CN101002942B - 一种peg化脂质体纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种PEG脂质体纳米颗粒。本发明为颗粒表面PEG层中的一小部分末端修饰了对硝基苯碳酸酯(pNP)基团的脂质体纳米颗粒；本发明以氯甲酸对硝基苯酯(pNPC)对聚乙二醇两端进行活化，合成DPPE-PEG-pNP，将大豆磷脂，胆固醇，DPPE-PEG，DPPE-PEG-pNP以一定的摩尔百分比溶于有机溶剂中，用超声薄膜法制备脂质体纳米颗粒，在pH7.5～8.5的条件下，室温搅拌4～5小时，连接上活性分子；本发明的脂质体纳米颗粒制备过程简单易行，连接活性分子的条件温和，而且不影响物质的活性，连接的带氨基的活性分子具有广泛性。

Description

一种PEG化脂质体纳米颗粒
技术领域
本发明属于药物载体，具体涉及一种PEG化脂质体纳米颗粒。
背景技术
脂质体作为药物载体已经有了近二十年的历史，已被广泛用作医药载体。国内外对于脂质体用于药物靶向载体也已开始了大量的研究，目前脂质体用做药物靶向载体，主要是通过一些物理或化学的方法将生物亲和分子连接到脂质体表面，从而达到靶向目的。经过多年研究，PEG化脂质体用于靶向载体的研究在实验与临床中均取得了一定的进展。但是，目前在脂质体表面连接生物亲和分子时主要是通过PEG一端的羧基与活性分子的氨基反应，这就存在着连接效率不高、连接条件较苛刻，从而导致连接上去的生物亲和分子的生物活性大大降低，严重影响了脂质体用于靶向载体的研究与应用。因此，要提高连接到脂质体表面生物亲和分子的生物活性，还必须进一步研究如何活化PEG的问题。
发明内容
本发明旨在提供一种表面易修饰带氨基活性分子的PEG化脂质体纳米颗粒，以解决脂质体表面连接的生物亲和分子的生物活性不高的问题。
实现上述发明目的的技术方案为：
脂质体纳米颗粒表面的PEG层中一小部分PEG末端修饰了对硝基苯碳酸酯(pNP)基团。制备脂质体纳米颗粒包括活化PEG，脂质体纳米颗粒的制备以及生物活性分子的连接，(1)活化PEG：用氯甲酸对硝基苯酯(pNPC)活化聚乙二醇两端，pNPC与PEG2000的投料摩尔比在4∶1至6∶1之间，将反应物溶于乙腈，加入三乙胺，在无水、室温条件下反应12～14小时，在除去结晶物的滤液中加入乙醚重结晶，置于4℃冰箱中过夜，过滤的结晶物重新溶于乙腈，用相同步骤重结晶一次，最后在20℃真空干燥箱中干燥得PEG-(pNP)2；
(2)合成DPPE-PEG-pNP：将PEG-(pNP)2与二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)磷脂以8∶1至10∶1的摩尔比溶于氯仿中，加入少量三乙胺，在氮气保护下，温度在50℃左右，反应10～12小时，除去结晶物的滤液在真空旋转蒸发仪上蒸出有机溶剂后加入pH为4.5～5.5的磷酸缓冲液，超声水化成脂质体颗粒，过Cl-4B凝胶柱，氯仿萃取收集的成分后得DPPE-PEG-pNP；
(3)制备脂质体纳米颗粒：将原料按以下摩尔百分比：大豆磷脂35％～45％，胆固醇45％～55％，DPPE-PEG5％～9％，DPPE-PEG-pNP2％～8％，溶于氯仿中，用超声薄膜法制备脂质体纳米颗粒；
(4)连接活性分子：在脂质体纳米颗粒溶液中加入待连接的带氨基的活性分子，调节pH在7.5～8.5，室温下搅拌4～5小时。
下面结合附图进一步详述本发明：
附图说明
图1为颗粒的结构示意图。
图2为颗粒连接活性物质的反应示意图。
图3为制备颗粒的AFM表征。
图4为原料PEG2000的核磁共振表征。
图5为合成产物PEG-(pNP)2的核磁共振表征。
图6为颗粒连接小牛血清白蛋白(BSA)的蛋白质电泳图。
图中：1为颗粒与BSA为1∶1的混合液；2为超高速离心后的上清液；3为离心下来的颗粒；4为纯的BSA；5为颗粒与BSA2∶1的混合液；6为超高速离心后的上清液。
本发明提供的一种新型的表面易修饰带氨基活性分子的聚乙二醇(PEG)化脂质体纳米颗粒为脂质体外面连接了一层PEG，能起到增强颗粒在体内的生物相容性、避免被网状内皮系统所识别、延长体内循环时间的作用；在颗粒表面的一小部分PEG末端修饰上对硝基苯碳酸酯(pNP)基团，在pH7.5～8.5的近中性条件下，带氨基的活性物质通过氨基与pNP的取代反应能够很高效、快速地连接到颗粒表面，同时还能很好地保持物质的活性。其制备的具体步骤如下：
