KR20190098064A - 생체적합성 자성 물질 - Google Patents

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유안-훙 슈
치아-웬 후앙
밍-쳉 웨이
치-렁 첸
시안-지 왕
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Abstract

산화철 나노입자 및 하나 이상의 생체적합성 중합체를 포함하는 생체적합성 자성 물질로서, 생체적합성 중합체 각각은 하기 화학식 (I)을 가지고, 산화철 나노입자에 공유결합으로 결합되며:
Figure pat00012

여기서, 변수 R, L, x, 및 y 각각은 본원에서 정의되고, 상기 생체적합성 자성 물질은 총 철 이온에 대하여 4-15% Fe(II) 이온을 포함한다. 또한, 상기 생체적합성 자성 물질의 제조방법이 개시된다.

Description

생체적합성 자성 물질{BIOCOMPATIBLE MAGNETIC MATERIALS}
산화철 나노입자는 그들의 화학적 안정성 및 적합한 자화로 인해 자기 공명 영상법(MRI: magnetic resonance imaging)을 위한 조영제로서 유용하다. 마그네타이트(Fe3O4) 및 마그헤마이트(γ-Fe2O3)는 초상자성 산화철 나노입자의 2가지 예이다.
이들 산화철 나노입자는 생체적합성 중합체와 접합되어 생체적합성 자성 물질, 예를 들어, MRI 조영제를 형성할 수 있다.
관용적으로, Fe3O4 자성 나노입자는 Fe(II) 및 Fe(III) 염의 혼합물을 사용함으로써 합성된다. 이론상, Fe3O4 자성 나노입자는 전체 철 이온에 대해 약 33%의 Fe(II) 이온을 함유한다. 이와는 상이하게, γ-Fe2O3 자성 나노입자는 0%의 Fe(II) 이온을 함유한다.
Fe3O4는 γ-Fe2O3보다 더 강한 T 2 단축 효과, 즉, 더 높은 이완율 r2를 제공한다. 예를 들어, 문헌[Basti et al., J Colloid Interface Sci., 2010, 341: 248-254]; 및 문헌[Li et al., Theranostics, 2013, 3(8): 595-615]을 참조한다. 반면에, Fe3O4 나노입자는 하이드록실 라디칼을 생성함에 있어서 γ-Fe2O3 나노입자보다 유의적으로 더 효과적이며, 결과적으로 임상 응용에서 Fe3O4는 γ-Fe2O3에 비교하여 더 높은 독성을 유도할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Park et al., Arch Toxicol.,　2014, 88(8):1607-1618]; 및 문헌[Wu et al., Journal of Food and Drug Analysis, 2014, 22, 86-94]을 참조한다.
높은 이완율 및 낮은 독성을 나타내는 새로운 생체적합성 자성 물질을 개발할 필요성이 있다.
본 발명은 높은 이완율 및 낮은 독성을 가진 MRI 조영제로 사용할 수 있는 소정의 생체적합성 자성 물질에 관한 것이다.
본 발명의 일 태양에서 본 발명은, 산화철 나노입자, 및 산화철 나노입자에 공유 결합된, 각각 하기 화학식 (I)을 갖는, 하나 이상의 생체적합성 중합체를 함유하는 생체적합성 자성 물질을 포함한다:
[화학식 I]
Figure pat00001
,
이 화학식에서, R은 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C10 사이클로알킬, C1-C10 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C10 카보닐 기, 또는 C1-C10 아민 기이고; L은 링커이며; x는 1 내지 10이고; y는 5 내지 1000이다.
특히, 생체적합성 자성 물질은 전체 철 이온에 대해 4-15%의 Fe(II) 이온을 각각 함유한다.
산화철 나노입자는 생체적합성 자성 물질에 함유된 것과 동일하거나 상이한 Fe(II) 함량을 나타낼 수 있다. 예시적인 산화철 나노입자는 전체 철 이온에 대해 4-15%(예를 들어, 4-10% 및 4-8%)의 Fe(II) 이온을 그 안에 함유한다.
상기 화학식 (I)을 참조하여, 링커 L은 O, S, Si, C1-C6 알킬렌, 2개의 카보닐 기 및 2-20개의 탄소 원자를 함유하는 카보닐 부분(moiety), 또는 하기 화학식 중 하나를 갖는 기일 수 있다:
Figure pat00002
상기 식에서, 각각의 m, n, p, q, 및 t는 독립적으로 1-6이고; W는 O, S, 또는 NRb이며; 각각의 L1, L3, L5, L7, 및 L9는 독립적으로 결합, O, S, 또는 NRc이고; 각각의 L2, L4, L6, L8, 및 L10은 독립적으로 결합, O, S, 또는 NRd이며; V는 ORe, SRf, 또는 NRgRh이고, 각각의 Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rg, 및 Rh는 독립적으로 H, OH, C1-C10 알킬, C1-C10 헤테로알킬, C3-C10 사이클로알킬, C1-C10 헤테로사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이다.
본 명세서에서 용어 "알킬"은 포화된 선형 또는 분지형 탄화수소 부분, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 및 헥실을 지칭한다. 용어 "알케닐"은 적어도 하나의 이중 결합을 함유하는 선형 또는 분지형 탄화수소 부분, 예컨대 -CH=CH-CH3 및 -CH=CH-CH2-를 지칭한다. 용어 "알키닐"은 적어도 하나의 삼중 결합을 함유하는 선형 또는 분지형 탄화수소 부분, 예컨대 -C≡C-CH3 및 -C≡C-CH2-를 지칭한다. 용어 "사이클로알킬"은 포화된 사이클릭 탄화수소 부분, 예컨대 사이클로헥실 및 사이클로헥실렌을 지칭한다. 용어 "헤테로사이클로알킬"은 N, O, P, B, S, Si, Sb, Al, Sn, As, Se, 및 Ge 중에서 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 포화된 사이클릭 탄화수소 부분, 예컨대 피페라지닐 및 피페리디닐을 지칭한다.
