KR100670948B1 - 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 공유결합된 탄수화물다량체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 1 개 이상의 탄수화물 유도체가 하기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체 단일 분자의 A1 또는 A2와 공유결합하여 형성되는, 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 공유결합된 탄수화물 다량체, 그 탄수화물 다량체를 단백질 억제제 및 약물 전달체로서 사용하기 위한 용도, 그리고 탄수화물칩 및 단백질칩의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, A1, A2, 및 n은 명세서에서 정의된 바와 같다.
Description
도 1은 쿠커비투릴 유도체에 공유결합된 갈락토오스 다량체 및 독소루비신을 포함하는 약물 복합체의 쥐의 간암세포 RLC-16에 대한 표적 지향성을 실험한 결과를 나타내는 형광 현미경 사진이다.
도 2는 쿠커비투릴 유도체에 공유결합된 글루코오스 다량체 및 독소루비신을 포함하는 약물 복합체의 쥐의 간암세포 RLC-16에 대한 표적 지향성을 실험한 결과를 나타내는 형광 현미경 사진이다.
본 발명은 다수의 탄수화물 분자가 거대 고리 분자에 공유결합된 탄수화물 다량체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 하나 이상의 탄수화물 유도체가 공유결합된 탄수화물 다량체에 관한 것이다.
세포표면의 탄수화물은 효소, 항체 그리고 렉틴과 같은 단백질과 상호 작용함으로써 발생, 분화, 면역 등 다양한 생물학적인 반응을 개시한다. 뿐만 아니라, 독성 물질, 박테리아, 바이러스 등의 감염 과정도 탄수화물과 단백질의 상호작용에 의해 일어난다. 이와 같이, 세포 표면의 탄수화물은 생물학적인 특이적 인지 과정에서 중요한 매개체로 작용한다.
탄수화물과 단백질간의 상호작용은 매우 특이적인 것으로 알려져 있으나, 이러한 탄수화물과 단백질간의 일대일 결합력은 매우 낮다(Kd =10-3~10-6 M). 이러한 낮은 결합력을 보상하기 위하여, 자연계는 리간드와 그들의 수용체를 다량으로 복제하여 리간드와 수용체가 밀집된 상태에서 협력적으로 강하게 결합할 수 있도록 하였다. 이것을 소위 다가 효과라 부른다. 이러한 자연계의 다가 효과를 모방하여 다수의 탄수화물이 공유적으로 결합된 탄수화물 다량체들의 합성에 관한 연구가 이루어져 왔다. 탄수화물 중합체와 소중합체, 탄수화물 덴드리머, 탄수화물 계면활성제 집합체, 탄수화물 금속 복합체 등 다양한 탄수화물 다량체가 합성되었다.
탄수화물 다량체를 치료학 분야에 응용하는 방법 중의 하나는 특정한 단백질이 중재하는 생물학적인 과정을 방해하는 단백질 저해제로 사용하는 것이다. 현재, 특정 탄수화물 항원을 이용하여 암 백신으로 활용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
또한 탄수화물 다량체를 매개로 약리활성 물질을 전달하려는 약물전달시스템 역시 많은 관심을 받는 분야이다. 세포 표면의 렉틴 단백질은 매우 특이적인 형태로 노출되어 있기 때문에 이러한 렉틴 단백질에 인지될 수 있는 특이적인 탄수화물을 이용하여 다량체를 합성하는 경우, 그 탄수화물 다량체에 약리활성물질을 결합 시켜 원하는 세포에 선택적으로 약리활성물질을 전달할 수 있게 된다.
초분자 화학(Supramolecular chemistry)이란 수소결합, 정전기적 상호작용, 반데르발스 상호작용 등의 분자사이에서 작용하는 약한 힘으로 생성되는 2개 이상의 분자 집합체인 초분자에 관하여 연구하는 학문이다. 일반적으로 거대 고리 화합물이라고 불리우는 주인 분자의 공동(cavity)은 적당한 크기의 손님 분자(guest molecule)와 비공유적인 결합이 가능하다. 초분자 화학자들은 생물학적으로 중요한 물질들을 손님 분자로 이용하려는 연구에 많은 관심을 가졌다. 이미, 아자크라운 에테르(azacrown ether), 캘릭스아렌, 및 시클로덱스트린과 같은 거대 고리 화합물를 기본 골격으로 하여 탄수화물 다량체를 합성한 결과들이 보고 되었으며, 이러한 거대 고리 화합물 기반의 탄수화물 다량체들과 렉틴 단백질과의 상호작용을 연구한 결과들도 보고 되고 있다(Lindhorst, T. K. et al. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 2307, Aoyama, Y. et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 6676 및 Stoddart, J. F. et al. Bioconjugate Chem. 2001, 12, 655).
기존의 탄수화물 다량체와는 달리, 위와 같은 거대고리 화합물을 기반으로 하여 합성된 탄수화물 다량체의 경우, 탄수화물 잔기에서의 단백질과의 상호작용과 거대 고리 화합물 공동에서의 주인-손님 상호작용으로 단백질-탄수화물 다량체-손님 분자의 세 가지로 이루어지는 복합체를 형성할 수 있다.
따라서 이러한 거대 고리 화합물 기반의 탄수화물 다량체는 특정한 단백질이 중재하는 생물학적인 과정을 방해하는 단백질 저해제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 거대고리 화합물 공동에서의 주인-손님 상호작용을 응용하여, 거대고리 화합물에 잘 포접(inclusion)되는 앵커링 에이전트에 약리활성물질을 스페이서를 경유하여 공유결합으로 연결시키면, 약리활성물질이 거대고리 화합물에 비공유적으로 포접되게 되어, 약리활성 물질을 탄수화물과 결합하는 단백질이 존재하는 원하는 세포에 선택적이며, 보다 효율적으로 전달할 수 있다. 더 나아가, 거대고리 화합물에 잘 포접되는 앵커링 에이전트를 고체 기판(substrate) 상에 스페이서를 경유하여 결합시키는 경우 탄수화물칩을 제조할 수 있으며, 그 탄수화물과 결합하는 단백질을 결합시켜 단백질칩과 같은 생물학적인 센서로의 응용이 가능하다.
쿠커비투릴은 1905년 베렌드(R. Behrend), 마이어(E. Meyer), 러쉐(F. Rusche)에 의하여 최초로 보고된 물질로서, 이들의 논문(Liebigs Ann. Chem. 1905, 339, 1)에 따르면 글리코루릴(glycoluril)과 과량의 포름알데히드를 염산(HCl) 존재 하에서 축합시켜 무정형의 침전을 얻은 다음, 이를 뜨거운 진한 황산으로 녹이고 물로 희석하면 결정 상태로 얻을 수 있다고 한다. 그러나, 이 문헌에서는 이 화합물이 C10H11N7O4˙2H2O의 화학식을 갖는 물질이라고 잘못 추정하였으며 구조는 밝혀내지 못했다.
1981년 목(W. Mock)과 공동 연구자들은 이 물질이 여섯 개의 단량체가 모여 고리를 이룬 거대한 고리 화합물로 C36H36N24O12의 화학식을 갖는다는 사실을 밝혀냈으며, X-선 회절법에 의해 그 구조를 확인하였다(J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 7367). 그들은 이 화합물을 쿠커비투[6]릴이라고 명명하였다. 그 후 쿠커비투[6]릴의 개선된 합성 방법이 공개되었다(DE 196 03 377 A1).
이후 2000년에 들어서면서 김기문과 공동 연구자들은 기존의 쿠커비투[6]릴의 합성방법을 개선하여 쿠커비투[6]릴 뿐만 아니라 동족체인 쿠커비투[n]릴 (n = 5, 7, 8)들을 합성, 분리하고 각각의 구조를 X-선 회절법으로 확인하였다(J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 540).
한편, 국제출원 특허공개공보 00/68232에는 하기 참고도 1과 같은 화학식의 쿠커비투릴[n]을 개시하고 있다.
