CN102643420A - 一种异端基双官能团聚烷基醚类化合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种异端基双官能团聚烷基醚类化合物，所述化合物具有通式（I），其中，A选自亲电基团-CONHNH2、-ONH2或-NH2中的任意一种；PAG为不含端基的聚烷基醚链。本发明所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物可以和蛋白质、多肽或者药物分子的自由巯基、羰基在温和条件下发生反应，反应特异性强，速度快。该类聚合物可以用于蛋白质多肽及其他药物分子及载体间的化学交联，制备定点均一的结合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种异端基双官能团聚烷基醚类化合物，具体涉及一种在医药、生物化工、化学工程领域中能够对多种蛋白质、多肽、大分子药物等进行共价偶联的异端基双官能团聚烷基醚类聚合物及其用途。
背景技术
聚烷基醚类聚合物聚乙二醇（polyethylene glycol）是一种以环氧乙烷为原料聚合得到的高分子，是一种能同时在大多数有机溶剂例如甲醇、二氯甲烷、氯仿和水中都具有良好溶解性能的聚醚类化合物，无腐蚀性，无刺激性，无免疫原性和抗原性，生物相容性好，在体内表现为低蛋白质和低血小板吸附以及低细胞粘附性，并且已经获得美国FDA批准应用。
由于聚乙二醇具有以上这些优良品质，因此作为添加剂在很多领域，例如化妆品、水基涂料、纸张涂层、粘合剂、印刷油墨、表面活性剂等都得到了广泛的应用。同时，在生物医药领域，聚乙二醇与蛋白质、多肽或者其他药物分子通过化学方法相连后，在提高他们水溶性的同时，显著增大了偶联物的水合半径，很好地改善了这些物质在体内的药代动力学和生理学特征，例如屏蔽多肽的抗原性，降低体内清除率，降低蛋白水解酶的水解程度，增大偶联物的表观分子量，降低肾脏清除率，延长体内半衰期。
聚乙二醇在用于化学偶联时，需要将末端不活泼的羟基先行衍生为其他反应活性更高的官能团，然后与目标分子的对应基团进行共价连接得到偶联产物。在某些情况下若要将两个不同的分子或者药物分子与其他载体或者固体表面通过聚乙二醇共价连接，则需要通过两端均带有活性官能团的双端基聚乙二醇分别与两者进行共价偶联来达到目的，这一点在蛋白质、多肽或者一些抗肿瘤药物的研究中显得尤为突出。异端基双官能团的聚乙二醇研制在文献中已经有一些报道，如Volcker等采用一端为十八酰基一端为氨基的聚乙二醇为原料进行多步衍生和分离纯化后制备一端为羟基一端为羰基的异端基双官能团聚乙二醇（N.H.,Klee,D.,Hanna,M.,et.Al.Synthesis of heterotelechelicpoly(ethylene glycol)s and their characterization by MALDI-TOF-MS.Macromolecular Chemistry and Physics.1999,200(6):1363-1373）；Chee-Youb Won以一端为t-Boc一端为氨基的聚乙二醇为原料制备了一端为丙烯酰基一端为异氰酸酯的异端基双官能团聚乙二醇交联剂（Won,C.Y.Synthesis ofheterobifunctional poly(ethy1ene glycol)containing an acryloyl group at one end andan isocyanate group at the other end.Polymer Bulletin,2004,52(2):109-115）；Mack等则是以两端均为羟基的聚乙二醇为原料制备了Fmoc-β-Ala-PEG-O-CONH-CH2COOH（Mack,J.Kienle,S.,Leipert,D.,et.al.Heterobifunctionalized tetraethylene glycol:A spacer for surface attachment of viralpeptide epitopes for ELISA and derivatization of membrane modifying peptides.Letters in Peptide Science,1999,6(2-3):135-142）。相反，在专利中却很少有相关技术报道。