본 명세서에서 용어 "헤테로알킬"은 N, O, P, B, S, Si, Sb, Al, Sn, As, Se, 및 Ge 중에서 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 지방족 부분을 지칭한다. 헤테로알킬의 예는 메톡시메틸 및 메틸아미노에틸을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "아릴"은 C6 모노사이클릭, C10 비사이클릭, C14 트리사이클릭, C20 테트라사이클릭, 또는 C24 펜타사이클릭 방향족 환 시스템을 지칭한다. 아릴 기의 예는 페닐, 페닐렌, 나프틸, 나프틸렌, 안트라세닐, 안트라세닐렌, 피레닐, 및 피레닐렌을 포함한다. 본 명세서에서 용어 "헤테로아릴"은 하나 이상의 헤테로원자(예컨대 O, N, S, 또는 Se)를 가진 방향족 5-8 원 모노사이클릭, 8-12 원 비사이클릭, 11-14 원 트리사이클릭, 및 15-20 원 테트라사이클릭 환 시스템을 지칭한다. 헤테로아릴 기의 예는 푸릴, 푸릴렌, 플루오레닐, 플루오레닐렌, 피롤릴, 피롤릴렌, 티에닐, 티에닐렌, 옥사졸릴, 옥사졸릴렌, 이미다졸릴, 이미다졸릴렌, 벤즈이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴렌, 티아졸릴, 티아졸릴렌, 피리딜, 피리딜렌, 피리미디닐, 피리미디닐렌, 퀴나졸리닐, 퀴나졸리닐렌, 퀴놀리닐, 퀴놀리닐렌, 이소퀴놀릴, 이소퀴놀릴렌, 인돌릴, 및 인돌릴렌을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 언급된 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 헤테로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴은 치환된 부분 및 비치환된 부분 양자 모두를 포함한다. 사이클로알킬, 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐, 사이클로알케닐렌, 사이클로알키닐, 사이클로알키닐렌, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알케닐, 헤테로사이클로알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴 상의 가능한 치환체는 C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, C3-C20 사이클로알킬, C3-C20 사이클로알케닐, C3-C20 헤테로사이클로알킬, C3-C20 헤테로사이클로알케닐, C1-C10 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 아미노, C1-C10 알킬아미노, C2-C20 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, C1-C10 알킬설폰아미노, 아릴설폰아미노, C1-C10 알킬이미노, 아릴이미노, C1-C10 알킬설폰이미노, 아릴설폰이미노, 하이드록실, 할로, 티오, C1-C10 알킬티오, 아릴티오, C1-C10 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아실아미노, 아미노아실, 아미노티오아실, 아미도, 아미디노, 구아니딘, 우레이도, 티오우레이도, 시아노, 니트로, 니트로소, 아지도, 아실, 티오아실, 아실옥시, 카복실, 및 카복실산 에스테르를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 반면에, 지방족, 헤테로지방족, 옥시지방족, 알킬, 알킬렌, 알케닐, 알케닐렌, 알키닐, 및 알키닐렌 상의 가능한 치환체는 C1-C10 알킬을 제외한 상기 열거된 치환체 모두를 포함한다. 사이클로알킬, 사이클로알킬렌, 사이클로알케닐, 사이클로알케닐렌, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알케닐, 헤테로사이클로알케닐렌, 아릴, 및 헤테로아릴은 또한 서로 융합될 수 있다.
상기 기재된 생체적합성 자성 물질의 제조 방법이 본 발명에 추가로 포함된다.
본 방법은 4개의 단계를 포함한다: (i) 제1 유기 용매 중에 산화철 나노입자를 함유하는 제1 용액을 제공하며, 산화철 나노입자는 전체 철 이온에 대해 4-15%의 Fe(II) 이온을 함유하는 단계; (ii) 제2 유기 용매 중에 화학식 (I)의 생체적합성 중합체를 함유하는 제2 용액을 제공하는 단계; (iii) 제1 용액과 제2 용액을 혼합하여 혼합 용액을 제공하는 단계; 및 (iv) 혼합 용액에 물을 첨가하고 생성되는 용액을 적어도 20 시간 동안 교반하여 생체적합성 자성 물질을 수득하는 단계.
바람직하게, 산화철 나노입자는 불활성 기체 대기 하에 하이드록사이드 용액을, Fe(II) 염을 함유하는 철 용액과 혼합함으로써 형성된다.
하나 이상의 실시 형태의 상세 사항이 하기 상세한 설명에 기술되어 있다. 실시 형태의 다른 특징, 목적, 및 이점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 자명할 것이다.
산화철 나노입자, 및 산화철 나노입자에 공유 결합된 하나 이상의 생체적합성 중합체를 함유하는 생체적합성 자성 물질이 본 명세서에 상세하게 개시된다.
산화철 나노입자는 입자 크기가 1 내지 100 nm(예를 들어, 2 내지 50 nm 및 5 내지 25 nm)인 초상자성 코어일 수 있다. 초상자성 코어의 제조는 당업계에 주지되어 있다. 문헌[Laurent et al., Chem. Rev., 2008, 108, 2064-2110]을 참조한다.