(1)氯甲酸对硝基苯酯(pNPC)对聚乙二醇两端进行活化。pNPC与PEG2000的投料摩尔比在4∶1至6∶1之间，将反应物溶于经过无水化处理的乙腈，加入少量重蒸过的三乙胺，在无水、室温条件下反应12～14小时，过滤除去结晶物，在滤液中加入乙醚重结晶，置于4℃冰箱中过夜，重新过滤得结晶物，结晶物重新溶于乙腈，用相同步骤重复重结晶一次，最后20℃真空干燥箱中干燥得PEG-(pNP)2，结构式如下：
Figure S07134215520070125D000021
(2)：合成DPPE-PEG-pNP：将PEG-(pNP)2与二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)磷脂以8∶1至10∶1的摩尔比溶于氯仿中，加入少量三乙胺，在氮气保护下反应10～12小时，温度控制在50℃左右，过滤除结晶物，滤液在真空旋转蒸发仪上蒸出氯仿，在圆底烧瓶壁上形成一层薄膜，加入适量的pH为4.5～5.5的PBS缓冲液，超声水化成脂质体颗粒，过Cl-4B凝胶柱，氯仿萃取后得产品DPPE-PEG-pNP(结构示意见图1)。
(3)制备脂质体纳米颗粒：制备颗粒原料的配比按如下摩尔百分比：大豆磷脂35％～45％，胆固醇45％～55％，DPPE-PEG5％～9％，DPPE-PEG-pNP2％～8％，将原料溶于有机溶剂氯仿，用超声薄膜法制备脂质体纳米颗粒(见图3的AFM表征)：
(4)将带氨基的活性分子加到脂质体颗粒溶液中，调节pH至7.5～8.5，室温下搅拌反应4～5小时(连接活性物质的反应示意见图2)。
采用本发明制备的这种新型PEG化脂质体纳米颗粒具有以下特点：
1、该颗粒制备过程简单，所需合成步骤较少，合成过程简单易行。
2、该颗粒连接带氨基活性物质的条件温和，在pH7.5～8.5、室温下反应4～5小时就可以高效、快速地连接上去。
3、该颗粒连接活性分子时不影响物质的活性，活性物质连接上去以后还能保持跟以前基本一致的活性，在药物控释与缓释中可以充分起到靶向的作用。
4、该颗粒连接活性分子具有广泛性，凡是带氨基的活性物质，理论上都是可以通过此方法连接到脂质体表面上去。
具体实施方式
实施例1：
称取0.8g氯甲酸对硝基苯酯(pNPC)溶解于10ml经无水化处理过的乙腈溶剂中，称取2.0gPEG2000溶解于30ml的乙腈溶剂中，往pNPC溶液中快速加入2.0g活化了的分子筛与1ml无水化处理过的三乙胺溶液，在密闭体系中用恒压低压漏斗把PEG2000的溶液逐滴加入到pNPC溶液中去，流速控制在0.5滴/秒，室温下搅拌14小时。滤除沉淀，滤液中加无水乙醚400ml，置于4℃冰箱中重结晶过夜，晶体经抽滤，以少量乙醚洗涤后，溶于乙腈，再重结晶一次，得到产物PEG-(pNP)2，真空下抽掉溶剂与水分(核磁共振表征结果见图5)，与图4原料PEG的核磁共振表征比较，可以看出，在化学位移7.386-7.409与8.275-8.297处分别有四个H，且为双峰，说明PEG的两端基本上都已经修饰上pNP。称取1g合成好的PEG-(pNP)2溶于20ml的氯仿中，在氮气保护下，加入50mg的DPPE溶液，50℃下反应10小时，旋转蒸发仪上蒸发出溶剂，加入pH为4.5的磷酸缓冲液(PBS)溶液5ml水化，过Cl-4B柱，收集带乳白色的成分，氯仿萃取此成分得产品DPPE-PEG-pNP。将大豆磷脂70mg，胆固醇60mg，DPPE-PEG5.0mg，DPPE-PEG-pNP3.0mg置于圆底烧瓶中，10ml氯仿溶解，用超声薄膜法制备脂质体纳米颗粒；用5ml pH为7.4的PBS做分散液，用5mg/ml的小牛血清白蛋白(BSA)溶液做模拟活性分子，在pH为4.5的条件下与颗粒作用，钠米颗粒结合带氨基活性物质的能力见图6蛋白质电泳图，其中1泳道为颗粒与5mg/ml BSA溶液体积比为1∶1的混合液，2泳道为超高速离心后的上清液，3泳道为离心下来的颗粒，4泳道为纯的BSA溶液，5泳道为颗粒与BSA溶液体积比为2∶1的混合液，6泳道为超高速离心后的上清液。2泳道只显示出很低浓度的BSA，而6泳道基本上看不出上清液中还有BSA，说明BSA已经基本上修饰到颗粒表面上了。
