CN116178733B - 一种基于三官能团氨基酸的支化单分散peg衍生物、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物、制备方法和应用，涉及有机合成领域，结构式如下式所示，其中，n1、n2、n3分别为氧化乙烯基的重复单元数，各自独立，为3‑120的整数；R1、R2、R3为PEG的端基，分别选自反应性基团、受保护的反应性基团、双性离子中的一种；AA1、AA2分别为三官能团的氨基酸的残基；L1、L2、L3为连接基；N为连接AA1和AA2的连接基；R为AA2的官能团或者被保护的官能团；k为0‑12的整数；该支化单分散PEG衍生物具有精准分子量，确定的化学结构与物理性能，合成方法简单，可以作为难溶药物，如紫杉醇、SN‑38、阿霉素等抗癌药物的载体。
Description
技术领域
本发明涉及有机合成领域，具体涉及一种基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物、制备方法和应用。
背景技术
PEG(Polyethylene glycol，PEG)是一种水溶性合成聚合物，常用于化妆品及药物辅料，是美国食品和药物监督管理局(FDA)批准可用于人体内注射的极少数合成聚合物之一。PEG修饰药物后能减少药物与蛋白质的相互作用，降低毒副作用，降低免疫原性，提高药物的半衰期。目前生物医药领域使用的PEG修饰剂是多分散性的(多分散指数可以定义为重均分子量Mw/数均分子量Mn，用于衡量分子量分布的宽度)，这对PEG药物后续的分离提纯、结构表征、质量控制、药代动力学研究、PEG诱发抗体机理以及修饰后药物发挥的最大作用等研究带来极为不利的影响。
单一分子量的PEG的特征在于，在MALDI-ToF质谱中展现至少一种单一分子量的分子离子峰(M+H+、M+Na+、M+K+)，而多分散性PEG的特征在于质量间隔44的各种分子量的分子离子峰，分布范围较宽，一般呈正态分布；单一分子量的PEG的另一个特征在于液相检测谱图呈现为一个窄而尖的峰，相反，多分散性的PEG则显示一个宽而矮的钝峰。现有技术中，许多研究表明分子量大小对修饰药物的性能有很大的影响，包括纳米药物的脂质体，采用的PEG是多分散的，这势必要影响它的血液循环时间，降低药物靶向输送效率。
单分散PEG的制备工艺路线长，产率低，对分子量超过2000的PEG合成难度较大。公开号为CN104211943A的中国专利文献公开了一种制备分离单分散PEG的方法，包括：原料PEG溶于有机溶剂中，在碱性物质催化作用下，与通式为R–B的化合物反应，制得不同极性的PEG衍生物的混合物，进一步硅胶柱层析分离后，获得单一分布的PEG衍生物，其中，R选自C1-C4烷基、芳基，B选自氯离子、溴离子、碘离子、巯基、磺酸基、异氰酸基、异氰尿酸基。但是上述制备方法的产率有待进一步提高。
直联结构的PEG结构较为简单，只有末端可用于修饰偶联药物，而支化PEG具有支链结构，支链结构在一个或多个端上具有官能团，如末端呈树枝结构的支链PEG、叉状PEG和多臂PEG等，能够实现多种共轭可能性、提高载药量或提高药物的稳定性等。现有技术中，文献Hsu H J,Han Y,Cheong M,et al.Dendritic PEG outer shells enhance serumstability of polymeric micelles[J].Nanomedicine,2018:S1549963418301023.记载了支化PEG胶束在血清中表现出更长的半衰期以及更慢的释放曲线，经荧光淬灭分析与分子动力学模拟表明，支化PEG胶束的高血清稳定性可归因于其支化的PEG外壳。因此，有必要研发一种安全性好、高纯度、高收率且易于工业化放大生产的支化单分散PEG衍生物。
发明内容
本发明提供了一种基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物，该衍生物能够对生物相关物质进行修饰且具有良好生物相容性，且易于合成，具有工业化合成潜力。
具体采用的技术方案如下：
一种基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物，具有如式(Ⅰ)所示的结构式：
