CN102481255A - 颗粒组合物和含有其的医药组合物 - Google Patents

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Abstract

一种颗粒组合物，其含有嵌段共聚物单元和带电脂质，该嵌段共聚物单元以疏水性聚合物链段朝向内侧，并且亲水性聚合物链段朝向外侧的状态放射状配置，该带电脂质带有与应该被内包的药物的电荷相反电荷，该带电脂质以吸引在疏水性聚合物链段侧的状态配置。在该颗粒组合物中，通过与带电脂质的静电结合，药物被保持在颗粒内，另一方面可以防止颗粒外周面带有能够吸引与上述带电脂质带有相反电荷的带电性物质的电荷。

Description

颗粒组合物和含有其的医药组合物
技术领域
本发明涉及可以作为药物递送系统(DDS)的载体使用的颗粒组合物(例如，高分子微团)，和具有该颗粒组合物与在其中内包的药物的医药组合物(例如，高分子微团制剂)。
背景技术
相比于利用低分子化合物的以往型的医药品，利用诸如蛋白质和核酸的生物体高分子的生物医药品，容易被酶分解或被免疫系统排除。专利文献1～4从提高生物医药品在生物体内的稳定性的观点出发，公开了使生物体高分子内包于由脂质双层膜构成的核糖体的DDS。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2001/034115号小册子
专利文献2：国际公开第1998/58630号小册子
专利文献3：国际公开第2005/092389号小册子
专利文献4：日本特表2001-504093
发明内容
发明所要解决的课题
在专利文献1～3中记载的以往型DDS中，通过以脂质双层膜保护作为药物的生物体高分子，虽然能够提高药物在生物体内的稳定性，但是药物难以从载体释放。另外，这样的以往型DDS，由于其粒径大小和构成脂质双层膜的脂质具有的电荷，从而容易被诸如肺、肝脏和脾脏的网状内皮系统捕捉，所以有时在到达投药对象物以前会从血中被除去。在专利文献4中记载的DDS中，通过将核糖体隐形化，可以实现防止被捕捉到这样的网状内皮系统，但仍然有药物难以从载体释放的倾向。
相比于使用核糖体的以往型DDS，以高分子微团作为载体的DDS能够将DDS颗粒大幅度地小型化(例如，平均粒径100nm以下)，该高分子微团通过由疏水性聚合物链段和亲水性聚合物链段形成的嵌段共聚物单元构成。但是，这样的以高分子微团作为载体的DDS，如后述的比较例所示，由于将生物体高分子保持在DDS颗粒内的作用过弱，仍然有难以将药物适当输送到投药对象物中的情况。另外，在这样的DDS中，有时在制造后的储藏期间中，药物也会从载体脱离。
用于解决课题的方法
本发明提供一种颗粒组合物，其含有具有疏水性聚合物链段和亲水性聚合物链段的嵌段共聚物单元，多个上述嵌段共聚物单元以上述疏水性聚合物链段朝向内侧，并且上述亲水性聚合物链片朝向外侧的状态放射状配置，该颗粒组合物还具有带电脂质，该带电脂质带有与应该被内包的药物的电荷相反的电荷，通过与该带电脂质的静电结合将上述药物保持在颗粒内，另一方面该带电脂质以被吸引到上述疏水性聚合物链段侧的状态配置，从而防止颗粒外周面带有能够吸引与上述带电脂质带有相反电荷的带电性物质的电荷。
从另一个侧面，本发明提供一种医药组合物，其具有上述颗粒组合物、和在该颗粒组合物中内包的带有与带电脂质相反电荷的药物。
发明的效果
根据本发明，能够提供适于DDS的药物载体和利用该药物载体的医药品，该药物载体药物保持性优异，并且能够防止生物体分子向载体表面的附着，该附着会导致妨碍药物向投药对象物搬运。相比于以往型的DDS，这些药物载体和医药品能够向投药对象物可靠地输送药物。
附图说明
图1(a)～(c)是表示本发明的颗粒组合物和医药组合物结构的一例的示意图。
图2是表示在试验例1b中测得的颗粒组合物的电动电位(zetapotential)的绝对值与在试验例1c中测得的颗粒组合物的血中凝集度的关系的图表。
图3是表示在试验例2b中的白蛋白-FITC荧光强度测定结果的图表。
图4是表示在试验例5a中的电泳结果的图。
图5是用于说明在试验例5c中测得的颗粒组合物的抗癌活性的图表。
图6是用于说明在试验例5d中测得的颗粒组合物在血清中的凝集性的图表。
图7是表示在试验例5b中测得的颗粒组合物的电动电位的绝对值与在试验例5d中测得的颗粒组合物的血中凝集度的关系的图表。
图8是用于说明在试验例5f中测得的药物的脏器转移性的图表。
具体实施方式
图1(a)是表示本发明的颗粒组合物(以下，有时简称为“颗粒组合物”)结构的一例的示意图。图1(b)是其部分放大图。颗粒组合物1含有嵌段共聚物单元2和带电脂质3。嵌段共聚物单元2具有亲水性聚合物链段2a和疏水性聚合物链段2b，以疏水性聚合物链段2b朝向内侧，并且亲水性聚合物链段2a朝向外侧的状态，放射状配置在颗粒组合物1内。另外，带电脂质3带有与应该内包的药物的电荷相反的电荷，以吸引在疏水性聚合物链段2b侧的状态配置。图1(c)是表示本发明的颗粒状医药组合物(以下，有时简称为“医药组合物”)结构的一例的示意图。医药组合物1’具有颗粒组合物1和带有与带电脂质3相反电荷的药物4，药物4通过与带电脂质3静电结合被保持在颗粒组合物1内。
在本说明书中，“带电脂质”是指在生理性pH(例如pH7.4)的水性介质中具有多于正电荷的负电荷的阴离子性脂质，和在该水性介质中具有多于负电荷的正电荷的阳离子性脂质。因此，在本说明书中，关于具有阳离子性基团和阴离子性基团的所谓两性带电脂质，也根据上述基准处理。
带电脂质3在颗粒组合物1内通过静电结合保持应该被内包的药物4。带电脂质3只要至少在从颗粒组合物1形成的医药组合物1’的储藏环境下，带有与被内包的药物4的电荷相反的电荷即可。由此，能够在制造后的储藏期间中在颗粒组合物1内更可靠地保持药物4。带电脂质3和药物4优选即使以血中为代表的生理环境下(例如，pH7.4)，也带有相反的电荷。由此，能够更可靠地防止在向投药对象物的输送途中，药物4从颗粒组合物1脱离。
带电脂质3由下面的机理以吸引在疏水性聚合物链段侧2b的状态配置。颗粒组合物1通过包括将嵌段共聚物单元2和带电脂质3悬浊在水溶液中的工序的方法形成。嵌段共聚物单元2的疏水性聚合物链段2b因为是疏水性的，所以在水溶液中不扩散地凝集存在。亲水性聚合物链段2a可以在水溶液中扩散并自由地运动。因此，嵌段共聚物单元2在水溶液中，以疏水性聚合物链段2b朝向内侧，亲水性聚合物链段2a朝向外侧的放射状配置。而且，带电脂质3因为疏水性强，相比于水或亲水性聚合物链段2a，与疏水性聚合物链段2b的亲和性高，所以被吸引在疏水性聚合物链段2b侧，与颗粒组合物1的外周面离开配置。由此，可以防止颗粒组合物1和医药组合物1’的外周面带有能够吸引带有与带电脂质3相反电荷的带电性物质(例如，血中的蛋白质)的电荷。
