CN102753151A - 颗粒状医药组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提高了药物传递系统中适合的颗粒状医药组合物的药物封入稳定性。颗粒状医药组合物（1）含有以疏水性聚合物链段（2b）朝向内侧且亲水性聚合物链段（2a）朝向外侧的状态配置为放射状的嵌段共聚物单元（2）、含有生物体高分子的药物（4）、和带有与药物（4）的电荷相反电荷的带电脂质（3），该带电脂质（3）以吸引在疏水性聚合物链段（2b）侧的状态配置，药物（3）配置在疏水性聚合物链段（2b）的内侧。根据该医药组合物（1），能够显著防止药物（4）向颗粒外的脱落。

Description

颗粒状医药组合物
技术领域
本发明涉及在颗粒状载体组合物中内包有药物的、能够作为药物传递系统（DDS）利用的颗粒状医药组合物。
背景技术
利用蛋白质或核酸这样的生物体高分子的生物医药品，与利用低分子化合物的以往型的医药品相比，容易被酶分解或被免疫系统排除。从提高生物体内的生物医药品的稳定性的观点，专利文献1～3公开了在由脂质双层膜构成的脂质体中内包有生物体高分子的DDS。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2001／034115号小册子
专利文献2：国际公开第1998／58630号小册子
专利文献3：国际公开第2005／092389号小册子
发明内容
发明所要解决的课题
在专利文献1～3中记载的以往型的DDS中，通过以脂质双层膜保护作为药物的生物体高分子，能够提高生物体内的药物的稳定性，但药物难以从载体放出。而且，这样的以往型的DDS由于其粒径的大小和构成脂质双层膜的脂质所具有的电荷，容易被肺、肝脏和脾脏这样的网状内皮系统捕捉，因此在到达给药对象物以前，有时从血液中被除去。
以由具有疏水性聚合物链段和亲水性聚合物链段的嵌段共聚物单元所构成的高分子胶束作为载体的DDS，与使用脂质体的以往型的DDS相比，能够将DDS颗粒大幅度小型化（例如，平均粒径100nm以下）。但是，以这样的高分子胶束作为载体的DDS，如后述的比较例所示，由于将生物体高分子保持在DDS颗粒内的作用过弱，仍然有难以对给药对象物适当输送药物的情况。另外，在这样的DDS中，在制造后的存储期间中也有药物从载体脱离的情况。
本发明的发明人进行了防止颗粒外周面带有能够吸引带电性物质的电荷的高分子胶束DDS的开发（日本特愿2009－200681）。这样的DDS虽然能够防止能够导致妨碍向给药对象物的药物搬运的生物体分子向载体表面的附着，但从更长期地保持药物的观点出发，仍有能够改善的余地。
用于解决课题的方法
本发明在于提供一种颗粒状医药组合物，其含有具有疏水性聚合物链段和亲水性聚合物链段的嵌段共聚物单元、药物、带有与药物的电荷相反的电荷的带电脂质，上述药物至少含有选自蛋白质或核酸中的生物体高分子，多个上述嵌段共聚物单元以上述疏水性聚合物链段朝向内侧且上述亲水性聚合物链段朝向外侧的状态配置为放射状，上述带电脂质以吸引在上述疏水性聚合物链段侧的状态配置，上述药物存在于比上述疏水性聚合物链段更靠近颗粒的内侧，由此防止该药物向颗粒外的脱落。
发明的效果
根据本发明，能够提高适于DDS的医药组合物的药物的封入稳定性。这样的医药组合物，与以往型的DDS相比，能够更可靠地输送药物。特别是在用于对于到达耗时的向给药对象物的药物送达中是有用的。
附图说明
[图1]图1（a）和图1（b）是用于说明本发明的医药组合物的代表性结构的图。
[图2]图2（a）和图2（b）是用于说明由冻结操作造成的颗粒内的药物分布的变化的图。
[图3]图3（a）和图3（b）是表示医药组合物的封入稳定性评价的结果的图。