산화철 나노입자는 전형적으로 유기산 또는 그의 염으로 형성된다. 유기산 또는 염의 예는 올레산 및 그의 염을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
중요하게, 산화철 나노입자는 바람직하게 전체 철 이온에 대해 4-15%의 Fe(II) 이온을 그 안에 함유한다. 예시적인 산화철 나노입자는 전체 철 이온에 대해 4-10% 또는 4-8%의 Fe(II) 이온을 함유한다. 산화철 나노입자 내의 Fe(II) 이온의 함량은 생체적합성 자성 물질이 높은 이완율 및 낮은 독성을 나타내기 위해 중요하다. 더욱 구체적으로, 낮은 Fe(II) 함량, 예를 들어, 전체 철 이온에 대해 4% 미만의 Fe(II) 이온은 전형적으로 낮은 이완율을 나타낸다. 반면에, 높은 Fe(II) 함량, 예를 들어, 전체 철 이온에 대해 15% 초과의 Fe(II) 이온은 높은 독성을 야기할 수 있다.
생체적합성 자성 물질은 또한 그의 생체적합성을 향상시키기 위해 하나 이상의 생체적합성 중합체를 함유한다. 각각의 생체적합성 중합체는 하기 화학식 (I)을 갖는다:
[화학식 I]
Figure pat00003
,
상기 식에서, 변수 R, L, x, 및 y는 요약 섹션에 정의되어 있다.
일 실시 형태에서, 산화철 나노입자는 각각 하기 화학식을 갖는 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유 결합된다:
Figure pat00004
,
상기 식에서, R1은 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C10 사이클로알킬, C1-C10 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C10 카보닐 기, 또는 C1-C10 아민 기이고; R2는 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C10 사이클로알킬, C1-C10 헤테로사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이며; x는 1 내지 10이고; y는 5 내지 1000이다.
바람직하게, R1은 C1-C6 알킬, C1-C10 카보닐 기, 또는 C1-C10 아민 기이고, R2는 H 또는 C1-C6 알킬이다. 예를 들어, R1은 메틸(-CH3), 카복실(-COOH), 또는 아미노(-NH2)이고, R2는 H이다.
R1이 카복실(-COOH) 또는 아미노(-NH2)인 경우, 카복실-종결 또는 아민-종결 생체적합성 중합체는 생물학적 분자, 예를 들어, 엽산과 커플링될 수 있다. 예를 들어, 엽산은 -CONH- 연결부를 형성함으로써 아민-종결 생체적합성 중합체와의 커플링을 가능하게 한다.
본 발명의 생체적합성 자성 물질은 생물학적 응용을 위해 특이적 표적화제(targeting agent)에 커플링될 수 있다. 특이적 표적화제의 예는 항체, 단백질, 펩티드, 효소, 탄수화물, 당단백질, 뉴클레오티드, 및 지질을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 예시적인 생체적합성 자성 물질에서, R1은 항체(예를 들어, My10)에 커플링된다.
상기 기재된 생체적합성 자성 물질의 제조 방법 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
다시, 본 방법은 하기 단계를 포함한다: 제1 유기 용매 중에 산화철 나노입자를 함유하는 제1 용액을 제공하며, 여기에서 산화철 나노입자는 전체 철 이온에 대해 4-15%의 Fe(II) 이온을 함유하는 단계; 제2 유기 용매 중에 화학식 (I)의 생체적합성 중합체를 함유하는 제2 용액을 제공하는 단계; 제1 용액과 제2 용액을 혼합하여 혼합 용액을 제공하는 단계; 및 혼합 용액에 물을 첨가하고 생성되는 용액을 적어도 20 시간 동안 교반하여 생체적합성 자성 물질을 수득하는 단계.
본 방법에 사용되는 산화철 나노입자는 전형적으로 불활성 기체 대기 하에 하이드록사이드 용액을, Fe(II) 염을 함유하는 철 용액과 혼합함으로써 형성된다.
예시적인 철 용액은 Fe(II) 염(예를 들어, FeCl2) 및 Fe(III) 염(예를 들어, FeCl3)을 함유하며, 여기에서 Fe(III)/Fe(II)의 몰 비는 1.70 이상(예를 들어, 1.75 이상, 1.80 이상, 및 1.90 이상)이다.
하이드록사이드 용액은 농도가 2 N 이하(예를 들어, 1.5 N 이하 및 1 N 이하)인 소듐 하이드록사이드 용액일 수 있다.
불활성 기체의 예는 질소 및 아르곤을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
반복하면, 산화철 나노입자는 유기산 또는 그의 염으로 형성될 수 있다. 예시적인 유기산 또는 염은 올레산 또는 그의 염이다. 올레산을 사용하는 경우, 그것은 철 1 몰 당 100 mL 이하(예를 들어, 90 mL 이하, 70 mL 이하, 및 50 mL 이하)의 양으로 존재할 수 있다.
일례에서, 산화철 나노입자는 FeCl2 및 FeCl3을 함유하는 철 용액 및 올레산으로부터 형성되어 산화철-올레산 나노입자 또는 IO-OA를 제공한다. 이러한 예시적인 산화철 나노입자는 하기와 같이 제조될 수 있다: 용매(예를 들어, 물) 중에 FeCl2와 FeCl3을 혼합하는 단계, 질소 하에 소듐 하이드록사이드 용액(예를 들어, 1 N)을 상기 혼합물에 첨가하는 단계, 및 그렇게 얻어진 용액을 올레산으로 처리하여 IO-OA 나노입자를 형성하는 단계.
산화철 나노입자는, 유기산 또는 그의 염으로 처리한 후에, 물을 제거하는 단계, 그것을 톨루엔에 용해시키는 단계, 및 그렇게 얻어진 액체를 원심분리하여 소정의 대형 입자를 제거하는 단계에 의해 바람직하게 수집된다.