由于目前较常应用的一些活性官能团针对蛋白质、多肽或者其他分子的化学偶联过程具有相当大的随机性，造成了其化学偶联过程的可控性差，偶联产物具有不可重复性，从而严重影响他们的后续研究及应用，如Drezek等人用α-二硫吡啶基-ω-琥珀酰亚胺酯聚乙二醇对金纳米球和非特异性抗体Ig-G进行偶联来制备癌症诊断试剂（Loo,C.,Lowery，A.,Halas,N.,West,J.,Drezek,R.Immunotargeted Nanoshells for Integrated Cancer Imaging and Therapy.NanoLetters.2005,5(4):709-711），J.S.Chen等人则是采用α-琥珀酰亚胺琥珀酸酯-ω-琥珀酰亚胺酯聚乙二醇将胶原蛋白和辣根过氧化酶进行交联制备长效缓释蛋白制剂（Chen,J.S.,Noah,E.M.,Pallua,N.,Steffens,G.C.M.The use of bifunctionalpolyethyleneglycol derivatives for coupling of proteins to and cross-linking ofcollagen matrices.Journal of Materials Science:Materials in Medicine.2001,13(11):1029-1035），但他们所选择聚乙二醇交联剂带有的琥珀酰亚胺酯基团不具备反应特异性，从而会不可避免地导致不必要的副交联产物产生。这类问题在目前聚乙二醇交联的研究中普遍存在，因此，研制能实现他们定点化学偶联的试剂这项工作便显得非常重要。
发明内容
本发明利用硫代苯磺酸酯与巯基的特异反应，以及酰肼与羰基的特异性反应来实现聚烷基醚类化合物的两个端基分别与两个不同的蛋白质、多肽或者其他分子进行互不交叉的高度特异性化学偶联。
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种异端基双官能团聚烷基醚类化合物，所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物一端为硫代磺酸酯，另一端为酰胺基、氧胺基、氨基等亲电基团，克服了现有双端基聚烷基醚类化合物，尤其是双端基聚乙二醇在应用中的诸多缺陷。
本发明所述的化合物具有通式（I）：
其中，A为亲电官能团，所述亲电官能团选自酰肼、氧胺或氨基中的任意一种，即通式（I）中A选自亲电基团-CONHNH2、-ONH2或-NH2中的任意一种。
其中，PAG为不含端基的聚烷基醚链，例如聚乙二醇、聚环氧丙烷、聚四氢呋喃、聚环氧丁烷、聚环氧氯丙烷、聚硅氧烷、聚甲醛等；所述的PAG优选为聚低链烷基醚类聚合物；所述低链烷基为碳数在2-7之间的烷基，例如碳数为2、3、4、5、6、7。
本发明所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物中，不含端基的聚烷基醚链PAG的分子量范围为100-80000Da，例如132、352、528、3080、8800、13200、26400、39600、48444、62612、77132等，优选为1000-50000Da；
优选地，所述PAG为聚乙二醇、聚环氧丙烷或聚四氢呋喃中的任意一种。
优选地，其中，R是选自C1-C5的直链或支链烷基和/或C6-C10的芳基或芳烷基中的任意一种，例如甲基、乙基、正丁基、异丁基、异戊基、正戊基、苯基、苄基、苯乙基等，优选自甲基、乙基、丙基、苯基或芳烷基中的任意一种。
根据R的不同，本发明所述异端基双官能团聚烷基醚类化合物所含有的硫代磺酸酯官能团可以选自硫代烷基磺酸酯和硫代芳基磺酸酯。
可采用的硫代烷基磺酸酯的实施例有硫代甲基磺酸酯、硫代氯甲基磺酸酯、硫代乙基磺酸酯、硫代丙基磺酸酯或2-羟基丙基硫代磺酸酯；可采用的硫代芳基磺酸酯的实例有硫代苯磺酸酯、硫代对甲苯磺酸酯或4-氯苯基硫代磺酸酯。
优选地，本发明所述的硫代烷基磺酸酯包括硫代甲基磺酸酯、硫代乙基磺酸酯和硫代丙基磺酸酯，其中所述的硫代芳基磺酸酯包括硫代苯磺酸酯和硫代对甲苯磺酸酯。
优选地，X、Y独立地选自-CONH-、-O-CONH-、-NH-或-O-中的一种，例如X、Y均为-CONH-，X为-O-CONH-、Y为-NH-，或X为-O-、Y为-O-CONH-。
优选地，m、n、p、w独立地选自0到4的整数，例如0、1、2、3、4，所述的m、n、p、w的数值典型但非限制性的例子有m为0、n为4、p为0、w为1，或者m、n、p、w均为1，或者m为2、n为0、p为3、w为4等。
本领域技术人员所熟悉的对蛋白质、多肽或其他分子发生的随机化学偶联的偶联位点异构体的结合物分离非常困难，从而无法直接作为药物使用。本发明所述的一端为硫代苯磺酸酯，另一端为亲电基团的异端基双官能团聚烷基醚类聚合物可以分别以巯基定点和羰基定点的方式与蛋白质、多肽或者其他分子发生化学偶联，从而有效避免随机偶联产生的混合物，避免了偶联位点异构结合物的分离步骤，更方便直接作为药物使用。
本发明所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物（I）与蛋白质、多肽或者其他分子发生特异性化学偶联的原理如下：
1、当需要定点化学偶联的物质含有巯基时，化合物（I）与其发生特异反应，生成的产物结构如（III）所示：