[图4]图4（a）和图4（b）是表示医药组合物的血液中滞留性评价的结果的图。
具体实施方式
在以下的说明中，为了容易地理解本发明，参照图1和图2。但是，图1和图2均为示意图，本发明在任何意义上，都不限定于这些图。在图1和图2中，表示了带电脂质为阳离子性脂质、药物为阴离子性药物的情况，但本发明不限于这样的方式。
在图1（a）中表示本发明的颗粒状医药组合物（以下，有时简称为“医药组合物”）的代表性结构。医药组合物1含有嵌段共聚物单元2、带电脂质3和药物4。在图1（b）中放大表示了嵌段共聚物单元2。嵌段共聚物单元2具有亲水性聚合物链段2a和疏水性聚合物链段2b，以疏水性聚合物链段2b朝向内侧且亲水性聚合物链段2a朝向外侧的状态，在医药组合物1内呈放射状配置。带电脂质3带有与药物4的电荷相反的电荷，以吸引在疏水性聚合物链段2b侧的状态配置。
在本发明的医药组合物1中，如图1（a）所示，药物存在于疏水性聚合物链段2b内侧。此外，这并不是要限定于医药组合物1中所内包的全部药物4局部存在于疏水性聚合物链段2b内侧的状态，并没有排除一部分药物4存在于疏水性聚合物链段2b外侧的状态。本发明的医药组合物1通过使药物4存在于该位置，可以防止药物4的泄露，换而言之处于药物4的封入稳定性提高的状态。
医药组合物1，例如，能够通过对处于药物被内包于疏水性聚合物链段2b外侧的区域的状态的医药组合物前体，实施冻结操作而形成。此外，如后所述，医药组合物前体1′能够通过公知的方法使药物内包于载体组合物而容易地形成。在图2（a）中表示了冻结操作前的医药组合物前体1″中颗粒内的药物4分布，在图2（b）中表示了冻结操作后的医药组合物1中颗粒内的药物4分布。如图2（a）所示，在医药组合物前体1′中，若实施冻结操作，比疏水性聚合物链段2b存在于颗粒外侧的药物4，就向着颗粒内侧移动，如图2（b）所示，可以得到存在于疏水性聚合物链段2b内侧的医药组合物1。这样，本发明的医药组合物1，能够通过将在医药组合物前体1′中配置在疏水性聚合物链段2b的外侧的药物4经过冻结操作使其向疏水性聚合物链段2b的内侧移动而形成。这样得到的药物移动产生的原因尚未确定，但可以认为是由于构成载体组合物的嵌段共聚物2和带电脂质3的配置通过冻结操作被打乱，经过随之产生的间隙，药物4容纳在颗粒的更内部。冻结操作至少进行1次即可，但优选实施2次以上。通过重复冻结操作，能够促进药物4向颗粒内部的容纳。
作为冻结操作，只要是冻结干燥操作和冻结熔融操作这样的、伴随规定的组合物的冻结的操作即可。
冻结干燥操作包括冻结组合物的工序（冻结工序A）和将冻结组合物干燥的工序（干燥工序）。冻结工序A能够通过将组合物在－200℃以上、优选在－100℃以上，另外在－10℃以下、优选在－20℃以下的温度，保持1小时以上、优选5小时以上，另外保持72小时以下、优选24小时以下来实施。干燥工序能够通过将冻结组合物的气氛气压力减压为真空状态（例如15Pa以下），诱导水分的升华而实施。从促进该升华的观点出发，可以使减压中的气氛气温度阶段性或连续地升温至高于冻结工序的温度，例如－20℃以上、或例如－10℃以上。升温时的气氛气温度的上限可以为25℃左右。干燥工序的时间能够设定为5小时以上，优选设定为20小时以上。干燥工序时间的上限没有特别限制，可以为例如100小时。由于经过冻结干燥操作得到的医药组合物1处于干燥状态，因此可以使其再溶解在水这样的公知的溶剂中使用。
冻结熔融操作包括与冻结工序A同样操作的冻结组合物的工序，和将冻结的组合物熔融的工序（熔融工序）。熔融工序能够通过将组合物在4℃以上、优选在10℃以上，另外在40℃以下、优选在30℃以下的温度保持30分钟以上、优选1小时以上，另外保持24小时以下、优选5小时以下而实施。
