ES2969318T3

ES2969318T3 - Método para el seguimiento de células inmunes

Info

Publication number: ES2969318T3
Application number: ES15176539T
Authority: ES
Inventors: Chih-Lung Chen; Wen-Yuan Hsieh; Chen-Hsuan Lin; Shian-Jy Wang
Original assignee: Megapro Biomedical Co Ltd
Current assignee: Megapro Biomedical Co Ltd
Priority date: 2014-07-14
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2024-05-17
Anticipated expiration: 2035-07-13
Also published as: US20240000978A1; WO2016008395A1; US20160008491A1; TW201601761A; EP2974745A1; CN107073140A; CN112472825A; TWI745272B; EP2974745B1; JP2017529119A; JP6817930B2; EP2974745C0

Abstract

Un método de seguimiento de células inmunitarias para detectar la respuesta inmunitaria. El método incluye pasos para identificar a un paciente que tiene una enfermedad asociada con un órgano; administrar nanopartículas magnéticas biocompatibles en el torrente sanguíneo del paciente; y obtención de una imagen de resonancia magnética del órgano. La presencia de manchas hiperintensas o hipointensas en la imagen de resonancia magnética indica respuesta inmune en el paciente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para el seguimiento de células inmunes

Antecedentes

El seguimiento de células inmunes, que se refiere a monitorizar la migración y acumulación de células inmunes, puede detectar efectivamente la respuesta inmune tal como el rechazo inmune, una de las principales causas de fallo funcional en pacientes que han recibido un trasplante de órgano.

La respuesta inmune generalmente se monitoriza analizando periódicamente muestras de biopsia (por ejemplo, una muestra de biopsia endomiocárdica) para detectar la presencia de células inmunes (por ejemplo, células T y macrófagos) en un órgano asociado a una enfermedad.

Este procedimiento de monitorización tiene varios inconvenientes. En primer lugar, al ser un procedimiento invasivo, tiende a provocar efectos secundarios adversos. Además, es propenso a errores de muestreo que pueden producir resultados de falso negativo. Además, a menudo no logra detectar el rechazo temprano, agudo o crónico. Finalmente, es un procedimiento costoso.

El seguimiento de células inmunes también se puede lograr administrando a los pacientes células inmunes premarcadas con nanopartículas magnéticas. Este procedimiento requiere una etapa tediosa de preetiquetado de células inmunes ex-vivo.

Chih-Lung Chen et al., Molecular Imaging and Biology, vol. 13, núm. 5, pág. 825, informan de nanopartículas de óxido de hierro con una relaxividad r2 de 319,2 (mM.s)-1.

Es necesario desarrollar un método simple y no invasivo que sea sensible para seguir células inmunes y detectar signos tempranos de enfermedad.

Sumario

Se describen aquí nanopartículas magnéticas para su uso en un método simple y no invasivo para seguir células inmunes con nanopartículas magnéticas biocompatibles usando exploraciones de imágenes por resonancia magnética ("MRI"). El método proporciona una sensibilidad inesperadamente alta. La invención es tal como se define en las reivindicaciones. La invención se refiere a nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso en un método de seguimiento de células inmunes como se define en las reivindicaciones.

El método incluye las siguientes etapas: (i) identificar un paciente que tiene una enfermedad asociada a un órgano (por ejemplo, corazón, riñón o ganglio linfático); (ii) proporcionar una suspensión acuosa, libre de partículas de tamaño superior a<1 00 0>nm y que contiene nanopartículas magnéticas biocompatibles, (iii) administrar la suspensión acuosa en el torrente sanguíneo del paciente; y (iv) obtener posteriormente una imagen de resonancia magnética del órgano. La respuesta inmune se detecta cuando la imagen muestra la presencia de manchas hiperintensas o hipointensas (p. ej., MRI potenciada en T2, T2* o difusión que muestra manchas hipointensas o resonancia magnética potenciada en T1 que muestra manchas hiperintensas). Por ejemplo, la enfermedad es cáncer (p. ej., linfoma) o rechazo de un órgano trasplantado (p. ej., corazón o riñón).

En una realización, el método se usa para detectar el rechazo inmune, en la que la etapa (i) es para identificar a un paciente que tiene un órgano trasplantado y la etapa (iv) es para obtener una imagen de resonancia magnética potenciada en T2 del órgano trasplantado. El rechazo inmune se detecta entonces cuando la imagen muestra la presencia de manchas hipointensas.