其中，所述的含巯基化合物为至少含有一个自由巯基的蛋白、多肽及其他分子，结构可以表示为B-SH。其中，PAG、p、m、n、w的定义与上述相同，不再赘述。
2、当需要定点化学偶联的物质含有羰基时，选用化合物（I）含有亲电基团酰肼-CONHNH2的异端基双官能团聚烷基醚类化合物与羰基化合物发生特异反应，生成的产物结构如（IV-A）所示：
其中，所述的含羰基的化合物为至少含有一个自由羰基的蛋白、多肽及其他分子，结构可以表示为E-CO-R’。其中，PAG、p、m、n、w的定义与上述相同，不再赘述。
3、当需要定点化学偶联的物质为含有羰基时，选用化合物（I）含有亲电基团氧胺-ONH2的异端基双官能团聚烷基醚类化合物与羰基化合物发生特异反应，生成的产物结构如（IV-B）所示：
其中，所述的含羰基的化合物为至少含有一个自由羰基的蛋白、多肽及其他分子，结构可以表示为E-CO-R’。其中，PAG、p、m、n、w的定义与上述相同，不再赘述。
4、当需要定点化学偶联的物质为含有羰基时，选用化合物（I）含有亲电基团氨基-NH2的异端基双官能团聚烷基醚类化合物与羰基化合物发生特异反应，生成的产物结构如（IV-B）所示：
其中，所述的含羰基的化合物为至少含有一个自由羰基的蛋白、多肽及其他分子，结构可以表示为E-CO-R’。其中，PAG、p、m、n、w的定义与上述相同，不再赘述。
作为本发明的可选技术方案，本发明所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物（I）中，A为酰肼-CONHNH2，PAG为聚乙二醇，p、n为2，X、Y为-O-，m为0，w为1时，得到化合物（II-A），通式如下：
或者，在本发明的又一个可选技术方案中，本发明所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物（I）中，A为氧胺-ONH2，PAG为聚乙二醇，p、n为2，X、Y为O，m为0，w为2时，得到化合物（II-B），通式如下：
或者，在本发明的又一个可选技术方案中，本发明所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物（I）中，A为氨基，PAG为聚乙二醇，p、n为2，X、Y为O，m为0，w为2时，得到化合物（II-C），通式如下：
所述的化合物（II-A）、（II-B）或（II-C）中，R独立地选自甲基、乙基、丙基、苯基或对甲苯基中的任意一种，即化合物（II-A）、（II-B）或（II-C）中的硫代磺酸酯官能团可以选自硫代甲基磺酸酯、硫代乙基磺酸酯、硫代丙基磺酸酯、硫代苯磺酸酯或硫代对甲苯磺酸酯中的任意一种。
在化合物（II-A）、（II-B）或（II-C）中，h均为聚乙二醇的聚合度，其数值决定于所选聚乙二醇的分子量；化合物（II-A）、（II-B）或（II-C）中聚乙二醇的分子量范围为100-80000Da，例如132、352、528、3080、8800、13200、26400、39600、48444、62612、77132等，优选1000-50000Da。
本发明的目的之二是提供一种化合物（II-A）的制备方法，所述方法包括如下步骤：
（1）以化合物（i-A）为原料，将其中的羟基活化，转化为离去基团Ｌ，得到化合物（ii-A）；所述Ｌ选自氯、溴、甲基磺酸酯以及对甲苯磺酸酯中的一种。
其中，所述的化合物（i-A）为本领域技术人员可获知的化合物，例如所述的化合物（i-A）购自Jenkem。
所述的羟基活化为本领域技术人员所熟知的技术，任何能够将羟基取代，并使该端化学性质活泼的方法均可用于本发明。所述的羟基活化试剂可以是卤化试剂，例如卤素单质、卤化氢、次卤酸、次卤化碳、光气（碳酰氯）、硫酰卤、三卤化磷、五卤化磷等。
（2）将化合物（ii-A）中的羧基活化，转化为活化酯基，得到化合物（iii-A）。
步骤（2）所述的化合物（iii-A）中的酯基是本领域技术人员能够获知的任何一种活化酯基，例如可以是琥珀酰亚胺碳酸酯基（-SC），琥珀酰亚胺乙酸酯基（-SCM），琥珀酰亚胺丙酸酯基（-SPA），琥珀酰亚胺琥珀酸酯基（-SS）等中的任意一种。
所述羧基转化为活化酯为本领域技术人员所熟知的技术，任何能够将化合物（ii-A）中的羧基转化为活化酯的方法均可用于本发明。羧基转化为活化酯的试剂可以是碳二亚胺类缩合剂，例如DCC（二环己基碳二亚胺）、DIC（二异丙基碳二亚胺）、EDCI（1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺）等，所述碳二亚胺类缩合剂可以配合缩合活化剂进行使用，所述的活化剂例如HOBt（1-羟基苯并三唑）、HOAT（1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑）、HOSu（N-羟基琥珀酰亚胺）等。所述的羧基转化为活化酯的试剂还可以是鎓盐类缩合剂，包括碳鎓盐和/或磷鎓盐，典型但非限制性的碳鎓盐有HATU、HBTU、HCTU、TUTU、HBPyU、TSTU等，典型但非限制性的磷鎓盐有PyBOT、PyAOT等。所述的羧基转化为活化酯的试剂还可以是有机磷类缩合剂，典型但非限制性的实施例有DPP-Cl、DECP、DPPA、MPTA等。所述的羧基转化为活化酯的试剂还可以是三苯基磷-多卤代甲烷、三苯基磷-六氯丙酮、三苯基磷-NBS、三(2,6-二甲氧基苯基)铋等。
