CN118085037A - 一种蛋白载体及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛋白载体及其制备方法、应用，蛋白质经蛋白载体化学修饰后制备成蛋白前药纳米粒子。本发明通过可逆化学修饰方法对蛋白药物进行修饰，通过合成中间含有还原敏感二硫键的两端硝基苯酯的小分子NPC‑ss‑NPC，利用NPC‑ss‑NPC一端的对硝基苯酯与PEG链的氨基共价连接形成酰胺键，外端引入与肿瘤细胞表面过表达的ανβ3整合素特异性结合的RGD，制得RGD‑PEG‑ss‑NPC，并以BSA、蛋白酶K和细胞色素C作为蛋白模型，制备蛋白前药纳米粒子，能够主动靶向到病灶组织，并在细胞内高GSH条件下打开二硫键还原为原始蛋白结构发挥其功能。

Description

一种蛋白载体及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及生物材料及生物医学技术领域，更具体地，涉及一种蛋白载体及其制备方法、应用。
背景技术
蛋白药物与传统的小分子化学药物相比，因其具有高效、安全、耐受性好、高选择性、高效价、低损耗等优点，而受到越来越多的关注。然而具有胞内靶点的蛋白药物在进入细胞内发挥作用的过程中会遇到多重障碍，比如蛋白质药物本身存在相对分子量大、易失活或降解、难以透过细胞膜及电荷异质性等问题。
基于此，目前研究人员已开发出多种蛋白纳米递送系统，如纳米水凝胶，纳米胶束以及囊泡等来将蛋白递送到细胞内。但是这些手段仍存在一定的局限性，如包封率低、载药量小、体内外释放具有明显突释效应等问题。除此之外，对蛋白质进行化学修饰也是一种新的手段。蛋白质修饰(磷酸化、泛素化、糖基化、乙酰化等)对于调节各种细胞信号以及蛋白质的功能至关重要，但蛋白的人工修饰策略如通过N-羟基琥珀酰亚胺脂(NHS)对氨基进行反应性修饰，往往是不可逆的，可能会影响蛋白活性。
因此，为了保证蛋白活性不受影响的同时使其能够跨越多种生理屏障顺利到达靶点发挥作用，合理的修饰手段十分必要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种蛋白载体及其制备方法、应用，通过可逆化学修饰方法对蛋白药物进行修饰，以BSA、蛋白酶K和细胞色素C作为蛋白模型，制备蛋白前药纳米粒子，能够主动靶向到病灶组织，并在细胞内高GSH条件下打开二硫键还原为原始蛋白结构发挥其功能。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种蛋白载体，所述蛋白载体的结构式如下：
本发明还公开了一种如上述的蛋白载体的合成方法，包括如下步骤：
(1)RGD-PEG-NH2的合成
将BOC-PEG-NHS溶解于NaHCO3缓冲液中，得到BOC-PEG-NHS溶液；
在冰浴条件下将RGD加入到所述BOC-PEG-NHS溶液中，于20℃～25℃的条件下反应12h～24h，得到第一反应液；
对所述第一反应液进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-BOC；
将所述RGD-PEG-BOC溶解于盐酸中，于20℃～25℃的条件下搅拌12h～24h以脱除BOC保护基团，得到第二反应液；
将所述第二反应液进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-NH2；
(2)NPC-ss-NPC的合成
在无水无氧的环境中，将二羟乙基二硫化物溶解于二氯甲烷中，并加入对硝基氯甲酸苯酯和无水吡啶，在20℃～25℃的条件下搅拌24h～48h，得到第三反应液；
将所述第三反应液进行旋蒸以去除二氯甲烷，得到粗产物，将所述粗产物过层析柱采用石油醚-二氯甲烷梯度洗脱后分离，得到NPC-ss-NPC；
(3)RGD-PEG-ss-NPC蛋白载体的合成
将所述NPC-ss-NPC溶解于二氯甲烷中，加入所述RGD-PEG-NH2，于0℃冰浴10min后，加入无水吡啶在20℃～25℃的条件下搅拌12h～24h，得到第四反应液；