El método descrito aquí usa un agente de contraste que contiene nanopartículas magnéticas biocompatibles para detectar la respuesta inmune con tecnología de MRI.

Cada una de las nanopartículas magnéticas biocompatibles contiene un núcleo superparamagnético que está cubierto por uno o más polímeros biocompatibles, cada uno de los cuales tiene un grupo polietilenglicol, un grupo silano y un conector que une, vía un enlace covalente, el grupo polietilenglicol y el grupo silano. Típicamente, estas nanopartículas magnéticas biocompatibles tienen cada una un tamaño de partícula de<1 0 - 1 0 0 0>nm y una tasa de relajación magnética transversal de 50-400. En un ejemplo, cada una de ellas tiene un tamaño de partícula de 15 a 200 nm y una tasa de relajación magnética transversal de 120 a 400.

Generalmente, el núcleo superparamagnético contiene un óxido de hierro, un óxido de cobalto, un óxido de níquel o una combinación de los mismos.

En cada uno de los polímeros biocompatibles, que cubren los núcleos superparamagnéticos, el grupo polietilenglicol normalmente tiene de 5 a 1000 unidades de oxietileno (p. ej., de 10 a 200 unidades de oxietileno), y el grupo silano típicamente contiene un grupo alquileno de C<1-10>(por ejemplo, un grupo alquileno de C<3>-C<10>).

Los detalles de una o más realizaciones se exponen en la descripción siguiente.

Descripción detallada

En la siguiente descripción detallada, con fines explicativos, se exponen numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión profunda de las realizaciones descritas.

La presente invención se refiere a nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso en un método de seguimiento de células inmunes según las reivindicaciones.

El método de esta invención se usa para seguir células inmunes usando nanopartículas magnéticas biocompatibles, cada una de las cuales contiene un núcleo superparamagnético cubierto por uno o más polímeros biocompatibles.

Los polímeros biocompatibles son biodegradables y no tóxicos para las células. Los polímeros biocompatibles que contienen silano, que pueden funcionalizarse fácilmente como se muestra a continuación, son adecuados para la preparación de nanopartículas magnéticas biocompatibles requeridas por este método.

Un polímero biocompatible ejemplar tiene la siguiente fórmula:

En la fórmula (I), R es H, alquilo de C<1>-C<6>, alquenilo de C<2>-C<6>, alquinilo de C<2>-C<6>, cicloalquilo de C<3>-C<10>, heterocicloalquilo de C<1>-C<10>, arilo, heteroarilo, un grupo carbonilo de C<1>-C<10>, o un grupo amino de C<1>-C<10>; L es un conector; m es de 1 a 10; y n es 5 a 1000.

Un conector puede ser O, S, Si, alquileno de C<1>-C<6>, un resto carbonilo que contiene dos grupos carbonilo y de 2 a 20 átomos de carbono, o un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas:

En estas fórmulas, cada uno de m, n, p, q, y t, independientemente, es 1-6; W es O, S o NRb; cada uno de L<1>, L<3>, L<5>,

L<7>, y L<9>, independientemente, es un enlace, O, S o NRc; cada uno de L<2>, L<4>, U, U, y L<10>, independientemente, es un enlace, O, S o NRd; y V es ORe, SRf, o NRgRh, en las que cada uno de Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rg y Rh, independientemente, es H, OH, un radical oxialifático de C<1>-C<10>, un radical alifático monovalente de C<1>-C<10>, un radical heteroalifático monovalente de C<1>-C<10>, un radical arilo monovalente o un radical heteroarilo monovalente.

Otro polímero biocompatible ejemplar tiene la siguiente fórmula:

En la fórmula (II), R<1>es H, alquilo de C<1>-C<6>, alquenilo de C<2>-C<6>, alquinilo de C<2>-C<6>, cicloalquilo de C<3>-C<10>, heterocicloalquilo de C<1>-C<10>, arilo, heteroarilo, un grupo carbonilo de C<1>-C<10>, o un grupo amino de C<1>-C<10>; R<2>es H, alquilo de C<1>-C<6>, alquenilo de C<2>-C<6>, alquinilo de C<2>-C<6>, cicloalquilo de C<3>-C<10>, heterocicloalquilo de C<1>-C heteroarilo; m es de 1 a 10 (p. ej., 3-10); y n es de 5 a 1000 (10-200). En una realización preferida, R<2>es H y el conector en la fórmula (II) es

