KR102321385B1 - 카테콜로 관능화된 자성 나노입자, 그의 제조 및 용도 - Google Patents

Abstract

표면이 카테콜로 관능화된 자성 나노입자; 및 치료 작용을 갖는 분자가 임의로 분산되어 있고 임의로 추가 관능화되는 생체적합성 폴리머 매트릭스에 캡슐화된 다수의 상기 나노입자를 포함하는 구조물이 개시된다; 그의 공학적 기술을 일으키는 상기 중합체 구조물이 도입된 면역계 세포가 또한 개시된다.

Description

카테콜로 관능화된 자성 나노입자, 그의 제조 및 용도 {MAGNETIC NANOPARTICLES FUNCTIONALIZED WITH CATHECOL, PRODUCTION AND USE THEREOF}

본 발명은 관능화된 나노입자, 그의 제조 및 그의 용도 분야에 관한 것이다.

알려진 바와 같이, 자철석은 화학식이 Fe₃O₄ (간혹 FeO·Fe₂O₃로도 표기됨)인 강자성 광물이다.

나노입자형 자철석, 즉 수 나노미터 내지 수십 나노미터 범위의 치수를 갖는 자철석은 라디오파 범위의 가변 자기장 내에 들어가면 전자기장과 상호작용한 후 열에너지를 주위에 방출하며 이에 따라 소위 온열 효과 (hyperthermic effect) 또는 자성 고열을 일으킨다.

종양학에서, 고열은 화학요법이나 방사선요법의 효과를 향상시키기 위해 활용된다; 실제로 고형암의 온도를 41 내지 45℃로 상승시키면 종양 세포의 세포자멸사가 유도된다; 일반적으로, 이는 종양 덩어리가 있는 부위의 주변을 적절한 온도로 조정한 액체로 세척하고 순환시킴으로써 적용된다.

최근, 종양 덩어리에 직접 삽입되어 마이크로파를 발생시키고, 그에 따라 쌍극 물 분자와 상호작용함으로써 고열을 발생하는 안테나가 채용된다.

이러한 치료는 일반적으로 극히 침습성이고 효과가 좋지 않으며 (제1의 경우), 제2의 경우에는 전이, 조직 괴사 위험 등과 같은 가능한 부정적인 부작용을 피할 수 없다.

종양 조직에 인접해 도달하거나 또는 바람직하게는 암 세포에 침투하는 자성 나노입자를 이용하면, 상기 문제를 극복하여 세포 수준으로 국소화된 온열 효과의 높은 효율성을 달성하는 것이 가능하다.

구체적으로, 고형 종양의 종양 세포 내 또는 알츠하이머 아밀로이드반과 같은 병리 조직 또는 부위 상, 또는 다발성 경화증의 손상 조직 상에 나노구조체를 보냄으로써 여러 복합 치료, 예컨대 온열 및 약리학적 치료를 부작용 없이 효율적인 방식으로 전달하는 것이 가능하다.

문헌에, 가능하게는 약물이 부하되고 표면 상에서 적합한 표적제로 관능화된 폴리머 또는 단백질 중 어느 하나의 코팅과 나노입자 자석철의 생체적합성 코어를 포함하는 하이브리드 무기-폴리머 또는 단백질 나노입자의 많은 예가 있다.

이들 나노입자는 전자기 EM 장의 효과 (온열 효과) 하에서 열을 발생하는 능력, 약물 전달 (DD) 가능성 및 그의 작용 동안 이미징 기술 (MRI)로 식별가능한 능력이 상승적으로 결합된 잠재성 치료 진단제이다.

국제 특허 출원 WO 2004/071386호는 간 종양에 도달하여 치료하는 것이 주 목적인, 생물학적 활성 분자와 자성 나노입자를 함유하는 모노- 또는 바이-라멜라 리포솜 마이크로캡슐로 이루어진 화합물을 기술한다.

유럽 특허 EP 1 979 365호에서 출원인은 분자 한쪽 말단이 자성 입자의 표면에 결합되어 있는 반면 다른 말단은 매여있지 않아서 약학 및 진단 분야에 사용하기 위한 바이오폴리머, 사이클로덱스트린, 항체 및 약물과 같은 복잡한 단위와 반응할 수 있고, 코팅에 좌우되는 성질 (예를 들어 광학 또는 자기적 성질)의 현저한 변화없이 나노입자의 전체적이고 조밀한 코팅이 일어나는 나노입자/바인더 복합체를 얻을 수 있는 이관능성 분자로 관능화된 나노미터 자성 입자로 이루어진 구조체를 기술하였다.

그 후 특허 EP 2 117 600호는 상기 특허 EP 1 979 365호에 기재된 것과 유사한 관능화된 입자를 가능하게는 약리학적 성질을 갖는 분자가 분산되어 있는 폴리머로 코팅한 구조체를 기술하였다.

또한, 유럽 특허 출원 2 512 992호 (동일 출원인의 이름으로)는 균일하고 제어된 크기를 가지는 (따라서 높은 온열 효과를 가지는) 자석철 나노입자를 용이하게 얻을 수 있는 폴리올 합성 방법을 기술하였다.

따라서, 상기에서 볼 수 있는 바와 같이, 고열을 단독으로 또는 전통적인 약물과 함께 적용하여 치료 작용을 수행할 수 있는 바디 입자가 선택적으로 연출하는 문제를 해결하기 위한 많은 해결책들이 문헌에 제시되어 왔다; 그러나, 공지 제품들은 아직 극복하지 못한 다양한 문제들로 인해 나노구조체로 종양 및 다른 질환의 효과적인 치료를 달성하기 위한 응용 요구들을 완전히 충족하지 못한다.

첫 번째 문제는 나노구조체의 특이성인데, 실제, 전신적으로 투여되는 경우 하이브리드 무기-폴리머/단백질 입자가 세망내피계 (세망세포, 대식세포, 쿠퍼세포)로부터 신속하게 제거된다고 문헌에 공지되어 있다.

따라서 나노구조체의 소거는 전신 수준에서 나노테라노스틱(nanotheranostic) 치료의 비효율성에 기여한다; 이러한 장애를 극복하기 위해 단일클론 항체, 펩티드 및 활성 분자 (예컨대 당 등)와 같은 전달 단위를 가지고 나노입자 폴리머/단백질 표면을 관능화하는 것을 비롯한 수많은 시도가 이루어져 왔으나, 이 경우, 대부분의 입자는 세망 내피계에 의해 제거되고 단지 소량만이 관련 부위, 종양 조직 및 암성 세포에 도달한다.

두 번째 문제는, 첫 번째 문제의 결과로 종양 또는 병리 조직에 도달하는 자성 입자의 양이 효율적인 온열 효과를 수행하기에 충분치 않을 수 있다는 것이다.

마지막으로, 현재의 나노테라노스틱 시스템은 생물학적 유체에서 안정성이 좋지 않고 따라서 종양 덩어리에 침투하지 못하거나 온전한 혈액-뇌 장벽을 넘어서지 못할 것 같은 (500-1000 nm 까지의) 거대 응집체를 형성하는 경향이 있으며, 이는 표적 세포내 이들 시스템의 특이적 표적화를 악화시키고 치료 효율성을 더욱 제한한다.

문헌에 면역계내 T 림프구가 항-종양 반응의 주역인 것으로 알려져 있다.

이들은 TCR이라고 하는 그의 특이적 수용체에 의해 종양 세포를 선택적으로 인식할 수 있다. 항원이 단핵세포, 대식세포, 수지상세포, 랑게르한스세포, 소교세포 또는 B 림프구에 의해 대표되는 세포에 의해 제시되는 경우 각각의 종양 항원 펩티드에 의한 T 림프구 활성화가 발생할 수 있다.

효과적인 T 림프구의 활성화를 위해, 항원 외에 막 신호 및 가용성 신호가 또한 추가로 필요하다. 가용성 신호 중에서, 가장 강력한 활성화 인자는 인터류킨 2 (IL-2)인 반면, 막 신호 중에서는 분자 B7이 가장 강력하다.

종양이 인식되면, 다양한 메커니즘을 통해 림프구에 의해 파괴되는데, 그 중에서 주요 메커니즘은 퍼포린에 연관되고 Fas 리간드에 연관되는 세포 상해 장치이다.

흑색종은 T 림프구에 의해 매개되는 강한 국소 면역 반응과 관련되어 있는 최초 종양 중 하나였으며, 수 년에 걸쳐 강력한 T-림프구 반응이 보다 나은 예후와 관련되어 있음을 입증할 수 있었다.

나노입자의 사용을 통해, 레이저/전자기장에 의해 활성화 후, 종양을 맞출 준비가 된 나노입자에 의해 무장되어 종양을 사멸하는데 특화된 T 림프구의 사용에 기반한 새로운 맞춤 항암 전략을 개발하는 것이 가능해졌다.

또한, 상기 문헌은 다발성 경화증, 알츠하이머병과 같은 신경계 질환에서 면역계, 특히 림프구 및 염증 세포에 의해 행해지는 역할에 대해 광범위하게 설명하였다.

다발성 경화증은 실제로 그의 발병에 T 림프구가 중요한 역할을 하는 자가면역 질환의 원형이다 (Elliot M. Frohman, M.D., Michael K. Racke, M.D., and Cedric S. Raine, N Engl J Med 2006; 354:942-955). 특히, 인터페론-감마 및 림포톡신과 같이 중요한 염증성 사이토카인을 생성할 수 있는 T 헬퍼 세포 (T-헬퍼 세포 1 (Th1)로 칭해짐) 뿐만 아니라, T 림프구 CD8, B 림프구 및 단핵구 계통의 면역 세포가 매우 중요하다. 또한 알츠하이머병 (Henry W. Querfurth, and Frank M. LaFerla, N Engl J Med 2010; 362:329-344)에서 중요한 병인적 역할이 아밀로이드 단백질에 기인해 소교세포 및 성상세포에 의한 인터류킨 1, 인터류킨 6, 종양 괴사 인자 α의 생산과 관련된 염증성 메커니즘에 의해 수행된다; 따라서, 본 발명에 따른 나노입자는 또한 이들 질환의 치료에도 중요한 역할을 할 수 있다.

