JP7335472B2

JP7335472B2 - 生体適合性磁性材料

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Publication number: JP7335472B2
Application number: JP2019011014A
Authority: JP
Inventors: 謝文元; 許源宏; 黄嘉▲ウェン▼; 魏明正; 陳志隆; 王先知
Original assignee: メガプロバイオメディカルカンパニーリミテッド
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2023-08-30
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: EP3524276B1; AU2019200753A1; JP2019137674A; EP3524276A1; DK3524276T3; CN110157000A; ES2903387T3; US20220080057A1; TWI811297B; KR20190098064A; AU2019200753B2; US20190247522A1; TW201936212A; CN110157000B; CA3032985A1

Description

酸化鉄ナノ粒子は、化学的安定性及び好適な磁化により磁気共鳴画像（ＭＲＩ）に対する造影剤として有用である。マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）及びマグヘマイト（γ－Ｆｅ_２Ｏ_３）は超常磁性酸化鉄ナノ粒子の二例である。

これらの酸化鉄ナノ粒子は、生体適合性ポリマーとコンジュゲートさせることで、生体適合性磁性材料、例えばＭＲＩ造影剤を形成することができる。

通常、Ｆｅ_３Ｏ_４磁性ナノ粒子は、Ｆｅ（ＩＩ）塩及びＦｅ（ＩＩＩ）塩の混合物を使用して合成される。理論上、Ｆｅ_３Ｏ_４磁性ナノ粒子は、全鉄イオンに関して約３３％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含む。それと異なり、γ－Ｆｅ_２Ｏ_３磁性ナノ粒子は０％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含む。

Ｆｅ_３Ｏ_４は、γ－Ｆｅ_２Ｏ_３より強いＴ_２短縮効果、すなわち高い緩和度ｒ２を提供する。例えば、非特許文献１及び非特許文献２を参照されたい。一方、Ｆｅ_３Ｏ_４ナノ粒子は、γ－Ｆｅ_２Ｏ_３ナノ粒子よりもヒドロキシルラジカルの産生に極めて有効であり、その結果、臨床適用では、Ｆｅ_３Ｏ_４はγ－Ｆｅ_２Ｏ_３と比較してより高い毒性を誘導し得る。例えば、非特許文献３及び非特許文献４を参照されたい。

Basti et al., J Colloid Interface Sci., 2010, 341: 248-254 Li et al., Theranostics, 2013, 3(8): 595-615 Park et al., Arch Toxicol., 2014, 88(8):1607-1618 Wu et al., Journal of Food and Drug Analysis, 2014, 22, 86-94

高い緩和度及び低い毒性を有する新たな生体適合性磁性材料を開発する必要がある。

本発明は、高い緩和度及び低い毒性を有するＭＲＩ造影剤として使用することが可能な特定の生体適合性磁性材料に関する。

本発明の一態様では、本発明は、酸化鉄ナノ粒子と、それぞれ下記式（Ｉ）：
を有し、上記酸化鉄ナノ粒子に共有結合されている１以上の生体適合性ポリマーとを含む生体適合性磁性材料を包含する。

この式では、ＲはＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_６アルキニル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１～Ｃ_１０カルボニル基、又はＣ_１～Ｃ_１０アミン基であり、Ｌはリンカーであり、ｘは１～１０であり、かつｙは５～１０００である。

特に、生体適合性磁性材料はそれぞれ、全鉄イオンに対して４％～１５％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含む。

酸化鉄ナノ粒子は、生体適合性磁性材料に含まれるものと同じ又はそれとは異なるＦｅ（ＩＩ）含有量を有し得る。例示的な酸化鉄ナノ粒子は、その全鉄イオンに対して４％～１５％（例えば４％～１０％及び４％～８％）のＦｅ（ＩＩ）イオンを含む。

上記式（Ｉ）に関して、リンカーＬは、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、２個のカルボニル基と、２個～２０個の炭素原子とを含むカルボニル部分、又は下記式：
（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｔは、それぞれ独立して１～６であり、ＷはＯ、Ｓ又はＮＲ_ｂであり、Ｌ_１、Ｌ_３、Ｌ_５、Ｌ_７及びＬ_９は、それぞれ独立して、結合、Ｏ、Ｓ又はＮＲ_ｃであり、Ｌ_２、Ｌ_４、Ｌ_６、Ｌ_８及びＬ_１０は、それぞれ独立して、結合、Ｏ、Ｓ又はＮＲ_ｄであり、かつＶはＯＲ_ｅ、ＳＲ_ｆ又はＮＲ_ｇＲ_ｈであり、Ｒ_ａ、Ｒ_ｂ、Ｒ_ｃ、Ｒ_ｄ、Ｒ_ｅ、Ｒ_ｆ、Ｒ_ｇ及びＲ_ｈは、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０ヘテロアルキル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールである）の１つを有する基であり得る。

本明細書において「アルキル」の用語は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル及びヘキシル等の飽和、直鎖又は分岐鎖の炭化水素部分を指す。「アルケニル」の用語は、－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ_３及び－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ_２－等の少なくとも１つの二重結合を含む直鎖又は分岐鎖の炭化水素部分を指す。「アルキニル」の用語は、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ_３及び－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ_２－等の少なくとも１つの三重結合を含む直鎖又は分岐鎖の炭化水素部分を指す。「シクロアルキル」の用語は、シクロヘキシル及びシクロヘキシレン等の飽和環状炭化水素部分を指す。「ヘテロシクロアルキル」の用語は、ピペラジニル及びピペリジニル等のＮ、Ｏ、Ｐ、Ｂ、Ｓ、Ｓｉ、Ｓｂ、Ａｌ、Ｓｎ、Ａｓ、Ｓｅ及びＧｅから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む飽和環状炭化水素部分を指す。