El término "alifático" aquí se refiere a un resto hidrocarbonado saturado o insaturado, lineal o ramificado, acíclico, cíclico o policíclico. Los ejemplos incluyen, entre otros, restos alquilo, alquileno, alquenilo, alquenileno, alquinilo, alquinileno, cicloalquilo, cicloalquileno, cicloalquenilo, cicloalquenileno, cicloalquinilo y cicloalquinileno. El término "alquilo" o "alquileno" se refiere a un resto hidrocarbonado saturado, lineal o ramificado, tal como metilo, metileno, etilo, etileno, propilo, propileno, butilo, butilenos, pentilo, pentileno, hexilo, hexileno, heptilo, heptileno, octilo, octileno, nonilo, nonileno, decilo, decileno, undecilo, undecileno, dodecilo, dodecileno, tridecilo, tridecileno, tetradecilo, tetradecileno, pentadecilo, pentadecileno, hexadecilo, hexadecileno, heptadecilo, heptadecileno, octadecilo, octadecileno, nonadecilo, nonadecileno, icosilo, icosileno, triacotilo y triacotileno. El término "alquenilo" se refiere a un resto hidrocarbonado lineal o ramificado que contiene al menos un doble enlace, tal como -CH=CH-CH3 y -CH=CH-CH<2>-. El término "alquinilo" se refiere a un resto hidrocarbonado lineal o ramificado que contiene al menos un triple enlace, tal como -C=C-CH y -C=C-CH<2>-. El término "cicloalquilo" se refiere a un resto hidrocarbonado cíclico saturado, tal como ciclohexilo y ciclohexileno.

El término "heteroalifático" aquí se refiere a un resto alifático que contiene al menos un heteroátomo (por ejemplo, N, O, P, B, S, Si, Sb, Al, Sn, As, Se y Ge). El término "heterocicloalquilo" se refiere a un resto cicloalquilo que contiene al menos un heteroátomo. El término "oxialifático" aquí se refiere a un -O-alifático. Los ejemplos de oxialifático incluyen metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, iso-butoxi, sec-butoxi y terc-butoxi.

El término "arilo" aquí se refiere a un sistema de anillo aromático monocíclico de C6, bicíclico de C<10>, tricíclico de C<14>, tetracíclico de C<20>o pentacíclico de C<24>. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, entre otros, fenilo, fenileno, naftilo, naftileno, antracenilo, antracenileno, pirenilo y pirenileno. El término "heteroarilo" aquí se refiere a un sistema de anillo aromático monocíclico de 5-8 miembros, bicíclico de 8-12 miembros, tricíclico de 11-14 miembros y tetracíclico de 15 20 miembros que tiene uno o más heteroátomos (tales como O, N, S, o Se). Los ejemplos de un grupo heteroarilo incluyen, entre otros, furilo, furileno, fluorenilo, fluorenileno, pirrolilo, pirrolileno, tienilo, tienileno, oxazolilo, oxazolileno, imidazolilo, imidazolileno, bencimidazolilo, bencimidazolileno, tiazolilo, tiazolileno, piridilo, piridileno, pirimidinilo., pirimidinileno, quinazolinilo, quinazolinileno, quinolinilo, quinolinileno, isoquinolilo, isoquinolileno, indolilo e indolileno.

A menos que se especifique lo contrario, los alifático, heteroalifático, oxialifático, alquilo, alquileno, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo mencionados aquí incluyen restos tanto sustituidos como no sustituidos. Los posibles sustituyentes en cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo incluyen, entre otros, alquilo de C<1>-C<10>, alquenilo de C<2>-C<10>, alquinilo de C<2>-C<10>, cicloalquilo de C<3>-C<20>, cicloalquenilo de C<3>-C<20>, heterocicloalquilo de C<3>-C<20>, heterocicloalquenilo de C<3>-C<20>, alcoxi de C<1>-C<10>, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, amino, alquilamino de C<1>-C<10>, dialquilamino de C<2>-C<20>, arilamino, diarilamino, alquilsulfonamino de C<1>-C<10>, arilsulfonamino, alquilimino de C<1>-C<10>, arilimino, alquilsulfonimino de C<1>-C<10>, arilsulfonimino, hidroxilo, halo, tio, alquiltio de C<1>-C<10>, ariltio, alquilsulfonilo de C<1>-C<10>, arilsulfonilo, acilamino, aminoacilo, aminotioacilo, amido, amidino, guanidina, ureido, tioureido, ciano, nitro, nitroso, azido, acilo, tioacilo, aciloxi, carboxilo y éster carboxílico. Por otro lado, los posibles sustituyentes en alifático, heteroalifático, oxialifático, alquilo, alquileno, alquenilo y alquinilo incluyen todos los sustituyentes mencionados anteriormente excepto alquilo de C<1>-C<10>. También pueden estar condensados entre sí cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo.