式(Ⅰ)中，n1、n2、n3分别为氧化乙烯基的重复单元数，各自独立，为3-120的整数；R1、R2、R3为PEG的端基，分别选自反应性基团、受保护的反应性基团、双性离子中的一种；AA1、AA2分别为三官能团的氨基酸的残基；L1、L2、L3分别为连接PEG和三官能团氨基酸的残基的连接基，选自酰胺键、二硫键、酰亚胺键、酯键或醚键等；N为连接AA1和AA2的连接基，选自酰胺键、二硫键、酰亚胺键、酯键或醚键等；R为AA2的官能团或者被保护的官能团，选自氨基、羧基、羟基、巯基或酚羟基等；k为0-12的整数。
所述三官能团的氨基酸包括但不限于赖氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸、酪胺酸、苏胺酸等。
优选的，n1、n2、n3各自独立地为3-80的整数。
进一步优选的，n1、n2、n3各自独立地为6-60的整数；k为0-8的整数。当n1、n2、n3小于6时，中间体的性状为胶状，难以提纯，不易于制备得到；而n1、n2、n3为6-60的整数时，性状相对较好，为油状或粉末状提纯较为方便，易于制备得到；其次，k越大，总产率越低，且当k增大时，在水与有机溶剂竞争溶解时，在水中的分配系数急剧增大，当n1、n2、n3小于6时，其达到目标分子量时需要更大的k，而n1、n2、n3为6-60的整数时，能够更快制备得到目标分子量的产物；最后，当n1、n2、n3大于60时，长链单分散聚乙二醇的活性基团可能无法完全反应并且会由于长链聚乙二醇带来的极性影响导致产物与未反应的原料难以分离，而n1、n2、n3各自独立地为6-60时则不存在上述问题。
反应性基团包括但不限于羟基、氨基、羧基、羧基的活化酯、点击反应基团、酰肼或卤代基等，受保护的反应性基团包括但不限于甲氧基等；双性离子包括但不限于磷脂酰胆碱或甜菜碱等。
优选的，所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物具有如式(II)所示的结构式：
式(II)中，R1、R2、R3为甲氧基，L1、L2、L3和N均为酰胺键；AA1为赖氨酸的残基，AA2为谷氨酸的残基。
或所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物具有如式(III)所示的结构式：
式(III)中，R1、R2、R3为甲氧基，L1、L2和N均为酰胺键；L3为二硫键；AA1为赖氨酸的残基，AA2为半胱氨酸的残基。
本发明还提供了所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物作为药物载体的应用。
可选的，以具有聚集诱导发光(AIE)效应的四聚苯乙烯(TPE)作为难溶性药物的模拟化合物，利用所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物作为其载体。结果表明制得的支化单分散PEG衍生物-TPE在水溶液中可形成自组装胶束，且由于PEG侧链的存在，胶束的临界浓度(CMC)与粒径随着支化度的提高而增大，同时发光强度下降。这些实验结果同时也说明了所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物可以作为难溶的抗癌药物(紫杉醇、SN-38、阿霉素等)的载体，通过化学键相连，达到被动靶向输送抗癌药物的目的。
本发明还提供了所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物修饰的生物相关物质，所述生物相关物质为能够与所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物的R基团通过化学键结合的功能性分子，包括含氨基的药物、含羟基的药物、含羧基的药物、荧光基团或示踪基团。
R官能团也可以与药物中的官能团之间用可降解的化学键链接，这些化学键包括，但不局限于，酯键、碳酸酯键、二硫键、腙键、acetal、以及酶降解链接键等。
本发明还提供了所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物的制备方法，包括：
以单分散mPEG-羧基与三官能团的氨基酸的衍生物为起始原料，或以单分散mPEG-氨基与三官能团的氨基酸的衍生物为起始原料，经至少一次缩合反应和至少一次脱保护反应得到；所述三官能团的氨基酸的衍生物为至少一个官能团被保护的三官能团的氨基酸。
优选的，以单分散单甲醚PEG羧酸(mPEGn-COOH，包括乙酸、丙酸、丁酸)与含游离氨基的三官能团的氨基酸的衍生物为起始原料，或以单分散单甲醚-PEG-氨基(mPEGn-NH2，包括乙胺、丙胺、丁胺等)与含羧基或羧基活化酯的三官能团的氨基酸的衍生物为起始原料，经至少一次缩合反应和至少一次脱保护反应得到；
