制备。
合成：
向无菌的40mL容器添加2.36mL缓冲液1mM并且然后添加4.26mL NBR_PTX。温和搅拌混合物以混合，并且然后添加1.19mL EDAC(0.028M)和1.45mL磺酸基-NHS。
总体积：2.36mL+4.26mL+1.19mL+1.45mL＝9.26mL
在40’(静置)后，添加通过用27.25mL缓冲液1mM稀释0.833mL的hERG1溶液(3mg/mL)获得的HERG1溶液。(V终＝37.34mL；Fe3O4＝0.056％)。
使其静置过夜。
纯化：
设置系统用于使用Pellicon XL 500kDa PES膜透析产物。用300mL H2O MilliQ洗涤，然后使400mL的0.5％次氯酸钠流动，并且保持在次氯酸盐中持续约30min。用400mL缓冲液1mM洗涤系统。
此时，产物被浓缩到13mL的体积(收集25mL渗透液)。将泵速设置为约13mL/min(P＝0.2毫巴)；t＝5’。
保留第一渗透液的比率用于BCA测试。
用60mL(4体积)的缓冲液1mM透析。v 13mL/min(P＝0.2毫巴)；t＝14’。
此时，产物被浓缩到10mL的体积；t＝10’。
回收的：7.40g
理论合成浓缩系数：5.5×
相比于NBR_PTX的理论稀释系数：2.8×
过滤：
产物用0.22μM Sterivex PES过滤器过滤。为了纯化全部的产物，需要一个过滤器。将产物储存在冰箱中。
回收的NBR_PTX＝6.88g
表征
DLS
Z电势
ICP
样品 Fe％ ％Fe3O4 毫摩尔浓度
NBR_PTX 0.191 0.264 11.400
程序的实际产率＝94.5％
实施例16
将NBR并入淋巴细胞中
T细胞和Jurkat细胞能够并入用由申请人开发的方法的纳米颗粒。T细胞/Jurkat细胞装载有以在合适的特定培养基(培养基)中0.05％的浓度的NP。为了形成含有NP的培养基，首先分配NP，并且然后分配特定培养基。培养基由以下组成：
·RPMI 1640培养基，w 2.0g/L NaHCO3-w/o L-谷氨酰胺。(BIOCHROM)(代码:F1215)-500mL添加有：
·L-谷氨酰胺，溶液200mM(100×)。(EUROCLONE)(代码：ECB3000D)-5.5mL，未稀释
·丙酮酸钠，100mM(100×)。(Gibco)(代码：11360-039)-5.5mL，未稀释
·MEM NEAA最小必需培养基非必需氨基酸(100×)。(Gibco)(代码：11140-035)-5.5mL，未稀释
·GENTOMIL(庆大霉素)80mg/2ml(AIC N°029314059)-12mL小瓶
·2-巯基乙醇(Merck)(代码：444203)-使用5.5mL如下的2-巯基乙醇：在99.963mL无菌H2O中的37μl 2-巯基乙醇(终体积100mL)。
·10％胎牛血清FBS：胎牛血清，合格的。(Sigma-Aldrich)(代码：F6178)。
当必需时，将使用患者的自体血清或缺乏血清的培养基代替胎牛血清。

Claims (17)

1.磁性纳米颗粒，所述磁性纳米颗粒的表面用儿茶酚功能化，并且其中所述磁性颗粒由纳米级磁铁矿颗粒组成。
2.构建体，所述构建体包含封装在生物相容的聚合物基质中的多个根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中具有治疗作用的分子任选地被分散。
3.根据权利要求2所述的构建体，所述构建体还包含多个金纳米棒。
4.根据权利要求2和3所述的构建体，其中所述生物相容的聚合物基质由生物可降解的共聚物组成。
5.根据权利要求5所述的构建体，其中所述生物可降解的共聚物选自：生物可降解的纳米胶束、聚酯、聚氨酯、聚碳酸酯和聚谷氨酸、聚醚胺和聚谷氨酸苄酯。
6.根据权利要求5所述的构建体，其中所述生物可降解的纳米胶束由聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚乙二醇羧酸酯(PLGA-b-PEG-COOH)组成，具有式(I)
其中m＝[117-330]；n＝[117-330]；p＝[60-100]。
7.根据权利要求2所述的构建体，其中所述具有治疗作用的分子选自：抗癌剂、过氧亚硝基清除剂、超氧化物歧化酶抑制剂、维甲酸、细胞因子、阿司匹林。
8.根据权利要求6所述的构建体，其中所述胶束的片段PEG-COOH的末端羧基用单克隆抗体、蛋白、肽或感兴趣的活性分子进一步功能化，用于通过细胞过表达物的特异性识别。
9.根据权利要求8所述的构建体，其中所述抗体选自hEGR、hEGFR、IgG、moAb。
10.一种用于制备根据权利要求2-6所述的构建体的方法，其中：通过批量或连续合成在混合池中以恒定流动将以下混合：
-溶解在溶剂中的聚合物的有机溶液，所述溶解在溶剂中的聚合物的有机溶液与用有机粘合剂包覆的纳米颗粒的悬浮液混合，
所述聚合物和所述用有机粘合剂包覆的纳米颗粒二者在相同的溶剂中，
-和
-Na2HPO4的水溶液(1mM)。
11.一种用于制备根据权利要求7和8所述的构建体的方法，其中所述片段PEG-COOH的末端羧基被活化以促进随后的通过氨基末端基团的酯化的攻击。
12.人类免疫系统的细胞，所述人类免疫系统的细胞含有根据权利要求2-8所述的构建体。
13.根据权利要求12所述的细胞，其中所述人类免疫系统的细胞选自：T-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、B-淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、γδ细胞。
14.根据权利要求1所述的纳米级颗粒和根据权利要求2-9所述的构建体用于过热疗法治疗的用途。
15.根据权利要求12和13所述的细胞用于诊断癌症、退行性疾病、中枢神经系统疾病、心脑血管疾病、传染病、移植、自体免疫性疾病的用途，和还用于治疗肿瘤、心脑血管疾病、退行性疾病(例如阿尔茨海默病)、传染病、移植、肝硬化和特征在于纤维发生的其他疾病、特征在于复发性胎儿丢失的疾病、子宫内胎儿死亡、新生儿疾病、先天性和获得性凝血功能障碍、遗传疾病、自体免疫性疾病的用途，和最后用于疼痛缓解的用途。
16.根据权利要求1所述的磁性纳米颗粒作为MRI成像工具的用途。
17.根据权利要求3所述的含有纳米棒的纳米颗粒用于诊断和治疗肿瘤疾病的用途。
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