도 1은 STEM 모드에서 전계 방출 건 주사 현미경으로 포착한, 폴리머 매트릭스 내 본 발명에 따른 나노입자에 의해 취해진 전형적인 클러스터 형성을 나타낸다.
도 2는 자성 입자와 금 나노로드의 혼합 구조를 나타낸다.
도 3은 블록 폴리머 PLGA-b-PEG-COOH로 코팅되고 자석철 나노입자 또는 자석철 및 금 나노로드로 이루어진 구조 모델을 개략적으로 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 나노구조화 구조물의 단계적 제조 공정의 레이아웃을 나타낸다.
도 5는 림프구의 정제 및 선택 방법의 레이아웃을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 나노입자로 충전된 단핵구/대식세포의 광학 현미경으로 포착한 사진을 나타낸다.
도 7 및 도 8은 NH2-PEG-COOH와 접합된 폴리머 PLGA-NHS의 1H-NMR을 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 생성물의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 본 발명에 따른 생성물에 대한 BCA 시험을 나타낸다.

발명의 요약

표면이 카테콜로 관능화된 자성 나노입자; 및 치료 작용을 갖는 분자가 임의로 분산되어 있고 임의로 추가 관능화되는 생체적합성 폴리머 매트릭스에 캡슐화된 다수의 상기 나노입자를 포함하는 구조물이 개시된다. 놀랍게도, 상기 폴리머 구조물은 면역계 세포에 도입되어 그의 공학적 기술을 발휘할 수 있는 것으로 나타났다.

발명의 상세한 설명

놀랍게도 본 발명에 따라, 생체적합성 폴리머 매트릭스에 캡슐화된 카테콜로 관능화된 다수의 자성 나노입자를 포함하는 구조물이 상기 문제점들을 극복함으로써 생리적 매질 및 인간 혈액에서 필요한 안정성을 보장할 수 있음이 밝혀졌다.

또한, 이들 구조물의 구조적 특징은 상기 특허들에 기재된 단분산 무기 코어에 의해 나타나는 것과 비교하여 온열 효과 시행의 보장을 돕는다; 이러한 이점은 온열 특성에 대해 상승효과를 이행하는, 폴리머 매트릭스 내 다수 입자의 구조 중심에서 결합하는 경향이 있는 자성 입자의 소위 "클러스터 구조" (도 1 참조)에 기인한다.

본 발명에 의하면, 카테콜에 의한 자성 입자의 관능화는 상기 클러스터 구조체를 발생시키고 그에 의해 경시적 안정성 및 온열 특성이 종래 기술에 공지된 것보다 훨씬 우수한 구조물을 얻게 하는데 필수적이다.

자성 입자 중에서도, 자석철이 특히 바람직하다. 필요에 따라, 본 발명에 따른 구조물은 상술된 바와 같은 자성 나노입자 외에, 다수의 금 나노로드를 가진다 (도 2 참조).

나노로드의 존재는 C02 레이저에 의해 발생되는 것과 같은 적외선 레이저 방사를 인가함으로써 자석철의 클러스터 구조체에 의해 부여되는 온열 효과를 더욱 증가시켜 상당한 온열 효과를 가능케 한다.

이것은 표면 구역용 레이저를 사용하는 결합된 레이저 및 라디오파 시스템 또는 심부용 라디오파 및 프로브를 통해 도달할 수 있는 것을 가능하게 한다.

자성 나노입자는 예를 들어 상기 유럽 특허 출원 2 512 992호에 기술된 바와 같은 공지 폴리올 공정을 통해 제조할 수 있으며, 상기 특허 제조 방법은 다음과 같다:

i) Fe^III의 폴리올 용액을 Fe⁰로부터 출발하여 제조하는 단계;

ii) 자철석 나노입자를 폴리올 합성 조건에서 제조하는 단계.

상기 단계 (i)는 하기 식에 따라 철에 대한 산 공격 (또한 아세트산과 같은 약산)의 잘 알려져 있는 공지 반응이다:

Fe⁰ + 2 H⁺ → Fe^{2 +} + 1/2 H₂↑

그 후, 100 ℃ 미만의 온도에서 반응 환경 중에 공기 플러싱 및 H₂O₂의 첨가를 통해 폴리올 중 Fe^II의 용액이 Fe^III (예를 들어 아세테이트)로 완전히 산화가능하다.

금 나노로드는 이온 형태의 금으로부터 출발하여 다양한 첨가제: 알킬트리메틸암모늄 브로마이드, CnTAB N = 10-16, 세틸피리디늄 클로라이드, C16 PC 및 PVP [이와 관련하여, M. Tsuji, K. Matsumoto, T. Tsuji, H. Kawazumid, Mater. Lett. 59 (2005) 3856 참조]의 존재하에 마이크로파를 이용한 합성 또는 또는 CTAB 및 AgNO3의 존재하에 아스코르브산에 의한 HAuCl₄의 환원에 의해 공지 방식으로 제조된다 (이와 관련하여, Ratto F. et al. J NANOPARTICLE RESEARCH 2010 및 Ratto F. et al. J NANOPARTICLE RESEARCH 2012 참조).

상술한 바와 같이 얻어진 자성 및/또는 광자기 입자의 표면은 입자 표면에 대한 OH 극성기의 친화성을 이용하여 카테콜 (이관능기)로 관능화되고, 단부는 폴리머/단백질 매트릭스에서의 후속 도입에 적합한 소수성 반응성을 유지하기 위해 입자 표면에 결합시키지 않는다.

본 발명에 따른 폴리머 매트릭스는 생분해성 코폴리머로 구성되고 따라서 매트릭스가 생리적 환경에서 분해됨에 따라 약물의 방출이 서서히 일어날 수 있게 허용하는 것으로 이해된다.

이러한 목적에 적합한 코폴리머의 예로는 생분해성 나노미셀, 폴리에스테르, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리카보네이트 및 폴리(글루탐)산, 폴리에테르아민 및 폴리벤질글루타메이트가 있다.

화학식 (I)를 가지는 폴리(락트-co-글리콜)산 및 폴리에틸렌 글리콜 카복실레이트의 블록 코폴리머 (PLGA-b-PEG-COOH, MnPLGA 범위 = 44-10 kDa, MnPEG = 2 - 3 kDa)로 이루어진 생분해성 나노미셀이 특히 바람직하다:

상기 식에서, m = [117-330]; n = [117-330]; p = [60-100]임.

상기 생성물은 공지되었고, 또한 항암제 시험을 위해 임상 단계 I의 수준에서 약물 전달을 위한 다양한 다른 연구에서 이미 사용되고 있다 (X. Shuai et al, 2004 및 X. Shuai, H. Ai, N. Nasonkla, S. Kim, J. Geo, J. Controlled Release, 2004, 98, 415 참조).

상기 폴리머는 실제로 PLGA의 잔기에 의해 보장되는 소수성 내부 영역과 PEG-COOH의 말단부에 의해 부여되는 친수성 외부 영역을 가지는 나노구형 시스템을 조립할 수 있는 특징을 가진다 (도 3 참조).

이러한 이중 특징은 나노구체가 소수성 부분의 유기 활성 성분을 포획할 수 있고 친수성 부분 덕분에 수용액에 분산될 수 있게 허용한다.

필요에 따라, 폴리머 분자는 공지된 방법 및 아래에 주어진 실시예에 기재된 바와 같이 폴리머 매트릭스에 분산된 치료 작용을 갖는 분자와 혼합될 수 있다.

본 발명에 따른 치료 작용을 갖는 분자의 예로서는 이를테면 항암 약물 (탁산, 겜시타빈, 빈크리스틴 등), 퍼옥시니트라이트 스캐빈저, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 억제제, 레티노이드 (벡사로텐), 인터류킨 10과 같은 사이토카인, TLR2를 활성화할 수 있는 HP-NAP 분자와 같은 TLR-리간드, 아스피린을 들 수 있다.

또한, 미셀의 PEG-COOH 단편의 카복실산 관능기는 세포 과발현에 의한 특이적 인식을 위한 단일클론 항체, 단백질, 펩티드 또는 관심 활성 분자 (예를 들어, 및/또는 형광 염료)와 안정한 화학적 결합을 허용한다.

본 발명에 따른 관능화에 유용한 항체로는 hERG, hEGFR, IgG, moAb 등을 언급할 수 있다.

실시예 (실시예 10 참조)는 특히, 이탈리아 특허 IT 1,367,861호에 기술되고 청구된 특이적 단일클론 항체 hERG1을 사용하여 상기 관능화를 설명한다.

특히, 이는 마우스를 EQPHMDSRIGWLHN 서열의 펩티드로 면역화하여 얻은 림프구와, 뮤린 신생 세포주 NS0에 속하는 불멸화 세포 간의 융합 산물을 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된, 단백질 HERG1의 세포외 부분 S5-기공에 대해 특이적인 단일클론 항체이다.

카테콜로 관능화된 자성 나노입자를 함유하는 본 발명에 따른 구조물 (이하, "나노생물반응장치"또는 "NBR"이라 함)은 나노침전을 수행함으로써 제조되는데, 여기서는 두 유체:

- 유기 바인더로 코팅된 나노입자의 현탁액과 혼합된, 용매에 용해된 폴리머의 유기 용액 (모두 동일 용매 중) 및

- Na2HP04 1 mM의 수용액

이 배치 (batch) 또는 연속 합성을 이용하여 혼합 셀에서 일정 유량으로 혼합된다.

배치 합성에서는, 폴리머 및 입자를 함유하는 유기 현탁액을 단일 단계에서 자기 교반없이 수용액에 주사기로 주입한다.

연속 합성에서는, 수성 스트림에 유기 용액의 첨가 (유기 부피/물의 비율 1/10)를 수행하기 위해 이중 연동식 펌프 시스템을 준비한다. 각각의 튜브는 Na₂HPO₃ 1 mM (pH 7.4) 용액 및 (관능화 입자 및 폴리머를 가지는) 유기 현탁액을 함유하는 렁 (lung)에서 직접 용액을 인출한다.

(폴리머에 포함된 카테콜로 관능화된 자성 나노입자로 이루어진) 하이브리드 입자의 분산액이 얻어지면, 후속 제조 단계에서 유기상의 양이 최소화되도록 유기 용매의 일부를 회전 증발기를 통해 제거한다.

이어 현탁액을 유기상 제거를 위해 수용액 Na₂HPO₃에 대해 투석하고, 0.1 내지 1% w/w의 농도를 얻기에 가능한 최소 부피로 농축시킨다.

제2 농축을 거쳐, 용도에 따라 5배 내지 20배 범위의 이론적 농도 계수와 함께 막 투석을 통해 훨씬 더 농축된 생성물을 수득하는 것이 가능하다. 이어 생성물을 필터로 0.22 ㎛ 까지 여과하여 박테리아 부하물을 제거한다. 21-24 kA/m의 교번 자기장 및 60-190 kHz의 진동수로 30 분간 조사하여 그의 온도를 적어도 5 ℃ 상승시키면 생성물은 우수한 온열 효율을 갖는다.