药物4存在于疏水性聚合物链段2b内侧的状态，例如，能够根据医药组合物1的Zeta电位的绝对值高于具有与该医药组合物1相同组成但不经过冻结操作形成的药物内包颗粒的Zeta电位的绝对值的现象来确定。这是由于若实施冻结操作则药物4向着颗粒的更内侧移动而离开颗粒的外表面，从而医药组合物1的Zeta电位的绝对值中带电脂质3的影响增加的缘故。
在本说明书中，带电脂质3是指在生理pH（例如，pH7.4）的水性介质中具有多于正电荷的负电荷的阴离子性脂质、和该水性介质中具有多于负电荷的正电荷的阳离子性脂质。因此，在本说明书中，关于具有阳离子性基团和阴离子性基团的所谓的两性带电脂质，按照上述基准进行处理。
带电脂质3通过静电结合在医药组合物1内保持药物4。带电脂质3只要至少在医药组合物1的存储环境下，带有与药物的电荷相反的电荷即可。带电脂质3和药物4优选在以血液中为代表的生理环境下（例如，pH7.4）也带有相反的电荷。
根据下面的机理，带电脂质3以吸引在疏水性聚合物链段2b侧的状态配置。作为本发明的医药组合物1的原材料的载体组合物，例如，能够通过包括在水溶液中悬浊嵌段共聚物单元2和带电脂质3的工序形成。嵌段共聚物单元2的疏水性聚合物链段2b由于为疏水性，因此在水溶液中不扩散而凝集存在。亲水性聚合物链段2a可以在水溶液中扩散自由地运动。因此，嵌段共聚物单元2在水溶液中配置为疏水性聚合物链段2b朝向内侧、亲水性聚合物链段2a朝向外侧的放射状。而且，带电脂质由于疏水性强，与水和亲水性聚合物链段2a相比，与疏水性聚合物链段2b的亲和性高，因此被吸引在疏水性聚合物链段2b侧。这样，带电脂质3就远离载体组合物的外周面而配置。而且，即使经过后述的冻结操作，带电脂质3也维持在吸引在疏水性聚合物链段2b侧的状态。
本发明的医药组合物1由于带电脂质3被吸引在疏水性聚合物链段2b侧而配置，因此处于防止医药组合物1的外周面带有能够吸引带有与带电脂质3相反电荷的带电性物质（例如，血液中的蛋白质）的电荷的状态。这样的状态，例如，能够通过从医药组合物1测定的Zeta电位的绝对值处于规定值以下的范围来确定。更具体而言，对于医药组合物1，希望Zeta电位的绝对值为15mV以下，优选为12mV以下，更优选为6mV以下，特别优选为3mV以下。通过在pH为7.4的10mM的HEPES缓冲溶液中，以载体组合物和医药组合物1中所含有的带电脂质的总量为每1毫升的该缓冲溶液为0.1mg的方式添加来测定Zeta电位。
嵌段共聚物单元相对于带电脂质3的比例，以重量比表示，希望为1.0以上，优选为1.5以上，更优选为2.0以上，还希望为50以下，优选为20以下，更优选为10以下。越提高该比例，越能够降低医药组合物1的Zeta电位的绝对值。另一方面，带电脂质3的比例越高，越能够更积极地将药物摄入颗粒内，因此，如上所述，该比例希望限制在50以下。
脂质可以为单纯脂质、复合脂质和衍生脂质中的任意种，能够例示磷脂、甘油糖脂、鞘糖脂、鞘氨醇类和甾醇类。更具体而言，作为阳离子性脂质，例如，可以列举1,2-二油酰基-3-三甲基铵基丙烷（DOTAP）、N-(2,3-二油烯基氧基丙烷-1-基)-N,N,N-三甲基氯化铵（DOTMA）、2,3-二油烯基氧基-N-[2-(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵（DOSPA）、1,2-二十四烷基氧基丙基-3-二甲基羟基乙基溴化铵（DMRIE）、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基羟基乙基溴化铵（DORIE）、3β-[N-(N′N′-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基]胆固醇（DC-Chol）。作为阴离子性脂质，例如，可以列举心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺（N-琥珀酰基PE）、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙二醇、胆固醇琥珀酸酯。医药组合物1能够含有2种以上的带电脂质3。