본 방법에서 사용되는 생체적합성 중합체로 돌아가서, 그들은 중합체 자체 뿐 아니라, 적용가능한 경우에 그들의 염 및 용매화물을 포함한다. 예를 들어, 중합체 상의 양성 하전된 기(예를 들어, 아미노)와 음이온 사이에 염이 형성될 수 있다. 적합한 음이온은 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 설페이트, 니트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 메탄설포네이트, 트리플루오로아세테이트, 아세테이트, 말레이트, 토실레이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루타메이트, 글루쿠로네이트, 락테이트, 글루타레이트, 및 말레에이트를 포함한다. 마찬가지로, 중합체 상의 음성 하전된 기(예를 들어, 카복실레이트)와 양이온 사이에 또한 염이 형성될 수 있다. 적합한 양이온은 소듐 이온, 포타슘 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 및 암모늄 양이온, 예컨대 테트라메틸암모늄 이온을 포함한다. 중합체는 또한 4차 질소 원자를 함유하는 염을 포함한다. 용매화물은 중합체와 약제학적으로 허용되는 용매 사이에 형성된 복합체를 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 용매의 예는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 아세테이트, 아세트산, 및 에탄올아민을 포함한다.
하기 반응식 (I)은 예시적인 실란-함유 생체적합성 중합체의 제조 공정을 나타낸다.
[반응식 I]
Figure pat00005
상기 반응식에 나타낸 바와 같이, 염기(예를 들어, 디메틸아미노피리딘)의 존재 하에 알콕실-폴리에틸렌 글리콜(분자량 2000)이 석신산 무수물과 반응하여 mPEG-COOH를 형성하며, 이어서 티오닐 클로라이드를 사용하여 이를 mPEG-COCl로 전환한다. mPEG-COCl을 (3-아미노프로필)-트리에톡시실란과 혼합하여 mPEG-실란을 수득한다.
당업자는 주지의 방법을 사용하여 생체적합성 중합체를 제조하기 위한 반응식 (I)에 나타낸 공정을 개질할 수 있다. 문헌[R. Larock, Comprehensive Organic Transformations(VCH Publishers 1989)]; 문헌[T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (3rd Ed., John Wiley and Sons 1999)]; 문헌[L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis (John Wiley and Sons 1994)]; 및 문헌[L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis (John Wiley and Sons 1995)], 및 그의 후속판을 참조한다. 생체적합성 중합체를 합성하기 위해 사용할 수 있는 특이적 경로는 하기에서 확인할 수 있다: (a) 문헌[Rist et al., Molecules 2005, 10, 1169-1178], (b) 문헌[Koheler et al., JACS, 2004, 126, 7206-7211]; 및 (c) 문헌[Zhang et al., Biom mircod 2004, 6:1 33-40].
생체적합성 자성 물질의 제조 방법을 수행하기 위해, 상기 기재된 산화철 나노입자를 함유하는 제1 용액을 제1 유기 용매 중에 형성하고, 상기 기재된 생체적합성 중합체를 함유하는 제2 용액을 제2 유기 용매 중에 제공한다.
제1 유기 용매 및 제2 유기 용매 각각은 독립적으로, 톨루엔, 지방족 탄화수소, 테트라하이드로푸란, 케톤, 알코올, 알킬 에스테르, 또는 그의 조합일 수 있다. 바람직하게, 양자 모두의 유기 용매는 톨루엔이다.
제1 용액과 제2 용액을 혼합하여 혼합 용액을 제공함에 있어서, 생체적합성 자성 물질을 제공하기 위해 혼합 용액에 물을 촉매로서 첨가하고 생성되는 용액을 적어도 20 시간 동안 교반하는 단계를 수행하는 것이 중요하다.
상기 기재된 바와 같이, 본 방법에 사용되는 산화철 나노입자는 전체 철 이온에 대해 4-15%의 Fe(II) 이온을 그 안에 함유한다. 본 방법을 수행한 후에, 그렇게 얻어진 생체적합성 자성 물질은 전형적으로 전체 철 이온에 대해 4-15%의 Fe(II) 이온을 함유한다.
상기 반응식 (I)에서 합성된 생체적합성 중합체는, 그것이 산화철 나노입자의 표면을 화학적으로 개질하여 생체적합성을 증가시킬 수 있다는 점에서 유용하다. 부가적으로, 생체적합성 중합체는, 그것이 입자(예를 들어, 나노입자, 자성 입자, 자성 나노입자, 및 초상자성 입자)를 표지하여 입자가 하나 이상의 표적화제, 형광제, 치료제, 또는 진단제에 대해 추가로 반응성이 되게 할 수 있다는 점에서 유용하다.
표적화제는 바람직하게 공유 결합을 통해 생체적합성 중합체에 커플링된다. 통상적으로 사용되는 표적화제는 항체, 단백질, 펩티드, 효소, 탄수화물, 당단백질, 뉴클레오티드, 및 지질을 포함한다. 표적화제와 커플링된 후에 생체적합성 자성 물질은 직경이 약 3-500 nm일 수 있다. 당업자는 임의의 적합한 표적화제를 나노입자 상에 부착하여 이에 특이성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 엽산을 사용하여 엽산염 수용체(folate receptor)를 가진 유방암 세포를 특이화(specify)할 수 있다. 엽산의 구조는 아민-종결 또는 카복시-종결 생체적합성 중합체와의 커플링을 가능하게 한다. 예를 들어, 엽산은 -CONH- 연결부를 형성함으로써 아민-종결 생체적합성 중합체와의 커플링을 가능하게 한다.
추가의 상술 없이, 본 명세서의 상세한 설명에 기초하여, 당업자는 본 실시 형태를 최대한으로 이용할 수 있을 것으로 생각된다. 이어지는 하기 특이적 실시예는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떠한 방식으로도 개시내용의 나머지를 제한하지 않는다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물은 원용에 의해 본 명세서에 전체적으로 포함된다.
실시예 1: 생체적합성 자성 물질의 제조
하기 기재된 절차에 따라 2개의 생체적합성 자성 물질을 제조하였다.