而且，如果这样操作悬浊在水溶液中，因为带电脂质3和嵌段共聚物单元2以混合的状态颗粒化，所以如图1(b)所示，带电脂质3不是在颗粒组合物1的环向以连续的状态配置，而是在颗粒组合物1的环向以介于相邻接的嵌段共聚物单元2之间的方式配置。由此，在颗粒组合物1中，在颗粒组合物1的环向相邻接的带电脂质3之间的接触被嵌段共聚物单元2隔断。因此，在颗粒组合物1中，在颗粒组合物1的环向相邻接的带电脂质3之间，为形成有能够容纳嵌段共聚物单元2程度的间隙G的状态，换而言之，处于相邻接的带电脂质3之间形成间隙G，在该间隙G中配置有嵌段共聚物单元2的状态。带电脂质3和嵌段共聚物单元2之间的结合力小于带电脂质3之间的结合力。因此，如果相比于脂质在环向处于被连续配置状态的以往型DDS(核糖体)，在颗粒组合物1中，容易产生由带电脂质3的脱落造成的颗粒形状崩解，其结果，就可以防止应该被内包在颗粒(载体)内的药物4被过剩地保持。在专利文献4中记载的以DDS为代表的隐形核糖体，因为通过在形成由脂质双层膜构成的核糖体主体后，使二嵌段共聚物附着在该主体表面而形成，所以，在环向相邻接的脂质之间的接触没有被嵌段共聚物等隔断，脂质仍旧处于在环向连续配置的状态。
防止颗粒组合物1和医药组合物1’的外周面带有可以吸引带电性物质的电荷的状态，例如，能够通过从颗粒组合物1和医药组合物1’测得的电动电位的绝对值在规定值以下的范围而确定。更具体而言，对于医药组合物1’，电动电位的绝对值希望为10mV以下，例如为5mV以下，或者例如为3mV以下，优选为2mV以下，更优选为1mV以下。由于在颗粒组合物1中含有药物4，医药组合物1’的电动电位的绝对值容易低于该颗粒组合物1固有的电动电位的绝对值。因此，对于颗粒组合物1，电动电位的绝对值希望为15mV以下，例如为12mV以下，或者例如为6mV以下，或者例如为3mV以下，优选为2mV以下，更优选为1mV以下。电动电位如下测定：在pH为7.4的10mM的HEPES缓冲溶液中，以每1mL该缓冲溶液，颗粒组合物1或医药组合物1’所含有的带电脂质3的总量为0.1mg的方式，添加颗粒组合物1或医药组合物1’。
在本说明书中，电动电位的绝对值作为将小数点以下四舍五入得到的数值处理。例如，电动电位的绝对值为“2mV以下”的状态包含小于2.5mV的状态。
另外，如后述的实施例所示，通过控制颗粒组合物1或医药组合物1’的电动电位的绝对值使其变低，能够防止颗粒组合物1或医药组合物1’的血中凝集。更具体而言，通过将颗粒组合物1的电动电位的绝对值控制在规定范围以下，就能够防止在血中的凝集，使得颗粒组合物1的血中凝集度，例如，为0.2以下，或者例如为0.18以下，或者例如为0.15以下，进一步为0.1以下，根据情况为0.05以下的程度。另外，通过将医药组合物1’的电动电位的绝对值控制在规定范围以下，就能够防止在血中的凝集，使得医药组合物1’的血中凝集度，例如，为0.2以下，或者例如为0.16以下，进一步为0.1以下，根据情况为0.05以下的程度。
血中凝集度如下操作计算。
i)在pH为7.4的10mM的HEPES缓冲溶液中，以每1mL该缓冲溶液带电脂质3的总量为2.2mg的方式添加测定对象的组合物(颗粒组合物1或医药组合物1’)，再在每1mL该缓冲溶液添加9mL FBS(牛血清)，制备测定样品A。
ii)除了代替FBS(牛血清)，使用pH为7.4的10mM的HEPES缓冲溶液以外，和上述i)同样操作，制备测定样品B。
iii)将测定样品A和B在37℃静置24小时后，分别测定相对于波长为700nm的光线的吸光度。
iv)将从“由测定样品A得到的吸光度”减去“由测定样品B得到的吸光度”得到的值作为血中凝集度。此外，该值越小，测定对象组合物在血中越难以凝集。
嵌段共聚物单元2相对于带电脂质3的比例，以质量比表示，希望为1.0以上，优选为1.5以上，更优选为2.0以上，还希望为50以下，优选为20以下，更优选为10以下。将该比例越提高，就能够越降低颗粒组合物1和医药组合物1’的电动电位的绝对值。另一方面，因为带电脂质3的比例越高，越能够将药物4更积极地包入颗粒内，所以希望如上所述该比例限制在50以下。
带电脂质3可以是单纯脂质、复合脂质和衍生脂质中的任意1种，能够例示磷脂质、甘油糖脂质、神经鞘糖脂质、鞘氨基醇碱类和甾醇类。更具体而言，作为阳离子性脂质，例如，可以列举1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、N-(2，3-二油酰氧基丙烷-1-基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、2，3-二油酰氧基-N-[2-(精胺羧基酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸(DOSPA)、1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基羟基乙基溴化铵(DMRIE)、1，2-二油酰氧基丙基-3-二乙基羟基乙基溴化铵(DORIE)、3β-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)。作为阴离子性脂质，例如，可以列举心磷脂、二酰磷脂丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺(N-琥珀酰PE)、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙二醇、琥珀酰胆甾醇等。
亲水性聚合物链段2a优选为来自由聚乙二醇或聚氧乙烯构成的水溶性聚合物的片段。亲水性聚合物链段2a的分子量希望为2500Da以上，优选为5000Da以上，更优选为8000Da以上，还希望为200000Da以下，优选为20000Da以下，更优选为15000Da以下。疏水性聚合物链段2b优选为来自聚氨基酸链的片段。疏水性聚合物链段2b的重复单元数希望为10个以上，优选为20个以上，还希望为200个以下，优选为100个以下，更优选为60个以下。从降低颗粒组合物1的电动电位的绝对值，换而言之，从减小颗粒组合物1的表面电荷(接近于中性)的观点出发，优选在嵌段共聚物单元2中，亲水性聚合物链段2a的尺寸(分子量)大于疏水性聚合物链段2b的尺寸(重复单元数)。
亲水性聚合物链段2a和疏水性聚合物链段2b，只要能够防止颗粒组合物1和医药组合物1’的颗粒外周面带有可以吸引带电性物质的电荷，也可以含有以氨基和羧基为代表的带电性取代基。
亲水性聚合物链段2a和疏水性聚合物链段2b，能够通过共价键使主链末端之间结合。更具体而言，作为嵌段共聚物单元2，能够例示由下述通式(Ⅰ)和通式(Ⅱ)表示的化合物。颗粒组合物1可以由2种以上的嵌段共聚物单元2形成。
Figure BDA0000139391540000071