본원에 기재된 방법으로 30 내지 60 nm의 범위에 집중된 치수 분포를 갖는 구조물의 제조가 가능하다.

현탁액의 정전 안정성 및 그의 이온 강도에 대한 정보를 얻기 위해 측정되는 얻어진 생성물의 ξ 전위 (Malvern Zetasizer nano-S)는 -30 mV 미만이고, 이는 입자가 (생리) pH 7.4에서 부분적으로 탈양성자화 된 카복실 그룹에 의해 생성된 음의 표면 정전기적 반발력에 의해 영향을 받는 것을 의미한다.

전술한 실험 조건은 세포 배양 (DMEM, RPMI)에 전형적으로 사용되는 배양 배지에서 희석 후, 희석에 의해 이온 강도 조건의 명확한 변경 후에 또한 약간의 응집 및 침전 경향을 나타내어 우수한 안정성을 갖는 현탁액을 허용한다.

표적 전달을 위하고 이미징 기법에 사용하기 위한 단일클론 항체 및/또는 형광 염료 (예: Cyanine®, Dylight® 등)로 표면에서 관능화된 생성물을 얻는 것은 제2의 농축 과정 (상기 참조)에 적용되기 전에 전구체로서 NBR의 사용을 필요로 한다.

전형적으로, 이 단계에서, 생성물은 약 0.05 내지 0.1 중량%의 무기물 농도를 갖는다.

예비 공정 단계는 활성화제, 예컨대 EDAC [1-에틸-3-(-3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드] (몰비 EDAC/COOH = 10/1) 및 설포-NHS (NHS/COOH = 1/1)와 극성 상과의 접촉으로 나노입자의 바깥 부분쪽으로 노출된 폴리머의 말단 카복실기를 활성화함으로써 단일클론 항체 및/또는 형광 염료의 말단 아민기의 에스테르화에 의한 후속 공격을 촉진한다.

(생체내 NIR 이미징 응용에 적합한) λl600 내지 800 nm에서 방출을 가지는 형광 염료의 경우, NHS 에스테르-말단 분자만을 시장에서 입수할 수 있기 때문에, 한쪽에는 형광 염료를 갖고, 다른 쪽에는 활성화된 폴리머의 카복실기를 가지는 브릿지 연결을 위해 디아미노-말단 링커가 가해지는 중간 단계를 제공하는 것이 필요하다.

나노입자의 표면이 활성화되면, 항체 및/또는 아미노-말단 염료 용액을 첨가하고 방치한다.

이어 현탁액을 농축하고, 수성 Na₂HPO₃에 대해 투석한 후, 용도에 따라 0.2 내지 1.0 중량% 까지의 무기상으로 농축한다.

그 후, 생성물을 필터로 0.22 ㎛ 까지 여과하여 박테리아 부하물을 제거한다.

본원에 기재된 방법은 40 내지 70 nm 범위에 집중된 치수 분포를 가지는 구조물의 제조를 가능케 한다.

현탁액의 정전 안정성 및 그의 이온 강도에 대한 정보를 얻기 위해 측정되는 얻어진 생성물의 전위 ξ (Malvern Zetasizer nano-S)는 -30 mV 미만이지만, NBR 생성물에 대해 측정된 것 보다는 크고, 이는 원 생성물의 카복실기에 의해 발휘되는 음 전하가 결합된 항체/염료에 의해 부분적으로 중화된 것을 의미한다.

입자에 결합된 항체의 함량을 BCA® 시험을 이용하여 분석한다: 단백질 분석 물을 함유하는 용액에 적합한 시약을 첨가한 다음, 스펙트럼 분석에 의해 562 nm에서 착색이 관찰되는 Cu^{2 +}의 복합체를 전개하고, 그로부터 선형 보정을 이용하여 항체의 농도를 유도한다.

본원에 기술된 절차로 예를 들어 moAb 공격 백분율이 무기상 함량에 대해 5 내지 30 중량%인, moAb로 관능화된 나노입자를 제조하는 것이 가능하다.

나노생물반응장치/친유성 약물 (이후 NBR_PTX라함) 및 나노생물반응장치/항체/친유성 약물 (NBR_hERG_PTX) 시스템 (여기서 친유성 약물은 예를 들어 파클리탁셀이다)의 제조는 상술한 바와 같은 나노생물반응장치의 합성 방법과 정확히 일치하며, 따라서 PLGA-b-PEG-COOH에 기초한 폴리머 매트릭스 내에 카테콜로 이미 관능화된 무기 나노입자의 캡슐화를 제공한다. 이 공정에서 유일한 변화는 폴리머 내 특정량의 약물의 용해와 관능화된 나노입자의 현탁액 제공이다.

다음으로, 나노침전법을 이용하여 파클리탁셀이 부하된 나노생물반응장치 (NBR_PTX)를 얻는데, 여기서는 상기 유기 용액이 혼합 셀 내의 Na₂HPO₄ 1 mm 수용액에 격렬히 첨가된다. 배치 합성에서 연속 합성에 이르기까지 현탁액의 형태학적 성질에는 변화가 없다. 적용되는 정제, 여과 및 농축 공정은 전술한 바와 동일하다.

생성물의 특성화를 위해, 평균 입경, 그의 ξ 전위 및 무기상의 농도 측정 외에, 캡슐화된 활성 성분의 양이 또한 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 결정된다.

수득한 특성화한 생성물을 표면에서 (hEGR, hEGFR, IgG,...)와 같은 표적 단위로 추가 관능화할 수 있다.

이를 위한 공정 설정은 정확히 전술한 바와 같은 나노생물반응장치 NBR_moAb의 표적화 절차를 따른다.

실제로, 이는 EDAC 및 설포-NHS와 같은 활성화제에 의한 폴리머 상에 존재하는 카복실기의 활성화 예비 단계 및 단일클론 항체와의 반응 단계를 제공하는데, 모두 NBR_moAbp 대해 전술한 바와 같은 공정에 명시된 것과 동일한 비율을 따른다.

이어 일반적인 정제 및 특성화 방법이 수행된다. 얻어진 나노입자 현탁액은 45 내지 55 nm의 평균 유체역학 직경을 갖고 ξ 전위는 -30 mV 훨씬 아래로 특정화된다.

본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 상기 정의된 바와 같은 구조물은 단백질 또는 항체 첨부에 대한 대안으로서, 면역계 세포에 도입될 수 있다.

놀랍게도, 카테콜로 관능화되고 상술된 바와 같은 폴리(락트-co-글리콜)산 및 폴리에틸렌 글리콜 카복실레이트의 블록 코폴리머 (PLGA-b-PEG-COOH, MnPLGA 범위 = 44-10 kDa, MnPEG = 2-3 kDa)로 코팅된 자철석 입자의 클러스터를 포함하는 구조물은 그의 기능 및 활력의 손상 없이 면역계 세포에 의해 용이하게 도입된다.

면역계 세포가 본 발명에 따른 구조물의 도입으로 조작되면, 이들은 종양 질환, 중추 신경계의 퇴행성 질환 (예: 알츠하이머병), 뇌 심혈관 및 감염성 질환, 이식, 자가면역 질환의 진단 및 종양, 뇌 심혈관 질환, 퇴행성 질환 (예: 알츠하이머병), 감염성 질환, 이식, 간경화 및 섬유조직성장이 관여하는 다른 병태, 습관성 유산을 특징으로 하는 질환, 자궁내 태아 사망, 신생아 질환, 선천성 및 후천성 응고 장애, 유전성 질환, 자가면역 질환의 치료 및 마지막으로 통증 완화를 위해 사용될 수 있다.

방출 유도는 상이한 방법, 예컨대 특이적 항원 (예: 흑색종 치료의 경우 MAGE-3, 다발성 경화증의 치료에 MOG 또는 미엘린 항원 등) 또는 적절한 면역조절 물질, 예컨대 IL-2, CD40 리간드, TLR-작용제, 리포좀, 면역자극 복합체 (ISCOMS)로 일어날 수 있다.

사실, 면역계 세포의 중요한 특성은 신체의 거의 모든 구역에 도달하는 능력에 의해 제시되고, 따라서 목적지에 필요한 특정 생성물을 본 발명에 따른 구조물을 통해 나르는, 특정 구역에 도달하기 위한 담체로서의 그의 용도는 저 특이성 치료로 제시되는 나노테라노스틱의 현재의 커다란 제한을 넘어서는 것에 주목해야 한다.

상기 목적에 유용한 면역계 세포는 예를 들어 다음중에서 선택된다:

T 림프구, 단핵구, 대식세포, 수지상세포, 자연 살해 세포, B 림프구, 호중성 과립구, 호산성 과립구, 호염기성 과립구, 감마 델타 세포.

세포를 단일 환자에서 취해 목적하는 나노입자를 부하한 뒤, 동일 환자에게 국소적 또는 전신적으로 재도입한다.

면역계 세포는 후술하는 바와 같이 정제될 것이고, 대상 질환에 걸린 신체 구역의 선택적/우선적 표적화를 용이하게 하기 위해, 세포를 생체 외에서 관련 항원 (또는 알레르겐), 면역조절 약물로 처리하거나, 면역 강화 또는 면역 억제 분자로 조작할 수 있다.

진단 또는 치료 목적을 위해 T 세포를 선택하는 방법 중 하나는 상술한 바와 같이 종양 항원일 수 있는 특정 항원에 특이적인 T 림프구의 수를 풍부하게 하는 것이다.

본 발명의 구조물로 적절히 조작된 림프구는 일단 자리를 잡으면, 적합한 화학적 자극에 의해 입자를 방출할 수 있고, 이어 입자는 라디오파 범위 전자기장의 조사하에서 고열을 발휘하거나, 항 종양 약물, 뇌 조직의 산화 스트레스시 활성적인 분자의 스캐빈저, 항염증성 분자 등과 같은 활성 성분을 방출할 수 있다. 나노입자는 림프구 자체 내에 한정된 상태를 유지하는 경우에도 여전히 자신의 기능을 수행할 수 있다.

자성 나노입자는 또한 뛰어난 T1 T2* 조영제 (상기 특허 참조)로서 MRI 이미징 기능을 수행할 수 있으며, 금 나노로드를 함유하는 나노입자는 레이저-매개된 항종양 치료에 사용될 수 있고 광음향 분광 타입의 방법으로 식별될 수 있다.