산화철-올레산( IO - OA ) 나노입자의 제조
100 L 유리 반응기 내에서 FeCl2·4H2O(900 g; 4.53 몰), FeCl3·4H2O(1327 g; 8.18 몰), 및 물(23.6 L)의 혼합물을 25 ℃에서 150-200 rpm으로 교반하였다. 질소 하에 반응기에 소듐 하이드록사이드 용액(1 N)을 0.2-0.3 kg/min의 속도로 첨가하여, 11-12의 pH 값을 유발하였다. 이어서, 올레산(800 mL; 철 1 몰 당 63 mL)을 첨가하고 생성되는 혼합물을 부가적인 60 분 동안 교반함으로써, IO-OA 나노입자를 수용액 중의 어두운 색의 페이스트로서 형성하였다. 염산(3 N)으로 물 용액의 pH를 1 내지 2의 pH 값으로 조정한 후에 물을 제거하였다. 이어서 잔류하는 어두운 색의 페이스트에 12 L의 톨루엔을 첨가하여 미정제 IO-OA 나노입자를 톨루엔 용액에 현탁시켰다. 톨루엔 중의 미정제 IO-OA 나노입자를 6000 rpm으로 15 분 동안 원심분리하여 톨루엔 중의 IO-OA 나노입자를 얻었다.
생체적합성 중합체 mPEG- 실란 -750 및 mPEG- 실란 -2000의 제조
생체적합성 중합체 mPEG-실란-750은 하기와 같이 제조하였다. 1000-mL 둥근 바닥 플라스크 내에서 300 g(0.4 몰)의 메톡시-PEG(mPEG, 분자량 750), 석신산 무수물(48 g; 0.48 몰), 및 4-디메틸아미노-피리딘(DMAP; 19.5 g; 0.159 몰)의 혼합물을 진공(20 토르) 하에 2 시간 동안 정치시켰다. 혼합물에 600 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 이를 30 ℃에서 1 일 동안 교반하여 mPEG-COOH를 형성하였다. 이어서, 36 mL(0.48 몰)의 티오닐 클로라이드를 1 mL/min의 속도로 첨가하고 혼합물을 2-3 시간 동안 교반하였다. 그 후에, 333.8 mL(2.4 몰)의 트리에틸아민을 1 mL/min의 속도로 첨가하여 6-7 부근의 pH를 얻었다. 실온으로 냉각시킨 후, mPEG-COCl을 함유하는 혼합물을 실온에서 적어도 8 시간 동안 94.5 mL(0.4 몰)의 3-아미노프로필 트리에톡시실란과 반응시켜 미정제 mPEG-실란-750을 수득하였다. 반응 혼합물에 9 L의 이소프로필 에테르를 첨가한 후에 미정제 mPEG-실란-750을 침전시켰다. 여과에 의해 고체 산물을 수집하고, 500 mL의 톨루엔에 재용해시키고, 5000 rpm으로 5 분 동안 원심분리하여 상청액을 수집하고, 여기에 9 L의 이소프로필 에테르를 첨가하였다. 이소프로필 에테르로부터 갈색의 오일성 액체를 분리하고 진공 하에 건조시켜 생체적합성 중합체 mPEG-실란-750을 얻었다.
생체적합성 중합체 mPEG-실란-2000은 하기와 같이 제조하였다. 딘-스타크 트랩(Dean-Stark Trap)이 장착된 20 L 반응 용기에 메톡시-PEG(mPEG, 분자량 2000)(3 kg)를 첨가하였다. 반응 용기에 15 L의 톨루엔을 첨가하고 기계식 교반기로 반응 혼합물을 150 ± 20 rpm으로 교반하였다. 반응은 120 ℃에서 수행하였으며 60 분 동안 환류시켰다. 이어서 반응 용기에 석신산 무수물(SA, 180 g) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP, 70 g)을 첨가하고 65 ℃에서 20 시간 동안 반응을 계속하여 mPEG-COOH를 형성하였다. 이어서, 반응 용기에 170 g의 티오닐 클로라이드(SOCl2)를 첨가하고, 반응 혼합물 위에 N2 기체 블랭킷을 사용하여 3 시간 동안 반응을 계속하였다. 그 후에, 반응 용기에 트리에틸아민(TEA, 436 g)을 첨가하고 250 rpm으로 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후에, mPEG-COCl을 함유하는 혼합물을 실온에서 적어도 8 시간 동안 300 g의 3-아미노프로필 트리에톡시실란과 반응시켜 미정제 mPEG-실란-2000을 수득하였다. 이어서, 그렇게 얻어진 미정제 재료를 여과하여 염을 제거하고 투명한 갈색 용액을 mPEG-실란-2000으로서 제공하였다.
생체적합성 중합체 COOH -PEG- 실란 -750 및 COOH -PEG- 실란 -2000의 제조
300 g(0.4 몰)의 PEG(분자량: 750) 및 600 mL의 N-메틸-2-피롤리돈을 1000 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고 진공(20 토르) 하에 2 시간 초과 동안 60 ℃로 가열하였다. 88 g(0.88 몰)의 석신산 무수물 및 19.5 g(0.16 몰)의 4-디메틸아미노-피리딘(DMAP)을 첨가하고 30 ℃에서 2 일 동안 반응시킴으로써, 디카복시-종결 PEG(COOH-PEG)를 얻었다.
36 ml(0.48 몰)의 티오닐 클로라이드를 1 mL/min의 속도로 첨가하고 2-3 시간 동안 교반하였다. 이어서, 133.8 mL(0.96 몰)의 트리에틸아민을 1 mL/min의 속도로 첨가하였다. 이어서 94.5 mL (0.4 몰)의 3-아미노프로필 트리에톡시실란을 적어도 12 시간 동안 반응에 첨가하였다. 재침전을 위해 9 L의 차가운 이소프로필 에테르에 반응 혼합물을 첨가하고, 생성되는 침전을 수집하고, 100 mL의 디클로로메탄에 재용해시켰다. 그렇게 얻어진 혼합물을 재침전을 위해 다시 9 L의 차가운 이소프로필 에테르에 첨가하였다. 미색 침전을 수집하고 진공 하에 2 일 동안 건조시킴으로써 생체적합성 중합체, 즉, COOH-PEG-실란-750을 얻었다.