Los polímeros biocompatibles descritos anteriormente incluyen los propios polímeros, así como sus sales y solvatos, si corresponde. Por ejemplo, se puede formar una sal entre un anión y un grupo cargado positivamente (p. ej., amino) en un polímero. Los aniones adecuados incluyen cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, nitrato, fosfato, citrato, metanosulfonato, trifluoroacetato, acetato, malato, tosilato, tartrato, fumarato, glutamato, glucuronato, lactato, glutarato y maleato. Asimismo, también se puede formar una sal entre un catión y un grupo cargado negativamente (p. ej., carboxilato) en un polímero. Los cationes adecuados incluyen ion sodio, ion potasio, ion magnesio, ion calcio y un catión amonio tal como ion tetrametilamonio. Los polímeros también incluyen aquellas sales que contienen átomos de nitrógeno cuaternarios. Un solvato se refiere a un complejo formado entre un polímero y un disolvente farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de disolventes farmacéuticamente aceptables incluyen agua, etanol, isopropanol, acetato de etilo, ácido acético y etanolamina.

El esquema (I) siguiente muestra un procedimiento de preparación de un polímero biocompatible que contiene silano a modo de ejemplo.

Como se muestra en el esquema (I), el alcoxil-polietilenglicol (peso molecular 2000) reacciona con anhídrido succínico en presencia de una base (por ejemplo, dimetilaminopiridina) para formar mPEG-COOH, que subsecuentemente se convierte en mPEG-COCl usando cloruro de tionilo. La mezcla de mPEG-COCl con (3-aminopropil)-trietoxisilano produce mPEG-silano.

Una persona experta en la técnica puede modificar el procedimiento mostrado en el Esquema (I) anterior para preparar polímeros biocompatibles usando métodos bien conocidos. Véase R. Larock, Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers 1989); T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (3rd ed., John Wiley and Sons 1999); L. Fieser y M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis (John Wiley and Sons 1994); y L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis (John Wiley and Sons 1995) y ediciones subsecuentes de los mismos. Las rutas específicas que se pueden usar para sintetizar los polímeros biocompatibles se pueden encontrar en: (a) Rist et al., Molecules, 2005, 10, 1169-1178, (b) Koheler et al., JACS, 2004, 126, 7206-7211; y (c) Zhang et al., Biom. Microd., 2004, 6:1 33-40.

Cada uno de los polímeros biocompatibles descritos anteriormente se puede revestir sobre un núcleo superparamagnético (p. ej., nanopartículas de óxido de hierro) mediante un enlace covalente para formar una nanopartícula magnética biocompatible para su uso en un agente de contraste. El núcleo superparamagnético tiene un tamaño de partícula de 8 a 25 nm (p. ej., de 12 a 25 nm y de 15 a 20 nm) y una relaxividad r2 de 120 a 250 (mM.s)-1 (p. ej., de 150 a 230 (mM.s)-1 y de 170 a 210 (mM.s)-1). La preparación de un núcleo superparamagnético es bien conocida en la técnica. Véase Laurent et al., Chem. Rev., 2008, 108, 2064-2110.

A continuación se describe un procedimiento típico para preparar nanopartículas superparamagnéticas. Primero, las nanopartículas de óxido de hierro se suspenden en tolueno y luego se agitan con mPEG-silano a temperatura ambiente durante 24 horas. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles resultantes son hidrófilas y pueden extraerse a una fase acuosa y subsecuentemente purificarse mediante ultrafiltración. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles preparadas de este modo tienen cada una una relaxividad r2 de 120 a 250 (mM.s)-1 (p. ej., de 150 a 230 (mM.s)-1 y de 170 a 210 (mM.s)-1).

La nanopartícula magnética biocompatible descrita anteriormente se puede formular en un agente de contraste, que se puede administrar por vía oral. Los ejemplos de agentes de contraste incluyen emulsiones, suspensiones acuosas, dispersiones y disoluciones. Si se desea, se pueden añadir ciertos agentes edulcorantes, saborizantes o colorantes.