정제 및 림프구 선택

종양에 대해 사용하기 위한 T 림프구는 관련 종양 항원의 투여 후, 말초 혈액 또는 종양 부위 또는 환자의 림프절로부터, 또는 관련이 있는 것으로 생각되는 신체의 다른 구역으로부터 표준화 방법을 사용하고/하거나 선택적 MACS® 방법의 도움을 받아 정제된다 (Current Protocols in Immunology 2013; D'Elios et al J Immunol 1997; 158:962-967).

종양에 특이적인 T 림프구를 선택하기 위하여, T 림프구를 5 일동안 완전 RPMI 배지에서 관련 종양 항원 (예컨대 흑색종을 위해 MAGE-3, 10 ㎍/㎖의 농도로)과 배지에 위치시킨다. 이어서, 재조합 인간 IL-2를 3 일마다 첨가하고, 그 후 세포에 나노입자를 부하한 후, 세척하고 환자에게 국소적으로 및/또는 전신적으로 투여할 것이다.

예를 들어 자성 공명 기술로 다발성 경화증을 위한 진단 제품으로 사용하기 위한 T 세포가 미엘린 항원 또는 MOG (10 ㎍/㎖), 또는 CNS의 구조에 우선적으로 오를 수 있는 다른 항원에 대한 그의 특이성에 대해 선택된다.

이를 위해, 이들을 5 일동안 하나 이상의 항원과 배양한 후, IL-2로 확장하고, NP를 부하한다.

동일 과정을 적절한 관련 항원을 사용하여 다른 신경학적 질환, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중, 뇌 및 기타 뇌-심혈관 질환에 사용할 수 있다.

(T 림프구에 항원을 제시하는 그의 능력이 매우 효율적이고, 따라서 T 림프구를 상당히 활성화할 수 있는) 수지상세포를 기존의 표준화 방법 및/또는 선택적인 방법 MACS®을 이용하여 얻을 수 있다 (Current Protocols in Immunology 2013; Codolo et al. Arthr Rheum 2008; 58:3609-17). 이들을 목적하는 항원과 36-44 시간 인큐베이션한 후, NP를 부하하고, 세척하여 치료 또는 진단 목적으로 환자에게 재주입한다 (도 5의 공정 레이아웃 참조).

강력한 세포독성 활성을 갖는 자연 살해 세포 및/또는 감마 델타 림프구는 기존의 표준화 방법 및/또는 선택적인 방법 MACS®을 이용하여 얻고 (Current Protocols in Immunology, 2013), 이어 여기에 목적하는 NP 및 경우에 따라 다른 면역조절 화합물을 부하한 후, 세척하여 치료 (예를 들어 항종양) 또는 진단 목적으로 환자에게 재도입한다.

호중성 과립구는 기존의 표준화 방법 및/또는 선택적인 방법 MACS®을 이용하여 얻고 (Current Protocols in Immunology, 2013), 이어 여기에 목적하는 NP 및 경우에 따라 다른 면역조절 화합물을 부하한 후, 세척하여 진단 (예를 들어 신체에서 다른 기술로 식별할 수 없는 임의의 감염 병소의 존재를 확인하기 위해) 또는 치료 목적으로 환자에게 재도입한다.

또한 예컨대 표준화 방법 및/또는 선택적인 방법 MACS® (Current Protocols in Immunology, 2013)을 이용하여 수득되는 B 림프구, 호산구, 호염기구와 같이, 다른 세포형이 진단 및/또는 치료적 사용을 위해 선택될 수 있다 (예컨대 종양, 자가면역 질환, 감염, 퇴행성 질환의 치료에 사용되는 이펙터 세포).

이어 이들에 목적하는 NP 및 경우에 따라 다른 면역조절 화합물을 부하한 후, 세척하여 환자에게 재도입한다.

나노입자가 부하된 면역 세포는 적절한 이미징 기술을 이용하여 질환의 위치에 있는 신체 구역을 표시하기 위해 사용될 수 있다.

T 세포 및 주르카트 (Jurkat) 세포는 4 시간 후 NP로 가장 적절히 채워진다.

단핵구/대식세포, 수지상세포, J774A.1 세포는 본 발명에 따른 방법으로 나노입자가 도입될 수 있으며, 여기서 단핵구/대식세포, 수지상세포, J774A.1 세포는 적합한 특정 배양 배지 (mmedium)에서 0.05%의 농도로 나노입자 (NP)가 부하된다. NP 함유 mmedium을 형성하기 위해, NP를 먼저 이어 특정 배양 배지를 분배한다.

mmedium은 다음과 같이 구성된다:

완전 DMEM 10% FBS

완전 DMEM:

. DMEM 고 글루코스 (DME/고). (EUROCLONE) (코드: ECB750 L).

. L-글루타민, 용액 200 mM (100×). (EUROCLONE) (코드: ECB 3000D)

. 페니실린 - 스트렙토마이신 용액 (100×). (ATCC) (번호: 30-2300)

≫ 10% 소태아혈청 FBS: 적격 소태아혈청. (Sigma-Aldrich) (코드: F6178-100 mL)

필요에 따라, 환자의 자가 혈청 또는 혈청 부재의 배지가 소태아혈청 대신 사용될 것이다.

단핵구/대식세포, 수지상세포, J774A.1 세포는 2 시간 후에 NP로 가장 적절히 채워질 것이지만, 도입 현상은 15 내지 최대 24 시간 후에 활성화된다.

도 6은 나노입자로 충전된 단핵구/대식세포의 광학 현미경으로 찍은 사진을 나타낸다.

본 발명은 하기에 주어지는 실시예와 구조물의 제조 및 면역계 세포의 조작을 위한 다양한 단계들을 개략적으로 요약한 도 4 및도 5를 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다.

실시예 1

디에틸렌 글리콜 DEG 중 아세트산철의 제조

시약:

0.716 mol과 동일한 40 g Fe (Fe< 99% <212mm); 800 g 물; 10.67 mol과 동일한 800 g CH3COOH (80%); 0.41 mol과 동일한 46.64 g 과산화수소수 (30%); 0.12 g 농 HCl; DEG (디에틸렌 글리콜) 3850 g.

합성:

철, 아세트산 및 물 용액 및 염산을 질소 흐름하에 5000 mL 4-구 플라스크에 충전하고, 온도를 90 ℃로 조절하여 6 시간동안 유지하였다. 시스템을 N2 하에 방냉하고, 용액을 여과하여 용해되지 않은 Fe를 제거하였다. 과산화수소수를 드립퍼를 사용하여 플라스크에 위치한 맑은 용액에 적가하고, 온도를 35 ℃에서 1 시간동안 유지하여 2.40%w/w의 철 역가를 갖는 맑은 용액 1628.3 g을 얻었다. 과량의 산을 40^o의 T에서 제1 진공 증류에 의해 스트리핑하고, 건조 부분을 물로 재순환하고, 2회 증류 제거하고 (2 연속 세척), 약 50^o의 T에서 최종 스트리핑하였다. 3850 g DEG를 건조물에 이론 철 역가가 1.01% w/w Fe의 값이 되도록 첨가하였다.

실시예 2

디에틸렌 글리콜 중 Fe3O4 나노입자의 제조

시약:

1.50 g Fe⁰ (Fe⁰< 99%, <212mm) Fe⁰ = 0.179 mol; 150 g DEG; DEG 1/10 농 HCl 37% 중 1.2 g 용액; DEG 중 300.00 g FeAc3 (1.01%w/w Fe^III).

금속 철 및 DEG를 500 mL 4-구 플라스크에 N2 하에 충전하고, 온도를 150 ℃로 조절하였다. 염산의 DEG 중 용액을 시스템에 첨가하고, 5 분동안 교반하에 방치하였다. 아세트산철을 정확한 입자 성장을 보장할 수 있도록 주사기를 이용해 10개의 등가 분취액에 첨가하고, 온도를 170 ℃로 조절한 후, 반응을 24-36 시간 내에 종료시켰다.

생성물을 60 ℃로 방냉하고, 반응하지 않은 금속 철을 자기적으로 유지하는 비이커에서 경사분리한 후, 0.45 ㎛ 유리섬유 상에서 여과하였다.

Fe₃O₄로 표현되는, 이온성 Fe로 0.91%±0.05의 역가를 가지는 디에틸렌 글리콜 중 자철석 나노현탁액 450 g은 1.253%±0.05에 상응한다. 이 샘플에서 고열을 측정하고, 그 값을 하기 표에 나타내었다.

SAR_M: 금속 (Fe)의 질량으로 표시되는 특이적 흡수율

실시예 3

유기 바인더 N-(3,4-디하이드록시펜에틸)도데칸아미드 (DDA)의 제조

MW = 335.48 g/mol

시약:

0.1318 mol과 동일한 25 g 도파민 하이드로클로라이드; 1L THF; 45 mL 트리에틸아민 0.32 mol; 31.20 mL 라우로일 클로라이드 0.135 mol;

정제 및 결정화

400 mL THF (Aldrich 401757-2L- Lot STBC4923V)

935 mL 에틸 아세테이트 (Aldrich 34972-2,5L- Lot 57BC011AV)

315 mL 석유 에테르 (Aldrich 77379-2,5L- Lot BCBG7367V)

합성:

5L 4-구 플라스크에 도파민 하이드로클로라이드에 이어 THF (1L)를 질소 분위기하에 충전하고, 트리에틸아민을 첨가한 후, 시스템을 약 20 분간 교반하에 유지하여 백색 현탁액을 수득하였다.

평저 3L 플라스크에 THF (1L) 및 아실화제를 첨가하였다. 용액을 교반하고, 연동식 펌프를 사용하여 약 2 mL/분의 속도로 9 시간에 걸쳐 5L 플라스크에 함유된 시약에 첨가하여 바닥에 약간의 백색 고체가 있는 황색-오렌지색의 용액을 수득하였다.

정제:

이어 합성 생성물을 함유하는 유기상을 정제하고, 후자를 반응동안 형성된 부산물로부터 회수하였다. 회전증발기를 통해 용매를 2회 재순환 (2×200 mL)으로 제거하여 정제를 수행하였다. 고체 잔사 및 합성 플라스크 내의 잔류 미량에 대해 수성 추출 및 에틸 아세테이트 처리를 분별 깔때기에서 수행하였다. 유기상을 모두 합해 Na2SO4로 건조시키고, 마지막으로 회전증발기에서 건조시켰다. 57 g의 오렌지색 유성 생성물을 수득하였다.

결정화:

석유 에테르:에틸 아세테이트 = 7:3의 혼합물 450 mL를 생성물에 첨가하였다. 현탁액을 냉수하에 투입하였더니 백색 고체가 결정화되기 시작하였다. 이 시스템을 하루 방치하였다.