亲水性聚合物链段2a优选为源自由聚乙二醇或聚氧乙烯构成的水溶性聚合物的链段。亲水性聚合物链段2a的分子量希望为2,500Da以上，优选为5,000Da以上，更优选为8,000Da以上，另外希望为200,000Da以下，优选为20,000Da以下，更优选为15,000Da以下。疏水性聚合物链段2b优选为源自聚氨基酸链的链段。这样的聚氨基酸链能够在医药组合物1中其一部分或全部形成α螺旋。因此，带电脂质3以吸引在聚氨基酸链的α螺旋部分的状态，换而言之以分散在α螺旋部分的周边的状态配置。疏水性聚合物链段2b的重复单元数希望为10个以上，优选为20个以上，另外希望为200个以下，优选为100个以下，更优选为60个以下。从降低医药组合物1的Zeta电位的绝对值的观点出发，换而言之从减少医药组合物1的表面电荷的（接近中性）观点，在嵌段共聚物单元2中，优选使得亲水性聚合物链段2a的大小（分子量）大于疏水性聚合物链段2b的大小（重复单元数）。亲水性聚合物链段2a和疏水性聚合物链段2b也可以具有支链结构。例如，也可以为对于一条链段结合有2条以上的链段的状态。
亲水性聚合物链段2a和疏水性聚合物链段2b只要是能够防止医药组合物1的颗粒外周面带有能够吸引带电性物质的电荷的程度，也可以还含有以氨基和羧基为代表的带电性的取代基。
亲水性聚合物链段2a和疏水性聚合物链段2b能够使用使主链的末端之间经过共价键结合得到的链段。更具体而言，作为嵌段共聚物单元2，能够例示下面的通式（I）和通式（II）所示的化合物。医药组合物1也可以由2种以上的嵌段共聚物单元2形成。
Figure BDA00001996298700071
在通式（I）和通式（II）中，R1和R3分别独立，表示氢原子或R8(R9)CH(CH2)q-所示的基团（其中，R8和R9：i）分别独立，为氢原子、C1-6烷氧基、芳氧基、芳基C1-3氧基、氰基、羧基、氨基、C1-6烷氧羰基、C2-7酰基酰胺基、三-C1-6烷基甲硅烷氧基、甲硅烷氧基、甲硅烷氨基；ii）一起形成由C1-3烷基取代的或未取代的亚乙二氧基或亚丙二氧基；或iii）和与它们结合的CH基的一起形成甲酰基），q为0～10的整数，R2为氢原子、饱和或不饱和的C1～C29脂肪族羰基或芳基羰基，R4为羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或芳基-低级烷氧基，R5为-O-或-NH-，R6为氢原子、苯基、苄基、-(CH2)4-苯基、未取代的或者由氨基或羰基取代的C4～C16烷基、或甾醇衍生物的残基，R7为亚甲基，n为处于55～4,600的范围的整数，x为处于10～200的范围的整数，m为处于0～200的范围的整数（其中，m为1以上时，（COCHNH）的单元和（COR7CHNH）的单元的结合顺序是任意的，m为2以上时，R6在1个嵌段共聚物内的各氨基酸单元中的分别独立地选择，无规地存在，但R6为氢原子的情况占R6整体的75%以下），y为1或2，L1为选自-NH-、-O-、-O-Z-NH-、-CO-、-CH2-和-O-Z-S-Z-NH-（其中，Z独立为C1～C6亚烷基。）的连接基团，L2为选自-OCO-Z-CO-和-NHCO-Z-CO-（其中，Z为C1～C6亚烷基）的连接基团。