Las nanopartículas magnéticas biocompatibles se pueden administrar a pacientes para marcar células inmunes (in vivo), como se describe en los ejemplos siguientes. A diferencia de la administración de células inmunes premarcadas con nanopartículas (in vivo), la administración de nanopartículas magnéticas biocompatibles en ausencia de células inmunes claramente tiene las ventajas de menos etapas operativas y menos obstáculos regulatorios.

Sin estar limitados por ninguna teoría, las nanopartículas magnéticas biocompatibles, una vez administradas a un paciente trasplantado, son captadas por las células inmunes (p. ej., macrófagos), que se acumulan en el órgano cuando se produce respuesta inmune. En otras palabras, las células inmunes marcadas de este modo se pueden monitorizar fácilmente mediante MRI potenciada en T1, T2, T2* o difusión, mostrar como puntos hiperintensos en una imagen de MRI potenciada en T1 o mostrar como puntos hipointensos en una imagen de MRI potenciada en T2, T2* o difusión. Un procedimiento de realizar MRI potenciada en T1, T2* o difusión es similar al de realizar MRI potenciada en T2 publicado en Mol. Imaging Biol., 2011, 13(5), 825-839.

Las nanopartículas magnéticas biocompatibles descritas anteriormente, cuando se administran a pacientes, exhiben una sensibilidad inesperadamente alta a la MRI para seguir células inmunes para monitorizar la respuesta inmune.

Los ejemplos específicos siguientes deben interpretarse como meramente ilustrativos. Sin más elaboración, se cree que una persona experta en la técnica puede, basándose en la presente descripción, utilizar las presentes realizaciones en su máxima extensión.

Preparación de nanopartículas de óxido de hierro biocompatibles.

Se prepararon dos nanopartículas de óxido de hierro biocompatibles de estas realizaciones siguiendo el procedimiento descrito a continuación.

Preparación de un núcleo de óxido de hierro.

Una mezcla de FeCl<2>.<4>H<2>O (11,6 g; 0,058 moles), FeCb-.<6>H<2>O (11,6 g; 0,096 moles) y agua (400 ml) se agitó a 300 rpm en un matraz de tres bocas a 25°C. Al matraz se añadió una disolución de hidróxido de sodio (2,5 N; 170 ml) a una velocidad de 47 gl/s, dando como resultado un valor de pH de 11 -12. Subsecuentemente, se añadió ácido oleico (20 ml) y se agitó durante 30 minutos, seguido de la adición de una disolución de HCl<6>N para ajustar el valor del pH a alrededor de 1. El núcleo de óxido de hierro precipitado de este modo en la mezcla se recogió mediante filtración, y se lavó 4-5 veces con agua para retirar el exceso de ácido oleico. Luego se secó al vacío para usarlo para acoplarlo, como se describe a continuación, con un polímero biocompatible.

Preparación de polímero biocompatible mPEG-silano-750 y mPEG-silano-2000.

El polímero biocompatible mPEG-silano-750 se preparó siguiendo el procedimiento que se describe a continuación.

Se dejó reposar una mezcla de 300 g (0,4 moles) de metoxi-PEG (mPEG, peso molecular 750), anhídrido succínico (48 g; 0,48 moles) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP; 19,5 g; 0,159 moles) en un matraz de fondo redondo de 1000 ml al vacío (20 Torr) durante 2 horas. Se añadieron 600 ml de tolueno a la mezcla, que después se agitó a 30°C durante un día para formar mPEG-COOH.

Subsecuentemente, se añadieron 36 ml (0,48 moles) de cloruro de tionilo a una velocidad de 1 ml/min y la mezcla se agitó durante 2-3 horas. Después, se añadieron 333,8 ml (2,4 moles) de trietilamina a una velocidad de 1 ml/min para obtener un pH de alrededor de 6-7. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla que contenía mPEG-COCl se hizo reaccionar con 94,5 ml (0,4 moles) de 3-aminopropiltrietoxisilano a temperatura ambiente durante al menos<8>horas para producir mPEG-silano-750.

Se precipitó mPEG-silano-750 después de añadir 9 litros de éter isopropílico a la mezcla de reacción. El producto sólido se recogió por filtración, se volvió a disolver en 500 ml de tolueno y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 minutos para recoger un sobrenadante, al que se le añadieron 9 litros de éter isopropílico. Se separó un líquido aceitoso marrón del éter isopropílico y se secó al vacío para obtener el polímero biocompatible mPEG-silano-750.