本明細書において「ヘテロアルキル」の用語は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｂ、Ｓ、Ｓｉ、Ｓｂ、Ａｌ、Ｓｎ、Ａｓ、Ｓｅ、及びＧｅから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む脂肪族部分を指す。ヘテロアルキルの例として、メトキシメチル及びメチルアミノエチルが挙げられる。

本明細書において「アリール」の用語は、Ｃ_６単環式の、Ｃ_１０二環式の、Ｃ_１４三環式の、Ｃ_２０四環式の、又はＣ_２４五環式の芳香族環系を指す。アリール基の例として、フェニル、フェニレン、ナフチル、ナフチレン、アントラセニル、アントラセニレン、ピレニル及びピレニレンが挙げられる。本明細書において「ヘテロアリール」の用語は、１以上のヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、Ｓ又はＳｅ等）を有する、芳香族の５員～８員の単環式の、８員～１２員の二環式の、１１員～１４員の三環式の、及び１５員～２０員の四環式の環系を指す。ヘテロアリール基の例として、フリル、フリレン、フルオレニル、フルオレニレン、ピロリル、ピロリレン、チエニル、チエニレン、オキサゾリル、オキサゾリレン、イミダゾリル、イミダゾリレン、ベンズイミダゾリル、ベンズイミダゾリレン、チアゾリル、チアゾリレン、ピリジル、ピリジレン、ピリミジニル、ピリミジニレン、キナゾリニル、キナゾリニレン、キノリニル、キノリニレン、イソキノリル、イソキノリレン、インドリル及びインドリレンが挙げられる。

別段の指定がない限り、本明細書で言及されるアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアルキル、アリール、及びヘテロアリールは、置換及び非置換の両方の部分を含む。シクロアルキル、シクロアルキレン、シクロアルケニル、シクロアルケニレン、シクロアルキニル、シクロアルキニレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニレン、アリール及びヘテロアリール上の可能性のある置換基として、限定されないが、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_１０アルキニル、Ｃ_３～Ｃ_２０シクロアルキル、Ｃ_３～Ｃ_２０シクロアルケニル、Ｃ_３～Ｃ_２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ_３～Ｃ_２０ヘテロシクロアルケニル、Ｃ_１～Ｃ_１０アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アミノ、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルアミノ、Ｃ_２～Ｃ_２０ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルスルホンアミノ、アリールスルホンアミノ、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルイミノ、アリールイミノ、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルスルホンイミノ、アリールスルホンイミノ、ヒドロキシル、ハロ、チオ、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルチオ、アリールチオ、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アシルアミノ、アミノアシル、アミノチオアシル、アミド、アミジノ、グアニジン、ウレイド、チオウレイド（thioureido）、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、アシル、チオアシル、アシルオキシ、カルボキシル、及びカルボキシルエステル（carboxylic ester）が挙げられる。一方、脂肪族、ヘテロ脂肪族（heteroaliphatic）、オキシ脂肪族（oxyaliphatic）、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、及びアルキニレン上の可能性のある置換基として、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル以外の上に列挙される全ての置換基が挙げられる。また、シクロアルキル、シクロアルキレン、シクロアルケニル、シクロアルケニレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは、互いに融合されてもよい。

本発明によって、上に記載される生体適合性磁性材料を作製する方法が更に包含される。

上記方法は、（ｉ）第１の有機溶媒中に、全鉄イオンに対して４％～１５％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含む酸化鉄ナノ粒子を含む第１の溶液を準備する工程と、（ｉｉ）第２の有機溶媒中に式（Ｉ）の生体適合性ポリマーを含む第２の溶液を準備する工程と、（ｉｉｉ）第１の溶液と第２の溶液とを混合して混合溶液を得る工程と、（ｉｖ）上記混合溶液に水を添加し、得られた溶液を少なくとも２０時間に亘って撹拌して生体適合性磁性材料を得る工程との４工程を含む。

酸化鉄ナノ粒子は、不活性ガス雰囲気下で、水酸化物溶液と、Ｆｅ（ＩＩ）塩を含む鉄溶液とを混合することによって形成されることが好ましい。

１以上の実施形態の詳細を、以下の詳細な説明に示す。それらの実施形態のその他の特徴、課題及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。

ＩＯ－ＯＡ（バッチ４）のＸＲＰＤパターンを示す図である。ＩＯ－ＯＡ／ｍＰＥＧ－シラン－２０００（バッチ２）のＸＲＰＤパターンを示す図である。

酸化鉄ナノ粒子と、該酸化鉄ナノ粒子に共有結合されている１以上の生体適合性ポリマーとを含む生体適合性磁性材料が本明細書に詳細に開示される。

酸化鉄ナノ粒子は、１ｎｍ～１００ｎｍ（例えば２ｎｍ～５０ｎｍ及び５ｎｍ～２５ｎｍ）の粒子径を有する超常磁性コアであってもよい。超常磁性コアの作製は当該技術分野でよく知られている。Laurent et al., Chem. Rev., 2008, 108, 2064-2110を参照されたい。