在通式（I）和通式（II）中，n优选为110以上的整数，更优选为180以上的整数，还优选为460以下的整数，更优选为340以下的整数，x优选为20以上的整数，还优选为100以下的整数，更优选为60以下的整数，m优选为100以下的整数，更优选为60以下的整数。
嵌段共聚物单元2可以为阴离子性聚合物、阳离子性聚合物、中性聚合物中的任意种。此外，在本说明书中，在生理pH（例如pH7.4）的水性介质中，将具有多于正电荷的负电荷的聚合物作为阴离子性的聚合物，将具有多于负电荷的正电荷的聚合物作为阳离子性的聚合物，将正电荷和负电荷的比率为相同程度的聚合物作为中性的聚合物。
嵌段共聚物单元2，例如，能够将具有亲水性聚合物链的聚合物和具有聚氨基酸链的聚合物直接或根据需要进行精制使分子量分布变窄后，通过公知的方法进行偶联而形成。关于通式（I）的嵌段共聚物单元2，例如，通过使用能够赋予R1的引发剂进行阴离子活性聚合形成聚乙二醇链后，在生长末端侧导入氨基，从该氨基末端聚合由β-苄基-L-天冬氨酸、γ-苄基-L-谷氨酸、Nε-Z-L-赖氨酸这样的被保护的氨基酸的N-羧酸酐（NCA）聚合而形成。
载体组合物，例如，能够如下操作而形成。首先，使嵌段共聚物单元、带电脂质和根据需要的中性的脂质溶解或分散在含有有机溶剂的形成溶液中，充分溶解或分散后蒸馏除去该有机溶剂。作为有机溶剂，能够例示丙酮、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、乙腈、四氢呋喃、甲醇。形成溶液能够含有2种以上的有机溶剂，也可以含有少量的水。在所得到的固形物或糊剂中，加入水或含有适当的盐或稳定化剂等的添加物的水溶液，通过搅拌使嵌段共聚物单元和脂质悬浊。通过将其用超声波照射、高压乳化机或挤出机等的方法进行分散、微小化，能够形成载体组合物。
药物4通过与带电脂质3的静电结合而保持在医药组合物1内。这样，带电脂质3和药物4的结合状态为可逆的，不伴随化学结构的变化。药物4不论是通过在载体组合物的形成过程中在形成溶液中添加，还是通过在药物4的溶液中添加载体组合物，都能够被内包在载体组合物中。
作为药物4，可以列举在生理pH（例如，pH7.4）的水性介质中具有多于正电荷的负电荷的阴离子性化合物和在该水性介质中具有多于负电荷的正电荷的阳离子性化合物。化合物优选高分子化合物。
药物4希望为生物体高分子。生物体高分子是指源自生物体的高分子和与其结构类似的高分子，更具体而言，希望选自蛋白质和核酸中的至少一种。蛋白质和核酸的种类和大小没有任何限定。因此，蛋白质包括肽。这样的生物体高分子在其结构的至少一部分中具有亲水性，特别是核酸显示非常强的亲水性。
因此，即使假设形成由具有与生物体高分子相反电荷的带电脂质构成的核酸－脂质复合体，即使将该复合体内包于不具有带电脂质的以往型的聚合物胶束颗粒中，通过具有极性部分的生物体高分子包围带电脂质的周围，该复合体的表面也变得接近于亲水性（至少在聚合物胶束的周围存在的嵌段共聚物的疏水性部分疏水性显著变差），因此利用疏水性相互作用使该复合体容纳于聚合物胶束的颗粒内侧并不容易。
从抑制药物4在血液中等从医药组合物1早期脱离，并且防止药物4在医药组合物1内持续保持过度期间的观点出发，优选将医药组合物1的带电脂质3和药物4的电荷比控制在规定范围。该电荷比，例如，作为药物4使用核酸时，根据［医药组合物中所含有的带电脂质中的阳离子性基团的摩尔浓度］／［核酸中的磷酸基的摩尔浓度］来规定，另外，例如，在使用以蛋白质为代表的具有两性带电性基团的药物4时，根据［医药组合物中所含有的带电脂质中的带电性基团的摩尔浓度］／（［具有与带电脂质的电荷相反电荷的、药物中的带电性基团的摩尔浓度］－［具有与带电脂质的电荷相同电荷的、药物中的带电性基团的摩尔浓度］）来规定。该电荷比优选为0.5以上，更优选为1以上，更加优选为2以上，另外优选为50以下，更优选为20以下，更加优选为10以下。