[참고도 1]
상기 화학식에서, n은 4 내지 12의 정수이다.
이상의 쿠커비투릴 유도체들은 치환기가 없는 글리코루릴 단량체들이 모여 이루어진 화합물이었으나, 치환기가 도입된 글리코루릴을 이용하여 합성된 쿠커비투릴 유도체가 개시되었다(Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1992, 31, 1475). 이 논문에 의하면, 디메틸글리코루릴과 포름알데히드와의 축합반응을 통하여 다섯 개의 디메타노디메틸글리코루릴이 고리를 이룬 데카메틸쿠커비투[5]릴(decamethylcucurbitu[5]ril)을 합성하였다.
쿠커비투릴은 거대고리분자 화합물로서 친유성의 공동을 가지고, 친수성의 입구를 양쪽에 가지고 있다. 그러므로, 쿠커비투릴은 공동 내에서는 친유성 상호작용이 이루어져, 기존의 사이클로덱스트린 보다도 다양한 종류의 화합물들과 대단히 안정적인 비공유결합을 통한 포접효과를 나타낸다. 이온성 물질과 극성이 큰 물질, 예를 들어 기체 화합물, 지방족 화합물, 방향족 화합물 등의 다양한 유기물질, 살충제, 제초제, 아미노산, 핵산, 이온화합물, 금속이온, 유기금속이온 등과 같은 다양한 종류의 화합물 등을 포접할 수 있다(J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 11316; 유럽특허 1094065; J. Org. Chem. 1986, 51, 1440). 특히 아미노기, 카르복실산 등의 작용기를 가진 화합물에 대해서 매우 안정적인 비공유결합을 통한 복합체를 형성하며, 이러한 특성을 이용하여 다양한 약물전달시스템 개발에 대한 지속적인 연구를 수행해 오고 있다.
본 발명자들은 최근 FDA에서 인증받은 항암제인 옥살리플라틴(oxaliplatin)과 쿠커비투릴이 안정한 비공유결합을 통한 복합체를 형성하여 쿠커비투릴이 약물전달시스템으로 사용된 예를 발표하였다(PCT/KR02/01755). 또한, 본 발명자들은 쿠커비투릴을 응용한 유사 로텍산(pseudo-rotaxane)을 통해 DNA의 결합능력이 향상됨을 보인 바 있으며, 쿠커비투릴을 이용한 덴드리머가 유전자전달시스템에 이용될 수 있는 방안에 대하여 연구, 발표한 바 있다(KR01-7169, Angew. Chem. Int. Ed., 2000 and 2001).
이에, 본 발명자들은 치료학 분야에 쿠커비투릴 분자의 응용 가능성을 인식하고, 쿠커비투릴 분자가 제공하는 생체적합성, 비면역성, 앵커링 에이전트(anchoring agent)의 포접성, 선택적 작용기 도입의 용이성과 같은 특성을 이용하고자, 쿠커비투릴 거대 고리 화합물을 이용한 탄수화물 다량체의 합성을 연구한 결과 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 목적은 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 하나 이상의 탄수화물 유도체가 공유결합된 탄수화물 다량체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 탄수화물 다량체를 단백질 억제제 또는 약물 전달체로서 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 탄수화물 다량체를 탄수화물칩 또는 단백질칩의 제조에 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 탄수화물 다량체, 앵커링 에이전트, 스페이서, 및 약물의 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 상기 탄수화물 다량체를 이용한 탄수화물칩 또는 단백질 칩을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1 개 이상의 탄수화물 유도체가 하기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체 단일분자의 A1 또는 A2와 공유결합하여 형성되는, 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 공유결합된 탄수화물 다량체를 제공한다:
상기 화학식 1에서,
n은 4 내지 20의 정수이고,
A1 및 A2는 각각 독립적으로 말단이 불포화결합인 C1-C20 알케닐옥시기, C1-C20 알키닐옥시기, C1-C20 알킬기를 갖는 카르복시알킬설파닐옥시기, C2-C8 알킬기를 갖는 카르복시알킬옥시기, C2-C8 알킬기를 갖는 아미노알킬옥시기, 및 C2-C8 알킬기를 갖는 히드록시알킬옥시기로 구성된 그룹에서 선택되며,
상기 탄수화물 다량체를 구성하는 1 개 이상의 화학식 2의 탄수화물 유도체는 서로 동일하거나 다를 수 있다.
상기 탄수화물 유도체에 공유결합되는 탄수화물 유도체는 단당류, 이당류, 또는 다당류 등 모든 탄수화물이 적용 가능하다.
상기 탄수화물 유도체가 상기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체에 공유결합되는 부분은 하기 화학식 2의 당 구조를 가질 수 있다:
상기 화학식 2에서,
m은 3 또는 4의 정수이고,
R은 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, C1-C8 히드록시알킬기, C1-C8 알킬기를 갖는 알킬옥시기로 구성된 그룹에서 선택되고,
R'은 C3-C8를 갖는 알킬티올, C3-C8 알킬아민, C3-C8의 알킬기를 갖는 에폭시알킬옥시알킬, C3-C8의 알킬기를 갖는 이소시안염, C3-C8의 알킬기를 갖는 이소티오시안염, 및 C3-C8의 알킬아지도로 구성된 그룹에서 선택된다.
상기 탄수화물 다량체는 단백질 억제제 또는 약물 전달체로서 사용될 수 있으며, 뿐만 아니라 탄수화물칩 또는 단백질칩과 같은 생체물질 분석용 센서의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면에서. 스페이서를 경유하여 약물이 결합된 앵커링 에이전트를 상기 탄수화물 다량체의 쿠커비투릴 유도체의 공동에 포접시킴으로써 생성되는, 탄수화물 다량체, 앵커링 에이전트, 스페이서, 및 약물의 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 탄수화물 다량체의 쿠커비투릴 유도체 공동에 포접된 앵커링 에이전트에 결합된 스페이서가 기판에 고정된 어레이를 갖는 탄수화물칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 탄수화물칩 상의 탄수화물 유도체에 단백질이 고정된 단백질칩을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명이 제공하는 탄수화물 다량체는 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 하나 이상의 탄수화물 유도체가 공유결합되어 형성된 것으로서, 다양한 탄수화물 유도체를 공유결합시키기 위한 쿠커비투릴 유도체로는 하기 화학식 1로 표시되는 쿠커비투릴 유도체를 사용하였다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
n은 4 내지 20의 정수이고,
A1 및 A2는 각각 독립적으로 말단이 불포화결합인 C1-C20 알케닐옥시기, C1-C20 알키닐옥시기, C1-C20 알킬기를 갖는 카르복시알킬설파닐옥시기, C2-C8 알킬기를 갖는 카르복시알킬옥시기, C2-C8 알킬기를 갖는 아미노알킬옥시기, 및 C2-C8 알킬기를 갖는 히드록시알킬옥시기로 구성된 그룹에서 선택된다.
구체적으로, 본 발명이 제공하는 탄수화물 다량체는 하나 이상의 탄수화물 유도체가 상기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체의 A1 또는 A2에 공유결합되어 형성된 다. 이 때, 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체에 공유결합되는 탄수화물 유도체는 모두 동일할 수도 있으나, 서로 다를 수도 있다.
상기 화학식 1의 화합물을 합성하기 위한 원료인 히드록시쿠커비투릴과 그 모체인 쿠커비투릴은 본 출원과 출원인이 동일한 한국특허공개 2003-60053, 2003-3901, 및 2001-39661 등에 개시되어 있으며, 이러한 문헌들은 전체가 참고로 본 명세서에 통합되어 있다. 이러한 문헌에 개시되어 있는 히드록시쿠커비투릴을 원료로 하여 유기합성 분야에 공지되어 있는 통상의 방법에 따라 상기 화학식 1의 화합물을 제조할 수 있다.