将所述第四反应液进行透析，离心，随后将样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-ss-NPC；
本发明还公开了一种如上述的蛋白载体的应用，所述蛋白载体可与蛋白质复合形成蛋白前药纳米粒子。
实施本发明实施例，将具有如下有益效果：
(1)以BSA为蛋白模型所制备的蛋白前药纳米粒子RGD-PEG-ss-BSA具有较好的生物相容性，溶血率5％以下，细胞存活率达80％以上。
(2)以蛋白酶K和细胞色素C作为蛋白模型所制备蛋白前药纳米粒子，修饰后PKζ电位由2.16mV转变为-14.37mV，经过10mM的GSH孵育后ζ电位恢复至1.79mV；CC修饰完后电位由9.09mV转变为-6.59mV，孵育后恢复至5.26mV。
(3)将不同浓度(0μg/mL～10μg/mL)的PK样品与荧光胺孵育4h后，RP-ss-PK，RP-cc-PK，P-ss-PK修饰度为55％，59％，31％。同样方法证明RP-ss-CC，RP-cc-CC，P-ss-CC氨基修饰度为88％，82％，53％。
(4)RP-ss-PK、RP-ss-CC对U87细胞均具有明显的细胞毒性，分别为21.6％和24.7％。
附图说明
图1为本发明实施例的RGD-PEG-NH2的核磁共振氢谱。
图2为本发明实施例的NPC-ss-NPC的核磁共振氢谱，碳谱及质谱。
图3为本发明实施例的NPC-cc-NPC的核磁共振氢谱，碳谱及质谱。
图4为本发明实施例的PEG-ss-NPC的核磁共振氢谱。
图5为本发明实施例的RGD-PEG-ss-NPC和RGD-PEG-cc-NPC的核磁共振氢谱。
图6为本发明实施例的蛋白前药纳米粒子RGD-PEG-ss-BSA(RP-ss-BSA)、PEG-ss-BSA(P-ss-BSA)的红细胞溶血率。
图7为本发明实施例的蛋白前药纳米粒子RGD-PEG-ss-BSA(RP-ss-BSA)、PEG-ss-BSA(P-ss-BSA)与U87细胞、COS-7细胞孵育24小时的细胞存活率。
图8为本发明实施例的RGD-PEG-ss-PK(RP-ss-PK)，RGD-PEG-ss-CC(RP-ss-CC)的电位分布。
图9为本发明实施例的PK、CC及修饰后蛋白与荧光胺孵育后荧光强度与浓度的关系。
图10为本发明实施例的U87细胞与PK、CC及修饰后蛋白孵育24h细胞存活率。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
本发明公开了一种蛋白载体，蛋白载体的结构式如下：
本发明还公开了一种如本发明任意实施例的蛋白载体的合成方法，包括如下步骤：
(1)RGD-PEG-NH2的合成
(1.1)将BOC-PEG-NHS溶解于NaHCO3缓冲液中，得到BOC-PEG-NHS溶液。
在一具体实施例中，BOC-PEG-NHS溶液在NaHCO3缓冲液中的浓度为0.1mol/L。
在一具体实施例中，NaHCO3缓冲液的浓度为0.1M，pH为8.3。
(1.2)在冰浴条件下将RGD加入到BOC-PEG-NHS溶液中，于20℃～25℃的条件下反应12h～24h，得到第一反应液。
在一具体实施例中，BOC-PEG-NHS与RGD的摩尔比为1∶3。
(1.3)对第一反应液进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-BOC。
在一具体实施例中，透析使用的透析袋的截留分子量为1000Da；第一反应物在超纯水中透析24h～48h。
(1.4)将RGD-PEG-BOC溶解于盐酸中，于20℃～25℃的条件下搅拌12h～24h以脱除BOC保护基团，得到第二反应液。
在一具体实施例中，HCl溶液的浓度为1M。
(1.5)将第二反应液进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-NH2。
在一具体实施例中，透析使用的透析袋的截留分子量为1000Da；第二反应液在盐酸中透析12h～24h；
(2)NPC-ss-NPC的合成