생체적합성 중합체 COOH-mPEG-실란-2000은 800 g(0.4 몰)의 PEG(PEG, 분자량 2000), 석신산 무수물(88 g; 0.88 몰), 및 4-디메틸아미노-피리딘(DMAP; 19.5 g; 0.16 몰)의 혼합물을 사용하여 상기 기재된 동일한 절차에 따라 제조하였다.
mPEG- 실란 -2000을 가진 생체적합성 자성 물질의 제조
하기와 같이 톨루엔 중에 mPEG-실란-2000을 산화철 나노입자, 즉, IO-OA 나노입자와 접합시킴으로써 생체적합성 자성 물질을 제조하였다.
2 L 둥근 바닥 플라스크 내에서 IO-OA 나노입자의 톨루엔 용액(6 mg Fe/mL, 700 mL)과 mPEG-실란-2000의 톨루엔 용액(160 mg/mL, 500 mL)을 혼합하고 생성되는 용액에 물을 첨가하였다. 24 시간의 반응 후에, mPEG-실란-2000 접합 산화철 나노입자를 물로 추출하고, 대형 입자를 제거하기 위해 여과하여 투명한 수용액을 제공하였다. 생성되는 수용액을 한외 여과 장치로 정제하고 농축하여 IO-OA/mPEG-실란-2000으로서 표지된 생체적합성 자성 물질을 얻었다.
COOH -PEG- 실란 -2000을 가진 생체적합성 자성 물질의 제조
10 g Fe의 IO-OA 나노입자를 함유하는 1-1.2 L의 톨루엔 용액에 250 g의 COOH-mPEG-실란-2000을 첨가하였다. 생성되는 혼합물을 2-3 시간 동안 초음파처리하였다. 1.5 L의 탈이온수를 첨가한 후, 한외 여과 장치에 의해 혼합물을 정제하고 100 mL로 농축하여 IO-OA/COOH-PEG-실란-2000으로 표지된 생체적합성 자성 물질을 얻었다.
실시예 2: 산화철 나노입자 및 생체적합성 자성 물질의 특성화
실시예 1에서 제조된 생체적합성 자성 물질 뿐 아니라 소정의 산화철 나노입자를 특성화하기 위해 하기와 같이 연구를 수행하였다.
Fe(II) 이온 결정
철 시험 키트(Spectroquant 1.00796.0001, Merck)에 의해 산화철 나노입자 및 생체적합성 자성 물질의 Fe(II)/Fe(III) 이온비를 측정하였다. 시험 키트 내의 시약, 즉, 1,10-페난트롤린은 Fe(II) 이온에 대해서는 감수성이지만 Fe(III) 이온에 대해서는 그렇지 않다. 완충 매질에서, Fe(II) 이온은 1,10-페난트롤린과 반응하여 적색 착물을 형성하였으며, 이를 광도계로 결정하였다. 먼저 황산을 첨가함으로써 시험 산화철 나노입자 또는 생체적합성 자성 물질을 철 이온으로 분해하고 생성되는 용액의 pH를 0.8 M NaHCO3를 사용하여 2 내지 8로 조정하였다. 그 과정 중에 Fe(II) 이온은 Fe(III) 이온으로 전환되지 않았음이 관찰되었다. 아스코르브산의 첨가 없이, Fe(II) 이온 만의 함량이 측정되었다. 아스코르브산을 첨가하여 모든 철 이온을 Fe(II) 이온으로 전환하는 단계에 의해 전체 철 이온이 추가로 측정되었다. Fe(II) 이온의 함량은 전체 철 이온에 대해 약 4-15%인 것으로 결정되었다. 상세한 결과는 하기 표 1에 나타낸다. 이 표는 또한 상업적 제제인 Feraheme에 대한 1.26%의 Fe(II) 함량을 포함함에 유의한다.
Fe(II) 함량의 측정
시험 샘플 Fe (II) %
IO-OA(회분 1) 4.32
IO-OA(회분 2) 5.78
IO-OA(회분 3) 4.19
IO-OA(회분 4) 10.88
IO-OA(회분 5) 6.84
IO-OA(회분 6) 8.55
IO-OA(회분 7) 6.53
IO-OA(회분 8) 9.64
IO-OA/mPEG-실란-2000(회분 1) 5.90
IO-OA/mPEG-실란-2000(회분 2) 6.29
IO-OA/mPEG-실란-2000(회분 3) 7.35
IO-OA/mPEG-실란-2000(회분 4) 8.44
IO-OA/mPEG-실란-2000(회분 5) 6.87
Feraheme 1.26
이들 결과는 본 발명의 생체적합성 자성 물질이 Feraheme에 비교하여 의외로 훨씬 더 높은 Fe(II) 함량을 나타냈음을 시사한다.
X-ray 분말 회절(XRPD)
소정의 산화철 나노입자 및 생체적합성 자성 물질의 구조를 하기와 같이 XRPD에 의해 조사하였다.
시험 샘플을 건조시켜 XRPD 측정을 위한 분말 형태를 제공하였다. 하기 도면, 즉, 도 1 및 도 2는 IO-OA(회분 4) 및 IO-OA/mPEG-실란-2000(회분 2)에 대한 XRPD 패턴을 나타낸다.