酸化鉄ナノ粒子は、典型的には有機酸又はその塩で形成される。有機酸又は塩の例として、限定されないが、オレイン酸及びその塩が挙げられる。

酸化鉄ナノ粒子は、好ましくはその全鉄イオンに対して４％～１５％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含むことに留意する。例示的な酸化鉄ナノ粒子は、全鉄イオンに対して４％～１０％又は４％～８％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含む。酸化鉄ナノ粒子中のＦｅ（ＩＩ）イオンの含有量は、生体適合性磁性材料が高い緩和度及び低い毒性を発揮するのに重要である。より具体的には、低いＦｅ（ＩＩ）含有量、例えば、全鉄イオンに対して４％未満のＦｅ（ＩＩ）イオンは、典型的には低い緩和度を呈する。一方、高いＦｅ（ＩＩ）含有量、例えば、全鉄イオンに対して１５％よりも多いＦｅ（ＩＩ）イオンは、高い毒性を引き起こす可能性がある。

また、生体適合性磁性材料は、その生体適合性を強化するため１以上の生体適合性ポリマーを含む。生体適合性ポリマーは、それぞれ、下記式（Ｉ）：
（式中、変項Ｒ、Ｌ、ｘ及びｙは発明の概要の欄に定義される）を有する。

一実施形態において、酸化鉄ナノ粒子は、それぞれ下記式：
（式中、Ｒ_１はＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_６アルキニル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１～Ｃ_１０カルボニル基、又はＣ_１～Ｃ_１０アミン基であり、Ｒ_２は、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_６アルキニル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、ｘは１～１０であり、かつｙは５～１０００である）を有する１以上の生体適合性ポリマーに共有結合されている。

Ｒ_１はＣ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０カルボニル基、又はＣ_１～Ｃ_１０アミン基であり、Ｒ_２はＨ又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであることが好ましい。例えば、Ｒ_１はメチル（－ＣＨ_３）、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）又はアミノ（－ＮＨ_２）であり、Ｒ_２はＨである。

Ｒ_１がカルボキシル（－ＣＯＯＨ）又はアミノ（－ＮＨ_２）である場合、カルボキシル末端又はアミン末端の生体適合性ポリマーを、生体分子、例えば葉酸とカップリングすることができる。例えば、葉酸は、－ＣＯＮＨ－結合を形成することによって、アミン末端生体適合性ポリマーとのカップリングを可能とする。

本発明の生体適合性磁性材料は、生物学的用途に対する特異的標的剤にカップリングすることができる。特異的標的剤の例として、限定されないが、抗体、タンパク質、ペプチド、酵素、炭水化物、糖タンパク質、ヌクレオチド及び脂質が挙げられる。例示的な生体適合性磁性材料において、Ｒ_１は抗体（例えば、Ｍｙ１０）にカップリングされる。

上記の生体適合性磁性材料を作製する方法も本発明の範囲に含まれる。

ここでも、上記方法は、以下の工程：第１の有機溶媒に、全鉄イオンに対して４％～１５％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含む酸化鉄ナノ粒子を含む第１の溶液を準備する工程と、第２の有機溶媒に式（Ｉ）の生体適合性ポリマーを含む第２の溶液を準備する工程と、第１の溶液と第２の溶液とを混合して混合溶液を得る工程と、混合溶液に水を添加し、得られた溶液を少なくとも２０時間に亘って撹拌して生体適合性磁性材料を得る工程とを含む。

上記方法で使用される酸化鉄ナノ粒子は、典型的には不活性ガス雰囲気下で水酸化物溶液とＦｅ（ＩＩ）塩を含む鉄溶液とを混合することによって形成される。

例示的な鉄溶液は、Ｆｅ（ＩＩ）塩（例えばＦｅＣｌ_２）及びＦｅ（ＩＩＩ）塩（例えばＦｅＣｌ_３）を含み、ここで、Ｆｅ（ＩＩＩ）／Ｆｅ（ＩＩ）のモル比は、１．７０以上（例えば１．７５以上、１．８０以上、及び１．９０以上）である。

水酸化物溶液は、２Ｎ以下（例えば、１．５Ｎ以下、及び１Ｎ以下）の濃度を有する水酸化ナトリウム溶液であってもよい。

不活性ガスの例として、限定されないが、窒素及びアルゴンが挙げられる。

繰り返しになるが、酸化鉄ナノ粒子は、有機酸又はその塩で形成され得る。例示的な有機酸又は塩は、オレイン酸又はその塩である。オレイン酸が使用される場合、鉄１モル当たり１００ｍＬ以下（例えば、９０ｍＬ以下、７０ｍＬ以下及び５０ｍＬ以下）の量で存在し得る。

一例では、酸化鉄ナノ粒子は、オレイン酸と、ＦｅＣｌ_２及びＦｅＣｌ_３を含む鉄溶液とから形成されて、酸化鉄－オレイン酸ナノ粒子、すなわちＩＯ－ＯＡが得られる。この例示的な酸化鉄ナノ粒子は、次の通り、溶媒（例えば水）中でＦｅＣｌ_２及びＦｅＣｌ_３を混合することと、窒素下で水酸化ナトリウム溶液（例えば１Ｎ）を上の混合物に添加することと、そのようにして得られた溶液をオレイン酸で処理してＩＯ－ＯＡナノ粒子を形成させることとにより作製され得る。

酸化鉄ナノ粒子は、有機酸又はその塩による処理の後に水を除去し、それをトルエンに溶解し、そのようにして得られた液体を遠心分離して特定の大きな粒子を取り除くことによって収集されることが好ましい。