(2.1)在无水无氧的环境中，将二羟乙基二硫化物溶解于二氯甲烷中，并加入对硝基氯甲酸苯酯和无水吡啶，在20℃～25℃的条件下搅拌24h～48h，得到第三反应液。
在一具体实施例中，二羟乙基二硫化物与对硝基氯甲酸苯酯、无水吡啶的摩尔比为1∶4∶0.1。
(2.2)将第三反应液进行旋蒸以去除二氯甲烷，得到粗产物，将粗产物过层析柱采用石油醚-二氯甲烷梯度洗脱后分离，得到NPC-ss-NPC。
(3)RGD-PEG-ss-NPC蛋白载体的合成
(3.1)将NPC-ss-NPC溶解于二氯甲烷中，加入RGD-PEG-NH2，于0℃冰浴10min后，加入无水吡啶在20℃～25℃的条件下搅拌12h～24h，得到第四反应液。
在一具体实施例中，NPC-ss-NPC、RGD-PEG-NH2和无水吡啶的摩尔比为10:1:10。
(3.2)将第四反应液进行透析，离心，随后将样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-ss-NPC。
在一具体实施例中，透析使用的透析袋的截留分子量为3500Da；透析为在超纯水中透析48h～72h；离心的转速为7000rpm。
本发明还公开了一种如本发明任意实施例的蛋白载体的应用，蛋白载体可与蛋白质复合形成蛋白前药纳米粒子。
在一具体实施例中，蛋白质包括BSA、蛋白酶K和细胞色素C中的一种。
在一具体实施例中，蛋白前药纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
S1、将蛋白质溶解于NaHCO3缓冲液中，加入相对于BSA的氨基5倍～10倍的RGD-PEG-ss-NPC，于0℃冰浴下搅拌12h，得到第五反应液。
在一具体实施例中，NaHCO3缓冲液的浓度为0.1M，pH为8.3～8.4。
在一具体实施例中，蛋白质在NaHCO3缓冲液的浓度为1mg/mL。
S2、将第五反应液进行超滤离心以去除剩余的RGD-PEG-ss-NPC，随后将样品浓缩至浓度为0.5mg/mL～1mg/mL，得到蛋白前药纳米粒子。
在一具体实施例中，超滤离心使用的超滤离心管的截留分子量为10KDa。
具体的，本发明针对于蛋白质作为药物在发展中存在的屏障，通过可逆化学修饰方法对蛋白药物进行修饰，以BSA、蛋白酶K和细胞色素C作为蛋白模型，制备蛋白前药纳米粒子。首先合成了中间含有还原敏感二硫键的两端硝基苯酯的小分子(NPC-ss-NPC)，利用NPC-ss-NPC一端的硝基苯酯与PEG链的氨基共价连接形成酰胺键，外端引入与肿瘤细胞表面过表达的ανβ3整合素特异性结合的RGD，利用RGD-PEG-ss-NPC的硝基苯酯与蛋白表面的氨基共价连接，对蛋白表面进行修饰制备蛋白前药纳米粒子。RGD与肿瘤表面的ανβ3整合素特异性结合使前药在肿瘤部位聚集，由RGD介导细胞内吞。入胞后二硫键选择性地在高GSH环境下断裂形成硫醇，并对自身亲核进攻释放蛋白，恢复原有结构与功能。
以下为具体实施例
1.RGD-PEG-NH2的合成
称取BOC-PEG-NHS(200mg，0.04mmol)用10mL NaHCO3缓冲液(0.1M，pH 8.3)溶解，冰浴条件下加入RGD(72.6mg，0.12mmol)，室温反应12h。随后将反应液转移至1000Da的透析装置中用超纯水透析三至四次，透析完成后转移至冷冻干燥机冻干得到产物RGD-PEG-BOC。用1M HCl溶液将RGD-PEG-BOC溶解，室温条件下搅拌过夜以脱除BOC保护基团，将反应液在MWCO 1000Da的透析袋中透析三至四次后冷冻干燥得到RGD-PEG-NH2。
2.RGD-PEG-cc-NPC的合成
(1)NPC-cc-NPC的合成
将1,6-己二醇(1g，0.0085mmol)用二氯甲烷溶解后,向其中加入对硝基氯甲酸苯酯(8.5g，0.0042mmol)，充分搅拌溶解后缓慢滴加无水吡啶(1.36mL，0.017mmol)，室温搅拌过夜，整个实验操作均需在无水无氧的条件下进行。反应完成后，将反应液转移至旋转蒸发仪去除溶剂二氯甲烷，将粗产物通过硅胶柱层析纯化，洗脱液为石油醚：二氯甲烷＝1:1。
(2)RGD-PEG-cc-NPC的合成