所述三官能团的氨基酸的衍生物包括L-赖氨酸乙酯二盐酸盐或N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯，缩合反应在碱性条件下进行，缩合反应使用缩合剂，缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐或N-羟基丁二酰亚胺。
反应原料加入三乙胺、4-二甲氨基吡啶、N,N-二异丙基乙胺、氢氧化钠或碳酸钠中的至少一种来达到所述碱性条件。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明制得的基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物具有精准分子量，确定的化学结构与物理性能，有助于PEG修饰剂的作用研究。
(2)本发明制备方法可以精准调节分子量大小，且能够任意调节PEG的结构与链长，以及氨基酸的种类，通过不同组合可以制备出多种衍生产物。
(3)本发明制得的基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物与线性结构的PEG修饰剂相比，具有更好的抗酶降解性能、更强的水溶性，且生物相容性优异，能够作为药物载体使用。
(4)本发明制得的基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物的物理性能与生物应用可以通过调节PEG的结构与链长，以及氨基酸的种类进行精确组合，在递送特定憎水药物的前提下，通过这样的组合与各种关键参数的调整，以期获得最佳的特定药物输送效果。
附图说明
图1为实施例2制得的所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物的基质辅助激光解吸飞行时间质谱检测结果。
图2为实施例4制得的所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物的基质辅助激光解吸飞行时间质谱检测结果。
图3为实施例2与实施例4制得的所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物的溶血性能。
图4为载药实验中样品1、样品2和样品3的水溶性对比图。
图5为载药实验中样品1、样品2和样品3的药物释放曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例与附图，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1
(1)在250mL单口瓶中依次加入80mL二氯甲烷(DCM)、6g单分散单甲醚PEG十五乙酸以及0.7g L-赖氨酸乙酯二盐酸盐，反应液冷却至-10℃，向反应液中加入24mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)与1.5g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，最后向反应液中滴加0.8g三乙胺(TEA)，滴加时间为10min。加料完毕，反应液升温至室温继续反应5h，TLC显示原料反应完毕，反应液用0.6M稀盐酸溶液、0.1M碳酸氢钠溶液与超纯水洗涤一次，有机相浓缩后得到5.76g无色油状化合物(式1-(1)所示的化合物)；
(2)在100mL单口瓶中加入步骤(1)得到的无色油状化合物4.76g与10mL清水，冰水浴下，向反应瓶中加入预先配置好的氢氧化钠水溶液(0.5g氢氧化钠溶解于25mL超纯水中)进行脱保护基反应，TLC检测显示原料完全反应后，反应液用二氯甲烷萃取，收集有机相并用饱和食盐水洗涤，有机相浓缩后得到4.1g白色固体(式1-(2)所示的化合物；收率为76％)。
该产物对应的核磁结果为：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.38(d,J＝8.1Hz,1H),7.04(t,J＝5.8Hz,1H),4.61(q,1H),4.02(d,J＝9.1Hz,2H),3.97(s,2H),3.90-3.43(m,120H),3.38(s,6H),3.28(q,2H),1.98-1.88(m,1H),1.84-1.74(m,1H),1.67-1.51(m,2H),1.49-1.34(m,2H).