本发明对羧基转化为活化酯的羟基提供物也没有具体的限定，任何一种能够获知的可以反应得到活化酯的羟基提供物均可实现本发明，例如NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）等。
（3）将化合物（iii-A）中的活化酯基转化为酰肼基，得到化合物（iv-A）。
将活化酯基转化为酰肼基是本领域技术人员所熟知的技术，本发明对于将活化酯基转化为酰肼基的方法没有具体限定，任何可以实现将活化酯基转化为酰肼基的方法均可用于本发明。典型但非限制性的例子是利用水合肼将活性酯基转化为酰肼基。
（4）将化合物（iv-A）中的离去基团L与硫代磺酸盐反应转化为硫代磺酸酯基，得到化合物（II-A）。
本发明所述的硫代磺酸盐选自硫代磺酸钠、硫代磺酸钾、硫代磺酸锂、硫代磺酸镁或硫代磺酸铝中的一种或至少两种的组合，进一步优选硫代磺酸钠。
具体地，化合物（II-A）的制备过程如下列方程式所示：
本发明的目的之三是提供一种（II-B）的制备方法，所述方法包括如下步骤：
（1）以化合物（i-B）（购自NANOCS）为原料，将其中的卤代基团X转化为NHP（酞酰亚胺）基团的化合物（ii-B）。
其中，所述的化合物（i-B）为本领域技术人员可获知的化合物，例如所述的化合物（i-B）购自NANOCS。
同样地，所述将卤代基团转化为NHP基团的过程是本领域技术人员所熟知的，例如，卤代物与N-羟基酞酰亚胺在三乙胺作用下，在DMF中加热反应数小时即可得到酞酰亚胺化产物。
（2）将化合物（ii-B）中的羟基活化，转化为离去基团Ｌ，得到化合物（iii-B）；所述Ｌ选自氯、溴、甲基磺酸酯以及对甲苯磺酸酯中的一种。
步骤（2）所述的羟基活化转化为离去基团L的方法与化合物（II-A）合成步骤（1）所述相同，此处不再赘述。
（3）将化合物（iii-B）中的NHP基团转化为氧胺，得到化合物（iv-B）。
步骤（3）所述的NHP基团转化为氧胺的步骤同样是本领域技术人员所熟知的，例如可以通过NHP基团与水合肼反应得到氧胺。
（4）将化合物（iv-B）中的离去基团L与硫代磺酸盐反应转化为硫代磺酸酯基，即得到化合物（II-B）。
步骤（4）所述的离去基团L与硫代磺酸盐的反应与化合物（II-A）合成步骤（4）相同，所述的硫代磺酸盐选自硫代磺酸钠、硫代磺酸钾、硫代磺酸锂、硫代磺酸镁或硫代磺酸铝中的一种或至少两种的组合，进一步优选硫代磺酸钠。
具体地，化合物（II-B）的制备过程如下列方程式所示：
本发明的目的之四是提供一种（II-C）的制备方法，所述方法包括如下步骤：
（1）以化合物（i-C）为原料，将其中的羟基活化，转化为离去基团Ｌ，得到化合物（ii-C）；所述Ｌ选自氯、溴、甲基磺酸酯以及对甲苯磺酸酯中的一种。
其中，所述的化合物（i-C）为本领域技术人员可获知的化合物，例如所述的化合物（i-C）购自NANOCS。
步骤（2）所述的羟基活化转化为离去基团L的方法与化合物（II-A）合成步骤（1）所述相同，此处不再赘述。
（2）将化合物（ii-C）中的中的离去基团L与硫代磺酸钠反应得到硫代磺酸酯基，得到化合物（iii-C）。
步骤（2）所述的离去基团L与硫代磺酸盐反应与化合物（II-A）合成步骤（4）相同，所述的硫代磺酸盐选自硫代磺酸钠、硫代磺酸钾、硫代磺酸锂、硫代磺酸镁或硫代磺酸铝中的一种或至少两种的组合，进一步优选硫代磺酸钠。
（3）将化合物（iii-C）中的叠氮基团被转化为氨基，得到化合物（II-C）。
将叠氮基团转化为氨基是本领域技术人员熟知的技术，本领域技术人员能够获知的将叠氮基团转化为氨基的方法均可用于本发明，例如采用四氢铝锂还原；在THF做溶剂条件下与三苯基磷反应，然后再滴加水等方法，此处不再赘述。
具体地，化合物（II-C）的制备过程如下列方程式所示：
本发明的目的之五是提供一种异端基双官能团聚烷基醚类化合物的用途，所述化合物用于对含有巯基和羰基的蛋白、多肽及其他分子进行化学偶联，所述化学偶联过程具有巯基特异性和羰基特异性。
巯基和羰基是蛋白质中用于定点偶联的重要基团，例如，在部分蛋白、多肽中本身就含有自由巯基；有部分蛋白、多肽末端为丝氨酸或者苏氨酸，经过定点氧化后就可以获得自由醛基；还有部分不含有巯基或羰基的蛋白、多肽化合物，可以通过化学或者基因工程的手段在蛋白质中引入；而对于短肽，可以通过在合成过程中引入这两种结构。因此本发明提供的异端基双官能团聚烷基醚类化合物，可很好地实现两个不同分子之间的定点均一交联。
优选地，本发明所述用于化学偶联的含有巯基的蛋白、多肽及其他分子至少含有一个自由巯基。