[도 1] IO-OA(회분 4)의 XRPD 패턴
Figure pat00006
[도 2] IO-OA/mPEG-실란-2000(회분 2)의 XRPD 패턴
Figure pat00007
XRPD에서 γ-Fe2O3과 Fe3O4 사이의 차이를 식별할 수 없으므로, 이들 도면은 IO-OA(회분 4) 및 IO-OA/mPEG-실란-2000(회분 2)의 결정 구조가 Fe3O4, γ-Fe2O3, 또는 Fe3O4와 γ-Fe2O3의 혼합물일 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: 이완율 측정
실시예 1에서 제조된 생체적합성 자성 물질의 이완율 뿐 아니라 Feraheme에 대한 이완율을 측정하기 위해 하기와 같이 연구를 수행하였다.
산화철 용액을 다양한 농도(0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 및 0.5 mM)로 제조하였다. Bruker Corporation으로부터의 Minispec mq 20에 의해 각각의 용액의 T2 이완 시간을 측정하였다. 세로축으로서의 이완 시간의 역수와 가로축으로서의 용액의 농도 사이에 선형 관계가 확립되었다. 선형 관계의 기울기가 r2 이완율로서 결정되었다. 결과는 하기 표 2에 나타낸다.
r2 이완율의 측정
시험 샘플 r2 이완율(mM·s)-1
IO-OA/mPEG-실란-2000(회분 2) 173
Feraheme 69
의외로, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 전체 철에 대해 6.29%의 Fe(II) 이온을 함유하는 IO-OA/mPEG-실란-2000(회분 2)은 173(mM·s)-1의 r2 이완율 값을 나타냈다. 극명하게 대조적으로, 전체 철에 대해 1.26%의 Fe(II) 이온을 함유하는 Feraheme은 69(mM·s)-1의 r2 이완율 값을 나타냈다.
이들 결과는 본 발명의 생체적합성 자성 물질이 Feraheme에 비교하여 의외로 훨씬 더 높은 r2 이완율을 나타냈음을 시사한다.
실시예 4: 특이적 표적화제와의 커플링
본 발명의 생체적합성 자성 물질과 특이적 표적화제의 커플링을 위한 프로토콜이 하기 기재되었다.
엽산염과의 커플링
226 ㎕의 엽산염 용액(엽산염/디메틸 설폭사이드: 10 mg/mL)을 50 mL 갈색 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 5 mL의 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 176.5 ㎕의 디사이클로헥실 카보디이미드 용액(디사이클로헥실 카보디이미드/DMSO: 5 mg/mL)을 용액에 첨가하고 1 시간 동안 교반하였다. 그 후에, 98.5 ㎕의 NHS 용액(N-하이드록시석신이미드/DMSO: 5 mg/mL)을 첨가하고 부가적인 1 시간 동안 교반하였다. 이어서 289 ㎕의 에틸렌디아민을 첨가하여 용액 A를 제공하였다.
1 mL의 IO-OA/COOH-PEG-실란-2000(4.48 mg Fe/mL) 및 10 ml의 DMSO를 진공 하에 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 176.5 ㎕의 디사이클로헥실 카보디이미드 용액(디사이클로헥실 카보디이미드/DMSO: 5 mg/mL)을 용액에 첨가하고 1 시간 동안 교반하였다. 그 후에, 98.5 ㎕의 NHS 용액(N-하이드록시석신이미드/DMSO: 5 mg/mL)을 첨가하고 부가적인 1 시간 동안 교반하여 용액 B를 제공하였다.
289 ㎕의 용액 A를 용액 B에 첨가하고 생성되는 용액을 8 시간 동안 교반하였다. 생성되는 용액을 투석막(Mw: 3000)에 첨가하고 투석에 증류수를 사용하였다. 이어서, 생성되는 용액을 한외 여과 장치에 의해 2 mL로 농축하여 표적화제와 커플링된 생체적합성 자성 물질, 즉, 엽산염-접합 IO-OA/COOH-PEG-실란-2000을 얻었다.
항체와의 커플링
IO-OA/COOH-PEG-실란-2000(4.48 mg Fe/mL)을 5 mL의 차가운 탈이온수와 혼합하고 얼음조 상에 유지하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(10-6 몰)를 용액에 첨가하고 30 분 동안 교반하였다. 이어서 N-하이드록시석신이미드(10-6 몰)를 혼합물에 첨가하고 추가의 30 분 동안 교반하였다. 생성되는 혼합물에 항체 My10(1 mL, 2 ㎍/mL)을 첨가하고 2 시간 동안 반응시켰다. 그렇게 얻어진 용액을 자성 분류 장치(magnetic sorting device)에 통과시킴으로써 정제하여 항체와 커플링된 생체적합성 자성 물질, 즉, My10-접합 IO-OA/COOH-PEG-실란-2000을 얻었다.
기타 실시 형태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 균등하거나 유사한 목적에 도움이 되는 대안적인 특징에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 단지 포괄적인 일련의 균등하거나 유사한 특징의 예이다.
상기 상세한 설명으로부터, 당업자는 기재된 실시 형태의 본질적 특성을 용이하게 확인할 수 있으며, 그의 사상 및 범위로부터 이탈하지 않으면서, 다양한 용법 및 조건에 그것을 적응시키기 위해 실시 형태의 다양한 변화 및 개질을 실행할 수 있다. 따라서, 다른 실시 형태 또한 청구범위 내에 있다. 개시된 실시 형태에 다양한 개질 및 변동이 실행될 수 있다는 것은, 당업자에게 자명할 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되고, 개시내용의 진정한 범위는 하기 청구범위 및 그들의 균등물에 의해 지시되도록 의도된다.