본 발명에 제공하는 탄수화물 다량체를 제공하기 위하여, 상기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체에 공유결합되는 탄수화물 유도체는 단당류, 이당류, 또는 다당류 등 탄수화물 다량체의 제조 목적에 따라 어떠한 탄수화물 다량체도 사용될 수 있다. 다만, 이러한 탄수화물 유도체는 상기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체와 공유결합하기 위해 쿠커비투릴 유도체와 결합되는 부분의 당 구조는 쿠커비투릴 유도체와 공유결합되기에 적절한 구조를 가져야 하며, 예를 들어 하기 화학식 2와 같은 구조를 가질 수 있다:
[화학식 2]
상기 화학식 2에서,
m은 3 또는 4의 정수이고,
R은 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, C1-C8 히드록시알킬기, C1-C8 알킬기를 갖는 알킬옥시기로 구성된 그룹에서 선택되고,
R'은 C3-C8를 갖는 알킬티올, C3-C8 알킬아민, C3-C8의 알킬기를 갖는 에폭시알킬옥시알킬, C3-C8의 알킬기를 갖는 이소시안염, C3-C8의 알킬기를 갖는 이소티오시안염, 및 C3-C8의 알킬아지도로 구성된 그룹에서 선택된다.
상기 화학식 2의 화합물은 산소를 포함하는 헤테로 고리가 오각형 또는 육각형 구조의 오탄당 또는 육탄당 구조를 가질 수 있으며, 구체적으로는 화학식 2의 화합물로서 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 알로오스, 알트로스, 굴로스, 아이도스, 탈로스, 리보오스, 아라비노스, 자일로스, 라익소스, 프사이코스, 프룩토스, 솔보스, 타가로스 등의 하나의 작용기가 R'으로 변형된 것들이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화학식 2의 탄수화물 유도체들은 종래에 유기 합성 분야에 공지되어 있는 합성방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 아세틱안하이드라이드를 이용하여 탄수화물의 히드록시기를 O-아세틸기로 전환할 수 있으며, 브롬산과의 반응에 의해 상기 탄수화물의 O-아세틸기를 브로모기로 바꿀 수 있다. 그런 다음, 브로모기를 티오우레아와 반응시키면 티올기로 바꿀 수 있고, 브로모기를 소듐아자이드와 반응시키면 아지도기로 바꿀 수 있고, 브로모기를 포타슘 티오시아네이트와 반응시키면 이소티오시아네이트기로 바꿀 수 있다. 이와 같이, 여러 가지 탄수화물 유도 체의 합성은 종래에 당해 기술분야에 공지되어 있는 합성 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명이 제공하는 탄수화물 다량체는 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체에 화학식 2와 같은 당 구조를 포함하는 탄수화물 유도체를 하나 이상 공유결합시켜 형성된 것이다. 즉, A1 또는 A2의 말단에 카르복실산, 아민, 히드록시기, 알릴기, 또는 프로파질기가 치환된 화학식 1의 쿠커비투릴에 작용기 중 하나가 아민, 에폭시, 티올기 또는 아지드기와 같은 작용기로 변경된 탄수화물 유도체를 반응시켜 공유결합의 형성에 의해 생성되는 것이다.
따라서, 본 발명의 일 측면에 따르면, 탄수화물 다량체는 화학식 2의 당 구조를 포함하는 탄수화물 유도체를 유기 합성분야에 공지되어 있는 통상의 방법을 이용하여 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체의 A1 또는 A2에 공유결합시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 제조방법은 화학식 1의 A1 또는 A2 그리고 화학식 2의 R' 기에 따라 달라질 것이며, 이에 따라 달라지는 공유결합 방법은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 선택할 수 있다.
구체적으로, 상기 탄수화물 유도체의 일부인 화학식 2의 당 구조가 상기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 결합되는 구조는 하기 화학식 3 내지 7과 같은 구조를 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하기 화학식 3 내지 7 에서는 편의상쿠커비투[n]릴을
로 표시하였으며, 공유결합된 탄수화물을 유도체를 한 개만 표시하였으나, 실질적으로는 공유결합된 탄수화물 유도체는 1 개 이상 존재할 수 있음을 포괄적으로 나타낸 것으로 이해하여야 한다. 또한, 이하에서는 하기 화학식 3 내지 7과 함께 그러한 결합 구조를 갖는 경우의 구체적인 제조방법을 함께 나타내었다.
상기 화학식 3에서,
m 및 R은 상기 화학식 2에서 정의된 바와 같고,
p1, q1, 및 r1은 각각 독립적으로 0 내지 20의 정수이다;
상기 화학식 3의 화합물은 설피도 결합에 의해 쿠커비투릴과 탄수화물 유도체가 공유결합 되어 얻어진 것으로서, 티올이 치환된 탄수화물 유도체와 알케닐옥시쿠커비투릴과의 라디칼 반응을 통해 얻을 수 있다.
상기 라디칼 반응을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같지만, 상기 화합물 의 제조방법이 이것만으로 한정되는 것은 아니다:
1) 알케닐옥시쿠커비투릴을 유기용매, 예를 들어 클로로포름과 메탄올 용매에 녹이는 단계;
2) 수정관을 반응용기로 하여 라디칼 개시제로서 AIBN(2,2-아조비스이소부티니트릴)을 촉매량만큼 부가하는 단계;
3) 티올이 치환된 탄수화물 유도체를 상기 반응용액에 가하는 단계;
4) 질소나 아르곤을 반응용액에 흘려주어 잔존하는 산소를 제거하는 단계;
5) 자외선 조사기에 반응용기를 수일간, 예를 들어 3일간 방치하는 단계;
6) 과량의 유기용매를 사용하여 반응 혼합물을 세척한 후, 여과하여 탄수화물 유도체가 설피도기로 연결된 쿠커비투릴을 얻는 단계;
7) 탄수화물 유도체가 설피도기로 연결된 쿠커비투릴을 유기용매, 예를 들어 메탄올에 녹이는 단계;
8) 촉매량의 소듐메톡시드를 가해 탄수화물의 보호기를 히드록시기로 치환하는 단계; 및
9) 상기 반응 혼합물에 물을 가한 후, 여과하고 건조하여 탄수화물이 설피도기로 연결된 쿠커비투릴을 얻는 단계.
상기 방법중 자외선 조사기를 사용하는 대신 80 내지 120℃ 사이의 열을 가함으로써 탄수화물이 설피도 결합으로 연결된 쿠커비투릴을 얻을 수도 있다.
상기 화학식 4에서,
m 및 R은 상기 화학식 2에서 정의된 바와 같고,
X는 C1-C20 알킬기를 갖는 알킬설피도알킬기 또는 C1-C20 알킬기이고, 이들 알킬기 중의 적어도 하나 이상의 수소원자는 할로겐원자, 히드록시기, 시아노기, 아미노기, 또는 니트로기로 구성된 그룹에서 선택된 치환기로 치환될 수 있으며,
q2 는 0 내지 20의 정수이다.
상기 화학식 4의 화합물은 아미드 결합에 의해 쿠커비투릴과 탄수화물 유도체가 공유결합 되어 얻어진 것으로서, 카르복실산이 치환된 쿠커비투릴과 아민기가 치환된 탄수화물 유도체를 반응시켜 아미드 결합을 형성시킴으로써 얻어질 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 4의 화합물은 다음과 같은 방법에 의해 얻어질 수 있지만, 이것은 예시적인 것에 불과하며 이와 같은 방법만으로 한정되는 것은 아니다:
1) 증류한 디메틸포름아미드에 카르복실산이 치환된 쿠커비투릴을 녹인 후 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보이미드하이드로클로라이드와 N-히드록시석신 이미드 또는 N,N-디메틸아세트아미드를 가하는 단계;
2) 아미노기가 치환된 탄수화물 유도체를 상기 반응 용액에 넣고 상온에서 12시간 이상 교반하는 단계;
3) 물과 유기용매를 사용하여 반응 혼합물을 세척 후 건조하여 탄수화물 유도체가 아미드 결합에 의해 연결된 쿠커비투릴을 획득하는 단계;
4) 탄수화물 유도체가 아미드 결합으로 연결된 쿠커비투릴을 유기용매, 예를 들어 메탄올에 녹이는 단계;
5) 촉매량의 소디움메톡사이드를 가해 탄수화물의 보호기를 히드록시기로 치환하는 단계; 및
6) 반응 혼합물에 물을 가한 후, 여과하고 건조하여 탄수화물이 아미드 결합으로 연결된 쿠커비투릴을 얻는 단계.