优选地，本发明所述用于化学偶联的含有羰基的蛋白、多肽及其他分子至少含有一个羰基。
进一步优选地，本发明所述蛋白质、多肽选自药用蛋白质和多肽，特别优选自干扰素、粒细胞集落刺激因子、血红蛋白、白介素、促红细胞生成素、免疫球蛋白及其片段等。
与现有技术相比，本发明所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物可以和蛋白质、多肽或者其他药物分子的自由巯基、羰基在温和条件下发生反应，反应特异性强，速度快。所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物可以用于蛋白质多肽及其他药物分子及载体间的化学交联，制备定点均一的结合物。
附图说明
图1是实施例1得到的一端溴一端羧基的聚乙二醇的化合物的质谱峰簇图。
图2是实施例1得到的一端溴一端SCM活化酯的聚乙二醇的化合物的质谱峰簇图。
图3是实施例1得到的一端溴一端酰肼的聚乙二醇的化合物的质谱峰簇图。
图4是实施例1得到的一端硫代苯磺酸酯一端酰肼的聚乙二醇的化合物的质谱峰簇图。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明实施例以聚乙二醇为例进行，但所属领域技术人员应当理解，本发明所述的聚烷基醚链可以替换，例如可以将聚乙二醇替换为其他聚低链烷基醚类聚合物，例如可以替换为聚环氧丙烷、聚四氢呋喃等，其具体反应条件可由本领域技术人员所掌握的现有技术或新技术根据本发明路线进行推断。
实施例1硫代苯磺酸酯-PEG-酰肼（~2000Da）的制备
350mg一端羟基一端羧基的聚乙二醇（平均分子量2000Da），具有式（i-A1）的化学结构为：
其中，p=2，n=2，m=0，n=0，w=1，X=-O-，Y=-O-，PAG=-(CH2CH2O)h-（其中PAG的平均分子量在2000Da左右），亦即表示为以下结构：
甲苯共沸除水，以一端羟基一端羧基的聚乙二醇为基准，依次加入1.5倍摩尔量的三溴化磷和2.5倍摩尔量的三乙胺，60℃反应2天，然后蒸干甲苯，重新用盐水溶解，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，得到白色固体粉末，质谱检测为2078.344±44.052n（具体见附图1），确认为一端为溴一端为羧基的聚乙二醇，化学结构为：
图1为得到的一端溴一端羧基的聚乙二醇的化合物的质谱峰簇。
将上一步得到的一端溴一端羧基的聚乙二醇用甲苯共沸除水，然后蒸干溶剂，加入干燥的二氯甲烷重新溶解，以一端溴一端羧基的聚乙二醇为基准，依次加入1.5倍摩尔量的NHS和1.5倍摩尔量的DCC，室温反应2天，过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，得到白色固体粉末，质谱检测为2219.405±44.052n（具体见附图2），确认为一端溴一端SCM活化酯的聚乙二醇，化学结构为：
图2为得到的一端溴一端SCM活化酯的聚乙二醇的化合物的质谱峰簇。
将上一步得到的一端溴一端SCM活化酯的聚乙二醇溶于二氯甲烷，以一端溴一端SCM活化酯的聚乙二醇为基准，加入10倍摩尔量的水合肼，室温反应过夜，加入饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，干燥得到白色固体产品，质谱检测为2268.552±44.052n（具体见附图3），确认为一端溴一端酰肼的聚乙二醇，化学结构为：
图3为得到的一端溴一端酰肼的聚乙二醇的化合物的质谱峰簇。
将上一步得到的一端溴一端酰肼的聚乙二醇溶于无水乙醇，以一端溴一端酰肼聚乙二醇为基准，加入5倍摩尔量的硫代苯磺酸钠，回流反应2天，然后蒸干溶剂，二氯甲烷重新溶解，过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，得到白色固体产物，质谱检测为2405.808±44.052n，（具体见附图4），确认为一端硫代苯磺酸酯一端酰肼的聚乙二醇，化学结构为：
图4为得到的一端硫代苯磺酸酯一端酰肼的聚乙二醇的化合物的质谱峰簇。
实施例2硫代苯磺酸酯-PEG-酰肼（~200Da）的制备
200mg一端羟基一端羧基的聚乙二醇（分子量164Da），具有实施例1所述的式（i-A1）的化学结构，其中，p=4，n＝1，m=4，n＝1，w=2，X=-O-，Y=-O-，PAG=-(CH2CH2O)h-（其中PAG的平均分子量在200Da左右），与甲苯共沸除水，然后以一端羟基一端羧基聚乙二醇为基准，依次加入1.5倍摩尔量的三溴化磷和2.5倍摩尔量的三乙胺，60℃反应1天，然后蒸干甲苯，重新用盐水溶解，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液浓缩，蒸干得到浅黄色粘稠液体，质谱检测为227.1，确认为一端为溴一端为羧基的聚乙二醇。