고체를 부크너 (Buckner) 상에서 여과하여 모액으로 세척하고, 오일 펌프를 사용하여 건조시켰다. 약 39 g을 수득하였다 (이론치 44 g, 수율 88.6%).

결정화 (2.45g- 오렌지 갈색 고체) 및 세척에 의한 모액을 건조시켰다 (PRIME 27.13g- 암갈색 고체).

실시예 4

(THF 중) Fe3O4 나노입자의 표면 관능화:

시약:

2.164·10-³ mol과 동일한 40.0 g Fe₃O₄ 분산물; 3.247·10-³ mol과 동일한 1089 mg DAA; 120 mL EtOH; 80.0 g THF.

120 mL EtOH 중 1089 mg DDA를 250 mL의 플라스크에서 가용화시켰다; 이렇게 제조된 용액을 60 ml의 시린지로 자철석에 첨가하였다. 그 다음 초음파조에서 1 시간동안 초음파 처리하였다. 샘플을 수 분간 방치한 다음 60 mL H20를 첨가하고, NP를 네오디뮴 자석에 고정시켰다; 상등액을 분리하고, 나노입자를 80.0 g THF에 다시 분산시켰다. 트리에틸아민 4 방울을 분산물에 첨가하였다 (입자가 약 10 분 후에 분산된다).

실시예 5

(아세톤 중) Fe3O4 나노입자의 표면 관능화:

시약:

0.2·10-³ mol과 동일한 4.0 g Fe₃O₄ 분산물; 0.3·10-³ mol과 동일한 108.0 mg DAA; 12.0 mL EtOH; 13.6 mL 아세톤.

자석철 현탁액을 초음파 조에서 1 시간동안 초음파 처리한 다음, 25 mL 주사기로 12.0 mL EtOH 중 108 mg DDA의 용액에 첨가하였다. 이어서, 30 분동안 초음파 처리하게 두었다. 시편을 수 분간 정치시켰다. 6 mL H₂O를 첨가하고, NP를 네오디뮴 자석에 고정한 후, 상등액을 분리하고, NP를 13.6 mL 아세톤에 다시 분산시켰다. 트리에틸아민 2 방울을 분산액에 첨가하였다 (입자가 즉시 분산된다).

실시예 6

폴리머 PLGA-b-PEG-COOH 43-3 kDa의 합성

블록 코폴리머 PLGA-b-PEG-COOH의 합성을 위해, 전구체 PLGA-COOH (MW 44-10 kDa)를 디사이클로헥실카보디이미드 (DCC)의 커플링 화학을 이용하여 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화한 후, 부가물을 후술하는 바와 같이 디클로로메탄 (DCM) 중에서 아미노-관능 부분 PEG-NH₂ (MW 2-3 kDa)과 배합하였다:

단계 1: NHS로 카복실 관능기의 활성화

시약

98 g PLGA-COOH (50:50 폴리 (DL-락티드-co-글리콜라이드),

카복실레이트 말단기

1.037g NHS (N-하이드록시숙신이미드 98%)

720 mL DCM (디클로로메탄 >99.9%)

1.98 g DCC (N,N-디사이클로헥실카보디이미드 99%)

990 mL DCM (디클로로메탄 >99.9%)

1600 mL 디에틸 에테르 (≥99.8)

공정

PLGA-COOH 및 600 mL 디클로로메탄을 질소하에서 5L 4-구 플라스크에 첨가하였다. 폴리머의 용해 후, N-하이드록시숙신이미드 (NHS)에 이어 N,N-디사이클로헥실카보디이미드 (DCC- 한번에 약 0.25 g)를 첨가하였다; 시스템을 불활성 분위기에서 약 40 시간동안 교반하에 방치하였다. 원료 물질이 손실되지 않도록, 120 mL 디클로로메탄을 사용하여 고체 유입 경로를 세척하였다.

황색 현탁액을 디사이클로헥실우레아 제거를 위해 2L 미상 플라스크로 여과하였다. 5L 플라스크를 250 mL (×3) 및 190 mL CH₂Cl₂로 세척하였다. 생성물을 1L 플라스크 (50 mL 건조 DCM 세척)에서 회전증발기에 의해 약 400 mL 부피로 농축하였다: 짙은 황색 현탁액을 얻었다.

PLGA-NHS를 400 mL (×4) 냉 디에틸 에테르를 사용하여 침전시켰다. 각 세척을 위해, 백색 고체를 경사 분리하고 상등액을 제거하였다. 이어서, 고체를 오일 펌프를 사용하여 약 2 시간 30 분동안 건조시켰다.

단계 2: PLGA-NHS와 NH2-PEG-COOH의 접합

PLGA-NHS

CHCl₃

CH₂Cl₂ - PM = 119.38

DIPEA N-에틸디이소프로필아민 [(CH3)2CH]2NC2H5 - PM=129.24

COOH-PEG-NH₂ HCl x NH₂-PEG-O-C₃H₆-COOH- PM PEG= 3000da

시약

PLGA-NHS (반응 중간체)

1L (합성) CHCl₃ (클로로포름 ≥99.5)

100 mL + 250 mL (세척) CHCl₃ (클로로포름 ≥99%, 0.75% 에탄올로 안정화)

1.2 mL DIPEA (N,N-디이소프로필에틸아민 99.5%)

7 g COOH-PEG-NH₂(폴리머-하이드로클로라이드 형태 비율)

1250 mL 디에틸 에테르 (≥99.8%)

1250 mL 탈이온수

공정

질소 흐름하에서 기계적 교반기가 장착된 2L 3-구 플라스크에 상기 얻어진 중간체를 1L 클로로포름에 용해시켰다. 1.2 mL DIPEA를 주사기를 이용하여 시스템에 첨가하고, 이어 7 g의 COOH-PEG-NH2 (소량 첨가)를 첨가하였다. 이 시스템을 약 90 시간동안 불활성 기류하에서 교반하에 방치하였다.

황색 용액을 3-구 플라스크로부터 2L 1-구 플라스크로 옮기고, 100 mL 클로로포름으로 세척하였다.

생성물을 회전증발기를 이용하여 약 550 ml (증류 부피 CHCl3 = 650 ml)로 농축하였다. 생성물을 2L 플라스크에서 1L 1-구 플라스크로 옮겼다 (250 mL CHCl₃로 세척).

침전된 코폴리머를 250 mL (×5) 냉 디에틸 에테르로 세척하였다: 처음에, 과포화 방지를 위해 현탁액을 천천히 첨가하고, 유리막대로 진탕하여야 한다. 각 세척시, 시스템을 빙조에서 정치시킨 후, 상등액을 제거하였다 (사차 염 및 미반응 유기 불순물을 함유하는 유백색 현탁액).

고무질 백색 고체를 250 mL (×5) 탈이온수로 세척하여 반응하지 않은 미량의 COOH-PEG-NH₂를 제거하였다.

시스템을 진공하에 (먼저 액체 링 펌프 및 이 후 오일 펌프) 두고, 진공 건조 (-30 ℃에서 오일 펌프 트랩), 건조 촉진을 위한 폴리머 붕해 및 하룻밤 냉동고 저장을 교대로 행하였다. 더 이상의 중량 손실이 관찰되지 않을 때까지 이 절차를 반복하였다.

생성물을 냉동고에 저장하였다.

86.80 g의 폴리머를 회수하였다 (약 83%의 수율).

실시예 7

합성 (PLGA-b-PEG-COOH 12-3 kDa)

단계 1: NHS로 카복실 관능기의 활성화

시약의 기술적 사양:

시약

7 g PLGA-COOH 7000-17000 (50:50 폴리 (DL-락티드-co-글리콜라이드), 카복실레이트 말단기) → 0.582 mmol

150 mL CH₂Cl₂ (디클로로메탄- >99.9%), PLGA-COOH의 안정화용

0.27 g 30 mL CH₂Cl₂로 세척한 NHS (N-하이드록시숙신이미드- 98%)

→ 2.34 mmol

0.51 g 50 mL CH₂Cl₂로 세척한 DCC (N,N-디사이클로헥실카보디이미드- 99%) → 2.493 mmol

70 mL CH₂Cl₂ (부크너에서 여과하기 전 500 mL 플라스크를 세척하기 위한 디클로로메탄 >99.9%)

550 mL 디에틸 에테르 (Aldrich ≥99.8%)

PLGA-COOH 및 150 mL 디클로로메탄을 질소하에 500 mL 플라스크에 첨가하였다. 폴리머 용해 후, NHS를 첨가하고 (펀넬 세척을 위해 30 mL CH₂Cl₂), 이어 DCC를 첨가하였다 - 연속 첨가 - (펀넬 세척을 위해 50 mL CH₂Cl₂).

시스템을 불활성 분위기에서 약 24 시간동안 교반하에 방치하였다.

무색 용액 (현탁액 중에 백색 고체를 가지는)을 부크너 상에서 1L 미상 플라스크로 여과하여 디사이클로헥실우레아를 제거하였다. 500 mL 플라스크를 70 ml CH₂Cl₂로 세척하였다.

생성물을 배형 1-구 플라스크로 옮기고, 부치 회전증발기로 농축시킨 다음, 약 1 시간 후에 농후한 백색 현탁액을 얻었다.

단계 2: PLGA-NHS와 NH2-PEG-COOH의 접합

시약

농후 현탁액 중 PLGA-NHS (반응 중간체)

260 mL 중간체용 CHCl₃ (클로로포름- Aldrich ≥99.5%-Cat)

20 mL 아미노 PEG COOH 세척용 CHCl₃

0.35 mL DIPEA (N,N-디이소프로필에틸아민 99.5%)

1.82 g COOH-PEG-NH₂ (폴리머-하이드로클로라이드 형태 비율) →

0.6066 mmol

520 mL 디에틸 에테르 (≥99.8%)

300 mL 탈이온수

공정

질소하에 500 mL 플라스크에서 중간체 (100) (×2) 및 60 mL CHCl3을 용해시켰다. 0.35 mL DIPEA를 주사기를 사용하여 시스템에 첨가하고, 이어 1.82 g COOH-PEG-NH2를 20 mL의 깔때기 세척을 위한 CHCl3와 함께 첨가하였다. 시스템을 96 시간동안 불활성 기류하에서 교반하에 방치하였다.

4-구 플라스크로부터 갈색과 흰색 잔사의 존재를 부크너 상에서 여과한 현탁액을 수 mL의 클로로포름으로 세척한 500 mL 1-구 플라스크로 옮겼다.