在通式(Ⅰ)和通式(Ⅱ)中，R1和R3分别独立，表示氢原子或由R8(R9)CH(CH2)q-表示的基团(其中，R8和R9，i)分别独立，为氢原子、C1-6烷氧基、烯丙氧基、烯丙基C1-3氧基、氰基、羧基、氨基、C1-6烷氧基羰基、C2-7酰胺基、三-C1-6烷基甲硅烷氧基、甲硅烷氧基、甲硅烷氨基，或ii)一起，形成被C1-3烷基取代的或未取代的亚乙基二氧基或亚丙基二氧基，或iii)与它们所结合的CH基一起形成甲酰基)，q是0～10的整数，R2是氢原子、饱和或不饱和的C1～C29脂肪族羰基或烯丙基羰基，R4是羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或烯丙基低级烷氧基，R5是-O-或-NH-，R6是氢原子、苯基、苄基、-(CH2)4-苯基、未取代的或由氨基或羰基取代的C4～C16烷基或甾醇衍生物的残基，R7是亚甲基，n是在55～4600范围的整数，x是在10～200范围的整数，m是在0～200范围的整数(其中，在m为1以上时，(COCHNH)单元和(COR7CHNH)单元无规地存在，在m为2以上时，R6在1个嵌段共聚物内的各氨基酸单元中分别独立地被选择、无规地存在，但R6为氢原子的情况占R6全体的75％以下)，y是1或2；L1是选自-NH-、-O-、-O-Z-NH-、-CO-、-CH2-和-O-Z-S-Z-NH-(其中，Z独立地为C1～C6亚烷基)中的连接基，L2是选自-OCO-Z-CO-和-NHCO-Z-CO-(其中，Z是C1～C6亚烷基)中的连接基。
在通式(Ⅰ)和通式(Ⅱ)中，n优选为110以上，更优选为180以上，还优选为460以下，更优选为340以下的整数，x优选为20以上，还优选为100以下，更优选为60以下的整数，m优选为100以下，更优选为60以下的整数。
嵌段共聚物单元2优选为阴离子性聚合物。通过使用阴离子性聚合物作为嵌段共聚物单元2，在作为带电脂质3使用阳离子性脂质时，易于将颗粒组合物1和医药组合物1’的电动电位的绝对值控制在3mV以下，更优选控制在2mV以下，更加优选控制在1mV以下。另外，如后述实施例所示，通过使用阴离子性聚合物作为嵌段共聚物单元2，相比于使用中性的聚合物的情况，即使电动电位的绝对值是相同程度，也能够更显著地防止在血中的凝集。另外，在本说明书中，在生理pH(例如，pH7.4)的水性介质中，将具有比正电荷多的负电荷的聚合物作为阴离子性，将具有比负电荷多的正电荷的聚合物作为阳离子性，将正电荷和负电荷的比例为相同程度的聚合物作为中性。
作为优选的阴离子性嵌段共聚物单元2，可以列举在通式(Ⅰ)和(Ⅱ)中，R5是-O-，R6是苄基、-(CH2)4-苯基、或者被取代的或由氨基或羰基取代的C4～C16烷基的共聚单元。
嵌段共聚物单元2，例如能够通过将具有亲水性聚合物链的聚合物和具有聚氨基酸链的聚合物直接由公知的方法进行偶合而形成，或根据需要将其精制使分子量分布变窄后由公知的方法进行偶合而形成。对于通式(Ⅰ)的嵌段共聚物单元2，例如也能够通过如下方法而形成：使用能够赋予R1的引发剂，通过进行阴离子活性聚合，形成聚乙二醇链后，在生长末端侧导入氨基，从该氨基末端使诸如β-苄基-L-天冬氨酸、γ-苄基-L-谷氨酸、Nε-Z-L-赖氨酸的被保护的氨基酸的N-羧酸酐(NCA)聚合。
颗粒组合物1例如能够如下操作而形成。首先，在含有有机溶剂的形成溶液中使嵌段共聚物单元2和带电脂质3溶解或分散，以及根据需要使中性脂质溶解或分散，在充分溶解或分散后，将该有机溶剂蒸发除去。作为有机溶剂，能够例示丙酮、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈、四氢呋喃、甲醇。形成溶液能够含有2种以上的有机溶剂，还可以含有少量的水。在得到的固体物或浆膏中，加入水或包含适当的盐或稳定剂等添加物的水溶液，通过进行搅拌使嵌段共聚物单元和脂质悬浊。能够使用超声波照射、高压乳化机或挤压机等方法将其分散、微小化，形成颗粒组合物1。
根据本发明，也能够提供医药组合物1’，其具有上述的颗粒组合物1、和带有与该颗粒组合物1中内包的带电脂质3相反电荷的药物4。药物4通过与带电脂质3的静电结合被保持在颗粒组合物1内。这样，带电脂质3和药物4的结合状态是可逆的，不伴随化学性的结构变化。不论是通过在颗粒组合物1的形成过程中在形成溶液中添加药物4，还是通过在药物4的溶液中添加颗粒组合物1，都能够使药物4内包在颗粒组合物中。
作为药物4，可以列举在生理pH(例如pH7.4)的水性介质中具有比正电荷多的负电荷的阴离子性化合物，和在该水性介质中具有比负电荷多的正电荷的阳离子性化合物。化合物优选为高分子化合物。
作为能够用于药物4的高分子化合物，可以列举肽、蛋白质、糖链、核酸等。
从抑制药物4在血中等过早地从颗粒组合物1脱离，并且防止药物4在颗粒组合物1内被持续保持过长时间的观点出发，优选将在医药组合物1’中的带电脂质3和药物4的电荷比控制在规定范围。例如，作为药物4使用核酸时，该电荷比被规定为[颗粒组合物所含有的带电脂质3中的阳离子性基团的摩尔浓度]/[核酸中的磷酸基的摩尔浓度]，另外，例如在使用以蛋白质为代表的具有两性带电性基团的药物时，规定为[颗粒组合物所含有的带电脂质中的带电性基团的摩尔浓度]/([具有与带电脂质的电荷相反电荷的在药物中的带电性基团的摩尔浓度]-[具有与带电脂质电荷相同电荷的在药物中的带电性基团的摩尔浓度])。该电荷比优选为0.5以上，更优选为1以上，更加优选为2以上，还优选为50以下，更优选为20以下，更加优选为10以下。
颗粒组合物1和医药组合物1’的平均粒径优选为10nm以上，更优选为30nm以上，还优选为300nm以下，更优选为200nm以下。
实施例
以下，由实施例进一步详细地说明本发明。另外，在以后的说明中的由动态光散射法(DLS)的颗粒组合物的平均粒径的测定中，使用光散射粒径测定装置Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)。
[实施例-试验例群1：颗粒组合物]
[实施例1-1]
在50mL二甲基亚砜中溶解5g质均分子量(Mw)为10000的α-甲氧基-ω-氨基-聚乙二醇(以下，有时表示为“PEG”)(日油株式会社)，加入5.5g(相对于聚乙二醇42当量)γ-苄基-L-谷氨酸(以下，有时表示为“PBLG”)的N-羧酸酐(NCA)，在40℃进行24小时反应。通过向己烷和乙酸乙酯的混合溶剂(体积比1∶1)1L中滴加该反应溶液，使聚合物析出。由减压过滤回收聚合物，再使其干燥，得到8.6g固体物。将其溶解在86mLDMF中，加入432μL乙酸酐，在40℃进行24小时反应。通过向己烷和乙酸乙酯的混合溶剂(体积比1∶1)1L中滴加该反应溶液，使聚合物析出。通过减压过滤回收聚合物，再使其干燥，得到8.1g聚乙二醇-聚(γ-苄基-L-谷氨酸)-Ac嵌段共聚物(以下，有时表示为“PEG-PBLG”)。在下述表示PEG-PBLG的结构式。从根据1H-NMR的解析，得知PBLG嵌段的聚合度为40。
Figure BDA0000139391540000111
混合4mL PEG-PBLG的氯仿溶液(50mg/mL)和0.5mL作为阳离子性带电脂质的1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(以下称为“DOTAP”)(Avanti Polar Lipid)的氯仿溶液(40mg/mL)，之后以旋转蒸发器蒸馏除去溶剂，再减压干燥一晚。在得到的固体物中加入10mL的20mM的HEPES缓冲液(pH7.4)，室温搅拌3小时使其悬浊。由超声波处理(130W、1秒钟脉冲、20分钟)该悬浊液，进行颗粒化。由0.2μm的过滤器(Millex GP，Millipore)过滤该溶液，得到颗粒组合物1。颗粒组合物1以亲水性聚合物链段朝向外侧的状态被配置为放射状，处于带电脂质被吸引在疏水性聚合物链段侧而配置的状态。后述颗粒组合物2～6也处于与其同样的状态。