상기 화학식 5에서,
m 및 R은 상기 화학식 2에서 정의된 바와 같고,
p3, q3, 및 r3은 각각 독립적으로 0 내지 20의 정수이다.
상기 화학식 5의 화합물은 에테르 결합에 의해 쿠커비투릴과 탄수화물 유도체가 공유결합 되어 얻어진 것으로서, 히드록시기가 치환된 쿠커비투릴과 에폭시기가 치환된 탄수화물 유도체의 친핵성 치환반응을 통해 얻어질 수 있다.
상기 친핵성 치환 반응은 다음과 같이 수행할 수 있다:
1) 말단에 히드록시기를 갖는 히드록시알킬옥시쿠커비투릴을 디메틸포름아미드에 용해시키는 단계;
2) 에폭시기가 치환된 탄수화물 유도체와 촉매량의 삼염화붕소를 서서히 가하는 단계;
3) 상온에서 1 내지 24시간 정도 교반한 후 85℃에서 추가적으로 1 내지 24시간 동안 교반하는 단계;
4) 물과 유기용매로 반응 혼합물을 세척한 후, 건조하여 목적물인 탄수화물 유도체가 에테르기로 연결된 쿠커비투릴을 합성하는 단계;
5) 탄수화물 유도체가 에테르기로 연결된 쿠커비투릴을 유기용매, 예를 들어 메탄올에 녹이는 단계;
6) 촉매량의 소듐 메톡시드를 가해 탄수화물의 보호기를 히드록시기로 치환하는 단계;
7) 반응혼합물에 물을 가한 후, 여과하고 건조하여 탄수화물이 에테르기로 연결된 쿠커비투릴을 얻는 단계.
상기 화학식 6에서,
m 및 R은 상기 화학식 2에서 정의된 바와 같고,
p4, q4, 및 r4은 각각 독립적으로 0 내지 20의 정수이다.
상기 화학식 6의 화합물은 아미노 결합을 통해 쿠커비투릴과 탄수화물 유도체가 공유결합되어 얻어진 것으로서, 아민이 치환된 쿠커비투릴과 에폭시기가 치환된 탄수화물 유도체의 친핵성 치환 반응을 통하여 얻어질 수 있다.
말단에 에폭시기가 치환된 탄수화물 유도체와 말단에 아미노기를 갖는 아미노알킬옥시쿠커비투릴의 친핵성 치환반응은 다음과 같이 수행될 수 있다.
1) 말단에 아미노기를 갖는 아미노알킬옥시쿠커비투릴을 포스페이트 완충용액(pH 7 내지 10)에 가하는 단계;
2) 에폭시기가 치환된 탄수화물 유도체를 상기 반응 용액에 가하는 단계;
3) 상온에서 1시간 내지 24시간 동안 교반하는 단계;
4) 물과 유기용매로 반응혼합물을 세척한 후 건조하여 목적물인 탄수화물 유도체가 아미노기로 연결된 쿠커비투릴을 합성하는 단계;
5) 탄수화물 유도체가 아미노기로 연결된 쿠커비투릴을 유기용매, 예를 들어 메탄올에 녹이는 단계;
6) 촉매량의 소듐메톡사이드를 가해 탄수화물의 보호기를 히드록시기로 치환하는 단계; 및
7) 상기 반응 혼합물에 물을 가한 후, 여과하고 건조하여 탄수화물이 아미노기로 연결된 쿠커비투릴을 얻는 단계.
상기 화학식 7에서,
m 및 R은 상기 화학식 2에서 정의된 바와 같고,
p5, q5, 및 r5는 각각 독립적으로 0 내지 20의 정수이다.
상기 화학식 7의 화합물은 트리아졸 결합을 통해 쿠커비투릴과 탄수화물 유도체가 공유결합되어 얻어진 것으로서, 알키닐옥시기가 치환된 쿠커비투릴과 아지도기가 치환된 탄수화물 유도체의 1,3-양극성 시클로 부가 반응을 통하여 얻어질 수 있다.
말단에 아지도기가 치환된 탄수화물 유도체와 말단에 알키닐옥시기를 갖는 알키닐옥시쿠커비투릴 사이의 1,3-양극성 시클로 부가반응은 다음과 같이 수행될 수 있다:
1) 말단에 알키닐기를 갖는 알키닐옥시쿠커비투릴을 9:1의 톨루엔:피리딘 용액에 가하는 단계;
2) 에폭시기가 치환된 탄수화물 유도체를 상기 반응 용액에 가하는 단계;
3) 용매를 환류시켜 1 시간 내지 24 시간 동안 교반한 후 상온에서 추가적으로 1 내지 24 시간동안 교반하는 단계;
4) 물과 유기용매로 반응혼합물을 세척한 후 건조하여 목적물인 탄수화물 유도체가 트라이아졸 결합으로 연결된 쿠커비투릴을 합성하는 단계;
5) 탄수화물 유도체가 트라이아졸 결합으로 연결된 쿠커비투릴을 유기용매, 예를 들어 메탄올에 녹이는 단계;
6) 촉매량의 소듐메톡시드를 가해 탄수화물의 보호기를 히드록시기로 치환하는 단계; 및
7) 상기 반응 혼합물에 물을 가한 후, 여과하고 건조하여 탄수화물이 트라이아졸 결합으로 연결된 쿠커비투릴을 얻는 단계.
상기 전반적인 제조방법에 사용되는 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 디메틸포름아미드 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법으로 생성될 수 있는 본 발명의 쿠커비투릴 유도체에 공유결합된 탄수화물 다량체는 생성물을 물과 다양한 유기용매로 충분히 세척하여 반응하지 않고 남아있는 불순물을 제거한 후 건조 및 정제 단계를 더 거치는 것이 보다 바람직 하다.
본 발명이 제공하는 상기 탄수화물 다량체는 쿠커비투릴 유도체에 공유결합되는 탄수화물의 종류에 따라 단백질 억제제로서 사용될 수 있다. 상기 탄수화물 다량체는 쿠커비투릴 단일 분자에 하나 이상의 탄수화물 유도체가 공유결합된 것으로서, 다수의 탄수화물 유도체가 결합된 형태일 수 있다. 이와 같이, 다수의 탄수화물이 결합된 탄수화물의 다량체는 소위 다가 효과에 의해 생체 내에서 그 탄수화물과 특이적으로 결합하는 단백질과 결합함으로써 해당 단백질이 중재하는 생체 내 생물학적 과정을 방해하는 작용을 할 수 있다.
본 발명의 탄수화물 다량체를 어떤 단백질의 억제제로서 사용할 수 있는가 하는 것은 탄수화물 다량체를 구성하는 탄수화물이 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이 무엇인지에 따라 달라질 것이며, 어떠한 탄수화물이 어떤 종류의 단백질의 작용을 특이적으로 억제할 수 있는지는 당해 기술분야에 다수 공지되어 있다.