实施例2
(1)在250mL单口瓶中依次加入100mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、5g单分散单甲醚PEG十六氨基、1.96g N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯与100mL二氯甲烷(DCM)，反应液冷却至0℃，向反应液中加入1.5g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)。加料完毕，反应液升温至25℃继续反应5h，TLC显示原料反应完毕，反应液用清水洗涤三次，收集有机相浓缩后得到5.5g无色油状液体(式2-(1)所示的化合物)；
(2)向150mL反应瓶中加入25mL二氯甲烷、20mL三氟乙酸与步骤(1)得到的无色油状液体4.56g，室温下反应5h，TLC显示原料已反应完毕。向反应液中缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液，摇匀分层后收集有机相，有机相减压浓缩，得到淡黄色油状液体。油状液体加入至混合溶液(乙酸乙酯:石油醚＝4:3)中置于-20℃重结晶的得到3.1g白色粉末。
(2-(2)所示化合物)
(3)向50mL反应瓶中加入25mL二氯甲烷(DCM)以及实施例1得到的白色固体3.5g(式1-(2)所示的化合物)与步骤(2)得到的白色粉末(2-(2)所示化合物)2.1g，再依次加入14mg 4-二甲氨基吡啶和458mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，常温下反应5h，TLC显示原料已反应完毕。反应液用清水洗涤两次，收集有机相。有机相经减压浓缩后，得到淡黄色油状液体，淡黄色油状液体溶解于清水中，用50mL的混合溶剂(二氯甲烷:乙酸乙酯＝5:1)萃取产物，收集有机相，有机相减压浓缩后加入80mL混合溶剂(乙酸乙酯:石油醚＝10:3)中置于-20℃重结晶得到3.5g白色固体。
(4)向50mL反应瓶中加入10mL清水与100mg氢氧化钠以及上步骤(3)得到的白色固体2.3g，室温下脱保护反应2h，TLC显示原料已反应完毕。反应液用0.6M稀盐酸溶液、0.1M碳酸氢钠溶液与清水各洗涤一次，经无水硫酸镁干燥，G3砂芯漏斗过滤后，减压浓缩，得到1.7g无色油状液体(式2-(4)所示的化合物)。
HPLC-CAD检测显示产品纯度为94.6％。反应总收率为29％。
质谱[M+Na]+＝2480.2(如图1所示)
核磁：1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.59(d,J＝7.0Hz,1H),7.38(d,J＝7.8Hz,1H),7.10(t,J＝6.0Hz,1H),6.88(t,J＝5.6Hz,1H),4.46(q,J＝7.0Hz,2H),4.03(q,2H),3.97(s,2H),3.78-3.51(m,180H),3.43(q,J＝4.6Hz,2H),3.38(s,9H),3.32-3.28(m,1H),3.27-3.23(m,1H),2.46-2.40(m,1H),2.37-2.32(m,1H),2.19-2.13(m,1H),2.10-2.05(m,1H),1.94-1.88(m,1H),1.75-1.69(m,1H),1.59-1.51(m,2H),1.44-1.36(m,2H)。
实施例3
(1)在250mL单口瓶中依次加入80mL二氯甲烷(DCM)、6g单分散单甲醚PEG十一乙酸以及1.35g L-赖氨酸乙酯二盐酸盐，反应液冷却至0℃，向反应液中加入64mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)与2.2g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，最后向反应液中滴加1.1g三乙胺(TEA)，滴加时间为10min。加料完毕，反应液升温至室温继续反应5h，TLC显示原料反应完毕，反应液用0.6M稀盐酸溶液、0.1M碳酸氢钠溶液与超纯水洗涤一次，有机相浓缩后得到6g无色油状化合物(式3-(1)所示的化合物)；
在100mL单口瓶中加入步骤(1)得到的6g无色油状化合物与10mL清水。冰水浴下，向反应瓶中加入预先配置好的氢氧化钠水溶液(0.5g氢氧化钠溶解于25mL超纯水中)进行脱保护基反应。TLC检测显示原料完全反应后，反应液用二氯甲烷萃取，收集有机相并用饱和食盐水洗涤，有机相浓缩后得到4.5g无色油状液体(式3-(2)所示的化合物)；收率为82％。
该产物对应的核磁结果为：1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.39(d,J＝8.2Hz,1H),7.08(t,J＝6.0Hz,1H),4.62(q,J＝7.3Hz,1H),4.07-3.99(m,2H),3.97(s,2H),3.70-3.62(m,84H),3.55(dd,J＝5.9,3.6Hz,4H),3.38(s,6H),3.29(p,J＝6.4Hz,2H),1.96-1.90(m,1H),1.82-1.76(m,1H),1.62-1.53(m,2H),1.47-1.37(m,2H).