El polímero biocompatible mPEG-silano-2000 se preparó siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente usando una mezcla de 800 g (0,4 moles) de metoxi-PEG (mPEG, peso molecular 2000), anhídrido succínico (48 g; 0,48 moles) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP; 19,5 g; 0,159 moles).

Acoplamiento de cada uno de mPEG-silano-750 y mPEG-silano-2000 con núcleo de óxido de hierro

Cada uno de los polímeros biocompatibles mPEG-silano-750 y mPEG-silano-2000 (250 g) obtenidos de este modo se suspendió en<1>-<1 , 2>litros de una disolución de tolueno que contenía<10>g del núcleo de óxido de hierro preparado como se describió anteriormente. La suspensión se agitó durante 24 horas, seguido de la adición de agua (1,5 l) para la extracción. La disolución acuosa extraída se filtró con un dispositivo de ultrafiltración, se lavó con agua y luego se concentró a 100 ml para obtener una suspensión de nanopartículas de óxido de hierro biocompatibles. La nanopartícula de óxido de hierro, independientemente de si se preparó a partir de mPEG-silano-750 o mPEG-silano-2000, se denomina iTrast.

Caracterización de nanopartículas de óxido de hierro biocompatibles (iTrast)

Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la nanopartícula magnética biocompatible iTrast obtenidas de este modo se tomaron usando un microscopio electrónico de transmisión de emisión de campo JEOL JEM-2100F. Las imágenes mostraron que iTrast tenía un núcleo de óxido de hierro de dimensión 10-12 nm.

La relaxividad transversal (r2) y la relaxividad longitudinal (r1) se determinaron siguiendo los procedimientos descritos en US Application Publication 2012/0329129 y Mol Imaging Biol, Chen et al., 2011, 13, 825-839. Se determinó que iTrast tenía una r2 de 205,3 ± 2,3 (mM.s<) -1>y una r1 de 18,6 ± 0,5 (mM.s)-1.

Detección de migración y acumulación de macrófagos en trasplantes

Se realizaron estudios para seguir macrófagos en órganos trasplantados siguiendo los procedimientos descritos a continuación.

Trasplante de corazón en ratas

El procedimiento operativo para usar el modelo heterotópico de corazón en funcionamiento se describe en PNAS, 2006, 103(6): 1852-1857. Se obtuvieron ratas Inbred Brown Norway (BN; RT1n) y Dark Agouti (DA; RT1a) de Harlan Laboratories Inc. (Indianapolis, IN). El trasplante alogénico entre diferentes cepas de ratas (DA ® BN) dio como resultado rechazo, mientras que el trasplante singénico entre las mismas cepas de ratas (DA ® DA o BN ^ BN) no causó rechazo. El grado de rechazo de los injertos cardíacos se determinó histopatológicamente según las pautas descritas en J. heart Lung Transplant, 1998, 17, 754-760 y J. Heart Transplant, 1990, 9, 587-593.

Un día después del trasplante de corazón, a cada rata se le inyectó por vía intravenosa 3 mg/kg de nanopartículas de iTrast. Se observó que los macrófagos estaban distribuidos de forma heterogénea en el corazón de rata con rechazo agudo. Inesperadamente, MRI in vivo, realizada el día 6 después de la operación, indicó que los macrófagos marcados con nanopartículas iTrast se acumularon en el corazón de aloinjerto.

La histopatología confirmó un patrón de progresión de epicardio a endocardio. Más específicamente, a medida que el rechazo avanzaba con el tiempo, la infiltración de macrófagos se extendía hacia la parte interna del miocardio.

La tinción con hierro de H&E y Perl se realizó en tejidos de injertos de corazón recogidos después de MRI in vivo. Los análisis histológicos e inmunohistoquímicos de los injertos mostraron que las células que contienen hierro representadas por la tinción con hierro de Perl se correlacionaban con el linaje de células macrófagos ED1+. Las células que contienen hierro se correlacionaban con macrófagos ED1+ en las áreas con infiltración de células inmunes más agresivas y alteraban la integridad del miocardio, como se revela mediante tinción H&E.