상기 특이적인 탄수화물-단백질 상호작용으로는 예를 들어, 글루코오스-ConA(Concanavalin A) 상호작용, 글루코오스-완두 렉틴(pea lectin) 상호작용, 갈락토오스-PNA(peanut lectin) 상호작용, 갈락토오스-GSI(Griffonia simplicifolia I), 만노오스-ConA(Concanavalin A) 상호작용, N-아세틸글루코오스아민-WGA(wheat germ agglutinin) 상호작용, N-아세틸글루코오스아민-EcorL(Erythrina corallodendron) 상호작용, N-아세틸락토오스아민-WGA(wheat germ agglutinin) 상호작용, N-아세틸락토오스아민-EcorL(Erythrina corallodendron) 상호작용 등이 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명이 제공하는 탄수화물 다량체는 또한 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 상기 탄수화물 다량체를 구성하는 거대고리 분자인 쿠커비투릴 유도체는 분자내 공동을 가지고 있으며, 이러한 분자내 공동은 앵커링 에이전트를 포접할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 이러한 쿠커비투릴 유도체는 종래의 시클로덱스트린보다 더 안정적인 비공유 결합을 통해 더욱 다양한 종류의 앵커링 에이전트를 포접할 수 있다(J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 11316; 유럽특허 1094065; J. Org. Chem. 1986, 51, 1440). 따라서, 본 발명의 탄수화물 다량체를 구성하는 쿠커비투릴 유도체의 공동에 포접될 수 있는 앵커링 에이전트에 스페이서를 경유하여 약리활성물질을 결합시켜, 탄수화물 다량체, 앵커링 에이전트, 스페이서, 및 약리활성물질의 복합체를 형성시킴으로써, 본 발명의 탄수화물 다량체를 약물의 담체로서 사용할 수 있는 것이다. 또한, 본 발명의 탄수화물 다량체는 단순한 약물의 담체로서의 역할을 뛰어넘어, 약물을 약물의 작용을 필요로 하는 표적 부위에만 작용시킬 수 있도록 하는 표적 지향성 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 이는, 본 발명의 탄수화물 다량체에 결합되어 있는 다수의 탄수화물 유도체를 원하는 표적 세포에 존재하는 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 탄수화물을 갖도록 변경시킴으로써 가능하다. 그리하여, 본 발명의 탄수화물 다량체는 약리활성 물질을 원하는 표적 부위에 효율적으로 전달시킴으로써 약물의 부작용을 최소화 할 수 있는 표적 지향성 약물 전달체로서 사용될 수 있다.
이와 함께, 본 발명은 상기 탄수화물 다량체를 포함하는 약물 전달체를 제공하며, 구체적으로는 스페이서를 경유하여 약물이 결합된 앵커링 에이전트가 상기 본 발명의 탄수화물 다량체의 공동에 포접된, 탄수화물 다량체, 앵커링 에이전트, 스페이서, 및 약물의 복합체를 제공한다.
본 발명이 제공하는 이러한 약물 복합체는 구체적으로 하기 화학식 8과 같은 화합물을 본 발명의 탄수화물 다량체에 포접시켜 형성되는 하기 참고도 2과 같은 구조를 가질 수 있다:
[참고도 2]
상기 화학식 8에서,
A는 용도에 따라 사용한 쿠커비투릴에 잘 포접되는 앵커링 에이전트로서 1,3-디아미노프로판, 1,4-디아미노부탄, 1,5-디아미노펜탄, 1,6-디아미노헥산, 스퍼민, 스퍼미딘, 프로필아민, 부틸아민, 펜틸아민, 헥실아민, 바이올로진, 피리딘, 페로센, 아미노산 등이 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며;
B는 스페어서로서, 각각 수소, 치환 또는 비치환된 C1-C30 알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C30 알케닐, 치환 또는 비치환된 C1-C30 알키닐, 치환된 또는 비치환 C2-C30 카르보닐알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C30 티오알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C30 알킬티올, 치환 또는 비치환된 C1-C30 알콕시, 치환 또는 비치환된 C1-C30 히드록시알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C30 알킬실릴, 치환 또는 비치환된 C1-C30 아미노알킬, 치환 또는 비치환된 C1-C30의 아미노알킬티오알킬, 치환 또는 비치환된 C5-C30 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C2-C30 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C6-C30 아릴, 치환 또는 비치환된 C6-C20 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 C4-C30 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환된 C4-C20의 헤테로아릴알킬로 구성된 군에서 선택되며;
T는 약리활성물질로서, 유기화합물, 단백질, 유전자 또는 이들의 조합이 사용될 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
상기 유기화합물로는 하이드로코르티손, 프레드니솔론, 스피로노락톤, 테스토스테론, 메제스테롤 아세테이트, 다나졸, 프로게스테론, 인도메타신, 암포테리신 B, 독소루비신 또는 이들의 조합을 사용할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
상기 단백질로는 인간성장호르몬, G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), 에리스로포이에틴(erythropoietin), 백신, 항체, 인슐린, 글루카곤, 칼시토닌(calcitonin), ACTH(adrenocorticotropic hormone), 소마토스태틴(somatostatin), 소마토트로핀(somatotropin), 소마토메딘(somatomedin), 부갑상선 호르몬, 갑상선 호르몬, 시상하부 분비물질, 프로락틴(prolactin), 엔돌핀, VEGF(vascular endothelial growth factor), 엔케팔린(enkephalin), 바소프레신(vasopressin), 신경성장촉진인자(nerve growth factor), 비자연발생적 아편양 물질(non-naturally occuring opioid), 인터페론, 아스파라기나아제(asparaginase), 알기나제(alginase), 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 펩신, 또는 이들의 조합을 사용할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
또한, 상기 본 발명의 탄수화물 다량체는 탄수화물칩 또는 단백질칩의 제조에 사용될 수 있다. 구체적으로는, 쿠커비투릴에 잘 포접되는 앵커링 에이전트를 고체 기판 상에 스페이서를 경유하여 결합시킴으로써 탄수화물칩, 단백질칩과 같은 생물학적인 센서로 응용할 수 있다. 상기 탄수화물 다량체에서 탄수화물을 변경시킴에 따라 다양한 탄수화물칩이 제작될 수 있다. 또한, 상기 탄수화물칩 상의 탄수화물 다량체에 결합되어 있는 탄수화물 유도체와 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 탄수화물 유도체와 특이적으로 결합시킴으로써 단백질칩이 제작될 수 있다.
이와 함께, 본 발명은 또한 본 발명의 탄수화물 다량체의 쿠커비투릴 유도체의 공동에 포접된 앵커링 에이전트가 스페이서를 경유하여 기판에 고정된 어레이를 갖는 탄수화물칩을 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 탄수화물 칩의 탄수화물 유도체에 단백질이 고정된 단백질칩을 제공한다. 이러한 탄수화물칩 또는 단백질칩을 구성하는 기판은 통상적으로 탄수화물칩 또는 단백질칩의 제조에 사용되는 기판이 이용될 수 있으며, 예를 들어 유리, ITO 유리, 실리콘, 수정, 금 등이 있다.
상기 본 발명이 제공하는 약물 복합체, 탄수화물칩, 및 단백질칩의 제조에 사용되는 앵커링 에이전트로는 상기 쿠커비투릴 유도체의 공동에 잘 포접되는 화합물이 사용될 수 있다.
쿠커비투릴에 잘 포접되어 앵커링 에이전트로서 사용될 수 있는 화합물로는 1,3-디아미노프로판, 1,4-디아미노부탄, 1,5-디아미노펜탄, 1,6-디아미노헥산, 스퍼민, 스퍼미딘, 프로필아민, 부틸아민, 펜틸아민, 헥실아민, 바이올로진, 피리딘, 페로센, 아미노산 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 앵커링 에이전트는 약물 복합체를 제조하기 위한 경우에는 상기 쿠커비투릴 유도체의 공극에 포접되는 성질 이외에 약물과 결합할 수 있는 스페이서와 결합될 수 있어야 하며, 이러한 약물과 결합 가능한 스페이서는 사용되는 약물에 따라 달라지며, 이러한 스페이서의 선택 및 그러한 스페이서를 앵커링 에이전트에 결합시키는 것은 유기 합성 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 수행할 수 있다.