将上一步得到的一端溴一端羧基的聚乙二醇用甲苯共沸除水，然后蒸干溶剂，加入干燥的二氯甲烷重新溶解，以一端溴一端羧基的聚乙二醇为基准，依次加入1.5倍摩尔量的NHS和1.5倍摩尔量的DCC，室温反应1天，过滤，滤液浓缩蒸干得到浅黄色粘稠液体，质谱检测为311.2，确认为一端溴一端SCM活化酯的聚乙二醇。
将上一步得到的一端溴一端SCM活化酯的聚乙二醇溶于二氯甲烷，以一端溴一端SCM活化酯的聚乙二醇为基准，加入10倍摩尔量的水合肼，室温反应过夜，加入饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干得到浅黄色粘稠液体，质谱检测为257.2，确认为一端溴一端酰肼的聚乙二醇。
将上一步得到的一端溴一端酰肼的聚乙二醇溶于无水乙醇，以一端溴一端酰肼的聚乙二醇为基准，加入5倍摩尔量的硫代苯磺酸钠，回流反应2天，然后蒸干溶剂，二氯甲烷重新溶解，过滤，滤液浓缩蒸干得到浅黄色粘稠液体，质谱检测为350.4，确认为一端硫代苯磺酸酯一端酰肼的聚乙二醇。
实施例3硫代苯磺酸酯-PEG-氧胺的制备
500mg一端羟基一端溴的聚乙二醇（平均分子量2000Da）溶于DMF，以一端羟基一端溴的聚乙二醇为基准加入1.5倍摩尔量的N-羟基酞酰亚胺和1.5倍摩尔量的三乙胺，80℃反应1天，蒸干溶剂后重新用盐水溶解，过滤，滤液用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，得到白色固体粉末，质谱检测为2102.344±44.052n，确认为一端为羟基一端为酞酰亚胺的聚乙二醇。
将上一步得到的一端羟基一端酞酰亚胺的聚乙二醇用甲苯共沸除水，然后以一端羟基一端酞酰亚胺的聚乙二醇为基础，依次加入1.5倍摩尔量的三溴化磷和2.5倍摩尔量的三乙胺，60℃反应2天，然后蒸干甲苯，重新用盐水溶解，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，得到白色固体粉末，质谱检测为2077.145±44.052n，确认为一端溴一端酞酰亚胺的聚乙二醇。
将上一步得到的一端溴一端为酞酰亚胺的聚乙二醇溶于二氯甲烷，以一端溴一端为酞酰亚胺的聚乙二醇为基础，加入10倍摩尔量的水合肼，室温反应5小时，加入饱和食盐水萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，干燥得到白色固体产品，质谱检测为2122.296±44.052n，确认为一端溴一端氧胺的聚乙二醇。
将上一步得到的一端溴一端氧胺的聚乙二醇溶于无水乙醇，并以其为基础，加入5倍摩尔量的硫代苯磺酸钠，回流反应2天，然后蒸干溶剂，二氯甲烷重新溶解，过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，得到白色固体产物，质谱检测为2172.548±44.052n，确认为一端硫代苯磺酸酯一端氧胺的聚乙二醇。
实施例4硫代苯磺酸酯-PEG-NH2的制备
400mg一端羟基一端叠氮的聚乙二醇（平均分子量2000Da），甲苯共沸除水，然后以一端羟基一端叠氮的聚乙二醇为基础，依次加入1.5倍摩尔量的三溴化磷和2.5倍摩尔量的三乙胺，60℃反应2天，然后蒸干甲苯，重新用盐水溶解，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，得到白色固体粉末，质谱检测为2089.244±44.052n，确认为一端为溴一端为叠氮的聚乙二醇。
将上一步得到的一端溴一端叠氮的聚乙二醇溶于无水乙醇，并以其为基础加入5倍摩尔量的硫代苯磺酸钠，回流反应2天，然后蒸干溶剂，二氯甲烷重新溶解，过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，得到白色固体产物，质谱检测为2138.386±44.052n，确证为一端硫代苯磺酸酯一端叠氮的聚乙二醇。
将上一步得到的一端硫代苯磺酸酯一端叠氮的聚乙二醇溶于干燥的四氢呋喃，并以其为基础，加入等摩尔量的三苯基膦，反应过夜，然后蒸干溶剂，重新用盐水溶解，二氯己烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，得到白色固体粉末，质谱检测为2200.478±44.052n，确认为一端硫代苯磺酸酯一端氨基的聚乙二醇。
实施例5硫代苯磺酸酯-PEG-酰肼（~80000Da）的制备
200mg一端羟基一端羧基的聚乙二醇（分子量约为80000Da），具有实施例1所述的式（i-A1）的化学结构，其中，p=0，n=3，m=1，n=4，w=1，X=-CONH-，Y=-NH-，PAG=-(CH2CH2O)h-（其中PAG的平均分子量在80000Da左右），与甲苯共沸除水，然后以一端羟基一端羧基聚乙二醇为基准，依次加入1.5倍摩尔量的三溴化磷和2.5倍摩尔量的三乙胺，60℃反应2天，然后蒸干甲苯，重新用盐水溶解，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，得到白色固体粉末，为一端为溴一端为羧基的聚乙二醇。