载体组合物和医药组合物1的平均粒径优选为10nm以上，更优选为30nm以上，另外优选为300nm以下，更优选为200nm以下。
实施例
以下通过实施例更详细地说明本发明。
I.颗粒状医药组合物的制备：
按照下面记载的方法制备颗粒状医药组合物，提供给后述的各种测定。
I－1.颗粒状载体组合物的制备：
I－1－1.颗粒状载体组合物A（使用PEG－PBLG）的制备：
将5g重均分子量（Mw）10000的α-甲氧基-ω-氨基-聚乙二醇（以下，有时表示为“PEG”）（日油株式会社）溶解于50ml二甲亚砜中，加入5.5gγ-苄基-L-谷氨酸（以下，有时表示为“PBLG”）的N-羧酸酐（NCA）（相对于聚乙二醇为42等量），在40℃进行24小时反应。通过将该反应溶液滴加在1L己烷和乙酸乙酯的混合溶剂（体积比1︰1）中，使聚合物析出。通过减压过滤回收聚合物，再使其干燥，得到8.6g的固形物。将其溶解于86ml DMF中，加入432μl乙酸酐，在40℃进行24小时反应。通过将反应溶液滴加在1L己烷和乙酸乙酯的混合溶剂（体积比1︰1）中，使聚合物析出。通过减压过滤回收聚合物，再使其干燥，得到作为中性聚合物的8.1g的聚乙二醇-聚(γ-苄基-L-谷氨酸)-Ac嵌段共聚物（以下，有时表示为“PEG-PBLG”）。在下述表示PEG-PBLG的结构式。从1H-NMR的解析得知PBLG嵌段的聚合度为40。
Figure BDA00001996298700111
在氯仿中以2.5／1／1的重量比混合作为通过以上的方法得到的嵌段共聚物单元的PEG-PBLG（10－40）、作为阳离子性脂质的DOTAP和作为中性脂质的DOPE，在减压下使其干燥固化。在该混合物中加入10mM的HEPES缓冲液（pH7.4），在4℃过夜搅拌后，照射超声波进行颗粒化，再通过0.22μm的过滤器，得到含有PEG-PBLG的脂质胶束（以下，有时表示“颗粒状载体组合物A”）的溶液。
I－1－2.颗粒状载体组合物B（使用PEG-pGlu（Bn））的制备：
通过对PEG-PBLG进行碱处理，使谷氨酸侧链的苄基脱保护，得到聚乙二醇-聚(L-谷氨酸)嵌段共聚物（以下，有时表示为“PEG-pGlu”）。通过对该PEG-pGlu的谷氨酸侧链使用苯甲醇的缩合反应部分地导入苄基（PhCH2），得到作为阴离子性聚合物的聚乙二醇-苄基导入聚(L-谷氨酸)-嵌段共聚物（以下，有时表示为“PEG-pGlu（Bn）”）。从1H－NMR的解析，得知苄基的导入数为每聚合物为35个。在下述表示PEG-pGlu（Bn）的结构式。
Figure BDA00001996298700121
混合1mL由以上方法得到的作为嵌段共聚物单元的PEG-pGlu（Bn）的丙酮溶液（50mg/mL）、0.5mL作为阳离子性的带电脂质的DOTAP的甲醇溶液（40mg/mL）和0.5mL作为中性脂质的DOPE的甲醇溶液（40mg/mL），在减压下使其干燥固化。在该混合物中加入2.5mL100mM的磷酸钠缓冲液（pH7.4），在室温搅拌3小时后，进行超声波处理（130W、1秒脉冲、10分钟），由此进行颗粒化，再通过0.22μm的过滤器（MillexGP，Millipore），得到含有PEG-pGlu（Bn）的脂质胶束（以下，有时表示为“颗粒状载体组合物B”）的溶液。
I－2.使用冻结操作的医药组合物的制备：
I－2－1.使用冻结熔融操作的医药组合物的制备：
使siRNA溶解于10mM的HEPES缓冲液（pH7.4），制备40μM的siRNA溶液。通过将该siRNA溶液与作为嵌段共聚物单元的含有PEG-PBLG的脂质胶束（颗粒状载体组合物A）的溶液、10mM的HEPES缓冲液和50%蔗糖溶液混合，得到作为药物内包在各试验例中记载的siRNA的脂质胶束（以下，有时表示为“颗粒状医药组合物A”）的溶液。此时，颗粒状医药组合物溶液中的siRNA浓度制备为10μM，蔗糖浓度制备为10%。另外，调整混合量比，使得作为阳离子性脂质（DOTAP）的正电荷（阳离子性基）的浓度和siRNA的负电荷（磷酸基）的浓度的比的电荷比（＋／－）为8。