또한, 상기 탄수화물칩 또는 단백질칩의 제조에 사용되는 앵커링 에이전트는 고체 기판 상에 결합할 수 있어야 하므로, 앵커링 에이전트가 고체 기판과 결합할 수 있는 스페이서와 결합되어야 하며, 이러한 결합은 유기 합성분야에 공지되어 있는 통상의 방법에 의해 가능하다. 고체 기판과 결합할 수 있는 그러한 스페이서는 수소, C1-C30 알킬, C2-C30 알케닐, C2-C30 알키닐, C2-C30 카르보닐알킬, C1-C30 티오알킬, C1-C30 티오알케닐, C1-C30 티오알키닐, C1-C30 알콕시, C1-C30 히드록시알킬, C1-C30 히드록시알케닐, C1-C30 히드록시알키닐, C1-C30 알킬실릴, C1-C30 아미노알킬, C1-C30의 아미노알킬티오알킬, C5-C30 시클로알킬, C2-C30 헤테로시클로알킬, C6-C30 아릴, C6-C20 아릴알킬, C4-C30 헤테로아릴, C4-C20의 헤테로아릴알킬로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 상기 스페이서는 할로겐원자, 히드록시기, 시아노기, 아미노기, 및 니트로기, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 치환기로 더욱 치환될 수 있다.
본 발명에서 치환기로서 사용되는 탄소원자수 1 내지 20 개의 알킬기로서는 선형 또는 분지형의 알킬기, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 옥틸, 데실 등을 예로 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 탄소원자수 1 내지 12개의 알킬, 더욱 바람직하게는 탄소원자수 1 내지 6개의 알킬기가 사용될 수 있다. 이들 알킬기 중의 적어도 하나 이상의 수소원자는 할로겐원자, 히드록시기, 시아노기, 아미노기, 또는 니트로기로 치환될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어져서는 안된다.
<실시예>
실시예 1
설피도 결합으로 쿠커비투릴에 공유결합된 갈락토오스 다량체의 합성
15 mg의 알릴옥시쿠커비투[6]릴(화학식 1에서 n이 6이며, A1 및 A2가 알릴옥시기인 쿠커비투릴 유도체)을 5 mL의 메탄올에 녹인 후 150mg의 테트라아세틸옥시티오갈락토오스(화학식 2에서 m이 4이며, R'는 티올, R은 각각 독립적으로 세 개의 히드록시, 한 개의 히드록시메틸기인 갈락토오스 유도체)와 AIBN(2,2-아조비스이소부티로나이트릴) 1mg을 가하였다. 수정관에 담아 질소를 흘려주어 산소를 제거한 후, 300 nm의 자외선을 3 일간 조사하였다. 반응 종료 후 n-헥산, 디메틸에테르 등으로 침전을 떨어뜨리고 세척한 후, 12시간 동안 상온에서 건조하여 테트라아세틸옥시갈락토오스가 설피드결합으로 연결된 쿠커비투릴을 합성하였다. 이후 상기 물질을 메탄올에 녹인 후, 10 ㎕의 소듐메톡시드를 가하고 5 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후, 물을 가해 물에 녹지 않는 물질을 제거한 후, 물에 녹는 부분을 진공 하에서 건조시켜 갈락토오스가 설피드 결합으로 연결된 쿠커비투릴(화학식 3에서 R이 세 개의 히드록시기, 한 개의 히드록시메틸기인 갈락토오스 다량체)을 60%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, D2O): δ= 5.57 (m, 12H), 4.50 (br d, J = 2.6 Hz, 24H), 3.99 (s, 24H), 3.73 (m, 36H), 3.67 (d, J = 8.85 Hz, 12H), 3.59 (m, 24H), 2.97 (br d, J = 6.4 Hz, 12H), 2.90 (br d, J = 6.4 Hz, 12H), 2.11 (br s, 24H).
실시예 2
아미드 결합으로 쿠커비투릴에 공유결합된 갈락토오스 다량체의 합성
20 mg의 카르복실산이 치환된 쿠커비투[6]릴(화학식 1에서 A1 및 A2가 카르복시에틸설파닐프로필옥시기인 쿠커비투릴 유도체)을 디메틸포름아미드 10 mL에 녹인 후, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDAC) 150mg과 N-히드록시숙신이미드 3 mg을 가했다. 이 용액에 500 mg의 테트라아세틸옥시아미노갈락토오스(화학식 2에서, m이 4이며, R'은 아민, R은 각각 독립적으로 세 개의 히드록시, 한 개의 히드록시메틸기인 갈락토오스 유도체)을 넣어준 후 12 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후 n-헥산, 디메틸에테르 등으로 침전을 떨어뜨리고 세척한 후, 12 시간동안 상온에서 건조하여 테트라아세틸옥시갈락토오스가 아미드결합으로 연결된 쿠커비투릴을 합성하였다. 이후 그 물질을 메탄올에 녹인 후, 10 ㎕의 소듐메톡시드를 가하고 5 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후, 물을 가해 물에 녹지 않는 물질을 제거한 후, 물에 녹는 부분을 진공 하에서 건조시켜 갈락토오스가 아미드 결합으로 연결된 쿠커비투릴(화학식 4에서 R이 세 개의 히드록시기, 한 개의 히드록시메틸기인 갈락토오스 다량체)을 70%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, D2O): δ= 5.57 (m, 12H), 5.25 (dd, J = 8 Hz, J = 8 Hz, 12H), 4.50 (br d, J = 2.6 Hz, 12H), 3.99 (s, 24H), 3.73 (m, 36H), 3.67 (d, J = 8.85 Hz, 12H), 3.59 (m, 24H), 2.97 (br d, J = 6.4 Hz, 12H), 2.90 (br d, J = 6.4 Hz, 12H),2.85 (t, J = 8.0 Hz, 24H), 2.40 (t, J = 8.0 Hz, 24H), 2.11 (br s, 24H).
실시예 3
에테르 결합으로 쿠커비투릴에 공유결합된 갈락토오스 다량체의 합성
40 mg의 2-히드록시에틸옥시쿠커비투[6]릴(화학식 1에서 A1 및 A2가 2-히드록시에틸옥시기인 쿠커비투릴 유도체)과 테트라아세틸옥시글리시독시프로필갈락토오스(화학식 2에서 m이 4이며, R'은 글리시독시프로필기, R은 각각 독립적으로 세 개의 히드록시, 한 개의 히드록시메틸기인 갈락토오스 유도체) 400 mg을 DMF 10 mL에 넣은 후, 삼염화붕소(BF3.Et2O)를 촉매량 가하였다. 상온에서 2 시간 교반후 50℃에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후 n-헥산, 디메틸에테르 등으로 침전을 떨어뜨리고 세척한 후, 12시간 동안 상온에서 건조하여 테트라아세틸옥시갈락토오스가 에테르 결합으로 연결된 쿠커비투릴을 합성하였다. 이후 그 물질을 메탄올에 녹인 후, 10 ㎕의 소듐메톡시드를 가하고 5 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후, 물을 가해 물에 녹지 않는 물질을 제거한 후, 물에 녹는 부분을 진공 하에서 건조시켜 갈락토오스가 에테르결합으로 연결된 쿠커비투릴(화학식 5에서 R이 세 개의 히드록시기, 한 개의 히드록시메틸기인 갈락토오스 다량체)을 50%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, D2O): δ= 5.57 (m, 12H), 4.50 (br d, J = 2.6 Hz, 12H), 3.99 (s, 24H), 3.73 (m, 48H), 3.67 (d, J = 8.85 Hz, 12H), 3.59 (br m, 48H), 3.44 (t, J = 4.5 Hz, 24H), 3.40 (m, 24H), 3.37 (m, 24H), 3,34 (br m, 12H), 1.52 (br m, 24H), 1.3 (br m, 24H).