[实施例1-2]
除了代替DOTAP使用作为阴离子性带电脂质的磷脂酸(以下有时表示为“PA”)以外，与实施例1-1同样操作，得到颗粒组合物2。
[实施例1-3]
混合4mL在实施例1-1中得到的PEG-PBLG的氯仿溶液(50mg/mL)、0.5mL作为阳离子性带电脂质的DOTAP(Avanti PolarLipid)的氯仿溶液(40mg/mL)和0.5mL作为中性脂质的二油酰基磷脂酰乙醇胺(以下有时表示为“DOPE”)(Avanti Polar Lipid)的氯仿溶液(40mg/mL)，之后以旋转蒸发器蒸馏除去溶剂，再减压干燥一晚。在得到的固体物中加入5mL的20mM HEPES缓冲液(pH7.4)，在室温搅拌3小时，使其悬浊。通过超声波处理(130W、1秒钟脉冲、20分钟)该悬浊液，进行颗粒化。由0.2μm的过滤器(Millex GP，Millipore)过滤该溶液，得到颗粒组合物3。
[实施例1-4]
除了将PEG-PBLG的氯仿溶液量改变为2mL以外，与实施例1-3同样操作，得到颗粒组合物4。
[实施例1-5]
除了将PEG-PBLG的氯仿溶液量改变为1.33mL以外，与实施例1-3同样操作，得到颗粒组合物5。
[实施例1-6]
除了将PEG-PBLG的氯仿溶液量改变为1mL以外，与实施例1-3同样操作，得到颗粒组合物6。
[实施例1-7]
通过碱处理在实施例1-1中得到的PEG-PBLG，将谷氨酸侧链的苄基脱保护，得到聚乙二醇-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物(PEG-pGlu)。相对该PEG-pGlu的谷氨酸侧链，由使用辛醇的缩合反应，部分地导入辛基(C8H17)，从而得到作为阴离子性聚合物的PEG-pGlu(C8)聚合物。从根据1H-NMR的解析，得知辛基的导入数是每个聚合物为33个。在下述表示PEG-pGlu(C8)的结构式。
Figure BDA0000139391540000121
混合1mL PEG-pGlu(C8)的甲醇溶液(50mg/mL)、0.5mL作为阳离子性带电脂质的DOTAP(Avanti Polar Lipid)的甲醇溶液(40mg/mL)和0.5mL作为中性脂质的二油酰基磷脂酰乙醇胺(以下有时表示为“DOPE”)(Avanti Polar Lipid)的甲醇溶液(40mg/mL)，之后以旋转蒸发器蒸馏除去溶剂，再减压干燥一晚。在得到的固体物中加入2.5mL的100mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)，在室温搅拌3小时，使其悬浊。由超声波处理(130W、1秒钟脉冲、10分钟)该悬浊液，进行颗粒化。由0.2μm的过滤器(Millex GP，Millipore)过滤该溶液，得到颗粒组合物7。
[实施例1-8]
除了将PEG-pGlu(C8)的甲醇溶液(50mg/mL)量改变为0.5mL以外，与实施例1-7同样操作，得到颗粒组合物8。
[实施例1-9]
通过碱处理在实施例1-1中得到的PEG-PBLG，将谷氨酸侧链的苄基脱保护，得到聚乙二醇-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物(PEG-pGlu)。相对该PEG-pGlu的谷氨酸侧链，由使用苯甲醇的缩合反应，部分地导入苄基(PhCH2)，从而得到作为阴离子性聚合物的PEG-pGlu(Bn)聚合物。从根据1H-NMR的解析，得知苄基的导入数是每个聚合物为34个。在下述表示PEG-pGlu(Bn)的结构式。
混合1mL PEG-pGlu(Bn)的丙酮溶液(50mg/mL)、0.5mL作为阳离子性带电脂质的DOTAP(Avanti Polar Lipid)的甲醇溶液(40mg/mL)和0.5mL作为中性脂质的二油酰基磷脂酰乙醇胺(以下有时表示为“DOPE”)的甲醇溶液(40mg/mL)(Avanti Polar Lipid)，之后以旋转蒸发器蒸馏除去溶剂，再减压干燥一晚。在得到的固体物中加入2.5mL的100mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)，室温搅拌3小时，使其悬浊。由超声波处理(130W、1秒钟脉冲、10分钟)该悬浊液、进行颗粒化。以0.2μm的过滤器(Millex GP，Millipore)过滤该溶液，得到颗粒组合物9。
[实施例1-10]
除了将PEG-pGlu(C8)的甲醇溶液(50mg/mL)量改变为0.5mL以外，与实施例1-7同样操作，得到颗粒组合物10。
[比较例1-1]
除了不添加DOTAP以外，与实施例1-1同样操作，得到比较用颗粒组合物C1。
[比较例1-2]
除了不添加DOTAP以外，与实施例1-3同样操作，得到比较用颗粒组合物C2。
[比较例1-3]
除了不添加PEG-PBLG以外，与实施例1-3同样操作，得到比较用颗粒组合物C3。该组合物C3不含嵌段共聚物，只含作为带电脂质的DOTAP和作为中性脂质的DOPE。
[试验例1a]
由动态光散射法测定颗粒组合物1～10和比较用颗粒组合物C1～C3的平均粒径。在表1中表示结果。
[表1]
Figure BDA0000139391540000151
[试验例1b]
在颗粒组合物3～10和比较用颗粒组合物C3中加入10mM的HEPES缓冲液(pH7.4)，制备样品使带电脂质的浓度为0.1mg/mL。使用光散射粒径测定装置Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)，对各样品(800μL)测定电动电位。在测定中，使用一次性毛细管检测池(disposable capillary cell)(DTS 1060，Malvern Instruments)，测定时的温度设定在25℃。
[表2]
  颗粒组合物   聚合物和脂质的质量比   电动电位(mV)
  3   PEG-PBLG∶DOTAP∶DOPE＝10∶1∶1   2.04
  4   PEG-PBLG∶DOTAP∶DOPE＝5∶1∶1   5.38
  5   PEG-PBLG∶DOTAP∶DOPE＝3.3∶1∶1   7.80
  6   PEG-PBLG∶DOTAP∶DOPE＝2.5∶1∶1   11.0
  7   PEG-pGlu(C8)∶DOTAP∶DOPE＝2.5∶1∶1   1.63
  8   PEG-pGlu(C8)∶DOTAP∶DOPE＝1.25∶1∶1   1.09
  9   PEG-pGlu(Bn)∶DOTAP∶DOPE＝2.5∶1∶1   0.26
  10   PEG-pGlu(Bn)∶DOTAP∶DOPE＝1.25∶1∶1   2.06
  C3   DOTAP∶DOPE＝1∶1   60.7
如表2所示，相比于不含嵌段聚合物单元的比较用颗粒组合物C3，在颗粒组合物3～10中电动电位的绝对值小。并且，在颗粒组合物3～10中，嵌段共聚物单元相对于带电脂质的质量比越高，电动电位的绝对值越小。其结果，意味着颗粒组合物3～10的颗粒外周面处于防止带有由带电脂质引起的电荷的状态。并且在将颗粒组合物中的带电脂质含量设为一定时，也意味着由亲水性聚合物链段构成的区域密度越高，颗粒外周面也越难以带有由带电脂质引起的电荷。