实施例4
(1)在250mL单口瓶中依次加入100mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、10g单分散单甲醚PEG十二氨基、5.2g N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯与150mL二氯甲烷(DCM)，反应液冷却至0℃，向反应液中加入3.6g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)。加料完毕，反应液升温至30℃继续反应5h，TLC显示原料反应完毕，反应液用清水洗涤三次，收集有机相浓缩后得到12.5g无色油状液体(式4-(1)所示的化合物)。
(2)向150mL反应瓶中加入25mL二氯甲烷、20mL三氟乙酸与步骤(1)得到的4.75g无色油状液体(式4-(1)所示的化合物)，室温下反应5h脱保护基，TLC显示原料已反应完毕。向反应液中缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液，摇匀分层后收集有机相，有机相减压浓缩，得到淡黄色油状液体。油状液体加入至混合溶液(乙酸乙酯:石油醚＝15:16)中置于-20℃重结晶的得到2.8g白色粉末(式4-(2)所示的化合物)。
(3)向100mL反应瓶中加入15mL清水与550mg氢氧化钠。反应液冷却至10℃向反应液中加入步骤(1)得到的3.88g无色油状液体(式4-(1)所示的化合物)，室温下反应2h脱保护基。TLC显示原料已反应完毕。反应液加入50mL二氯甲烷，摇晃后静置分相，收集有机相并减压浓缩，得到3.2g无色油状液体(式4-(3)所示的化合物)。
(4)向100mL反应瓶中加入50mL二氯甲烷以及步骤(2)得到的白色粉末(式4-(2)所示的化合物，m＝12)2.3g与步骤(3)得到的无色油状液体(式4-(3)所示的化合物)2.3g，再依次加入17.9mg 4-二甲氨基吡啶和620mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，常温下反应5h，TLC显示原料已反应完毕。反应液用15mL 0.6M稀盐酸洗涤三次，再用饱和食盐水洗涤三次，收集有机相用，减压浓缩，得到无色油状液体。将油状液体加入到EA:PE＝77:52混合溶剂中，置于-20℃重结晶，得到3.67g白色粉末(式4-(4)所示的化合物)。
(5)向50mL反应瓶中加入25mL二氯甲烷、20mL三氟乙酸与步骤(4)得到的3.57g白色粉末(式4-(4)所示的化合物)，室温下反应5h，TLC显示原料已反应完毕。向反应液中缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液，摇匀分层后收集有机相，有机相减压浓缩，得到淡黄色油状液体。油状液体加入至混合溶液(乙酸乙酯:石油醚＝1:2)中置于-20℃重结晶的得到1.3g白色粉末(式4-(5)所示的化合物)。
(6)向50mL反应瓶中加入25mL二氯甲烷以及实施例3制得的无色油状液体(式3-(2)所示的化合物)0.94g与步骤(5)得到的白色粉末1.13g(式4-(5)所示的化合物)，再依次加入13mg 4-二甲氨基吡啶和462mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，常温下反应5h，TLC显示原料已反应完毕。反应液用清水洗涤两次，收集有机相。有机相经减压浓缩后，得到淡黄色油状液体，淡黄色油状液体溶解于超纯水中，用50mL的混合溶剂(二氯甲烷:乙酸乙酯＝5:1)萃取产物，收集有机相，有机相减压浓缩后加入80mL混合溶剂(乙酸乙酯:石油醚＝3:2)中置于-20℃重结晶得到1.6g白色固体(式4-(6)所示的化合物)。
(7)向50mL反应瓶中加入10mL清水与100mg氢氧化钠以及步骤(6)得到的白色固体1.5g，室温下反应2h，TLC显示原料已反应完毕。反应液用0.6M稀盐酸溶液、0.1M碳酸氢钠溶液与清水各洗涤一次，经无水硫酸镁干燥，G3砂芯漏斗过滤后，减压浓缩，得到1g无色油状液体(式4-(7)所示的化合物)。反应总收率为12％。
HPLC-CAD检测显示产品纯度为97.6％。
质谱[M+Na]+＝2622.2(如图2所示)