此外，在本说明书记载的实施例中，作为siRNA，使用下面说明的siRNA。这些siRNA能够通过株式会社日本EGT得到。
·siRNA（Luc：使用以海萤荧光素酶基因为靶基因设计得到的、作为正义链的5′－CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT－3′（序列编号1）、作为反义链的5′－UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT－3′（序列编号2），由常规方法形成双链的siRNA。
·siRNA（Plk1）：使用以人Plk1（Polo-like kinase 1，保罗样激酶1）基因为靶基因设计得到的、作为正义链的5′－CCAUUAACGAGCUGCUUAAdTdT－3′（序列编号3）、作为反义链的5′－UUAAGCAGCUCGUUAAUGGdTdT－3′（序列编号4），由常规方法形成双链的siRNA。Plk1基因是细胞分裂的M期中重要的激酶。siRNA（Plk1）在导入细胞内的情况下诱导细胞凋亡。
·F－siRNA（Luc）：在siRNA（Luc）中，使用在序列编号2的反义链的5′末端附有Cy3标记的反义链（5′－Cy3-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT－3′）形成的siRNA。
将得到的siRNA内包脂质胶束（颗粒状医药组合物A）的溶液以未处理的状态、或者进行1次、2次、或3次冻结熔融操作，提供给以下的各种测定。此外，各冻结熔融操作通过在－80℃放置12小时使其冻结后，在室温放置1小时使其熔融而进行。
以下，有时将未处理的颗粒状医药组合物A表示为“参考例1的医药组合物”，将进行了1次冻结熔融的颗粒状医药组合物A表示为“实施例1的医药组合物”，将进行了2次冻结熔融的颗粒状医药组合物A表示为“实施例2的医药组合物”，将进行了3次冻结熔融的颗粒状医药组合物A表示为“实施例3的医药组合物”。另外，有时将这些参考例1和实施例1～3的医药组合物、以及后述的参考例2和实施例4的医药组合物总称，简单表示为“试样”。
此外，参考例1和实施例1～3的各医药组合物均通过带电脂质（DOTAP）将药物（siRNA）通过静电结合保持在颗粒内，另一方面以被吸引在疏水性聚合物链段侧的状态配置，从而处于防止颗粒外周面带有能够吸引带有与带电脂质相反的电荷的带电性物质的电荷的状态。另外，可以认为参考例1和实施例1～3的各医药组合物中，源自聚氨基酸链的疏水性聚合物链段（PBLG）形成α螺旋，带电脂质（DOTAP）分散在该α螺旋的周边。另外，实施例1～3的各医药组合物都处于药物在比疏水性聚合物链段更靠颗粒内侧存在的状态。
I－2－2.使用冻结干燥操作的医药组合物的制备：
在100μM的siRNA水溶液中，添加作为嵌段共聚物单元的含有PEG－pGlu（Bn）的脂质胶束（颗粒状单体组合物B）的溶液和蔗糖，在混合后在4℃静置2小时，由此得到作为药物内包有在各试验例中记载的siRNA的脂质胶束（以下，有时表示为“颗粒状医药组合物B”）的溶液。此时，进行制备，使得颗粒状医药组合物溶液中的siRNA浓度为20μM，蔗糖浓度为10%。另外，调整混合量比，使得作为阳离子性脂质（DOTAP）的正电荷（阳离子性基团）的浓度和siRNA的负电荷（磷酸基）的浓度的的比的电荷比（＋／－）为8。