上記方法に使用される生体適合性ポリマーに関して、これらの生体適合性ポリマーは、そのポリマー自体だけでなく、該当する場合には、それらの塩及び溶媒和物が含まれる。塩は、例えば、陰イオンと、ポリマー上の正に荷電した基（例えば、アミノ）との間で形成され得る。適切な陰イオンとして、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオン、クエン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、酢酸イオン、リンゴ酸イオン、トシル酸イオン、酒石酸イオン、フマル酸イオン、グルタミン酸イオン、グルクロン酸イオン、乳酸イオン、グルタル酸イオン及びマレイン酸イオンが挙げられる。同様に、塩は、陽イオンと、ポリマー上の負に荷電した基（例えば、カルボキシレート）との間でも形成され得る。適切な陽イオンとして、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン及びアンモニウム陽イオン、例えばテトラメチルアンモニウムイオンが挙げられる。該ポリマーには、第四級窒素原子を含む塩も含まれる。溶媒和物は、ポリマーと薬学的に許容可能な溶媒との間で形成された複合体を指す。薬学的に許容可能な溶媒の例として、水、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸及びエタノールアミンが挙げられる。

以下のスキーム（Ｉ）は、例示的なシラン含有の生体適合性ポリマーを作製する方法を示している。

上のスキームに示されるように、アルコキシル－ポリエチレングリコール（分子量２０００）は、無水コハク酸と塩基（例えば、ジメチルアミノピリジン）の存在下で反応することで、ｍＰＥＧ－ＣＯＯＨを形成し、それは引き続き塩化チオニルを使用してｍＰＥＧ－ＣＯＣｌへと転化される。ｍＰＥＧ－ＣＯＣｌと（３－アミノプロピル）－トリエトキシシランとを混合することで、ｍＰＥＧ－シランが得られる。

当業者は、よく知られた方法を使用して生体適合性ポリマーを製造するためにスキーム（Ｉ）に示される方法を変更することができる。R. Larock著、「包括的有機変換（Comprehensive Organic Transformations）」（VCH出版社、1989）、T. W. Greene及びP. G. M. Wuts著、「有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）」（第３版、John Wiley and Sons 1999）、L. Fieser及びM. Fieser著、「フィーザーとフィーザーの有機合成用の試薬（Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis）」（John Wiley and Sons 1994）、並びにL. Paquette編、「有機合成用試薬の事典（Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis）」（John Wiley and Sons 1995）とそれらの後続版とを参照のこと。該生体適合性ポリマーを合成するために使用することができる具体的な経路は、（ａ）Rist et al., Molecules, 2005, 10, 1169-1178、（ｂ）Koheler et al., JACS, 2004, 126, 7206-7211、及び（ｃ）Zhang et al., Biom. mircod., 2004, 6:1 33-40に見出すことができる。

生体適合性磁性材料を作製する方法を行うため、上記の酸化鉄ナノ粒子を含む第１の溶液を第１の有機溶媒に形成し、上記の生体適合性ポリマーを含む第２の溶液を第２の有機溶媒に提供する。

第１の有機溶媒及び第２の有機溶媒は、それぞれ独立して、トルエン、脂肪族炭化水素、テトラヒドロフラン、ケトン、アルコール、アルキルエステル、又はそれらの組み合わせであってもよい。両方の有機溶媒がトルエンであることが好ましい。

第１の溶液と第２の溶液とを混合して混合溶液を得る際には、混合溶液に触媒として水を添加し、得られた溶液を少なくとも２０時間撹拌して生体適合性磁性材料を得る工程を行うことが重要である。

上に記載されるように、上記方法で使用される酸化鉄ナノ粒子は、その全鉄イオンに対して４％～１５％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含む。上記方法を行った後、そのようにして得られた生体適合性磁性材料は、典型的には、全鉄イオンに対して４％～１５％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含む。

上のスキーム（Ｉ）で合成された生体適合性ポリマーは、生体適合性を増加させるため酸化鉄ナノ粒子の表面を化学的に修飾することができる点で有用である。さらに、生体適合性ポリマーは、１以上の標的剤、蛍光剤、治療薬、又は診断薬に対する更なる反応性を粒子に与えるため、粒子（例えばナノ粒子、磁性粒子、磁性ナノ粒子、及び超常磁性粒子）を標識することができる点で有用である。

標的剤は、共有結合を介して生体適合性ポリマーにカップリングされることが好ましい。一般に使用される標的剤として、抗体、タンパク質、ペプチド、酵素、炭水化物、糖タンパク質、ヌクレオチド及び脂質が挙げられる。生体適合性磁性材料は、標的剤とのカップリング後、約３ｎｍ～５００ｎｍの直径を有し得る。当業者は、ナノ粒子に特異性を与えるため、ナノ粒子に任意の好適な標的剤を付けることができる。例えば、葉酸は、葉酸受容体により乳癌細胞を特定するために使用され得る。葉酸の構造は、アミン末端又はカルボキシ末端の生体適合性ポリマーとのカップリングを可能とする。例えば、葉酸は－ＣＯＮＨ－結合を形成することによって、アミン末端生体適合性ポリマーとのカップリングを可能とする。

更なる詳細がなくとも、当業者であれば、本明細書の記載に基づき、本実施形態を十二分に利用することができるものと思われる。以下の具体的な実施例は、単に説明のためとして解釈されるべきであり、如何なる場合にも決してその開示以外の部分を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用された全ての刊行物は、引用することによりそれらの全体が本明細書の一部をなす。