核磁：1H NMR(400MHz,CD2Cl2)δ7.86(d,J＝6.6Hz,1H),7.60(d,J＝7.3Hz,1H),7.37(d,J＝7.4Hz,1H),7.18(t,J＝6.5Hz,1H),7.02(t,J＝5.7Hz,2H),4.53-4.30(m,3H),4.00(t,J＝20.0Hz,4H),3.78-3.50(m,174H),3.49-3.40(m,5H),3.38(s,12H),3.33-3.20(m,3H),2.43-2.25(m,4H),2.23-2.16(m,1H),2.15-1.99(m,3H),1.97-1.88(m,1H),1.77-1.65(m,1H),1.61-1.49(m,2H),1.45-1.32(m,2H)。
样品分析
溶血实验
将柠檬酸钠抗凝的兔血离心(1500rpm，5分钟)，丢弃上清液，然后用磷酸缓冲液(PBS)洗涤。洗涤和离心过程重复三次，直到上清液颜色变淡，收集红细胞。将获得的红细胞用PBS稀释以获得浓度为5％(v/v)的红细胞悬液。然后，将0.8mL不同药物浓度梯度(0.01mM、0.1mM、1mM)的实施例2与实施例4中的无色油状液体(式2-(4)所示的化合物、式4-(7)所示的化合物)与0.2mL红细胞悬液混合，超纯水组和PBS分别组用作阳性和阴性对照。将混合物在37℃下摇动(100rpm)培养1小时，然后离心(3000rpm，5min)。使用酶标仪在540nm处测量上清液中释放的血红蛋白的吸光度(Abs)。溶血百分比通过以下公式计算：
溶血性(Hemolysis)(％)＝(Abstest-Absnegative)/(Abspositive-Absnegative)×100％。
Abstest表示样品的吸光度，Absnegative表示阴性对照的吸光度，Abspositive表示阳性对照的吸光度。
实验结果如图3所示，实施例2与实施例4所制备的基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG溶血率几乎可以忽略(低于5％)，证明其良好的生物相容性。
载药实验
为评估本发明所得基于三官能团氨基酸的支化单分散mPEG衍生物作为药物载体的性能，使用基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物负载四聚苯乙烯(TPE)并与线性单分散单甲醚PEG修饰四苯乙烯进行对比。
样品1的合成
向100mL反应瓶中加入0.6g单分散单甲醚PEG乙酸、0.1g羟基-四苯乙烯(TPE-OH)与10mL二氯甲烷，向反应液中加入16mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)与125mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，室温下反应8h，TLC显示原料已反应完毕。反应结束后，反应液减压浓缩，加入至10mL乙酸乙酯(EA)中置于-20℃中结晶得到0.6g白色粉末(产率88.6％)
样品2的合成
向100mL反应瓶中加入1.5g实施例2所得无色油状液体(式2-(4)所示的化合物)、0.2g羟基-四苯乙烯(TPE-OH)与10mL二氯甲烷，向反应液中加入3mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)与128mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，室温下反应8h，TLC显示原料已反应完毕。反应液减压浓缩，加入至20mL混合溶剂(乙酸乙酯:石油醚＝3:2)中置于-20℃重结晶得到1g白色粉末(产率66.7％，常温下为淡黄色油状液体)
样品3的合成
向100mL反应瓶中加入589mg实施例4所得无色油状液体(式4-(7)所示的化合物)、79mg羟基-四苯乙烯(TPE-OH)与10mL二氯甲烷，向反应液中加入1mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)与46mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，室温下反应8h，TLC显示原料已反应完毕。反应液加压浓缩，加入至20mL混合溶剂(乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:1)中用清水洗涤两次；收集有机相并减压浓缩，加入至清水中，用乙酸乙酯洗涤两次，再用二氯甲烷萃取产物；收集有机相经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到0.45g无色油状液体(产率70％)
有机相水相分配实验
取2mmol样品1、样品2、样品3分别溶解于0.7mL超纯水中，加入等量的有机溶剂(DCM:EA＝1:2.5v/v)后摇匀并分相，取上层有机溶剂置于烘箱中烘干。烘干后称取残留物质量，计算它们分别在有机溶剂占总量的比值。