NPC-cc-NPC(74.73mg，0.17mmol)用二氯甲烷溶解后，冰浴条件下加入RGD-PEG-NH2(100mg，0.017mmol)，充分溶解后加入无水吡啶(13.4μL，0.17mmol)室温搅拌过夜，将反应液转移至3500Da的透析袋中透析三次后于高速冷冻离心机中7000rpm离心除去未反应的小分子，继续透析二至三次后。将透析液转移至冷冻干燥机冻干得到固体RGD-PEG-cc-NPC。
3.RGD-PEG-ss-NPC的合成
(1)NPC-ss-NPC的合成
将二羟乙基二硫化物(2mL，154g/mol)用二氯甲烷溶解后，向中加入对硝基氯甲酸苯酯(15g，0.0082mmol)，充分搅拌溶解后缓慢滴加无水吡啶(2.6mL，0.033mmol)，室温搅拌过夜，整个实验操作均需在无水无氧的条件下进行。同样反应完成后，反应液转移至旋转蒸发仪去除溶剂二氯甲烷，将粗产物通过硅胶柱层析纯化，石油醚：二氯甲烷＝1:2洗脱。
(2)RGD-PEG-ss-NPC的合成
NPC-ss-NPC(80mg，0.17mmol)用二氯甲烷溶解后，冰浴条件下缓慢加入RGD-PEG-NH2(100mg，0.017mmol)，冰浴10min待固体充分溶解后加入无水吡啶(13.4μL，0.17mmol)室温搅拌过夜，将反应液转移至MWCO 3500Da的透析袋中透析，并于高速冷冻离心机中7000rpm离心除去未反应的小分子。透析完成后将溶液转移至冷冻干燥机冻干得到固体RGD-PEG-ss-NPC。
(3)PEG-ss-NPC的合成
NPC-ss-NPC(80mg，0.17mmol)用二氯甲烷溶解后，冰浴条件下缓慢加入PEG5000-NH2(100mg，0.017mmol)，冰浴10min待充分溶解后加入无水吡啶(13.4μL，0.17mmol)室温搅拌过夜，将反应液转移至MWCO 3500Da的透析袋中透析，并于高速冷冻离心机中7000rpm离心除去未反应的小分子。透析完成后将溶液转移至冷冻干燥机冻干得到固体PEG-ss-NPC。
4.蛋白质前药纳米粒子的制备
将BSA溶解在1mL NaHCO3(0.1M，pH 8.4)溶液中，加入相对于BSA氨基过量5倍的RGD-PEG-ss-NPC(以下简称RP-ss-NPC)，冰浴下搅拌过夜，将反应液转移至MWCO 10KDa的超滤离心管中除掉未反应的RP-ss-NPC，并浓缩至目标浓度得到蛋白前药纳米粒子RP-ss-BSA。同理，按照上述方法制备RP-cc-BSA，P-ss-BSA。
5.细胞毒性蛋白前药纳米粒子的制备
将Proteinase k(以下简称PK)溶解在用1mL NaHCO3(0.1M，pH 8.3)溶液中，加入相对于PK氨基过量5倍的RP-ss-NPC，冰浴下搅拌过夜，将反应液转移至10K的超滤管中4000g离心除掉未反应的RP-ss-NPC并浓缩至所需蛋白浓度，得到蛋白前药纳米粒子RGD-PEG-ss-PK(RP-ss-PK)。同理，按照上述方法制备RP-cc-PK，P-ss-PK。细胞色素C(Cytochrome C，以下简称CC)蛋白前药纳米粒子的制备方法同PK一致，按照上述方法制备RGD-PEG-ss-CC(RP-ss-CC)，P-ss-CC，RP-cc-CC。
测试例
1、对蛋白载体、蛋白前药纳米粒子以及中间产物结构进行验证。
对RGD-PEG-NH2的结构进行表征，如图1所示，图1为RGD-PEG-NH2的核磁共振氢谱。根据PEG中的(-CH2)O化学位移在3.6ppm,cRGDfk苄基上苯环(-C6H5)的质子峰化学位移在7.1-7.4ppm，根据两者的积分面积计算得cRGDfk反应效率为64.0％。
对NPC-ss-NPC的结构进行表征，如图2所示，图2为NPC-ss-NPC的核磁共振氢谱，碳谱及质谱。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.38–8.22(m,4H),7.49–7.34(m,4H),4.59(t,J＝6.5Hz,4H),3.10(t,J＝6.5Hz,4H).