実施例１：生体適合性磁性材料の作製
２つの生体適合性磁性材料を以下に記載される手順に従って作製した。

酸化鉄－オレイン酸（ＩＯ－ＯＡ）ナノ粒子の作製
ＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ（９００ｇ、４．５３モル）と、ＦｅＣｌ_３（１３２７ｇ、８．１８モル）と、水（２３．６Ｌ）との混合物を１００Ｌ容のガラス反応器において２５℃、１５０ｒｐｍ～２００ｒｐｍで撹拌した。窒素下で水酸化ナトリウム溶液（１Ｎ）を０．２ｋｇ／分～０．３ｋｇ／分の速度で反応器に添加し、ｐＨ値１１～１２を生じた。その後、オレイン酸（８００ｍＬ、鉄１モル当たり６３ｍＬ）を添加し、得られた混合物を更に６０分間撹拌することにより、水溶液中に黒っぽいペーストとしてＩＯ－ＯＡナノ粒子を形成させた。水溶液のｐＨを塩酸（３Ｎ）によって１～２のｐＨ値に調整した後、水を除去した。その後、トルエン１２Ｌを残りの黒っぽいペーストに添加し、トルエン溶液中に粗製ＩＯ－ＯＡナノ粒子を懸濁した。トルエン中の粗製ＩＯ－ＯＡナノ粒子を６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、トルエン中にＩＯ－ＯＡナノ粒子を得た。

生体適合性ポリマーのｍＰＥＧ－シラン－７５０及びｍＰＥＧ－シラン－２０００の作製
生体適合性ポリマーのｍＰＥＧ－シラン－７５０を、以下の手順に従って作製した。メトキシ－ＰＥＧ（ｍＰＥＧ、分子量７５０）３００ｇ（０．４モル）と、無水コハク酸（４８ｇ、０．４８モル）と、４－ジメチルアミノ－ピリジン（ＤＭＡＰ、１９．５ｇ、０．１５９モル）との混合物を、１０００ｍＬ容の丸底フラスコ内にて真空（２０Ｔｏｒｒ）下で２時間に亘って静置した。その混合物にトルエン６００ｍＬを添加し、次いでそれを３０℃で１日間に亘って撹拌することで、ｍＰＥＧ－ＣＯＯＨを形成させた。引き続き、塩化チオニル３６ｍＬ（０．４８モル）を１ｍＬ／分の速度で添加し、その混合物を２時間～３時間に亘って撹拌した。その後に、トリエチルアミン３３３．８ｍＬ（２．４モル）を１ｍＬ／分の速度で添加することで、約６～７のｐＨが得られた。室温に冷やした後に、ｍＰＥＧ－ＣＯＣｌを含有する混合物を、３－アミノプロピルトリエトキシシラン９４．５ｍＬ（０．４モル）と室温で少なくとも８時間に亘って反応させることで、粗製ｍＰＥＧ－シラン－７５０が得られた。粗製ｍＰＥＧ－シラン－７５０は、上記反応混合物にイソプロピルエーテル９Ｌを添加した後に析出した。固体生成物を濾過により回収し、トルエン５００ｍＬ中に再溶解させ、５０００ｒｐｍで５分間に亘って遠心分離して上清を回収し、そこにイソプロピルエーテル９Ｌを添加した。イソプロピルエーテルから褐色の油状液体が分離し、それを真空下で乾燥させることで、生体適合性ポリマーのｍＰＥＧ－シラン－７５０を得た。

生体適合性ポリマーのｍＰＥＧ－シラン－２０００を以下通り作製した。ディーン・スタークトラップ（Dean-Stark Trap）を備える２０Ｌ容の反応槽にメトキシ－ＰＥＧ（ｍＰＥＧ、分子量２０００）（３ｋｇ）を添加した。トルエン１５Ｌを反応槽に添加し、反応混合物を機械的撹拌器により１５０±２０ｒｐｍで撹拌した。反応を１２０℃で行い、６０分間還流した。その後、無水コハク酸（ＳＡ、１８０ｇ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、７０ｇ）を反応槽に添加し、６５℃で２０時間反応を継続させてｍＰＥＧ－ＣＯＯＨを形成させた。その後、塩化チオニル（ＳＯＣｌ_２）１７０ｇを反応槽に添加し、反応の間、Ｎ_２ガスブランケットで覆って、３時間反応を継続させた。その後、トリエチルアミン（ＴＥＡ、４３６ｇ）を反応槽に添加し、２５０ｒｐｍで撹拌した。室温まで冷却した後、ｍＰＥＧ－ＣＯＣｌを含む混合物を、室温で少なくとも８時間に亘って３－アミノプロピルトリエトキシシラン３００ｇと反応させ、粗製ｍＰＥＧ－シラン－２０００を生じた。その後、そのようにして得られた粗製物を濾過して塩を除去し、ｍＰＥＧ－シラン－２０００として透明な褐色溶液を得た。

生体適合性ポリマーのＣＯＯＨ－ＰＥＧ－シラン－７５０及びＣＯＯＨ－ＰＥＧ－シラン－２０００の作製
ＰＥＧ（分子量：７５０）３００ｇ（０．４モル）及びＮ－メチル－２－ピロリドン６００ｍＬを１０００ｍＬ容の丸底フラスコに入れ、２時間超に亘って真空（２０Ｔｏｒｒ）下で６０℃まで加熱した。無水コハク酸８８ｇ（０．８８モル）及び４－ジメチルアミノ－ピリジン（ＤＭＡＰ）１９．５ｇ（０．１６モル）を添加して、３０℃で２日間反応させることでジカルボキシ末端ＰＥＧ（ＣＯＯＨ－ＰＥＧ）を得た。