将上一步得到的一端溴一端羧基的聚乙二醇用甲苯共沸除水，然后蒸干溶剂，加入干燥的二氯甲烷重新溶解，以一端溴一端羧基的聚乙二醇为基准，依次加入1.5倍摩尔量的NHS和1.5倍摩尔量的DCC，室温反应2天，过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，得到白色固体粉末，为一端溴一端SCM活化酯的聚乙二醇。
将上一步得到的一端溴一端SCM活化酯的聚乙二醇溶于二氯甲烷，以一端溴一端SCM活化酯的聚乙二醇为基准，加入10倍摩尔量的水合肼，室温反应过夜，加入饱和食盐水萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，得到白色固体粉末，为一端溴一端酰肼的聚乙二醇。
将上一步得到的一端溴一端酰肼的聚乙二醇溶于无水乙醇，以一端溴一端酰肼的聚乙二醇为基准，加入5倍摩尔量的硫代苯磺酸钠，回流反应2天，然后蒸干溶剂，二氯甲烷重新溶解，过滤，滤液浓缩，乙醚沉淀，过滤，得到白色固体粉末，为一端硫代苯磺酸酯一端酰肼的聚乙二醇。
实施例6硫代苯磺酸酯-PEG-酰肼交联BSA和SL8
SL8肽（商购于吉尔多肽）1mg溶于1mL醋酸缓冲液中，加入4mg/mL的高碘酸钠水溶液0.1mL，室温避光反应10分钟，然后加入0.1mL乙二醇继续反应30分钟，将反应产物用反相柱进行分离，并将接收液置换为醋酸缓冲液，得到的反应产物质谱检测分子量为950，确认为N末端氧化为醛基的SL8肽。
取300μL溶解于醋酸缓冲液的牛血清蛋白（BSA）（浓度为1mg/mL）置于密封管内，加入1.5倍摩尔量的硫代苯磺酸酯-PEG-酰肼（平均分子量2000Da），4℃反应过夜，然后离子交换色谱进行分离去除未反应的BSA和PEG，得到的产物质谱检测分子量为69.5kDa，确认为BSA-PEG偶联物。
将收集的BSA-PEG偶联产物溶液浓缩，并置换为醋酸缓冲液，加入上一步制得的末端为醛基的SL8肽，4℃反应过夜，然后再次离子交换色谱进行分离，得到产物质谱检测分子量70.4kDa，确认为HSA-PEG-SL8偶联物。
实施例7硫代苯磺酸酯-PEG-氧胺交联BSA和SL8
取300μL溶解于醋酸缓冲液的BSA（1mg/mL）置于密封管内，加入1.5倍摩尔量的硫代苯磺酸酯-PEG-氧胺（平均分子量2000Da），4℃反应过夜，然后离子交换色谱进行分离去除未反应的BSA和PEG，将收集的BSA-PEG偶联产物盐溶液浓缩，并置换为醋酸缓冲液，加入上一步制得的末端氧化为醛基的SL8肽，4℃反应过夜，然后再次离子交换色谱进行分离，得到的产物质谱检测分子量70.4kDa，确认为BSA-PEG-SL8偶联物。
实施例8硫代苯磺酸酯-PEG-NH2交联BSA和SL8
取300μL溶解于醋酸缓冲液的BSA（1mg/mL）置于密封管内，加入1.5倍摩尔量的硫代苯磺酸酯-PEG-NH2（平均分子量2000Da），4℃反应过夜，然后用离子交换色谱进行分离去除未反应的BSA和PEG，将收集的BSA-PEG偶联产物盐溶液浓缩，并置换为醋酸缓冲液，加入上一步制得的末端氧化为醛基的SL8肽，4℃反应过夜，然后再次离子交换色谱进行分离，得到的产物质谱检测分子量70.4kDa，确认为BSA-PEG-SL8偶联产物。
实施例9偶联效率比较
实施例6、7、8相同时间的交联产物进行色谱分析，硫代苯磺酸酯-PEG-酰肼交联BSA和SL8的偶联效率为43.1%（以SL8肽为基准），硫代苯磺酸酯-PEG-氧胺交联BSA和SL8的偶联效率为32.7%，硫代苯磺酸酯-PEG-NH2交联BSA和SL8的偶联效率为11.6%，说明这三类交联基团中，酰肼与醛基的偶联效率高于氧胺，而氧胺高于氨基。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种异端基双官能团聚烷基醚类化合物，其特征在于，所述化合物具有通式（I）：
其中，A选自亲电基团-CONHNH2、-ONH2或-NH2中的任意一种；
PAG为不含端基的聚烷基醚链。
2.如权利要求1所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物，其特征在于，其中，R是选自C1-C5的直链或支链烷基和/或C6-C10的芳基或芳烷基中的任意一种，优选自甲基、乙基、丙基、苯基或芳烷基中的任意一种；
优选地，X、Y独立地选自-CONH-、-O-CONH-、-NH-或-O-中的一种；
优选地，m、n、p、w独立地选自0到4的整数。
3.如权利要求1或2所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物，其特征在于，所述通式（I）中PAG为聚低链烷基醚类聚合物；