对NPC-cc-NPC的结构进行表征，如图3所示，图3为NPC-cc-NPC的核磁共振氢谱，碳谱及质谱。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.40–8.24(m,4H),7.48–7.34(m,4H),4.33(t,J＝6.6Hz,4H),1.83(t,J＝6.8Hz,4H),1.54(p,J＝3.6Hz,4H).
对PEG-ss-NPC的结构进行表征，如图4所示，图4为PEG-ss-NPC的核磁共振氢谱。根据1H-NMR中PEG的(-CH2)O化学位移在3.6ppm，NPC的(-C6H5NO2)的化学位移在7.49–7.34ppm和8.38–8.22ppm。
对RGD-PEG-ss-NPC,RGD-PEG-cc-NPC的结构进行表征，如图5所示，图5为RGD-PEG-ss-NPC,RGD-PEG-cc-NPC的核磁共振氢谱。cRGDfk苄基上苯环(-C6H5)的质子峰化学位移在7.1-7.4ppm，PEG的(-CH2)O化学位移在3.6ppm，NPC的(-C6H5NO2)的化学位移在7.49–7.34ppm和8.38–8.22ppm。同样的，RGD-PEG-cc-NPC的1H-NMR中PEG的(-CH2)O化学位移在3.6ppm，NPC的(-C6H5NO2)的化学位移在8.40–8.24和7.48–7.34。
2.蛋白递送载体的生物相容性分析
(1)红细胞溶血率
使用无细胞毒性的BSA为蛋白模型，构建蛋白前药纳米粒子RP-ss-BSA和P-ss-BSA。通过测试蛋白递送载体对红细胞的溶血率考察其血液相容性。取1mL的无菌脱纤维绵羊血1000g离心5min收集红细胞沉淀，弃上清用PBS(10mM，pH 7.4)悬浮红细胞沉淀并多次洗涤至上清无色澄清。随后，用PBS悬浮红细胞并稀释至浓度为2％(v/v)。取400μL红细胞悬液，分别与等体积溶于PBS的RP-ss-BSA、P-ss-BSA及0.05％的Tween 20均匀混合。随后将混合液于37℃恒温摇床中180rpm震荡孵育，于2h和4h取出200μL样品，1000g离心5min沉淀红细胞，取出上清于96孔板(100μL/孔)中，使用多功能读板机测定在540nm处的吸光度，每组重复三次，溶血率(％)计算公式为：溶血率(％)＝(A样品-A阴性对照)/(A阳性对照-A阴性对照)×100％。
(2)细胞毒性
使用无细胞毒性的BSA为蛋白模型，通过MTT法测定蛋白质前药纳米组装体RP-ss-BSA、P-ss-BSA对U87细胞和COS-7细胞的细胞毒性。将细胞以每孔1×105个/mL的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL。37℃、5％CO2培养箱中孵育12h，随后将培养基更换为100μL分别含有不同蛋白浓度的RP-ss-BSA、P-ss-BSA的培养基。37℃、5％ CO2培养箱中孵育24h后，吸出培养基并用PBS清洗两次。随后每孔加入100μL含有0.5mg/mL MTT的培养基，继续在培养箱中培养孵育4h。最后，弃除含有MTT的培养基，加入100μL DMSO震荡溶解活细胞产生的甲臜晶体。使用多功能读板机测试570nm和630nm(背景)处的吸光度。将未加样培养基组细胞作为对照组，每组设置5个复孔，细胞存活率计算公式为：细胞存活率(％)＝(A样品(570nm)-A样品(630nm))/(A对照(570nm)-A对照(630nm))×100％。
测试结果如图6和图7所示。根据图6所示，RP-ss-BSA、P-ss-BSA与红细胞共同孵育2h和4h后的红细胞溶血率均在5％以下，对比Tween 20显著改善了血液相容性，说明RP-ss-NPC及P-ss-NPC在血液循环中具有良好的安全性。如图7所示，将不同浓度的RP-ss-BSA、P-ss-BSA与U87细胞和COS-7细胞共同孵育24h后，细胞的存活率均在80％以上，显示出了良好的细胞相容性。
3.细胞毒性蛋白前药纳米粒子电位表征分析