塩化チオニル３６ｍｌ（０．４８モル）を１ｍＬ／分の速度で添加し、２時間～３時間撹拌した。その後、トリエチルアミン１３３．８ｍＬ（０．９６モル）を１ｍＬ／分の速度で添加した。次いで、３－アミノプロピルトリエトキシシラン９４．５ｍＬ（０．４モル）を添加し、少なくとも１２時間反応させた。反応混合物を冷イソプロピルエーテル９Ｌに添加し、再析出させ、得られた析出物を収集し、ジクロロメタン１００ｍＬに再度溶解した。そのようにして得られた混合物を、冷イソプロピルエーテル９Ｌに再び添加して、再析出させた。灰白色の析出物を収集し、真空下で２日間乾燥させることで生体適合性ポリマー、すなわちＣＯＯＨ－ＰＥＧ－シラン－７５０を得た。

ＰＥＧ（ＰＥＧ、分子量２０００）８００ｇ（０．４モル）と、無水コハク酸（８８ｇ、０．８８モル）と、４－ジメチルアミノ－ピリジン（ＤＭＡＰ、１９．５ｇ、０．１６モル）との混合物を使用して、上に記載されるのと同じ手順に従って生体適合性ポリマーＣＯＯＨ－ｍＰＥＧ－シラン－２０００を作製した。

ｍＰＥＧ－シラン－２０００による生体適合性磁性材料の作製
以下の通り、トルエン中でｍＰＥＧ－シラン－２０００を酸化鉄ナノ粒子、すなわちＩＯ－ＯＡナノ粒子とコンジュゲートさせることによって生体適合性磁性材料を作製した。

ＩＯ－ＯＡナノ粒子のトルエン溶液（６ｍｇＦｅ／ｍＬ、７００ｍＬ）とｍＰＥＧ－シラン－２０００のトルエン溶液（１６０ｍｇ／ｍＬ、５００ｍＬ）とを２Ｌ容の丸底フラスコで混合して、得られた溶液に水を添加した。２４時間の反応の後、ｍＰＥＧ－シラン－２０００コンジュゲート酸化鉄ナノ粒子を水によって抽出し、濾過して大きな粒子を除去し、透明な水溶液を得た。得られた水溶液を精製し、限外濾過装置で濃縮して、ＩＯ－ＯＡ／ｍＰＥＧ－シラン－２０００と称される生体適合性磁性材料を得た。

ＣＯＯＨ－ＰＥＧ－シラン－２０００による生体適合性磁性材料の作製
２５０ｇのＣＯＯＨ－ｍＰＥＧ－シラン－２０００を１０ｇのＦｅのＩＯ－ＯＡナノ粒子を含むトルエン溶液１Ｌ～１．２Ｌに添加した。得られた混合物を２時間～３時間、超音波処理した。１．５Ｌの脱イオン水を添加した後、その混合物を限外濾過装置によって精製し、１００ｍＬまで濃縮して、ＩＯ－ＯＡ／ＣＯＯＨ－ＰＥＧ－シラン－２０００と称される生体適合性磁性材料を得た。

実施例２：酸化鉄ナノ粒子及び生体適合性磁性材料の特性評価
実施例１で作製された生体適合性磁性材料と並んで、特定の酸化鉄ナノ粒子を以下の通り特性評価するため研究を行った。

Ｆｅ（ＩＩ）イオンの特定
酸化鉄ナノ粒子及び生体適合性磁性材料のＦｅ（ＩＩ）／Ｆｅ（ＩＩＩ）イオン比を、ＩｒｏｎＴｅｓｔキット（Ｓｐｅｃｔｒｏｑｕａｎｔ１．００７９６．０００１、Merck）によって測定した。検査キット中の試薬、すなわち、１，１０－フェナントロリンはＦｅ（ＩＩＩ）イオンではなくＦｅ（ＩＩ）イオンに感受性であった。緩衝培質では、Ｆｅ（ＩＩ）イオンは１，１０－フェナントロリンと反応して、測光によって特定された赤色の複合体を形成した。試験酸化鉄ナノ粒子又は生体適合性磁性材料は、硫酸の添加によって最初に鉄イオンに分解され、得られた溶液のｐＨを０．８ＭＮａＨＣＯ_３を使用して２～８に調整した。Ｆｅ（ＩＩ）イオンは処理の間Ｆｅ（ＩＩＩ）イオンに変換されなかったことが観察された。アスコルビン酸を添加せずに、Ｆｅ（ＩＩ）イオンのみの含有量を測定した。アスコルビン酸を添加して、全ての鉄イオンをＦｅ（ＩＩ）イオンに変換することで、全鉄イオンを更に測定した。Ｆｅ（ＩＩ）イオンの含有量は、全鉄イオンに対して約４％～１５％であることが特定された。詳細な結果を下記表１に示す。またこの表には、市販の薬剤であるＦｅｒａｈｅｍｅについて１．２６％のＦｅ（ＩＩ）の含有量が含まれていることに留意する。

これらの結果は、本発明の生体適合性磁性材料が予想外なことに、Ｆｅｒａｈｅｍｅと比較してはるかに高いＦｅ（ＩＩ）含有量を呈したことを示す。

Ｘ線粉末回析（ＸＲＰＤ）
特定の酸化鉄ナノ粒子及び生体適合性磁性材料の構造をＸＲＰＤによって以下の通り調査した。

試験試料を乾燥させて、ＸＲＰＤ測定用に粉末形態を得た。図１及び図２は、ＩＯ－ＯＡ（バッチ４）及びＩＯ－ＯＡ／ｍＰＥＧ－シラン－２０００（バッチ２）に対するＸＲＰＤパターンを示す。