实施例2：
称取0.6g氯甲酸对硝基苯酯(pNPC)溶解于10ml经无水化处理过的乙腈溶剂中，称取2.0gPEG2000溶解于30ml的乙腈溶剂中，往pNPC溶液中快速加入2.0g活化了的分子筛与1ml无水化处理过的三乙胺溶液，在密闭体系中用恒压低压漏斗把PEG2000的溶液逐滴加入到pNPC溶液中去，流速控制在0.5滴/秒，室温下搅拌12小时。滤除沉淀，滤液中加无水乙醚400ml，置于4℃冰箱中重结晶过夜，晶体经抽滤，以少量乙醚洗涤后，溶于乙腈，再重结晶一次，得到产物PEG-(pNP)2，真空下抽掉溶剂与水分。用核磁共振表征。称取1.0gPEG-(pNP)2溶于20ml的氯仿中，在氮气保护下，加入60mg的DPPE溶液，50℃下反应12小时，旋转蒸发仪上蒸发出溶剂，加入pH为5.0的PBS溶液5ml水化，过柱Cl-4B，收集带乳白色的成分，氯仿萃取此成分得产品DPPE-PEG-pNP。加大豆磷脂75mg，胆固醇60mg，DPPE-PEG4.0mg，DPPE-PEG-pNP4.0mg于圆底烧瓶中，10ml氯仿溶解，用超声薄膜法制备脂质体纳米颗粒；用5ml pH为7.4的PBS做分散液，用5mg/ml的小牛血清白蛋白(BSA)溶液做为模拟活性分子，在pH为5.0的条件下与颗粒作用4.5小时，通过蛋白质电泳证明颗粒结合带氨基活性物质的能力。
实施例3：
称取1.2g氯甲酸对硝基苯酯(pNPC)溶解于10ml经无水化处理过的乙腈溶剂中，称取2.0gPEG2000溶解于30ml的乙腈溶剂中，往pNPC溶液中快速加入2.0g活化了的分子筛与lml无水化处理过的三乙胺溶液，在密闭体系中用恒压低压漏斗把PEG2000溶液逐滴加入到pNPC溶液中，流速控制在0.5滴/秒，室温下搅拌13小时。滤除沉淀，滤液中加无水乙醚400ml，置于4℃冰箱中重结晶过夜，晶体经抽滤，乙醚洗涤后，溶于乙腈，再重结晶一次，得到产物PEG-(pNP)2，真空下抽掉溶剂与水分。用核磁共振表征。称取1.2g合成好的PEG-(pNP)2溶于20ml的氯仿中，在氮气保护下，加入50mg的DPPE溶液，50℃下反应11小时，旋转蒸发仪上蒸发出溶剂，加入pH为5.5的PBS溶液5ml水化，过柱Cl-4B，收集带乳白色的成分，氯仿萃取此成分得产品DPPE-PEG-pNP。加大豆磷脂70mg，胆固醇65mg，DPPE-PEG6.0mg，DPPE-PEG-pNP3.0mg于圆底烧瓶中，10ml氯仿溶解，用超声薄膜法制备脂质体纳米颗粒；用5ml pH为7.4的PBS做为分散液，用5mg/ml的小牛血清白蛋白(BSA)溶液做为模拟活性分子，在pH为5.5的条件下与颗粒作用5小时，通过蛋白质电泳来证明颗粒结合带氨基活性物质的能力。

Claims (1)

1.一种PEG化脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于：
(1)活化PEG：用氯甲酸对硝基苯酯活化PEG2000两端，氯甲酸对硝基苯酯与PEG2000的投料摩尔比在4∶1至6∶1之间，将反应物溶于乙腈，加入三乙胺，在无水、室温条件下反应12～14小时，在除去结晶物的滤液中加入乙醚重结晶，置于4℃冰箱中过夜，过滤得到的结晶重新溶于乙腈，用相同步骤重复重结晶一次，最后20℃真空干燥箱中干燥得PEG-(pNP)2；
(2)合成DPPE-PEG-pNP：将PEG-(pNP)2与二棕榈酰磷脂酰乙醇胺以8∶1至10∶1的摩尔比溶于氯仿中，加入少量三乙胺，在氮气保护下，温度50℃左右反应10～12小时，除去结晶物的滤液在真空旋转蒸发仪上蒸出有机溶剂后，加入pH4.5～5.5的PBS缓冲液，超声水化成脂质体颗粒，过Cl-4B凝胶柱，氯仿萃取后得DPPE-PEG-pNP；
(3)制备脂质体纳米颗粒，将原料按如下摩尔百分比：大豆磷脂35％～45％，胆固醇45％～55％，DPPE-PEG 5％～9％，DPPE-PEG-pNP 2％～8％，溶于有机溶剂中，用超声薄膜法制备脂质体纳米颗粒。
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