使用Zetasizer Nano ZS90纳米粒度仪测量RGD-PEG-ss-PK(RP-ss-PK)，RGD-PEG-ss-CC(RP-ss-CC)的ζ电势(Zeta potential)。测试结果如图8所示，未经修饰的PKζ电位为2.16mV，经RP-ss-NPC修饰完后电位由2.16mV转变为-14.37mV，经过10mM的GSH孵育后，二硫键打开，PEG链分离释放PK，由此ζ电位恢复至1.79mV，基本恢复至未修饰前电位水平；而同样经过RP-cc-NPC修饰的PKζ电位为-5.87,经GSH孵育后碳碳单键不能断开，PK不能得到释放因此电位未恢复。同样的未经修饰的CCζ电位为9.09mV，修饰完RP-ss-NPC后电位由9.09mV转变为-6.59mV，经过10mM的GSH孵育后，ζ电位恢复至5.26mV；经RP-cc-NPC修饰的CCζ电位为-4.70,同样CC不能被释放，因此电位未恢复至修饰前状态。
4.RP-ss-PK，P-ss-PK，RP-cc-PK的氨基定量及RP-ss-CC，P-ss-CC，RP-cc-CC的氨基定量分析，PEG链对蛋白的修饰度通过荧光胺检测蛋白游离氨基数进行表征。将溶解在DMSO中的荧光胺(30μL，3mg/mL)与修饰后的PK及CC样品(0-10μg/mL)混合，室温孵育4h后使用多功能读板机测试475nm处的荧光强度，以计算蛋白表面的剩余氨基基团。根据图9所示，将不同浓度(0μg/mL～10μg/mL)的PK样品与荧光胺孵育4h后，PK样品标准曲线斜率为8.5，修饰后RP-ss-PK，RP-cc-PK，P-ss-PK的斜率分别为3.9，3.5，5.9，证明分别有55％，59％，31％的氨基被修饰。同样将不同浓度(0mg/mL～0.5mg/mL)的CC样品与荧光胺孵育4h后，根据荧光强度比值证明RP-ss-CC，RP-cc-CC，P-ss-CC有88％，82％，53％的氨基被修饰。
5.蛋白前药纳米粒子的生物相容性
通过MTT法测定蛋白前药纳米粒子PK、RP-ss-PK、P-ss-PK以及CC、RP-ss-CC，P-ss-CC对U87细胞的细胞毒性。将U87细胞以每孔1×105的细胞密度接种在96孔板中，37℃、5％CO2培养箱中孵育24h，将培养基更换为100μL含有不同浓度的蛋白质前药纳米粒子的培养基。继续培养24h后弃除含有样品的培养基，PBS清洗两次。随后每孔加入100μL含有MTT(0.5mg/mL)的新鲜培养基，培养箱中孵育4h。最后，弃除含有MTT的培养基，加入100μL DMSO震荡混匀。使用多功能读板机测试570nm和630nm(背景)处的吸光度。同样将未加样培养基组细胞作为对照组，每组设置5个复孔，细胞存活率计算公式为：细胞存活率(％)＝(A样品(570nm)-A样品(630nm))/(A对照(570nm)-A对照(630nm))×100％。测试结果如图10(a)所示，PK、RP-ss-PK、P-ss-PK在30μg/mL时与U87细胞孵育24小时后，RP-ss-PK组细胞存活率在21.6％，细胞毒性相对于PK(49.6％)和P-ss-PK(30.2％)较明显。CC组的细胞毒性如图10(b)所示，当药物浓度在25μg/mL，孵育24h后CC的细胞存活率为94.4％，几乎不影响U87细胞的存活；P-ss-CC的细胞存活率在81.8％，而RP-ss-CC的细胞存活率仅为24.7％，并且随着药物浓度增大，细胞毒性显著增强。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种蛋白载体，其特征在于，所述蛋白载体的结构式如下：
2.一种如权利要求1所述的蛋白载体的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)RGD-PEG-NH2的合成
将BOC-PEG-NHS溶解于NaHCO3缓冲液中，得到BOC-PEG-NHS溶液；
在冰浴条件下将RGD加入到所述BOC-PEG-NHS溶液中，于20℃～25℃的条件下反应12h～24h，得到第一反应液；