생성물을 회전증발기를 이용하여 농축하였다 (CHCl3 증류 부피 = 170 mL). 120 mL 냉 디에틸 에테르 (백색 현탁액-유리막대-빙조 러빙), 60 mL (백색 현탁액-빙조), 80 mL (침전 시작-빙조), 60 mL (냉동고에서 약 1 시간)를 황색 용액에 첨가하였다. 생성물을 100 mL (×2) 냉 디에틸 에테르로 세척하였다. 각 세척시, 시스템을 냉동고에서 정치시킨 후, 상등액을 제거하였다 (사차 염 및 미반응 유기 불순물을 함유하는 유백색 현탁액). 에테르 중 세 분획을 건조하였다 (1.20 g).

고무질 백색 고체를 100 mL (×3) 탈이온수 (빙조)로 세척하여 반응하지 않은 미량의 COOH-PEG-NH2를 제거하였다.

코폴리머 (18.10 g)를 부치 회전증발기에서 진공하에 두고, 약 4 시간동안 오일 펌프 (에탄올-드라이아이스 트랩)에 연결하였다 (7.78 g- 건조와 붕해를 교대로 수행). 생성물을 붕해시킨 후 진공하에 두고, 건조, 붕해 및 냉동고 단계를 교대로 행하였다.

더 이상의 중량 손실이 관찰되지 않을 때까지 이 절차를 반복하였다.

생성물을 냉동고에 저장하였다.

7.52 g의 폴리머를 회수하였다 (88%-86%의 수율).

(2 g) P.M.:11300 g/mol - 0.1769 mmol

(5 g) P.M.:15400 g/mol - 0.3246 mmol

mmol PLGA COOH: 0.5015

g PLGA PEG COOH (mol _2g* P.M._2g) + (mol _5g* P.M._5g) = 2.529 + 5.972 = 8.5 g

PM=12000으로 계산. 예상치 8.74 g PLGA PEG COOH

실시예 8

나노생물반응장치 (NBR)의 설정

시약:

9.5e-04 mol Fe₃O₄와 동일한 40.0 g Fe3O4-DDA; 5e-06 mol 폴리머와 동일한 220.0 mg PLGA-b-PEG-COOH; 400 ml 인산염 완충액 1 mM

220.0 mg 폴리머를 5 mL THF에서 용해시킨 후, 40.0 g의 Fe3O4-DDA를 60 mL 주사기를 사용하여 유기 용액에 주입하였다. 생성물을 회전증발기에서 농축하여 존재하는 THF를 제거하였다. 유기 증발물이 더 이상 형성 및 응축되지 않으면 이 과정을 중지하였다.

생성물을 다음 과정에 따라 농축하고, Pellicon 2mini 100kDa 막을 가진 Cogent M 시스템으로 투석하였다:

시스템이 배출되고 나면, 1.5 이론적 계수로 농축한 다음, 10^-3M으로 완충된 2000 mL UP 물로 투석시킨 NBR 현탁액을 도입하였다.

시스템을 30 분동안 NaOCl 1:10에서 유지한 후, 500 kDa의 막을 가진 Pellicon XL 시스템에서 100 mL의 부피로 더 농축시켰다.

20배의 이론 농도 계수 (무기물의 이론 농도: 1.0%)에 도달하면 과정을 중단하였다.

이어 PES 중에 Millipore Sterivex 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 이를 냉장고에 저장하였다.

배양 배지에서의 안정성:

샘플을 DMEM+10%FBS+글루타민+항생제에서 1:20 (0.05% wt 무기상)으로 희석하였다: 응집없이 맑음.

실시예 9

연속 나노생물반응장치 (NBR) 생산

시약:

4.4e-06 mol 폴리머와 동일한 200 mg PLGA-b-PEG-COOH; 52.6 g THF; 8.6e-04 mol Fe₃O₄와 동일한 36.4 g Fe3O4-DDA; pH 7.4 = 10^-3M으로 인산염 완충액을 가지는 1000 mL H₂O MilliQ.

100 mL 삼각 플라스크에 0.2 g 폴리머 PLGA-b-PEG-COOH 및 52.6 g THF를 첨가하고 완전히 용해될 때까지 (수 분간) 교반하였다. 마지막으로, 36.4 g Fe304-DDA를 첨가하였다.

합성:

수성 스트림에 유기 용액 첨가 (THF/물의 부피비 = 1/10)를 수행하기 위해 이중 연동식 펌프 시스템을 보정 후 설치하였다. 각 튜브는 2.5 L 병에서 제조한 인산염 완충 용액 및 (PLGA-b--PEGCOOH 및 입자를 가지는) THF 용액을 함유하는 렁 (lung)에서 직접 용액을 인출한다.

생성물을 먼저 THF를 제거하기 위해 회전증발기에서 스트리핑하고 건조시켰다; 휘발성 성분이 증발되면, 생성물을 회수하였다. 그 다음, 생성물을 농축하고, Pellicon 2mini 100kDa 막을 가진 Cogent M 시스템으로 투석하였다.

시스템을 비워 254.5 g의 생성물을 회수하였다.

이론 농도 계수: 4.7X

이론 농도: 0.078%

농도 및 투석에 필요한 시간: 20 분

생성물을 추가로 500 kDa 막을 가진 Pellicon XL에서 농축하였다. 최종 농도를 위해 필요한 시간은 1 시간이다.

회수: 약 1-2 mL 막 내에 순 사용적 (net dead volume) 11.51 g.

이론 농도 (V_사(dead) 1.5 mL 고려): 14%

실시예 10

moAb와 표적 나노생물반응장치 (NBR_hERG)의 구축

시약:

0.533 μmol -COOH와 동일한 40.38 mL NBR; 0.533 μmol과 동일한 2.32 mL 설포-NHS 0.23 mM 용액; 0.053 mmol과 동일한 190 μL EDAC*HCl 28 mM 용액; 4.0 mg hERG (2.7e-08 mol)와 동일한 2.64 mL 1.52 mg/mL hERG 용액; 1500 mL Na₂HPO₃ 수용액 = 10^-3M.

멸균 250 mL 베슬에 40.38 mL NBR을 첨가한 후, 0.19 mL EDAC (0.028 M) 및 2.32 mL 설포-NHS를 첨가하였다. 40 분 후 (정치), 2.64 mL의 hERG1 용액 (1.52 ㎎/mL = 4.0 mg)을 15.52 mL 인산염 완충액 1 mM로 희석하고, 42.89 mL 활성화 NBR에 첨가하였다. (V_최종 = 661.05 mL; Fe₃O₄ = 0.056%). 하룻밤 정치시켰다.

시스템을 PES 중 Pellicon XL 500 kDa 막을 사용하여 생성물이 투석되도록 설정하였다. 시스템을 300 mL H₂O MilliQ로 세척하고, 400 mL의 0.5% 차아염소산나트륨을 흘린 후, 시스템을 약 30 분동안 살균되게 하였다. 이어 400 mL 완충액 1 mM로 세척하였다.

그 다음에 펌프 속도를 약 15 mL/분 (P = 0.27 bar)로 설정하고 생성물을 22 mL의 부피로 농축하였다. 또한 첫 번째 투석 투과물을 BCA® 시험으로 분석하였다.

100 mL (4 부피)의 완충액 1 mM을 15 mL/분 (P = 0.27 bar)의 속도로 하여 투석하고, 4.7 mL의 부피로 농축하였다.

마지막으로, 생성물을 PES 중에 0.22 μM 필터로 여과하였다. 이를 냉장고에서 저장하였다. 이와 같이 얻어진 생성물은 0.05 중량%에서 배양 배지에서 희석 후 우수한 안정성을 나타내었다; 응집물 또는 응괴 고체 형태가 육안으로 관찰되지 않았다.

BCA 시험

BCA 시험의 수행을 위해, NBR_hERG의 농도를 상응하는 무 항체 (NBR)의 것 (따라서 화이트로 제공)에 대해 정규화하였다. 관련 시약을 첨가하여 염색이 현상되면, 샘플을 UV-VI를 분광광도계로 분석한 후, 흡광도 값을 (BSA 표준을 사용하여) 미리 준비한 보정 곡선에 대해 내삽하고, 등가의 moAb 농도를 외삽하였다. 용출액 및 화이트 (NBR)에서 관찰된 moAb의 값을 NBR_hERG 샘플에 대응하는 것에서 제해 NBR_hERG 상에 존재하는 항체의 순량을 계산하였다. 하기 식을 참조한다:

순 (net) C_{moAb ( NBR _moAb)} = C_{moAb ( NBR _moAb)} - C_{moAb ( NBR ) -} C_{moAb (용출액)}

측정된 실험값은 다음과 같다:

mAb 용출액 = 45 ㎍/mL

mAb NBR = 435 ㎍/mL

mAb NBR_hERG = 863 ㎍/mL

실제 mAb (mAb NBR_hERG - mAb NBR) = 428 ㎍/mL

mAb/Fe₃O₄ 비율 = 0,14

실시예 11

FLUO-염료와 표적 나노생물반응장치 (NBR_Fluo)의 구축

시약의 기술적 사양:

NBR [Fe₃O₄] = 0.081% [PLGA-b-PEG-COOH] = 0.061% *

1,4-디아미노부탄 MW = 88.15 g/mol d = 0.877g/mL

Alexa Fluor® 750 (750nm) MW = 1300 g/mol

H₂O UP 중 인산염 완충액 C = 1M; pH 7.4

시약:

30.00 mL NBR (0.40 μmol PPGC43-3.1)

1 mg Alexa Fluor 750 (770 μL 중 → [1 mM])

1500 mL H₂O MilliQ + 인산염 완충액 (7.4) = 10^-3M

설포-NHS MW = 217.13 g/mol

EDAC·HCl MW = 191.7 g/mol

Fluo-NH2 용액의 제조

형광단을 770 μL DMSO로 용해하여 1 nmol/μL 용액을 얻었다. 12 mL 바이알에 4950 μL의 1 mM 인산염 완충액을 첨가하고, 50 μL의 형광단 Alexa Fluor 750 용액 (50 nmol)을 첨가하였다. 이어 자성 교반하에 배치하고, 132 ㎍/mL 1,4-디아미노부탄 용액 100 μL를 첨가하였다 (150 nmol = 13.2 g에 해당). 용액을 암실에서 질소 흐름하에 24 시간동안 반응되도록 하였다. 얻어진 NH2-말단 형광단을 정제없이 후속 합성 단계에 사용하였다.

설포-NHS 용액 (0.23 mM)의 제조

5.0 mg의 설포-NHS를 정확히 칭량하고, 1 mM 인산염 완충액을 사용하여 100 mL 플라스크에서 용해하였다.