[试验例1c：血清中的凝集性评价]
作为颗粒组合物，使用颗粒组合物3～10和比较用颗粒组合物C3，从如上述操作制备的测定样品A和B，以孔板检测仪(Plate Reader)(POWERSCAN HT，大日本制药)测定相对于波长700nm光线的吸光度，算出血中凝集度。另外，得到的值为0以下时，将血中凝集度设为0。在表3中表示该结果和在试验例1b中测得的电动电位的绝对值，并且在图2中表示电动电位的绝对值和血中凝集度的关系。
[表3]
  颗粒组合物   血中凝集度   电动电位(mV)
  无   0.118   -
  3   0.093   2.04
  4   0.177   5.38
  5   0.185   7.80
  6   0.198   11.0
  7   0   1.63
  8   0   1.09
  9   0.012   0.26
  10   0.073   2.06
  C3   0.375   60.7
如图2和表3所示，颗粒组合物在电动电位的绝对值为10mV以下，进一步为6mV以下，特别为3mV以下的范围时，血中凝集度低。
[实施例-试验例群2：白蛋白(pH7.4)内包颗粒组合物]
[实施例2]
在20mM的HEPES缓冲液(pH7.4)中溶解来自牛的白蛋白由FITC(荧光素5-异硫氰酸盐)所标记的白蛋白-FITC(Sigma Aldrich)，形成10mg/mL溶液。混合0.2mL该白蛋白溶液、0.5mL颗粒组合物1(含有40mg/mL的PEG-PBLG和4mg/mL的DOTAP)与0.5mL 20mM的HEPES缓冲液(pH7.4)，通过在4℃静置过夜，形成白蛋白内包颗粒组合物。以动态光散射法求出的该颗粒组合物的平均粒径为98.7nm。另外，白蛋白的等电点(PI)约为4.8，在pH7.4为显示阴离子性的生物高分子。
[比较例2-1]
除了取代颗粒组合物1，使用颗粒组合物2(含有40mg/mL的PEG-PBLG和4mg/mL的PA)以外，与实施例2同样操作，形成白蛋白内包颗粒组合物。以动态光散射法求出的该颗粒组合物的平均粒径为91.6nm。
[比较例2-2]
除了取代颗粒组合物1，使用比较用颗粒组合物C1(含有40mg/mL的PEG-PBLG)以外，与实施例2同样操作，形成白蛋白内包颗粒组合物。以动态光散射法求出的该颗粒组合物的平均粒径为118nm。
[比较例2-3]
除了取代颗粒组合物1，使用比较用颗粒组合物C2(含有40mg/mL的PEG-PBLG和2mg/mL的DOPE)以外，与实施例2同样操作，形成白蛋白内包颗粒组合物。以动态光散射法求出的该颗粒组合物的平均粒径为119nm。
[试验例2a：由超速离心的白蛋白保持性的评价]
将在实施例2、比较例2-1～比较例2-3中得到的白蛋白内包颗粒组合物的溶液各40μL，在与360μL 10mM的HEPES缓冲液(pH7.4)混合的状态，由超速离心机(Optima MAX Ultracentrifuge，BeckmanCoulter)以100000×g、4℃超速离心处理1小时。以孔板检测仪(POWERSCAN HT，大日本制药)测定(激发波长485nm，荧光波长528nm)上清液中的白蛋白-FITC的荧光强度，根据下述式(1)，算出颗粒组合物中的白蛋白保持率。
(保持率)＝(A-B)×100/A        式(1)
A：在颗粒组合物中添加的白蛋白-FITC的荧光强度
B：在上清液中的白蛋白-FITC的荧光强度
[表4]
  使用的颗粒组合物   pH   白蛋白-FITC的保持率(％)
  实施例2   1   7.4   94.0
  比较例2-1   2   7.4   0
  比较例2-2   C1   7.4   0
  比较例2-3   C2   7.4   0
如表4所示，在实施例2中，在离心处理后，也有94％的白蛋白被保持在颗粒内，但在比较例2-1～比较例2-3中，在离心处理后，白蛋白没有残留。
[试验例2b：由凝胶过滤色谱法的白蛋白的保持性评价]
由使用Sepharose CL-4B的凝胶过滤色谱分析实施例2和比较例2-1中得到的白蛋白内包颗粒组合物的溶液各1mL。分为组分(fraction)回收洗脱液，以孔板检测仪(POWERSCAN HT，大日本制药)测定(激发波长485nm，荧光波长528nm)各组分中所包含的白蛋白-FITC的荧光强度。另外，作为洗脱液，使用在10mM的HEPES缓冲液中添加了150mM的氯化钠的溶液(pH7.4)。
图3是表示其测定结果的图表。如图3所示，在白蛋白单体和在比较例2-1中，在组分20附近确认了洗脱峰，相对于此，在实施例2中，在组分10附近确认了洗脱峰。这意味着相比于比较例2-1，实施例2的白蛋白向颗粒内的保存性优异。
[实施例-试验例群3：葡聚糖内包颗粒组合物]
[实施例3]
在20mM的HEPES缓冲液(pH7.4)中溶解将平均分子量为20000的葡聚糖由FITC标记的葡聚糖-FITC(SigmaAldrich)，形成10mg/mL的溶液。混合0.2mL该葡聚糖溶液、0.5mL颗粒组合物1(含有40mg/mL的PEG-PBLG和4mg/mL的DOTAP)与0.5mL 20mM的HEPES缓冲液(pH7.4)，通过在4℃静置过夜，形成葡聚糖内包颗粒组合物。以动态光散射法求出的该颗粒组合物的平均粒径为77.6nm。另外，葡聚糖在pH7.4时，是显示阴离子性的生物高分子。
[比较例3-1]
除了取代颗粒组合物1，使用颗粒组合物2(含有40mg/mL的PEG-PBLG和4mg/mL的PA)以外，与实施例3同样操作，形成葡聚糖内包颗粒组合物。以动态光散射法求出的该颗粒组合物的平均粒径为95.4nm。
[比较例3-2]
除了取代颗粒组合物1，使用比较用颗粒组合物C1(含有40mg/mL的PEG-PBLG)以外，与实施例3同样操作，形成葡聚糖内包颗粒组合物。以动态光散射法求出的该颗粒组合物的平均粒径为119nm。
[比较例3-3]
除了取代颗粒组合物1，使用比较用颗粒组合物C2(含有40mg/mL的PEG-PBLG和4mg/mL的DOPE)以外，与实施例3同样操作，形成葡聚糖内包颗粒组合物。以动态光散射法求出的该颗粒组合物的平均粒径为119nm。
[试验例3：由超速离心的葡聚糖保持性的评价]
对于在实施例3、比较例3-1～比较例3-3中得到的葡聚糖内包颗粒组合物的溶液各40μL，与试验例2a同样操作，测定上清液中的葡聚糖-FITC的荧光强度，根据下述式(2)，算出在颗粒组合物中的葡聚糖保持率。
(保持率)＝(A’-B’)×100/A’  式(2)
A’：在颗粒组合物中添加的葡聚糖-FITC的荧光强度
B’：在上清液中的葡聚糖-FITC的荧光强度
[表5]
  使用的颗粒组合物   pH 葡聚糖-FITC的保持率(％)
  实施例3   1   7.4   38.67
  比较例3-1   2   7.4   6.24
  比较例3-2   C1   7.4   2.39
  比较例3-3   C2   7.4   4.03