优选地，所述低链烷基为碳数在2-7之间的直链或支链烷基；
进一步优选地，所述PAG分子量范围为100-80000Da，优选为1000-50000Da；
特别优选地，所述PAG为聚乙二醇、聚环氧丙烷或聚四氢呋喃中的任意一种。
4.如权利要求1-3之一所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物，其特征在于，所述化合物具有通式（II-A）：
其中，R是选自C1-C5的直链或支链烷基和/或C6-C10的芳基或芳烷基中的任意一种，优选自甲基、乙基、丙基、苯基或芳烷基中的任意一种；
h为聚乙二醇的聚合度，其数值决定于所选聚乙二醇的分子量，（II-A）中聚乙二醇的分子量范围为100-80000Da，优选1000-50000Da。
5.如权利要求1-3之一所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物，其特征在于，所述化合物具有通式（II-B）：
其中，R是选自C1-C5的直链或支链烷基和/或C6-C10的芳基或芳烷基中的任意一种，优选自甲基、乙基、丙基、苯基或芳烷基中的任意一种；
h为聚乙二醇的聚合度，其数值决定于所选聚乙二醇的分子量，（II-B）中聚乙二醇的分子量范围为100-80000Da，优选1000-50000Da。
6.如权利要求1-3之一所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物，其特征在于，所述化合物具有通式（II-C）：
其中，R是选自C1-C5的直链或支链烷基和/或C6-C10的芳基或芳烷基中的任意一种，优选自甲基、乙基、丙基、苯基或芳烷基中的任意一种；
h为聚乙二醇的聚合度，其数值决定于所选聚乙二醇的分子量，（II-C）中聚乙二醇的分子量范围为100-80000Da，优选1000-50000Da。
7.如权利要求4所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）以化合物（i-A）为原料，将其中的羟基活化，转化为离去基团Ｌ，得到化合物（ii-A）；所述Ｌ选自氯、溴、甲基磺酸酯以及对甲苯磺酸酯中的一种；
（2）将化合物（ii-A）中的羧基活化，转化为活化酯基得到化合物（iii-A）；
（3）将化合物（iii-A）中的活化酯基转化为酰肼基，得到化合物（iv-A）；
（4）将化合物（iv-A）中的离去基团L与硫代磺酸盐反应转化为硫代磺酸酯基，得到化合物（II-A）；
优选地，所述的硫代磺酸盐选自硫代磺酸钠、硫代磺酸钾、硫代磺酸锂、硫代磺酸镁或硫代磺酸铝中的一种或至少两种的组合，进一步优选硫代磺酸钠。
8.如权利要求5所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）以化合物（i-B）为原料，将其中的卤代基团X转化为NHP基团；
（2）将化合物（ii-B）中的羟基活化，转化为离去基团Ｌ，得到化合物（iii-B）；所述Ｌ选自氯、溴、甲基磺酸酯以及对甲苯磺酸酯中的一种；
（3）将化合物（iii-B）中的NHP基团转化为氧胺，得到化合物（iv-B）；
（4）将化合物（iv-B）中的离去基团L与硫代磺酸盐反应转化为硫代磺酸酯基，得到化合物（II-B）；
优选地，所述的硫代磺酸盐选自硫代磺酸钠、硫代磺酸钾、硫代磺酸锂、硫代磺酸镁或硫代磺酸铝中的一种或至少两种的组合，进一步优选硫代磺酸钠。
9.如权利要求6所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）以化合物（i-C）为原料，将其中的羟基活化，转化为离去基团Ｌ，得到化合物（ii-C）；所述Ｌ选自氯、溴、甲基磺酸酯以及对甲苯磺酸酯中的一种；
（2）将化合物（ii-C）中的离去基团L与硫代磺酸盐反应转化为硫代磺酸酯基，得到化合物（iii-C）；
（3）将化合物（iii-C）中的叠氮基团转化为氨基，得到化合物（II-C）；
优选地，所述的硫代磺酸盐选自硫代磺酸钠、硫代磺酸钾、硫代磺酸锂、硫代磺酸镁或硫代磺酸铝中的一种或至少两种的组合，进一步优选硫代磺酸钠。
10.如权利要求1-5任一项所述的异端基双官能团聚烷基醚类化合物的用途，其特征在于，所述化合物用于对含有巯基和羰基的蛋白、多肽及其他分子进行化学偶联，所述化学偶联过程具有巯基特异性和羰基特异性；
优选地，所述含有巯基的蛋白、多肽及其他分子至少含有一个自由巯基；
优选地，所述含有羰基的蛋白、多肽及其他分子至少含有一个羰基；
进一步优选地，所述蛋白质、多肽选自药用蛋白质和多肽，特别优选干扰素、粒细胞集落刺激因子、血红蛋白、白介素、促红细胞生成素、免疫球蛋白及其片段等。
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