EDAC 용액 (0.028 mM)의 제조

4 mL 바이알에 2.7 mg EDAC 및 0.5 mL의 1 mM 완충액을 첨가하였다. 뚜껑을 닫고, 진탕하여 혼합을 촉진하였다. 이 용액은 반응 직전에 제조하여야 한다.

합성:

100 mL 바이알에 30.00 mL NBR DF를 첨가하고, 0.14 mL EDAC (0.028 M) 및 1.72 mL 설포-NHS (0.23 mM)를 첨가하였다.

총 부피: 30.00 mL + 0.14 mL + 1.72 mL = 31.86 mL

40 분 후 (정치), Alexa Fluor 750 용액 (10 nmol/mL) 2.64 mL를 첨가하였다.

4 시간동안 정치시켰다.

대조 DL를 수행하였다 (NBR_Fluo TQ).

정제:

시스템을 PES 중 Pellicon XL 500 kDa 막과 easy-load II 헤드를 갖춘 연동식 펌프 Masterflex L/S를 사용하여 생성물이 투석되도록 설정하였다. 이어 시스템을 0.5% 차아염소산나트륨을 유동시켜 멸균하고, 약 30 분동안 반응되도록 방치하였다. 멸균 MilliQ 물로 세척한 후, 시스템을 1 mM 인산염 완충액으로 준비하고 (또한 멸균), 펌프 속도를 약 12 mL/분 (0.25 mbar)으로 설정하여 생성물을 10 mL의 부피로 농축시켰다 (23 mL 투과물 수집). UV-VIS 분석을 위해 제1 투과물의 속도를 유지하였다. 이어 40 mL (4 부피)의 완충액 1 mM를 12 mL/min (P = 0.25 mbar)의 속도로 적용하여 투석하였다. 이 시점에, 6 mL의 부피로 농축하였다.

회수: 5.00 g

이론 합성 농도 계수: 5.8X

NBR에 대한 이론 농도 계수: 5X

여과:

생성물을 PES 중에 0.22 μM Millex 필터로 여과하였다. 전체 생성물의 정제를 위해 하나의 필터가 필요하다. 이를 냉장고에서 저장하였다.

회수한 NBR_27_Fluo_01 DF = 4.49 g

실시예 12

Fluo-염료와 표적 나노생물반응장치 (NBR_Fluo)의 구축

시약의 기술적 사양:

NBR [Fe₃O₄] = 0.081% [PPGC43-3.1] = 0.061% *

1,4-디아미노부탄 MW = 88.15 g/mol d = 0.877g/mL

Alexa Fluor 750 (750nm) MW = 1300 g/mol

H2O UP 중 인산염 완충액 C = 1M; pH 7.4

시약:

30.00 mL NBR (0.40 μmol PPGC43-3.1)

50,00 nmol 시아닌 5-1,4-디아미노부탄 (5.0 mL 중 → [10 μM])

1500 mL H₂O MilliQ + 인산염 완충액 (7.4) = 10^-3M

설포-NHS MW = 217.13 g/mol

EDAC·HCl MW = 191.7 g/mol

Fluo-NH2 용액의 제조

12 mL 바이알에 5 mL의 1 mM 인산염 완충액, 50 nmol (1 병) 시아닌 5, NHS-에스테르, 이어 150 nmol (13.2 g) 1,4-디아미노부탄을 첨가하였다. 용액을 암실에서 자석 교반 및 질소 흐름하에 24 시간동안 반응되도록 방치하였다. 얻어진 NH2 말단 형광단을 정제없이 후속 합성 단계에 사용하였다.

질소 흐름. 얻어진 NH2 말단 형광단은 정제없이 후속 합성 단계에 이용할 것이다.

설포-NHS 용액 (0.23 mM)의 제조

5.0 mg의 설포-NHS를 정확히 칭량하고, 1 mM 인산염 완충액을 사용하여 100 mL 플라스크에서 용해하였다.

EDAC 용액 (0.028 mM)의 제조

4 mL 바이알에 2.7 mg EDAC 및 0.5 mL의 1 mM 완충액을 첨가하였다. 뚜껑을 닫고, 진탕하여 혼합을 촉진하였다. 이 용액은 반응 직전에 제조하여야 한다.

합성:

50 mL 멸균 바이알에 30.00 mL NBR을 첨가하고, 0.14 mL EDAC (0.028 M) 및 1.72 mL 설포-NHS (0.23 mM)를 첨가하였다.

총 부피: 30.00 mL + 0.14 mL + 1.72 mL = 31.86 mL

40 분 후 (정치), 2.64 mL의 시아닌-5NH₂ 용액 (10 nmol/mL)을 첨가하였다.

4 시간동안 정치시켰다.

정제:

시스템을 PES 중 Pellicon XL 500 kDa 막을 사용하여 생성물이 투석되도록 설정하였다.

이 시점에 생성물을 10 mL의 부피로 농축시켰다 (23 mL 투과물 수집). 펌프 속도를 약 12 mL/분 (P = 0.25 mbar); t = 4'으로 설정하고; UV-VIS 분석을 위해 제1 투과물의 속도를 유지하였다.

40 mL (4 부피)의 완충액 1 mM를 12 mL/min (P = 0.25 mbar); t = 11'로 투석하였다.

이 시점에, 6 mL의 부피; t = 5'로 농축하였다.

회수: 4.29 g

이론 합성 농도 계수: 5.5X

NBR에 대한 이론 농도 계수: 4.8X

여과:

생성물을 PES 중에 0.22 μM Millex 필터로 여과하였다. 전체 생성물의 정제를 위해 하나의 필터가 필요하다. 이를 냉장고에서 저장하였다.

회수한 NBR_Fluo = 4.11 g

실시예 13

moAb 및 Fluo-염료와 표적 나노생물반응장치 (NBR_hERG - Fluo)의 제조

시약의 기술적 사양:

NBR [Fe₃O₄] = 0.821% [PPGC43-3.1] = 0.616%

1,4-디아미노부탄 MW = 88.15 g/mol d = 0.877g/mL

시아닌 5-NHS 에스테르 (650nm)

H₂O UP 중 인산염 완충액 C = 1M; pH 7.4

설포-NHS MW = 217.13 g/mol

EDAC·HCl MW = 191.7 g/mol

hERG1 MW = 15000 g/mol

시약:

4.79 mL NBR (0.64 μmol PPGC43-3.1)

25 nmol 시아닌 5-NHS 에스테르 (2.5 mL 중 → [10 μM])

2.7 mg EDAC

5.0 mg 설포-NHS

4.8 mg hERG (3.2 mL → 1500 ㎍/ml)

1500 mL H₂O MilliQ + 인산염 완충액 (pH 7.4) [] = 10^-3M

Fluo-NH2 용액의 제조

12 mL 바이알에 5 mL의 1 mM 인산염 완충액, 50 nmol (1 병) 시아닌 5 NHS-에스테르를 첨가하고, 자석 교반하에 놓은 후, 100 μL의 13.2 mg/100 mL 1,4-디아미노부탄 용액 (150 nmol = 13.2 ㎍에 상응)을 첨가하였다. 용액을 암실에서 질소 흐름하에 24 시간동안 반응되도록 방치하였다. 얻어진 NH2 말단 형광단을 정제없이 후속 합성 단계에 사용할 것이다.

설포-NHS 용액 (0.23 mM)의 제조

5.0 mg의 설포-NHS를 정확히 칭량하고, 1 mM 인산염 완충액을 사용하여 100 mL 플라스크에서 용해하였다.

EDAC 용액 (0.028 mM)의 제조

4 mL 바이알에 2.7 mg EDAC 및 0.5 mL의 1 mM 완충액을 첨가하였다. 뚜껑을 닫고, 진탕하여 혼합을 촉진하였다. 이 용액은 반응 직전에 제조하여야 한다.

합성:

100 mL 멸균 바이알에 7.95 mL 완충액 1 mM에 이어 4.79 mL NBR을 첨가하였다. 혼합물을 온화하게 교반하여 혼합한 뒤, 2.29 mL EDAC (0.028 M) 및 2.79 mL 설포-NHS (0.23 mM)을 첨가하였다.

총 부피: 7.95 mL + 4.79 mL + 2.29 mL + 2.79 mL = 17.83 mL

40 분 후 (정치), 2.5 mL의 시아닌-5NH5 에스테르 용액 (10 nmol/mL)을 첨가하였다. 3.2 mL의 hERG1 용액 (1.5 mg/mL = 4.8 mg)을 52.32 mL 인산염 완충액 1 mM에서 희석한 후, 활성화된 NBR 및 형광단을 함유하는 현탁액에 첨가하였다. 하룻밤 정치시켰다.

정제:

시스템을 NBR_19에 이미 사용된 PES 중 Pellicon XL 500 kDa 막을 사용하여 생성물이 투석되도록 설정하였다. 300 mL H₂O MilliQ로 세척하고, 400 mL의 0.5% 차아염소산나트륨을 흘린 후, 차아염소산에 약 30 분 두었다. 시스템을 400 mL 완충액 1 mM로 세척하였다.

이 시점에 생성물을 20 mL의 부피로 농축시켰다 (50 mL 투과물 수집). 펌프 속도를 약 14 mL/분 (P = 0.2 mbar); t = 15'으로 설정하고; BCA 시험을 위해 제1 투과물의 속도를 유지하였다.

80 mL (4 부피)의 완충액 1 mM를 14 mL/min (P = 0.2 mbar); t = 16'로 투석하였다.

이 시점에, 10 mL의 부피; t = 4'로 농축하였다.

회수: 6.469 g

NBR에 대한 이론 농도 계수: 1.3X

여과:

생성물을 PES 중에 0.22 μM Millex 필터로 여과하였다. 전체 생성물의 정제를 위해 하나의 필터가 필요하다. 이를 냉장고에서 저장하였다.

회수한 NBR_hERG-Fluo = 7.79 g

실시예 14

활성 성분이 부하된 나노생물반응장치 (NBR_PTX 및 NBR_hERG_PTX)의 제조

시약의 기술적 사양:

PPGC43-3.1 (배치 5-A) 50:50 Mw = 43000; PEG Mw 3000

Fe3O4-DDA [Fe₃O₄] = 0.55%

PTX Discovery Fine Chemicals

인산염 완충액 1 mM pH = 7.4

THF d = 0.89

시약:

35.6 g Fe3O4-DDA (40.0 mL) (195.8 mg Fe₃O₄) 490 mg/L (물 중)

212.6 mg PPGC43-3.1 490 mg/L (물 중)

21.2 mg PTX

400 ml 인산염 완충액 1 mM (실제: 440 mL)

60 mL 주사기 25G 바늘

[PLGA-PEG (5.5 mg/g), PTX (0.55 mg/g) 및 Fe₃O₄ (5.5 mg/g)를 함유한] THF 용액의 제조

212.6 mg PPGC43-3.1을 4 mL (4 mL 바이알) THF 및 2.12 mL THF (4 mL 바이알) 중 21.2 mg PTX에 용해시키고, 100 mL 플라스크 내의 35.6 g Fe3O4-DDA에 첨가하였다.