Trasplante de riñón en cerdos

Se trataron cerdos no compatibles con el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) con dosis altas de tacrolimus durante 12 días. Luego se trasplantaron aloinjertos de riñón (n = 5) a estos cerdos. Como se esperaba, el día 14, todos los aloinjertos de riñón aislados fueron rechazados ya que la concentración de creatinina sérica se duplicó en comparación con la del día 0.

Un día después del trasplante de riñón, a cada cerdo se le inyectaron por vía intravenosa 3 mg/kg o 6 mg/kg de partículas iTrast. Los macrófagos acumulados marcados por iTrast de tamaño nanométrico en el riñón rechazado fueron detectados inesperadamente por MRI in vivo en los días 3, 6, 9, 12 y 16.

De hecho, también se encontró que iTrast en dosis de tanto 3 mg/kg como 6 mg/kg mejoró los puntos hipointensos alrededor del córtex el día 9 y día 6, respectivamente, en comparación con la creatinina sérica, lo que indica un rechazo inmune de todos los riñones aislados.

Seguimiento de macrófagos en ganglios linfáticos

Se estudió iTrast para detectar cambios en la morfología de un ganglio linfático según el procedimiento mostrado a continuación.

Se indujo en la pata delantera un modelo de metástasis de melanoma de ratón usando células B16-F10. Se administró iTrast (2, 4 y 6 mg de Fe/Kg) a los ratones durante el desarrollo del tumor, y los animales fueron evaluados repetidamente mediante imágenes de MRI potenciada en T2, T2* y difusión (es decir, T2WI, T2*WI, DWI) después de la administración de iTrast.

Se descubrió que las etapas del tumor afectaron significativamente a los resultados del marcaje. Cuando se administró iTrast por vía intravenosa en una dosis de 4 mg de Fe/kg, se observó inesperadamente un marcaje transitorio en los ganglios linfáticos centinela y subsecuentes de animales que tenían un tumor en etapa temprana. El grado de señales transitorias en estos ganglios linfáticos se debilitó cuando el tumor alcanzó una etapa avanzada. La histología confirmó que el tumor en etapa temprana no era metastásico, mientras que el tumor en etapa tardía era metastásico.

Otras realizaciones

Todas las características descritas en esta memoria descriptiva se pueden combinar en cualquier combinación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso en un método de seguimiento de células inmunes, comprendiendo el método:

identificar un paciente que tiene una enfermedad asociada a un órgano;

proporcionar una suspensión acuosa que contiene nanopartículas magnéticas biocompatibles, estando la suspensión acuosa libre de partículas que tienen un tamaño superior a 1000 nm, conteniendo cada una de las nanopartículas magnéticas biocompatibles un núcleo superparamagnético que está cubierto por uno o más polímeros biocompatibles, cada uno de los cuales tiene un grupo polietilenglicol, un grupo silano y un conector que une, mediante un enlace covalente, el grupo polietilenglicol y el grupo silano;

administrar la suspensión acuosa al torrente sanguíneo del paciente; y

después de la etapa de administración, obtener una imagen de resonancia magnética del órgano,

en el que el órgano es un riñón o un ganglio linfático, cada una de las nanopartículas magnéticas biocompatibles tiene una relaxividad r2 de 120 a 250 (mM.s)-1, y la presencia de manchas hiperintensas o hipointensas en la imagen de resonancia magnética indica respuesta inmune en el paciente.

2. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso según la reivindicación 1, en las que la imagen de resonancia magnética es una imagen de resonancia magnética potenciada en T2 o T2*.

3. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso según la reivindicación 1 o 2, en las que la enfermedad es cáncer o rechazo de un órgano trasplantado.

4. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso según la reivindicación 3, en las que el órgano trasplantado es corazón o riñón.

5. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso según la reivindicación 3, en las que el cáncer es linfoma.

6. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en las que el núcleo superparamagnético contiene un óxido de hierro, un óxido de cobalto, un óxido de níquel o una combinación de los mismos; el grupo polietilenglicol tiene 5-1000 unidades de oxietileno; el grupo silano contiene un grupo alquileno de C<1>-<10>; y el conector es O, S, Si, alquileno de C<1>-C<6>, un resto carbonilo que contiene dos grupos carbonilo y de 2 a 20 átomos de carbono, o un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas:

;en las que cada uno de m, n, p, q y t, independientemente, es 1-6; W es O, S o NRb; cada uno de L<1>, L<3>, L<5>, L<7>, y L<9>, independientemente, es un enlace, O, S o NRc; cada uno de L<2>, L<4>, Le, Le, y L<10>, independientemente, es un enlace, O, S o NRd; y V es ORe, SRf, o NRgRh, siendo cada uno de Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf, Rg y Rh, independientemente, H, OH, un radical oxialifático de C<1>-C<10>, un radical alifático monovalente de C<1>-C<10>, un radical heteroalifático monovalente de C<1>-C<10>, un radical arilo monovalente o un radical heteroarilo monovalente.

7. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en las que el núcleo superparamagnético es una nanopartícula superparamagnética de óxido de hierro; el grupo polietilenglicol tiene de 10 a 200 unidades de oxietileno; el grupo silano contiene alquileno de C<3>-C<10>; y el conector es un resto carbonilo de la siguiente fórmula:

;<8>. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en las que el núcleo superparamagnético está cubierto por uno o más polímeros biocompatibles que tienen la siguiente fórmula:

;en la que

R es H, alquilo de C<1>-C<6>, alquenilo de C<2>-C<6>, alquinilo de C<2>-C<6>, cicloalquilo de C<3>-C<10>, heterocicloalquilo de C<1>-C<10>, arilo, heteroarilo, un grupo carbonilo de C<1>-C<10>, o un grupo amino de C<1>-C<10>;

L es un conector;

m es de<1>a<1 0>; y

n es 5 a 1000.

9. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso según la reivindicación<8>, en las que el conector es O, S, Si, alquileno de C<1>-C<6>, un resto carbonilo que contiene dos grupos carbonilo y de<2>a 20 átomos de carbono, o un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas:

;en las que cada uno de m, n, p, q y t, independientemente, es 1-6; W es O, S o NRb; cada uno de L<1>, L<3>, L<5>, L<7>, y L<9>, independientemente, es un enlace, O, S o NRc; cada uno de L<2>, L<4>, L6, L8, y L<10>, independientemente, es un enlace, O, S o NRd; y V es ORe, SRf, o NRgRh, siendo cada uno de Ra, Rb, R<c>, Rd, Re, Rf, Rg y Rh, independientemente, H, OH, un radical oxialifático de C<1>-C<10>, un radical alifático monovalente de C<1>-C<10>, un radical heteroalifático monovalente de C<1>-C<10>, un radical arilo monovalente o un radical heteroarilo monovalente.

10. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en las que el núcleo superparamagnético está cubierto por uno o más polímeros biocompatibles que tienen la siguiente fórmula:

;en la que

R<1>es H, alquilo de C<1>-C<6>, alquenilo de C<2>-C<6>, alquinilo de C<2>-C<6>, cicloalquilo de C<3>-C<10>, heterocicloalquilo de C<1>-C<10>, arilo, heteroarilo, un grupo carbonilo de C<1>-C<10>, o un grupo amino de C<1>-C<10>;

R<2>es H, alquilo de C<1>-C<6>, alquenilo de C<2>-C<6>, alquinilo de C<2>-C<6>, cicloalquilo de C<3>-C<10>, heterocicloalquilo de C<1>-C<10>, arilo o heteroarilo;

m es de<1>a<1 0>; y

n es 5 a 1000.

11. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso según la reivindicación 10, en las que cada una de las nanopartículas magnéticas biocompatibles tiene un tamaño de partícula de 15-200 nm; la enfermedad es el rechazo de un riñón trasplantado; el núcleo superparamagnético es una nanopartícula superparamagnética de óxido de hierro; el grupo polietilenglicol tiene de<10>a<2 0 0>unidades de oxietileno; el grupo silano contiene alquileno de C<3>-C<10>; el conector es un resto carbonilo de la siguiente fórmula:

;y la imagen de resonancia magnética es una imagen de resonancia magnética potenciada en T2 o T2*.

12. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso según la reivindicación 10, en las que R<1>es H; R<2>es H, alquilo de C<1>-C<6>, un grupo carbonilo de C<1>-C<10>, o un grupo amino de C<1>-C<10>; m es de 3 a<1 0>; y n es de<10>a<2 0 0>.

13. Las nanopartículas magnéticas biocompatibles para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o 12, en las que cada una de las nanopartículas magnéticas biocompatibles tiene un tamaño de partícula de<10>a<1 00 0>nm, preferiblemente en las que cada una de las nanopartículas magnéticas biocompatibles tiene un tamaño de partícula de 15 a 200 nm.