结果图4所示，样品1全部分布于有机相中；49％的样品2分布于有机相相中；而对于样品3，有机相中仅存12％，说明随着支化程度的增加，水溶性越好。
抗酯酶解实验
称取2mg酯酶(150U/mg)，加入至10mL pH＝7.4PBS缓冲液中，配置为酯酶溶液(30U/mL)待用。称取样品1、样品2、样品3各5mmol，分别溶解于2mL的PBS缓冲液中，配置成胶束溶液，再将2mL胶束溶液加入至预热好的2mL酯酶溶液中，置于37℃下持续搅拌。在第0min、10min、20min、30min、40min、50min、1h、1.5h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h，吸取100μL溶液，加入至900μL色谱纯乙腈中，充分摇匀后，用0.45μm滤膜过滤，取20μL进行HPLC分析，计算出每个样品的TPE释放百分比并与时间关系作图。
结果如图5所示，样品1中线性PEG组在酶溶液中发生TPE突释，6h内几乎全部释放，而样品2与样品3中的支化PEG组的TPE释放曲线更加缓和，72h后释放80％，稳定性更高。
以上所述实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物，其特征在于，具有如式(Ⅰ)所示的结构式：
式(Ⅰ)中，n1、n2、n3分别为氧化乙烯基的重复单元数，各自独立，为6-60的整数；R1、R2、R3为PEG的端基，分别选自反应性基团、受保护的反应性基团、双性离子中的一种；AA1、AA2分别为三官能团的氨基酸的残基；L1、L2、L3分别为连接PEG和三官能团氨基酸的残基的连接基；N为连接AA1和AA2的连接基；R为AA2的官能团或者被保护的官能团；k为0-12的整数且k不为0；
所述三官能团的氨基酸包括赖氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸、酪胺酸或苏胺酸。
2.根据权利要求1所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物，其特征在于，k为0-8的整数且k不为0。
3.根据权利要求1所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物，其特征在于，反应性基团包括羟基、氨基、羧基、羧基的活化酯、点击反应基团、酰肼或卤代基，受保护的反应性基团包括甲氧基；双性离子包括磷脂酰胆碱或甜菜碱。
4.根据权利要求1-3任一所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物作为药物载体的应用。
5.根据权利要求1-3任一所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物修饰的生物相关物质，其特征在于，所述生物相关物质为能够与所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物的R基团通过化学键结合的功能性分子，包括含氨基的药物、含羟基的药物、含羧基的药物、荧光基团或示踪基团。
6.根据权利要求1-3任一所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物的制备方法，其特征在于，以单分散mPEG-羧基与三官能团的氨基酸的衍生物为起始原料，或以单分散mPEG-氨基与三官能团的氨基酸的衍生物为起始原料，经至少一次缩合反应和至少一次脱保护反应得到；所述三官能团的氨基酸的衍生物为至少一个官能团被保护的三官能团的氨基酸。
7.根据权利要求6所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物的制备方法，其特征在于，所述三官能团的氨基酸的衍生物包括L-赖氨酸乙酯二盐酸盐或N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-1-叔丁酯，缩合反应在碱性条件下进行，缩合反应使用缩合剂，缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐或N-羟基丁二酰亚胺。
8.根据权利要求7所述基于三官能团氨基酸的支化单分散PEG衍生物的制备方法，其特征在于，反应原料加入三乙胺、4-二甲氨基吡啶、N,N-二异丙基乙胺、氢氧化钠或碳酸钠中的至少一种来达到所述碱性条件。
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