실시예 4
아미노 결합으로 쿠커비투릴에 공유결합된 갈락토오스 다량체의 합성
30 mg의 2-아미노에틸옥시쿠커비투[6]릴(화학식 1에서 A1 및 A2가 2-아미노에틸옥시기인 쿠커비투릴 유도체)과 테트라아세틸옥시글리시독시프로필갈락토오스(화학식 2에서 m이 4이며, R'은 글리시독시프로필기, R은 각각 독립적으로 세 개의 히드록시, 한 개의 히드록시메틸기인 갈락토오스 유도체) 300 mg을 포스페이트 완충용액(pH 8.8)에서 12시간 교반 후 0.2 N HCl 용액 1 mL를 가해 30 분간 교반하였다. 반응 종료 후 n-헥산, 디메틸에테르 등으로 침전을 떨어뜨리고 세척한 후, 12 시간 동안 상온에서 건조하여 테트라아세틸옥시갈락토오스가 아미노 결합으로 연결된 쿠커비투릴을 합성하였다. 이후 위 물질을 메탄올에 녹인 후, 10 ㎕의 소듐메톡시드를 가하고 5 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후, 물을 가해 물에 녹지 않는 물질을 제거한 후, 물에 녹는 부분을 진공 하에서 건조시켜 갈락토오스가 아미노 결합으로 연결된 쿠커비투릴(화학식 6에서 R이 세 개의 히드록시기, 한 개의 히드록시메틸기인 갈락토오스 다량체)을 55%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, D2O): δ= 5.57 (m, 12H), 4.50 (br d, J = 2.6 Hz, 12H), 3.99 (s, 24H), 3.73 (m, 48H), 3.67 (d, J = 8.85 Hz, 12H), 3.59 (br m, 24H), 3.44 (t, J = 4.5 Hz, 24H), 3.37 (m, 24H), 3,34 (br m, 12H), 2.79 (br m, 48H), 1.52 (br m, 24H), 1.3 (br m, 24H).
실시예 5
트라이아졸 결합으로 쿠커비투릴에 공유결합된 갈락토오스 다량체의 합성
30 mg의 프로파질옥시쿠커비투[6]릴(화학식 1에서 A1 및 A2가 프로파질옥시기인 쿠커비투릴 유도체)과 테트라아세틸옥시아지도갈락토오스(화학식 2에서 m이 4이며, R'은 아지도기, R은 각각 독립적으로 세 개의 히드록시, 한 개의 히드록시메틸기인 갈락토오스 유도체) 300 mg을 9:1의 톨루엔:피리딘 용액 5 mL에서 환류시켜 24 시간 교반 후, 상온에서 추가적으로 12시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후 n-헥산, 디메틸에테르 등으로 침전을 떨어뜨리고 세척한 후, 12 시간 동안 상온에서 건조하여 테트라아세틸옥시갈락토오스가 트라이아졸 결합으로 연결된 쿠커비투릴을 합성하였다. 이후 위 물질을 메탄올에 녹인 후, 10 ㎕의 소듐메톡시드를 가하고 5 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후, 물을 가해 물에 녹지 않는 물질을 제거한 후, 물에 녹는 부분을 진공 하에서 건조시켜 갈락토오스가 트라이아졸 결합으로 연결된 쿠커비투릴(화학식 7에서 R이 세 개의 히드록시기, 한 개의 히드록시메틸기인 갈락토오스 다량체)을 65%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, D2O): δ= 8.24 (s, 12H), 5.57 (m, 12H), 5.39 (d, J = 2.6 Hz, 12H), 4.50 (br d, J = 15 Hz, 12H), 4.47 (br s, 24H), 3.99 (s, 24H), 3.73 (m, 12H), 3.67 (d, J = 8.85 Hz, 12H), 3.59 (m, 24H).
상기 실시예에서는 본 발명이 제공하는 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 공유결합되는 탄수화물 다량체의 결합 방식에 대한 몇 가지 예만을 나타내었으나, 유기합성에 대한 통상의 지식을 가진 자들이라면 보다 다양한 종류의 결합을 통해 보다 다양한 탄수화물 유도체가 쿠커비투릴 유도체에 공유결합으로 연결되어 합성될 수 있다는 것을 본 발명에 대한 상기 설명 및 상기 실시예를 통해 알 수 있을 것이다.
실시예 6
쿠커비투릴에 공유결합된 갈락토오스 다량체의 단백질 저해 실험
단당류인 갈락토오즈 한 분자에 비하여, 상기 화학식 3 의 갈락토오즈 다량체(화학식 3에서 m=4, p1=3, q1=0, r1=1, R=히드록시기)가 효과적으로 PNA(peanut lectin) 단백질을 저해하는가를 알아보기 위해 ELLA(Enzyme-Linked Lectin Assay)실험을 실시하였다.
먼저, 37℃, pH 7.3의 포스페이트 버퍼 수용액(PBS) 0.01M 속에서 10㎍/mL 농도의 폴리(아크릴아미드-co-알릴 D-만노사이드) 중합체 용액을 사용하여 두시간 동안 제노바인드 미세적정 플레이트(Xenobind microtitration plate)의 well 부분을 코팅시켰다(사용한 양은 100㎕/well). 그 후 0.05%(v/v)의 Tween 20을 함유한 0.01M의 포스페이트 버퍼용액(PBST)으로 well을 3번정도 세척하였다(세척량은 300㎕/well). 이 세척과정은 배양주기 마다 반복하였다. 그 후, BSA/PBS 용액 250㎕/well를 한시간 동안 가하였다.
쿠커비투릴에 공유결합된 갈락토오스 다량체를 다양한 농도로 준비하고, 피넛 렉틴-퍼옥시데이즈(peanut lectin peroxidase) 접합체를 준비한다. 이때 피넛 렉틴의 농도는 모액을 150배로 희석하여 사용하였다. 갈락토오스 다량체와 peanut 렉틴-퍼옥시데이즈 접합체를 포스페이트 버퍼속에서 함께 섞은 후, 100㎕의 혼합액을 상기의 제노바인드 미세적정 플레이트위에 가하였다.
약 한시간 후, 제노바인드 미세적정 플레이트에 존재하는 혼합액을 항원이 코팅된 플레이트 (Antigen-coated plate)로 옮긴후 한시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후 포스페이트 버퍼용액으로 plate를 세척한 후, 퍼옥시데이즈 기질(substrate)인 2,2-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid (ABTS)를 50㎕/well의 양으로 첨가하였다. 이 때는 시트레이트-포스페이트(citrate-phosphate) 버퍼용액 (0.2M, pH 4.0 with 0.015% H2O2)을 사용하였다.
30분 후에 1M의 황산용액을 50㎕/웰로 가하여 반응을 종료시켰다. 그 후 410과 570 nm 의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
저해 퍼센트는 다음의 식으로 계산할 수 있다.
%저해 = (Ano inhibitor-Ainhibitor)/(Ano inhibitor) * 100
대조 실험으로 쿠커비투릴에 공유결합된 갈락토오스 다량체 대신 단당류인 갈락토오스를 이용하여 실험하였다. 각각의 실험을 두 번씩 반복하였다. 아래의 표 1은 실험 결과를 보여준다. IC50 값은 코팅된 항원의 50%을 저해하는 데에 필요한 농도를 말한다. rel potency 는 쿠커비투릴에 결합된 12개의 갈락토오스 다량체를 하나의 갈락토오스로 환산하였을때 상대적인 저해 능력을 외삽한 것이다. 단당류 갈락토오스보다 8.77배의 저해능력을 보임을 알 수 있다.