합성:

THF 용액을 25G 바늘 치수의 60 ml 주사기를 이용하여 400 ml의 인산염 완충액 1 mM에 적층하였다.

수득한 NBR_PTX: 455.8 g

스트리핑

생성물을 회전증발기에서 처리하여 존재하는 THF를 제거하였다. 이를 위해, 생성물을 1000 mL 플라스크로 옮기고, 다음 조건을 설정하였다:

조 온도 40 ℃

압력: 154 mbar

회전: 80 rpm

1 시간 후, 휘발 성분의 증발이 끝나면, 생성물을 회수하여 칭량하였다.

NBR_PTX 회전증발기에서 회수한 양 = 418.22 g (37.58 g THF 제거)

투석 및 농축:

생성물을 농축하고, 50 kDa 막을 가진 AMICON 시스템으로 하기 절차에 따라 투석하였다:

1) 50 mL 삼투처리된 H₂O로 세척하여 막 내 불순물을 제거하였다

2) 시스템을 H₂O UP 중 50 mL 인산염 완충액 (10^-3M)을 함유한 용액으로 세척하였다.

시스템이 배출되고 나면, NBR_PTX를 첨가하고, 약 100 mL로 농축하였다.

그 후, 150 mL 완충액 1 mM로 4회 세척을 수행하였다. 마지막으로, 75 mL로 농축하고 45 mL 용출액은 버렸다.

시스템을 비워 59.40 g의 생성물 (NBR_PTX)을 회수하였다.

이론 농도 계수 = 7.7X

여과:

생성물을 PES 중에 Millipore Sterivex 0.22 μM 필터 (원통형 필터)로 여과하였다.

안정성:

DMEM+10%FBS+글루타민+항생제에서 1:8로 희석한 농축 샘플은 응집이 없고 맑았다.

실시예 15

활성 성분이 부하된 나노생물반응장치 (NBR_PT-X 및 NBR_hERG_PTX)의 제조

시약의 기술적 사양:

NBR_PTX [Fe₃O₄] = 0.48 % [PPGC43-3.1] = 0.36% *

H₂O UP 중 인산염 완충액 C = 1M; pH 7.4

설포-NHS MW = 217.13 g/mol

EDAC MW = 155.24 g/mol d = 0.877 g/mL

hERG MW = 150000 g/mol

시약:

4.26 mL NBR_PTX_p10 DF (3.33*10^-4 μmol PPGC43-3.1)

5.0 mg 설포-NHS (100 mL 중 → [0.23 mM])

20 μL EDAC (4 mL 중 → [28 mM])

2.5 mg hERG (0.833 mL*3 mg/mL)

1500 mL 인산염 완충액 (pH 7.4) [] = 10^-3 M

설포-NHS 용액 (0,23 mM)의 제조

5.0 mg의 설포-NHS를 칭량하고, 1 mM 인산염 완충액을 사용하여 100 mL 플라스크에서 용해하였다.

EDAC 용액 (0.028 mM)의 제조

4 mL 바이알에 2.7 mg EDAC 및 0.5 mL의 1 mM 완충액을 첨가하였다. 뚜껑을 닫고, 진탕하여 혼합을 촉진하였다. 이 용액은 반응 직전에 제조하여야 한다.

합성:

40 mL 멸균 바이알에 2.36 mL 완충액 1 mM 및 이어 4.26 mL NBR_PTX를 첨가하였다. 혼합물을 온화하게 교반하여 혼합한 후, 1.19 mL EDAC (0.028 M) 및 1.45 mL 설포-NHS를 첨가하였다.

총 부피: 2.36 mL + 4.26 mL + 1.19 mL + 1.45 mL = 9.26 mL

40 분 후 (정치), 0.833 mL의 hERG1 용액 (3 mg/mL)을 27.25 mL 완충액 1 mM로 희석하여 얻은 HERG1 용액을 첨가하였다. (V_최종= 37.34 mL; Fe₃O₄ = 0.056%).

하룻밤 정치시켰다.

정제:

시스템을 PES 중 Pellicon XL 500 kDa 막을 사용하여 생성물이 투석되도록 설정하였다. 300 mL H₂O MilliQ로 세척하고, 400 mL의 0.5% 차아염소산나트륨을 흘린 후, 차아염소산에 약 30 분 두었다. 시스템을 400 mL 완충액 1 mM로 세척하였다.

이 시점에 생성물을 13 mL의 부피로 농축시켰다 (25 mL 투과물 수집). 펌프 속도를 약 13 mL/분 (P = 0.2 mbar); t = 5'으로 설정하고; BCA 시험을 위해 제1 투과물의 속도를 유지하였다.

60 mL (4 부피)의 완충액 1 mM를 13 mL/min (P = 0.2 mbar); t = 14'로 투석하였다.

이 시점에, 10 mL의 부피; t = 10'로 농축하였다.

회수: 7.40 g

이론 합성 농도 계수: 5.5X

NBR_PTX에 대한 이론 희석 계수: 2.8X

여과:

생성물을 PES 중에 0.22 μM Sterivex 필터로 여과하였다. 전체 생성물의 정제를 위해 하나의 필터가 필요하다. 이를 냉장고에서 저장하였다.

회수한 NBR_PTX = 6.88 g

실시예 16

림프구에 NBR의 도입

T 세포 및 주르카트 (Jurkat) 세포는 본 출원인에 의해 개발된 방법으로 나노입자가 도입가능하다. T 세포/주르카트 세포를 적합한 특정 배양 배지 (배지)에서 0.05%의 농도로 NP를 부하하였다. NP를 함유하는 배지를 형성하기 위하여, NP를 먼저 이어 특정 배양 배지를 분배하였다. 배지는 다음과 같이 구성된다:

·mRPMI 1640 배지, w 2.0 g/L NaHCO3 - w/o L-글루타민. (BIOCHROM) (코드: F1215)- 다음이 첨가된 500 mL:

· L-글루타민, 용액 200 mM (100×). (EUROCLONE) (코드: ECB 3000D)- 희석없이 5.5 mL

· 피루브산나트륨, 100 mM (100×). (Gibco) (코드: 11360-039)- 희석없이 5.5 mL

· MEM NEAA 최소필수배지 비필수 아미노산 (100×). (Gibco) (코드: 11140-035)- 희석없이 5.5 mL

· GENTOMIL (제타마이신) 80 mg/2 ml (AIC No^o 029314059)- 1 2 mL 바이알

· 2-머캅토에탄올. (Merck) (코드: 444203) - 5.5 mL 2-머캅토에탄올을 다음과 같이 사용: 99.963 mL 멸균 H2O 중 37 ㎕ 2-머캅토에탄올 (최종 부피 100 mL)

· 10% 소태아혈청 FBS: 적격 소태아혈청. (Sigma-Aldrich) (코드: F6178)

필요에 따라, 환자의 자가 혈청 또는 혈청 부재의 배지가 소태아혈청 대신 사용될 것이다.

Claims (17)

1. 다수의 자성 나노입자를 포함하는 구조물로서, 상기 자성 나노입자는 나노미터 자철석 입자로 이루어지고 입자의 표면이 카테콜로 관능화되며, 치료 작용을 갖는 분자가 임의로 분산되어 있는 생체적합성 폴리머 매트릭스내에 캡슐화된 구조물.
2. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 폴리머 매트릭스가 생분해성 코폴리머로 이루어진 구조물.
3. 제2항에 있어서, 상기 생분해성 코폴리머가 생분해성 나노미셀, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리카보네이트, 폴리(글루탐)산, 폴리에테르아민 및 폴리벤질글루타메이트로부터 선택되는 구조물.
4. 제3항에 있어서, 상기 생분해성 나노미셀이 하기 화학식 (I)를 가지는 폴리(락트-co-글리콜)산 및 폴리에틸렌 글리콜 카복실레이트 (PLGA-b-PEG-COOH)로 구성된 구조물:
   

   

   
   상기 식에서, m = [117-330]; n = [117-330]; p = [60-100]이다.
5. 제1항에 있어서, 치료 작용을 갖는 상기 분자가 항암제, 퍼옥시니트라이트 스캐빈저, 슈퍼옥시디스뮤타제 억제제, 레티노이드, 사이토카인, 아스피린으로부터 선택되는 구조물.
6. 제4항에 있어서, 미셀의 단편 PEG-COOH의 말단 카복실기가 세포 과발현에 의한 특이적 인식을 위한 단일클론 항체, 단백질, 펩티드 또는 관심 활성 분자로 추가로 관능화된 구조물.
7. 제6항에 있어서, 상기 항체가 hEGR, hEGFR, IgG, moAb로부터 선택되는 구조물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 금 나노로드를 추가로 포함하는 구조물.
9. - 유기 바인더로 코팅된 나노입자의 현탁액과 혼합된, 용매에 용해된 폴리머의 유기 용액 (모두 동일 용매 중), 및
   - Na₂HP0₄ 1 mM의 수용액
   을 배치 또는 연속 합성을 이용하여 혼합 셀에서 일정 유량으로 혼합하는 것인,
   제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 구조물의 제조방법.
10. 단편 PEG-COOH의 말단 카복실기가 아미노 말단기의 에스테르화에 의한 후속 공격을 촉진하도록 활성화되는, 제6항에 따른 구조물의 제조방법.
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 구조물을 함유하는 인간면역계 세포.
12. 제11항에 있어서, 다수의 금 나노로드를 추가로 포함하는 인간면역계 세포.
13. 제11항에 있어서, T-림프구, 단핵구, 대식세포, 수지상세포, 자연 살해 세포, B-림프구, 호중성 과립구, 호산성 과립구, 호염기성 과립구, 감마 델타 세포로부터 선택되는 인간면역계 세포.
14. 제12항에 있어서, T-림프구, 단핵구, 대식세포, 수지상세포, 자연 살해 세포, B-림프구, 호중성 과립구, 호산성 과립구, 호염기성 과립구, 감마 델타 세포로부터 선택되는 인간면역계 세포.
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