Claims (21)

  1. 산화철 나노입자; 및
    산화철 나노입자에 공유 결합된, 각각 하기 화학식 (I)을 갖는, 하나 이상의 생체적합성 중합체를 포함하며, 전체 철 이온에 대해 4-15%의 Fe(II) 이온을 함유하는 생체적합성 자성 물질:
    [화학식 I]
    Figure pat00008
    ,
    상기 식에서,
    R은 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C10 사이클로알킬, C1-C10 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C10 카보닐 기, 또는 C1-C10 아민 기이고;
    L은 링커이며;
    x는 1 내지 10이고;
    y는 5 내지 1000이다.
  2. 제1항에 있어서,
    산화철 나노입자가 전체 철 이온에 대해 4-15%의 Fe(II) 이온을 함유하는 생체적합성 자성 물질.
  3. 제2항에 있어서,
    산화철 나노입자가 전체 철 이온에 대해 4-10%의 Fe(II) 이온을 함유하는 생체적합성 자성 물질.
  4. 제1항에 있어서,
    전체 철 이온에 대해 4-10%의 Fe(II) 이온을 함유하는 생체적합성 자성 물질.
  5. 제1항에 있어서,
    산화철 나노입자가 유기산 또는 그의 염으로 형성되는 생체적합성 자성 물질.
  6. 제5항에 있어서,
    유기산 또는 염이 올레산 또는 그의 염인 생체적합성 자성 물질.
  7. 제1항에 있어서,
    링커가 O, S, Si, C1-C6 알킬렌, 2개의 카보닐 기 및 2-20개의 탄소 원자를 함유하는 카보닐 부분(moiety), 또는 하기 화학식 중 하나를 갖는 기인 생체적합성 자성 물질:
    Figure pat00009

    상기 식에서, 각각의 m, n, p, q, 및 t는 독립적으로 1-6이고; W는 O, S, 또는 NRb이며; 각각의 L1, L3, L5, L7, 및 L9는 독립적으로 결합, O, S, 또는 NRc이고; 각각의 L2, L4, L6, L8, 및 L10은 독립적으로 결합, O, S, 또는 NRd이며; V는 ORe, SRf, 또는 NRgRh이고, 각각의 Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rg, 및 Rh는 독립적으로 H, OH, C1-C10 알킬, C1-C10 헤테로알킬, C3-C10 사이클로알킬, C1-C10 헤테로사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이다.
  8. 제1항에 있어서,
    산화철 나노입자가 각각 하기 화학식을 갖는 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유 결합되는 생체적합성 자성 물질:
    Figure pat00010
    ,
    상기 식에서,
    R1은 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C10 사이클로알킬, C1-C10 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, C1-C10 카보닐 기, 또는 C1-C10 아민 기이고;
    R2는 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C10 사이클로알킬, C1-C10 헤테로사이클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이며;
    x는 1 내지 10이고;
    y는 5 내지 1000이다.
  9. 제8항에 있어서,
    R1이 C1-C6 알킬, C1-C10 카보닐 기, 또는 C1-C10 아민 기이고, 및 R2가 H 또는 C1-C6 알킬인 생체적합성 자성 물질.
  10. 제9항에 있어서,
    R1이 메틸, 카복실, 또는 아미노이고, 및 R2가 H인 생체적합성 자성 물질.
  11. 제8항에 있어서,
    R1이 항체, 단백질, 펩티드, 효소, 탄수화물, 당단백질, 뉴클레오티드, 및 지질로 구성된 그룹 중에서 선택된 특이적 표적화제(targeting agent)에 커플링되는 생체적합성 자성 물질.
  12. 제11항에 있어서,
    특이적 표적화제가 항체인 생체적합성 자성 물질.
  13. 제1항에 있어서,
    전체 철 이온에 대해 4-15%의 Fe(II) 이온을 함유하는 산화철 나노입자가 올레산 또는 그의 염으로 형성되는 생체적합성 자성 물질.
  14. 제1항에 있어서,
    전체 철 이온에 대해 4-15%의 Fe(II) 이온을 함유하는 산화철 나노입자가 각각 하기 화학식을 갖는 하나 이상의 생체적합성 중합체에 공유 결합되는 생체적합성 자성 물질:
    Figure pat00011
    ,
    상기 식에서,
    R1은 메틸 또는 카복실이고, R2는 H이며, x는 1 내지 10이고, y는 5 내지 1000이다.
  15. 제1 유기 용매 중에 산화철 나노입자를 함유하는 제1 용액을 제공하며, 산화철 나노입자는 전체 철 이온에 대해 4-15%의 Fe(II) 이온을 함유하는 단계;
    제2 유기 용매 중에 화학식 (I)의 생체적합성 중합체를 함유하는 제2 용액을 제공하는 단계;
    제1 용액과 제2 용액을 혼합하여 혼합 용액을 제공하는 단계; 및
    혼합 용액에 물을 첨가하고 생성되는 용액을 적어도 20 시간 동안 교반하여 생체적합성 자성 물질을 수득하는 단계를 포함하는, 제1항의 생체적합성 자성 물질의 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    산화철 나노입자가 불활성 기체 대기 하에 하이드록사이드 용액을, Fe(II) 염을 함유하는 철 용액과 혼합함으로써 형성되는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    철 용액이 Fe(II) 염 및 Fe(III) 염을 함유하며, 여기에서 Fe(III)/Fe(II)의 몰 비는 1.70 이상인 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    산화철 나노입자가 올레산 또는 그의 염으로 형성되는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    산화철 나노입자가 철 1 몰 당 100 mL 이하의 양으로 존재하는 올레산으로 형성되는 방법.
  20. 제15항에 있어서,
    제1 유기 용매 및 제2 유기 용매 각각이 독립적으로, 톨루엔, 지방족 탄화수소, 테트라하이드로푸란, 케톤, 알코올, 알킬 에스테르, 또는 그의 조합인 방법.
  21. 제15항에 있어서,
    불활성 기체가 질소 또는 아르곤인 방법.
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