对所述第一反应液进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-BOC；
将所述RGD-PEG-BOC溶解于盐酸中，于20℃～25℃的条件下搅拌12h～24h以脱除BOC保护基团，得到第二反应液；
将所述第二反应液进行透析，随后将透析后的样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-NH2；
(2)NPC-ss-NPC的合成
在无水无氧的环境中，将二羟乙基二硫化物溶解于二氯甲烷中，并加入对硝基氯甲酸苯酯和无水吡啶，在20℃～25℃的条件下搅拌24h～48h，得到第三反应液；
将所述第三反应液进行旋蒸以去除二氯甲烷，得到粗产物，将所述粗产物过层析柱采用石油醚-二氯甲烷梯度洗脱后分离，得到NPC-ss-NPC；
(3)RGD-PEG-ss-NPC蛋白载体的合成
将所述NPC-ss-NPC溶解于二氯甲烷中，加入所述RGD-PEG-NH2，于0℃冰浴10min后，加入无水吡啶在20℃～25℃的条件下搅拌12h～24h，得到第四反应液；
将所述第四反应液进行透析，离心，随后将样品冷冻干燥，得到RGD-PEG-ss-NPC；
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述RGD-PEG-NH2的合成中，所述BOC-PEG-NHS与RGD的摩尔比为1∶3；
所述BOC-PEG-NHS溶液在NaHCO3缓冲液中的浓度为0.1mol/L。
4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述NPC-ss-NPC的合成中，所述二羟乙基二硫化物与对硝基氯甲酸苯酯、无水吡啶的摩尔比为1∶4∶0.1；
所述RGD-PEG-ss-NPC的合成中，所述NPC-ss-NPC、所述RGD-PEG-NH2和所述无水吡啶的摩尔比为10:1:10。
5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述RGD-PEG-NH2的合成中，所述NaHCO3缓冲液的浓度为0.1M，pH为8.3；
所述HCl溶液的浓度为1M；
所述透析使用的透析袋的截留分子量为1000Da；
所述第一反应物在超纯水中透析24h～48h；
所述第二反应液在盐酸中透析12h～24h。
6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述RGD-PEG-ss-NPC的合成中，所述透析使用的透析袋的截留分子量为3500Da；
所述透析为在超纯水中透析48h～72h；
所述离心的转速为7000rpm。
7.一种如权利要求1所述的蛋白载体的应用，其特征在于，所述蛋白载体可与蛋白质复合形成蛋白前药纳米粒子。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述蛋白质包括BSA、蛋白酶K和细胞色素C中的一种。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述蛋白前药纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
将蛋白质溶解于NaHCO3缓冲液中，加入相对于BSA的氨基5倍～10倍的RGD-PEG-ss-NPC，于0℃冰浴下搅拌24h，得到第五反应液；
将所述第五反应液进行超滤离心以去除剩余的RGD-PEG-ss-NPC，随后将样品浓缩至浓度为0.5mg/mL～1mg/mL，得到蛋白前药纳米粒子。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述NaHCO3缓冲液的浓度为0.1M，pH为8.3～8.4；
所述蛋白质在NaHCO3缓冲液的浓度为1mg/mL；
所述超滤离心使用的超滤离心管的截留分子量为10KDa。
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