如表5所示，在实施例3中，在离心处理后也有近40％的葡聚糖被保持在颗粒内，但在比较例3-1～比较例3-3中，在离心处理后，在颗粒内葡聚糖几乎没有残留。
[实施例-试验例群4：白蛋白(pH3.3)内包颗粒组合物]
[实施例4]
在50mM的甘氨酸缓冲液(pH3)中溶解白蛋白(来自牛，SigmaAldrich)，形成1mg/mL的溶液。混合2mL该白蛋白溶液、0.5mL颗粒组合物2(含有40mg/mL的PEG-PBLG和4mg/mL的PA)与0.5mL20mM的HEPES缓冲液(pH7.4)，由在pH3.3、4℃静置过夜，形成白蛋白内包颗粒组合物。以动态光散射法求出的该颗粒组合物的平均粒径为78.8nm。另外，白蛋白在pH3.3时显示阳离子性。
[比较例4-1]
除了取代颗粒组合物2，使用颗粒组合物1(含有40mg/mL的PEG-PBLG和4mg/mL的DOTAP)以外，与实施例4同样操作，形成白蛋白内包颗粒组合物。以动态光散射法求出的该颗粒组合物的平均粒径为95.1nm。
[比较例4-2]
除了取代颗粒组合物2，使用颗粒组合物C1(含有40mg/mL的PEG-PBLG)以外，与实施例4同样操作，形成白蛋白内包颗粒组合物。以动态光散射法求出的该颗粒组合物的平均粒径为115nm。
[比较例4-3]
除了取代颗粒组合物2，使用颗粒组合物C2(含有40mg/mL的PEG-PBLG和1mg/mL的DOPE)以外，与实施例4同样操作，形成白蛋白内包颗粒组合物。以动态光散射法求出的该颗粒组合物的平均粒径为120nm。
[试验例4：由超速离心的白蛋白保持性的评价]
将在实施例4、比较例4-1～比较例4-3中得到的白蛋白内包颗粒组合物的溶液各400μL，由超速离心机(Optima MAX Ultracentrifuge，Beckman Coulter)以100000×g、4℃超速离心处理1小时。以蛋白质定量试剂盒BCA Protein Assay(Pierce)定量上清液中的白蛋白浓度，根据下述式(3)，算出颗粒组合物中的白蛋白的保持率。
(保持率)＝(A″-B″)×100/A″  式(3)
A″：在颗粒组合物中添加的白蛋白的浓度
B″：在上清液中的白蛋白浓度
[表6]
  使用的颗粒组合物  pH   白蛋白的保持率(％)
  实施例4   2  3.3   94.75
  比较例4-1   1  3.3   49.85
  比较例4-2   C1  3.3   42.86
  比较例4-3   C2  3.3   55.39
如表6所示，在实施例4中，在离心处理后，也有大于94％的白蛋白被保持在颗粒内，但在比较例4-1～比较例4-3中，离心处理后的白蛋白保持率没有高到与实施例4相匹敌的程度。
[实施例-试验例群5：siRNA内包颗粒组合物]
[实施例5]
接着，按照记载的程序，进行向各颗粒组合物的siRNA的内包处理。
对于颗粒组合物3～6和比较用颗粒组合物C3，如下操作地进行内包处理。使siRNA溶解在10mM的HEPES缓冲液(pH7.4)中，制备20μM的siRNA溶液。在250μL的该siRNA溶液中，添加250μL以满足目的电荷比(+/-)的方式将浓度调整过的颗粒组合物，混合后，通过在4℃静置2小时，进行向颗粒组合物的siRNA的内包处理。另外，“电荷比(+/-)”是指[颗粒组合物所含有的阳离子性脂质的阳离子性基团的浓度]/[核酸中的磷酸基浓度]。对于颗粒组合物7～10，在100μL 100μM的siRNA水溶液中添加279μL颗粒组合物，在混合后通过4℃静置2小时，进行向颗粒组合物的siRNA的内包处理。这样操作得到的siRNA内包颗粒组合物的电荷比(+/-)为8。另外，从颗粒组合物7～10得到的siRNA内包颗粒组合物，按照通常方法，制成进行了冷冻干燥处理的储藏剂(stock)，通过使其再溶解在水中，在后述的各种试验中使用。
接着说明在以下的试验例中使用的siRNA。这些siRNA能够通过株式会社Nippon EGT购入。
-siRNA(Luc)：是以海荧(sea-firefly)荧光素酶基因作为模板而设计的，使用5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3’(序列序号1)作为正义链，使用5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3’(序列序号2)作为反义链，由通常方法使其形成双链的siRNA。
-siRNA(Plk1)：是以人Plk1(Polo-like kinase 1)基因作为模板而设计的，使用5’-CCAUUAACGAGCUGCUUAAdTdT-3’(序列序号3)作为正义链，使用5’-UUAAGCAGCUCGUUAAUGGdTdT-3’(序列序号4)作为反义链，由通常方法使其形成双链的siRNA。Plk1基因是在细胞分裂的M期重要的激酶。siRNA(Plk1)在被导入细胞内时，诱导细胞凋亡。
-F-siRNA(Luc)：是使用在siRNA(Luc)中，在序列序号2的反义链的5’末端上带有Cy3标记的反义链(5’-Cy3-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT-3’)形成的siRNA。
[试验例5a]
在试验例5a中，作为颗粒组合物，使用颗粒组合物4和颗粒组合物6，作为siRNA，使用siRNA(Luc)，以电荷比为0.5、1、2、4和8的方式，以在实验例5中表示的方法进行siRNA的内包处理。如下操作由电泳法分析在内包处理后的各颗粒组合物中的siRNA内包率。在聚丙烯酰胺凝胶(Novex 20％TBE Gel，Invitrogen)中，将含有100ng的siRNA的各颗粒组合物上样，使用TBE溶液作为电泳缓冲液，以施加电压100V、泳动时间1小时的条件进行电泳。另外，作为对照，将100ng的siRNA同时电泳。结束后，由发色用试剂SYBR(注册商标)GreenⅡ(Invitrogen)进行染色，由图像解析用显像装置MolecularImager FX(Bio-Rad)进行图像化。
图4是表示在试验例5a中的电泳结果图。图中，电荷比0是指对照。如图4所示，电荷比为2以上时，不能确认来自游离siRNA的条带。这意味着在使用颗粒组合物4和颗粒组合物6的情况下，电荷比为2以上时，可以将几乎全部的siRNA颗粒内包在颗粒组合物中。因为相比于siRNA，内包了siRNA的颗粒组合物在电泳中的泳动度变小，所以如果siRNA被适当地内包，在对应的泳道中就不会检测到来自游离siRNA的条带。
[试验例5b]
在试验例5b中，作为颗粒组合物，使用颗粒组合物3～10和比较用颗粒组合物C3，然后，作为siRNA，使用siRNA(Luc)，以电荷比为8的方式，以在实验例5中表示的方法进行siRNA的内包处理。在内包处理后的颗粒组合物中加入10mM的HEPES缓冲液(pH7.4)，将带电脂质的浓度调整为0.1mg/mL。对于这些样品(800μL)，使用光散射粒径测定装置Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)，测定电动电位。在测定中使用一次性毛细管检测池(DTS1060，MalvernInstruments)，测定时的温度设定在25℃.