[표 1]
| 화합물 | IC50 (mM) | rel potency |
| 쿠커비투릴에 공유결합된 갈락토오스 다량체 | 0.09 | 8.77 |
| 갈락토오스 | 9.47 | 1.00 |
실시예 7
쿠커비투릴에 공유결합된 탄수화물 다량체와 독소루비신 약물 복합체의 특정세포 상호작용 확인 실험
상기의 쿠커비투릴에 공유결합된 탄수화물 다량체들이 특정한 세포만을 선택적으로 인지하여 약물을 전달하는지를 확인하기 위하여 형광실험을 실시하였다. 먼저 상기 화학식 3의 갈락토오스 다량체와 글루코스 다량체를 합성 하였다(화학식 3에서 m=5, p1=3, q1=0, r1=1, R=히드록시기). 그리고 이러한 다량체의 쿠커비투릴 공동에 약리활성 물질을 비공유적으로 결합시키기 위하여, 항암제로 잘 알려진 독소루비신(Doxorubin) 화합물의 카르복실기와 쿠커비투릴의 앵커링 에이전트인 스퍼미딘(spermidine)의 아민기를 아마이드 결합으로 공유결합시켜, 스퍼미딘-독소루비신 접합체를 합성하였다(화학식 8의 A=스퍼미딘, T=독소루비신). 독소루비신은 방향족 고리화합물로서 자외선 활성을 가지므로 형광물질의 기능도 할 수 있다.
실험을 위하여, 갈락토오즈 수용체를 갖는 세포로 잘 알려진 쥐의 간암세포 RLC-16을 37℃, pH 7.3의 포스페이트 버퍼 수용액속에서 배양해 두었다. 이후 쿠커비투릴에 공유결합된 갈락토오즈 다량체 2.5 mM과 스퍼미딘-독소루비신 접합체 1 mM을 혼합한 용액을 상기의 RLC-16 세포와 함께 10분간 배양한 후, 포스페이트 버퍼 수용액으로 두 번 세척하였다. 이 후 형광현미경으로 위의 세포를 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 하부 사진은 현미경 사진이며, 도 1의 상부 사진은 그것의 형광이미지로서 붉은색의 형광을 나타내는 것을 볼 수 있다. RLC-16 세포의 갈락토오즈 수용체가 갈락토오즈 다량체를 인식하여 그것을 함입함으로서 갈락토오즈에 비공유결합되었던 스퍼미딘-독소루비신 접합체가 세포안으로 들어갈 수 있게 되어, 형광을 나타낸 것이다.
대조실험을 위하여, 쿠커비투릴에 공유결합된 글루코오즈 다량체 2.5 mM과 스퍼미딘-독소루비신 접합체 1mM을 혼합한 용액을 상기의 RLC-16 세포와 함께 10분간 배양한 후, 포스페이트 버퍼 수용액으로 두 번 세척하였다. 이 후 형광현미경으로 위의 세포를 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 하부 사진은 현미경 사진이며, 상부 사진은 형광이미지로서 형광이 나타나지 않은 것을 볼 수 있다. RLC-16 세포의 갈락토오즈 수용체는 글루코오즈 다량체를 인식하지 못하여, 갈락토오즈에 비공유결합되어있는 스퍼미딘-독소루비신 접합체가 세포안으로 들어갈 수 없었기 때문에 형광을 내지 못한 것이다.
상기한 바와 같이, 본 발명이 제공하는 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 공유결합된 탄수화물 다량체는 특정한 단백질이 중재하는 생물학적인 과정을 방해하는 단백질 저해제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 사이클로덱스트린에 결합된 탄수화물 다량체보다 앵커링 에이전트가 쿠커비투릴 거대분자 내 공극에 더 안정적인 비공유결합에 의해 포접됨으로써, 앵커링 에이전트에 스페이서를 경유하여 결합된되는 약리활성물질과 복합체를 형성하므로, 약리활성물질을 원하는 세포에 선택적이며, 더욱 효율적으로 전달할 수 있다. 더 나아가, 쿠커비투릴에 잘 포접되는 앵커링 에이전트를 고체 기판 상에 스페이서를 경유하여 공유 결합시킴으로써 탄수화물칩 또는 단백질칩을 제조할 수 있다.
Claims (15)
1 개 이상의 탄수화물 유도체가 하기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체 단일분자의 A1 또는 A2와 공유결합하여 형성되며, 상기 탄수화물 유도체가 상기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체에 공유결합되는 부분은 하기 화학식 2의 당 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 공유결합된 탄수화물 다량체:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
n은 4 내지 20의 정수이고,
A1 및 A2는 각각 독립적으로 말단이 불포화결합인 C1-C20 알케닐옥시기, C1-C20 알키닐옥시기, C1-C20 알킬기를 갖는 카르복시알킬설파닐옥시기, C2-C8 알킬기를 갖는 카르복시알킬옥시기, C2-C8 알킬기를 갖는 아미노알킬옥시기, 및 C2-C8 알킬기를 갖는 히드록시알킬옥시기로 구성된 그룹에서 선택되며,
[화학식 2]
상기 화학식 2에서,
m은 3 또는 4의 정수이고,
R은 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, C1-C8 히드록시알킬기, C1-C8 알킬기를 갖는 알킬옥시기로 구성된 그룹에서 선택되고,
R'은 C3-C8를 갖는 알킬티올, C3-C8 알킬아민, C3-C8의 알킬기를 갖는 에폭시알킬옥시알킬, C3-C8의 알킬기를 갖는 이소시안염, C3-C8의 알킬기를 갖는 이소티오시안염, 및 C3-C8의 알킬아지도로 구성된 그룹에서 선택되며,
상기 탄수화물 다량체를 구성하는 1 개 이상의 탄수화물 유도체는 서로 동일하거나 다를 수 있다.
제 1 항에 있어서, 상기 탄수화물 유도체는 단당류, 이당류, 또는 다당류인 것을 특징으로 하는 탄수화물 다량체.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 2의 당 구조가 상기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 하기 화학식 3과 같이 공유결합되는 것을 특징으로 하는 탄수화물 다량체:
[화학식 3]
상기 화학식 3에서,
m 및 R은 제1항에서 정의된 바와 같고,
p1, q1, 및 r1은 각각 독립적으로 0 내지 20의 정수이다.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 2의 당 구조가 상기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 하기 화학식 4와 같이 공유결합되는 것을 특징으로 하는 탄수화물 다량체:
[화학식 4]
상기 화학식 4에서,
m 및 R은 제1항에서 정의된 바와 같고,
X는 C1-C20 알킬기를 갖는 알킬설피도알킬기 또는 C1-C20 알킬기이고, 이들 알킬기 중의 적어도 하나 이상의 수소원자는 할로겐원자, 히드록시기, 시아노기, 아미노기, 또는 니트로기로 구성된 그룹에서 선택된 치환기로 치환될 수 있으며,
q2 는 0 내지 20의 정수이다.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 2의 당 구조가 상기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 하기 화학식 5와 같이 공유결합되는 것을 특징으로 하는 탄수화물 다량체:
[화학식 5]
상기 화학식 5에서,
m 및 R은 제1항에서 정의된 바와 같고,
p3, q3, 및 r3은 각각 독립적으로 0 내지 20의 정수이다.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 2의 당 구조가 상기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 하기 화학식 6과 같이 공유결합되는 것을 특징으로 하는 탄수화물 다량체:
[화학식 6]
상기 화학식 6에서,
m 및 R은 제1항에서 정의된 바와 같고,
p4, q4, 및 r4은 각각 독립적으로 0 내지 20의 정수이다.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 2의 당 구조가 상기 화학식 1의 쿠커비투릴 유도체 단일 분자에 하기 화학식 7과 같이 공유결합되는 것을 특징으로 하는 탄수화물 다량체:
[화학식 7]
상기 화학식 7에서,
m 및 R은 제1항에서 정의된 바와 같고,
p5, q5, 및 r5는 각각 독립적으로 0 내지 20의 정수이다.
제 1 항, 제 2 항, 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 탄수화물 다량체를 인 비트로(in vitro) 단백질 억제제로서 사용하는 방법.
삭제
삭제
삭제
스페이서를 경유하여 약물이 결합된 앵커링 에이전트가 제 1 항, 제 2 항, 및 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 탄수화물 다량체의 쿠커비투릴 유도체의 공동에 포접된, 탄수화물 다량체, 앵커링 에이전트, 스페이서, 및 약물의 복합체.
삭제
삭제
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