ＸＲＰＤにおけるγ－Ｆｅ_２Ｏ_３とＦｅ_３Ｏ_４との間の差を区別することができないため、これらの図は、ＩＯ－ＯＡ（バッチ４）及びＩＯ－ＯＡ／ｍＰＥＧ－シラン－２０００（バッチ２）の結晶性構造が、Ｆｅ_３Ｏ_４、γ－Ｆｅ_２Ｏ_３、又はＦｅ_３Ｏ_４とγ－Ｆｅ_２Ｏ_３との混合物である可能性を示す。

実施例３：緩和度測定
実施例１で作製された生体適合性磁性材料の緩和度と並んで、Ｆｅｒａｈｅｍｅについての緩和度を以下の通り測定して研究を行った。

酸化鉄溶液を様々な濃度（０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ及び０．５ｍＭ）で作製した。Bruker Corporation製のＭｉｎｉｓｐｅｃｍｑ２０によって、各溶液のＴ２緩和時間を測定した。縦軸としての緩和時間の逆数と、横軸としての溶液の濃度との間で直線関係が確立された。直線関係の勾配をｒ２緩和度と定めた。結果を下記表２に示す。

予想外なことに、上の表２に示されるように、全鉄に対して６．２９％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含むＩＯ－ＯＡ／ｍＰＥＧ－シラン－２０００（バッチ２）は、１７３（ｍＭ・ｓ）^－１のｒ２緩和度の値を呈した。極めて対照的に、全鉄に対して１．２６％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含むＦｅｒａｈｅｍｅは、６９（ｍＭ・ｓ）^－１のｒ２緩和度の値を呈した。

これらの結果は、本発明の生体適合性磁性材料が、予想外なことに、Ｆｅｒａｈｅｍｅと比較してはるかに高いｒ２緩和度を呈したことを示す。

実施例４：特異的標的剤とのカップリング
以下に本発明の生体適合性磁性材料を特異的標的剤とカップリングさせるプロトコルを記載する。

葉酸塩とのカップリング
葉酸溶液（葉酸塩／ジメチルスルホキシド：１０ｍｇ／ｍＬ）２２６μＬを５０ｍＬ容の褐色丸底フラスコに入れた。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５ｍＬ及びジシクロヘキシルカルボジイミド溶液（ジシクロヘキシルカルボジイミド／ＤＭＳＯ：５ｍｇ／ｍＬ）１７６．５μＬを上記溶液に添加し、１時間撹拌した。その後、ＮＨＳ溶液（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド／ＤＭＳＯ：５ｍｇ／ｍＬ）９８．５μｌを添加し、更に１時間撹拌した。その後、エチレンジアミン２８９μＬを添加して、溶液Ａを得た。

ＩＯ－ＯＡ／ＣＯＯＨ－ＰＥＧ－シラン－２０００（４．４８ｍｇＦｅ／ｍＬ）１ｍＬ及びＤＭＳＯ１０ｍｌを真空下で５０ｍＬ容の丸底フラスコに入れた。ジシクロヘキシルカルボジイミド溶液（ジシクロヘキシルカルボジイミド／ＤＭＳＯ：５ｍｇ／ｍＬ）１７６．５μｌを上記溶液に添加し、１時間撹拌した。その後、ＮＨＳ溶液（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド／ＤＭＳＯ：５ｍｇ／ｍＬ）９８．５μｌを添加し、更に１時間撹拌して溶液Ｂを得た。

２８９μＬの溶液Ａを溶液Ｂに添加し、得られた溶液を８時間撹拌した。得られた溶液を透析膜（Ｍｗ：３０００）に添加し、蒸留水を透析に使用した。その後、得られた溶液を限外濾過装置によって２ｍＬまで濃縮し、標的剤とカップリングされた生体適合性磁性材料、すなわち葉酸塩コンジュゲートＩＯ－ＯＡ／ＣＯＯＨ－ＰＥＧ－シラン－２０００を得た。

抗体とのカップリング
ＩＯ－ＯＡ／ＣＯＯＨ－ＰＥＧ－シラン－２０００（４．４８ｍｇＦｅ／ｍＬ）を、冷脱イオン水５ｍＬと混合して、氷浴で維持した。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１０^－６モル）を上記溶液に添加し、３０分間撹拌した。次いで、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（１０^－６モル）をその混合物に添加し、更に３０分間撹拌した。抗体Ｍｙ１０（１ｍＬ、２μｇ／ｍＬ）を得られた混合物に添加し、２時間反応させた。そのようにして得られた溶液を、磁力選別装置を通過させることによって精製して、抗体とカップリングした生体適合性磁性材料、すなわちＭｙ１０コンジュゲートＩＯ－ＯＡ／ＣＯＯＨ－ＰＥＧ－シラン－２０００を得た。

他の実施形態
本明細書で開示された特徴は全てあらゆる組合せで組み合わせることができる。本明細書で開示される各特徴は同じ、同等の、又は同様の目的を果たす代替特徴に置き換えることができる。そのため特に明記しない限り、開示される各特徴は一連の包括的な同等又は同様の特徴の例にすぎない。