[表7]
  使用的颗粒组合物   电荷比(+/-)   电动电位(mV)   处理前的电动电位(mV)
  3   8   1.93   2.04
  4   8   2.63   5.38
  5   8   4.67   7.80
  6   8   6.17   11.0
  7   8   0.37   1.63
  8   8   0.95   1.09
  9   8   0.567   0.26
  10   8   0.96   2.06
  C3   8   55.1   60.7
如表7所示，使用颗粒组合物3～10得到的内包处理颗粒组合物，电动电位的绝对值显著下降，可以认为内包了大量的siRNA。并且，如表7所示，带电脂质相对于嵌段共聚物单元的添加比例越增加，siRNA内包处理后的电动电位的减少幅度越大。这意味着带电脂质的添加比例越大，就能够内包更多的siRNA。
[试验例5c：对MDA-MB-231细胞的活性评价]
在试验例5c中，作为颗粒组合物，使用颗粒组合物3～6，作为siRNA，使用siRNA(Plk1)，以电荷比为8的方式，以在实验例5中表示的方法进行siRNA的内包处理。然后，使用siRNA内包处理颗粒组合物，进行相对于MDA-MB-231细胞的如下所述的活性评价。另外，作为无活性的对照序列使用siRNA(Luc)，进行同样的实验。
[活性评价]
在siRNA内包颗粒组合物中加入10mM的HEPES缓冲液(pH7.4)，将siRNA浓度调整为3μM/mL。以每1孔2000个细胞的比例。在96孔板上接种来自人乳癌的MDA-MB-231细胞，在24小时后，在培养基中各添加siRNA内包颗粒组合物。siRNA在培养基中的最终浓度调整为300nM、100nM、33nM和11nM。再培养96小时后，使用细胞数测定试剂盒Cell Counting Kit-8(同仁堂)评价细胞的存活率。
图5是用于说明该活性评价结果的图表。如图5所示，内包siRNA(Plk1)的颗粒组合物，相比于内包siRNA(Luc)的颗粒组合物，细胞数的减少显著。这意味着siRNA内包颗粒组合物正常发挥功能。
[试验例5d：在血清中的凝集性评价]
在试验例5d中，作为颗粒组合物，使用颗粒组合物3～10和比较用颗粒组合物C3，然后，作为siRNA，使用siRNA(Luc)，以电荷比为8的方式，以在实验例5中表示的方法进行siRNA的内包处理。从如上述操作制备的样品A和B，由孔板检测仪(POWERSCAN HT，大日本制药)测定相对波长700nm光线的吸光度，算出血中凝集度。另外，得到的值为0以下时，将血中凝集度设为0。
图6是表示从使用颗粒组合物4的内包处理颗粒组合物和使用比较用颗粒组合物C3的内包处理颗粒组合物中的测定样品A(有FBS)和测定样品B(无FBS)得到的吸光度的图表。如图6所示，在使用比较用颗粒组合物C3的内包处理颗粒组合物中，由FBS处理，吸光度大幅增加。这意味着产生了由与血清成分相互作用造成的凝集。在使用颗粒组合物4的内包处理颗粒组合物(siRNA内包颗粒组合物)中，几乎没有由FBS处理产生的吸光度增加。
图7和下述的表8是表示在试验例5b中测定的内包处理颗粒组合物的电动电位的绝对值与在试验例5d中测定的内包处理颗粒组合物的血中凝集度的关系的图表和表。
[表8]
  使用的颗粒组合物   血中凝集度   电动电位(mV)
  无   0.118   -
  3   0.092   1.93
  4   0.132   2.63
  5   0.142   4.67
  6   0.153   6.17
  7   0   0.37
  8   0   0.95
  9   0   0.57
  10   0   0.96
  C3   0.292   55.1
如图7和表8所示，内包处理颗粒组合物的电动电位的绝对值在5mV以下，3mV以下，进一步在2mV以下，特别在1mV以下范围时，血中凝集度明显低。
[试验例5e：血中滞留性的评价]
在试验例5e中，作为颗粒组合物，使用颗粒组合物3～10，并且作为siRNA，使用F-siRNA(Luc)，以电荷比为8的方式，以在实验例5中表示的方法进行siRNA的内包处理。再对于颗粒组合物4，也进行电荷比为1、2和4的siRNA的内包处理。对得到的siRNA内包颗粒组合物，以体积比1/20添加3M的氯化钠水溶液，制备含有150mM氯化钠的等渗液(siRNA内包颗粒组合物样品)。作为对照，在pH7.4的10mM的HEPES缓冲液中溶解F-siRNA(Luc)而得到的10μM的siRNA溶液中，以体积比1/20添加3M的氯化钠水溶液，制备含有150mM氯化钠的等渗液(siRNA单体样品)。在Balb/c小鼠(日本CharlesRiver)的尾静脉中投与siRNA内包颗粒组合物样品和siRNA单体样品，在1小时后，从下腔静脉采取200μL血液。各样品的投与量调整为F-siRNA相对于小鼠体重的比例为1mg/kg。
对于从投与了来自颗粒组合物3～6的样品的个体采取的血液，以4℃、2000×g离心10分钟，从上清得到80μL血浆。通过将该血浆的荧光强度由孔板检测仪(POWERSCAN HT，大日本制药)测定(激发波长485nm，荧光波长528nm)，将在血中残留的F-siRNA定量。关于从投与了来自颗粒组合物7～10的样品的个体采取的血液，以4℃、2000×g离心10分钟，从上清得到100μL血浆。在该血浆中加入1mLSepasol RNA Ⅰ(Nakalai Tesque)，由漩涡搅拌机搅拌，静置5分钟。在其中加入200μL氯仿，颠倒混合后，静置3分钟。将该溶液以5200×g、4℃离心10分钟，通过由孔板检测仪(POWERSCAN HT，大日本制药)测定(激发波长485nm，荧光波长528nm)300μL得到的上清的荧光强度，将在血中残留的F-siRNA定量。
[表9]
Figure BDA0000139391540000251
[表10]
Figure BDA0000139391540000261
如表9所示，在使用颗粒组合物3～10制备的siRNA内包颗粒组合物中，可以确认0.9％以上的F-siRNA在血中残留。而且，在siRNA内包颗粒组合物中，嵌段共聚物单元相对于带电脂质的质量比越高，F-siRNA的残留率越高。这意味着将颗粒组合物中的带电脂质含量设为一定时，由亲水性聚合物链段构成的区域的密度越增加，在血中能够将药剂维持在颗粒内的时间越长。另外，电动电位的绝对值越低的样品，F-siRNA的残留量越高，使用电动电位的绝对值为0.37mV的颗粒组合物7样品中的F-siRNA的残留量为37.9％，使用电动电位的绝对值为0.57mV的颗粒组合物9样品中的F-siRNA的残留量为15.5％。而且，如表10所示，siRNA内包颗粒组合物中的电荷比越高，F-siRNA的残留率越高。这意味着带电脂质的添加比例越大，在血中能够将药剂维持在颗粒内的时间越长。
对于作为颗粒组合物使用颗粒组合物6，作为siRNA使用siRNA(Luc)，以电荷比为1.5的方式，以在实验例5中表示的方法进行siRNA的内包处理的样品，以在试验例5b中记载的方法测定电动电位，结果其绝对值为0.36mV，与使用颗粒组合物7的样品几乎相同。但是，对于以在试验例5e中表示的方法，作为siRNA使用F-siRNA(Luc)，对颗粒组合物6进行内包处理的样品(电动电位：0.36mV)进行血中滞留性的评价，结果F-siRNA的残留量为0.91％。即，相比于使用了颗粒组合物6样品，使用了颗粒组合物7的样品的电动电位的绝对值虽然为相同程度，但内包药物的血中滞留性明显优异。这样，相比于由中性聚合物构成颗粒组合物的情况，通过以阴离子性聚合物构成颗粒组合物，能够大幅度提高内包药物的血中滞留性。