上記記載から、当業者であれば記載された実施形態の本質的な特性を容易に確かめることができ、その趣旨及び範囲から逸脱せずに、実施形態の様々な変更及び修正を行うことで、実施形態を様々な用法及び条件に適合させることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。開示された実施形態に様々な変更及び変化を加えることができることは、当業者には明白であろう。明細書及び実施例は例示的なものに過ぎないと解釈され、本開示の真の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物によって指示されることが意図される。

Claims

生体適合性磁性材料であって、
酸化鉄－有機酸ナノ粒子と、
それぞれ下記式（Ｉ）：

（式中、
ＲはＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_６アルキニル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１～Ｃ_１０カルボニル基、又はＣ_１～Ｃ_１０アミン基であり、
Ｌはリンカーであり、
ｘは１～１０であり、かつ、
ｙは５～１０００である）を有し、前記酸化鉄－有機酸ナノ粒子に共有結合されている１以上の生体適合性ポリマーと、
を含み、ここで、前記酸化鉄－有機酸ナノ粒子が、全鉄イオンに対して４％～１０％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含む、
生体適合性磁性材料。
前記酸化鉄－有機酸ナノ粒子が、全鉄イオンに対して４％～８％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含む、請求項１に記載の生体適合性磁性材料。
前記酸化鉄－有機酸ナノ粒子が、酸化鉄－オレイン酸ナノ粒子である、請求項１に記載の生体適合性磁性材料。
前記リンカーが、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、２個のカルボニル基と、２個～２０個の炭素原子とを含むカルボニル部分、又は下記式：

（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｔは、それぞれ独立して１～６であり、ＷはＯ、Ｓ又はＮＲ_ｂであり、Ｌ_１、Ｌ_３、Ｌ_５、Ｌ_７及びＬ_９は、それぞれ独立して、結合、Ｏ、Ｓ又はＮＲ_ｃであり、Ｌ_２、Ｌ_４、Ｌ_６、Ｌ_８及びＬ_１０は、それぞれ独立して、結合、Ｏ、Ｓ又はＮＲ_ｄであり、かつＶはＯＲ_ｅ、ＳＲ_ｆ又はＮＲ_ｇＲ_ｈであり、Ｒ_ａ、Ｒ_ｂ、Ｒ_ｃ、Ｒ_ｄ、Ｒ_ｅ、Ｒ_ｆ、Ｒ_ｇ及びＲ_ｈは、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０ヘテロアルキル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールである）の１つを有する基である、請求項１に記載の生体適合性磁性材料。
前記酸化鉄－有機酸ナノ粒子が、それぞれ下記式：

（式中、
Ｒ_１はＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_６アルキニル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１～Ｃ_１０カルボニル基、又はＣ_１～Ｃ_１０アミン基であり、
Ｒ_２はＨ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_６アルキニル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
ｘは１～１０であり、かつ、
ｙは５～１０００である）を有する１以上の生体適合性ポリマーに共有結合されている、請求項１に記載の生体適合性磁性材料。
Ｒ_１がＣ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_１～Ｃ_１０カルボニル基、又はＣ_１～Ｃ_１０アミン基であり、Ｒ_２がＨ又はＣ_１～Ｃ_６アルキルであり、Ｒ _１が任意にメチル、カルボキシル又はアミノであり、Ｒ _２が任意にＨである、請求項５に記載の生体適合性磁性材料。
Ｒ_１が、抗体、タンパク質、ペプチド、酵素、炭水化物、糖タンパク質、ヌクレオチド、及び脂質からなる群から選択される特異的標的剤にカップリングされており、前記特異的標的剤が任意に抗体である、請求項５に記載の生体適合性磁性材料。
前記酸化鉄－有機酸ナノ粒子が、それぞれ下記式：

（式中、Ｒ_１はメチル又はカルボキシルであり、Ｒ_２はＨであり、ｘは１～１０であり、かつｙは５～１０００である）を有する１以上の生体適合性ポリマーに共有結合されている、請求項１に記載の生体適合性磁性材料。
請求項１に記載の生体適合性磁性材料を作製する方法であって、
全鉄イオンに対して４％～１０％のＦｅ（ＩＩ）イオンを含む酸化鉄－有機酸ナノ粒子を第１の有機溶媒中に含む第１の溶液を準備することと、
第２の有機溶媒に式（Ｉ）の生体適合性ポリマーを含む第２の溶液を準備することと、
前記第１の溶液と前記第２の溶液とを混合して混合溶液を得ることと、
前記混合溶液に水を添加し、得られた溶液を少なくとも２０時間に亘って撹拌して生体適合性磁性材料を得ることと、
を含み、
前記酸化鉄－有機酸ナノ粒子が、不活性ガス雰囲気下で、水酸化物溶液をＦｅ（ＩＩ）塩を含む鉄溶液と混合することによって形成され、前記鉄溶液が１．７０以上のＦｅ（ＩＩＩ）／Ｆｅ（ＩＩ）のモル比でＦｅ（ＩＩ）塩及びＦｅ（ＩＩＩ）塩を含み、前記酸化鉄－有機酸ナノ粒子が、鉄１モル当たり１００ｍＬ以下の量のオレイン酸を添加することで形成される、
方法。
前記第１の有機溶媒及び前記第２の有機溶媒が、それぞれ独立して、トルエン、脂肪族炭化水素、テトラヒドロフラン、ケトン、アルコール、アルキルエステル、又はそれらの組み合わせであり、前記不活性ガスが窒素又はアルゴンである、請求項９に記載の方法。