[试验例5f：脏器转移性的评价]
在试验例5f中，作为颗粒组合物，使用颗粒组合物3和比较用颗粒组合物C3，然后，作为siRNA，使用F-siRNA(Luc)，以电荷比为8的方式，以在实验例5中表示的方法进行siRNA的内包处理。对内包处理后的颗粒组合物，以体积比1/20添加3M的氯化钠水溶液，制备含有150mM氯化钠的等渗液(内包处理颗粒组合物样品)。在Balb/c裸鼠(雌，5周龄，日本Charles River)中移植来自人乳癌的MDA-MB-231细胞。对4周后肿瘤尺寸为200mm3以上的鼠，投与内包处理颗粒组合物样品。投与的F-siRNA量相对于小鼠的体重调整为1mg/kg。在从投与10分钟后、60分钟后和180分钟后，采取50～100μg各脏器，分别加入1mL RNA萃取试剂Sepasol RNA Ⅰ(Nakalai Tesque)，进行匀浆化。相对500μL各个匀浆化物，加入100μL氯仿，以4℃、5200G离心10分钟后，由孔板检测仪(POWERSCAN HT，大日本制药)测定(激发波长485nm，荧光波长528nm)200μL上清液的荧光强度，将转移到各脏器中的F-siRNA定量。
[表11]
-转移率表示每1g组织的F-siRNA定量值相对于每只小鼠个体的F-siRNA的投与量的比例(％)。“n.d.”表示“没有检出(not detected)”。
图8是用于说明在试验例5f中测得的药物的脏器转移性的图表。如图7和表11所示，在使用比较用颗粒组合物C3得到内包处理颗粒组合物时，迅速从血中消失，确认到向肺的显著集积。另一方面，在使用颗粒组合物4得到siRNA内包颗粒组合物时，在血中滞留得更长，并且也确认到向肿瘤的转移。
工业上的可利用性
通过将本发明的颗粒组合物作为药物载体使用，使药物内包制成为医药组合物，能够在生物体内更有效地保持药物(特别是高分子化合物)，能够保护其不被分解或排泄。另外，能够在保持活性的状态下将药物送达患部。还能够避免由与血中成分的相互作用产生的药物载体的凝集。由此，药物的有效利用率被显著改善，可以期待由投与量大幅度减少产生的医疗经济上的改善和有效的药理作用的表达。投与量的减少在抑制对于蛋白质和核酸等的免疫应答的诱发和对血液凝固系统的影响等副作用的等方面也是有用的。
Figure IDA0000139391640000011
Figure IDA0000139391640000031

Claims (12)

1.一种颗粒组合物，其特征在于：
含有具有疏水性聚合物链段和亲水性聚合物链段的嵌段共聚物单元，多个所述嵌段聚合物单元以所述疏水性聚合物链段朝向内侧，并且所述亲水性聚合物链段朝向外侧的状态放射状配置，
该颗粒组合物还具有带有与应该被内包的药物的电荷相反电荷的带电脂质，通过与该带电脂质的静电结合将所述药物保持在颗粒内部，另一方面，该带电脂质以吸引在所述疏水性聚合物链段侧的状态配置，从而防止颗粒外周面带有能够吸引带有与所述带电脂质的电荷相反电荷的带电性物质的电荷。
2.如权利要求1所述的颗粒组合物，其特征在于：
所述带电脂质在颗粒组合物的环向不以连续状态配置，而是以在颗粒组合物的环向介于相邻接的所述嵌段共聚物单元之间的方式配置，从而在颗粒组合物的环向相邻接的带电脂质之间的接触处于被所述嵌段共聚物单元隔断的状态。
3.如权利要求1或2所述的颗粒组合物，其特征在于：
所述亲水性聚合物链段是聚乙二醇链，所述疏水性聚合物链段是聚氨基酸链。
4.如权利要求1～3中任一项所述的颗粒组合物，其特征在于：
所述疏水性聚合物链段是阴离子性聚合物链段。
5.如权利要求1～4中任一项所述的颗粒组合物，其特征在于：
所述疏水性聚合物链段由下述通式(Ⅰ)和(Ⅱ)表示，
Figure FDA0000139391530000021
式中，R1和R3分别独立，表示氢原子或由R8(R9)CH(CH2)q-表示的基团，其中，R8和R9，i)分别独立，为氢原子、C1-6烷氧基、烯丙氧基、烯丙基C1-3氧基、氰基、羧基、氨基、C1-6烷氧基羰基、C2-7酰胺基、三-C1-6烷基甲硅烷氧基、甲硅烷氧基、甲硅烷氨基，或ii)一起，形成被C1-3烷基取代的或未取代的亚乙基二氧基或亚丙基二氧基，或iii)与它们所结合的CH基一起形成甲酰基，q是0～10的整数，
R2是氢原子、饱和或不饱和的C1～C29脂肪族羰基或烯丙基羰基，
R4是羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或烯丙基低级烷氧基，
R5是-O-或-NH-，
R6是氢原子、苯基、苄基、-(CH2)4-苯基、未取代的或被氨基或羰基取代的C4～C16烷基、或甾醇衍生物的残基，
R7是亚甲基，
n是在55～4600范围的整数，
x是在10～200范围的整数，
m是在0～200范围的整数，其中，在m为1以上时，(COCHNH)的单元和(COR7CHNH)的单元无规地存在，在m为2以上时，R6在1个嵌段共聚物单元2内的各氨基酸单元中分别被独立地选择、无规地存在，但R6为氢原子的情况占R6全体的75％以下，
y是1或2；
L1是选自-NH-、-O-、-O-Z-NH-、-CO-、-CH2-和-O-Z-S-Z-NH-中的连接基，其中，Z独立地为C1～C6亚烷基，L2是选自-OCO-Z-CO-和-NHCO-Z-CO-中的连接基，其中，Z是C1～C6亚烷基。
6.如权利要求5所述的颗粒组合物，其特征在于：
在所述通式(Ⅰ)和(Ⅱ)中，R5是-O-，R6是苄基、-(CH2)4-苯基或者未取代的或被氨基或羰基取代的C4～C16烷基。
7.如权利要求1～6中任一项所述的颗粒组合物，其特征在于：
在pH是7.4的10mM的HEPES缓冲溶液中，以所述颗粒组合物所含有的所述带电脂质总量为每1毫升的该缓冲溶液为0.1mg的方式添加所述颗粒组合物时，所测定的电动电位的绝对值被控制在15mV以下范围的状态，由此防止所述颗粒组合物在血中的凝集。
8.如权利要求7所述的颗粒组合物，其特征在于：
通过所述电动电位的绝对值被控制在3mV以下范围的状态，进一步防止所述的颗粒组合物在血中的凝集。
9.一种医药组合物，其特征在于：
具有权利要求1～8中任一项所述的颗粒组合物，和在该颗粒组合物中内包的带有与所述带电脂质相反电荷的药物。
10.如权利要求9所述的医药组合物，其特征在于：
在pH是7.4的10mM的HEPES缓冲溶液中，以所述颗粒组合物中所含有的所述带电脂质总量为每1毫升的该缓冲溶液为0.1mg的方式添加所述医药组合物时，所测定的电动电位的绝对值被控制在10mV以下范围的状态，由此防止所述医药组合物在血中的凝集。
11.如权利要求10所述的医药组合物，其特征在于：
通过所述电动电位的绝对值被控制在2mV以下范围的状态，进一步防止所述医药组合物在血中的凝集。
12.如权利要求9～11中任一项所述的医药组合物，其特征在于：
通过所述疏水性聚合物链段由阴离子性聚合物链段构成，所述医药组合物处于药物的血中滞留性提高的状态。
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