通过将所得到的siRNA内包脂质胶束（颗粒状医药组合物B）在未处理的状态下、或按照常规方法制作实施了冻结干燥操作的冻存剂，使其在水中再溶解，提供给以下的各种测定。此外，冻结干燥操作使用Trio master II A-04（日精株式会社制）实施。
以下，有时将未处理的颗粒状医药组合物B表示为“参考例2的医药组合物”，将进行了冻结干燥操作的颗粒状医药组合物B表示为“实施例4的医药组合物”。
此外，参考例2和实施例4的各医药组合物均通过带电脂质（DOTAP）通过静电结合将药物（siRNA）保持在颗粒内，另一方面以被吸引在疏水性聚合物链段侧的状态配置，从而处于防止颗粒外周面带有能够吸引带有与带电脂质相反电荷的带电性物质的电荷的状态。另外，可以认为参考例2和实施例4的各医药组合物中，源自聚氨基酸链的疏水性聚合物链段（pGlu（Bn））形成α螺旋，带电脂质（DOTAP）分散在该α螺旋的周边。另外，实施例4的医药组合物处于药物存在于比疏水性聚合物链段更靠颗粒内侧的状态。
II.颗粒状医药组合物的各种测定：
II－1.光散射测定：
作为siRNA使用siRNA（Luc），将按照上述“I.颗粒状医药组合物的制备”的方法、作为嵌段共聚物单元使用PEG-PBLG（中性聚合物）制备的参考例1（未处理）、实施例1（冻结熔融1次）、实施例2（冻结熔融2次）和实施例3（冻结熔融3次）的各医药组合物、以及作为嵌段共聚物单元使用PEG-pGlu（Bn）（阳离子性聚合物）制备的参考例2（未处理）和实施例4（冻结干燥）的各医药组合物作为试样，提供给以下的测定。
以10mM的HEPES缓冲液稀释各试样，以siRNA浓度1μM使用。利用光散射分析装置（Zetasizer Nano ZS，Malvern Instruments）测定各试样中的胶束的粒径、散射强度和Zeta电位的绝对值。
在表1中表示粒径和Zeta电位的测定结果。
若比较作为嵌段共聚物单元使用PEG-PBLG（中性聚合物）的实施例1～3的医药组合物和参考例1的医药组合物，与参考例1（未处理）的医药组合物相比，在实施例1（冻结熔融1次）、实施例2（冻结熔融2次）和实施例3（冻结熔融3次）的各医药组合物中，对于胶束的粒径和散射强度没有发现大的变化，较为稳定，但观察到了Zeta电位增加的现象。这样的Zeta电位的增加，若考虑粒径和散射强度没有产生大的变化的方面，则可以认为并不是因为脂质从胶束解离，而是siRNA向胶束的内部移动，胶束表面的正电荷相对增加的缘故。
[表1]
医药组合物    粒径（nm）  Zeta电位的绝对值（mV）
参考例1（PEG-PBLG，未处理）    116     6.85
实施例1（PEG-PBLG，冻结熔融1次）    120     9.00
实施例2（PEG-PBLG，冻结熔融2次）    122     11.10
实施例3（PEG-PBLG，冻结熔融3次）    122     11.10
参考例2（PEG-pGlu（Bn），未处理）   147     0.445
实施例4（PEG-pGlu（Bn），冻结干燥） 190     0.421
II－2.内包率的测定：
作为siRNA使用siRNA（Luc），将按照上述“I.颗粒状医药组合物的制备”的方法、作为嵌段共聚物单元使用PEG-PBLG（中性聚合物）制备的参考例1（未处理）、实施例1（冻结熔融1次）、实施例2（冻结熔融2次）和实施例3（冻结熔融3次）的各医药组合物、以及使用PEG-pGlu（Bn）（阳离子性聚合物）制备的参考例2（未处理）和实施例4（冻结干燥）的各医药组合物作为试样，提供给以下的测定。
II－2－1.标准曲线的制作：
以10mM的HEPES缓冲液稀释40μM的siRNA溶液，制作1／3的稀释系列各50μL（从40μM到0.68nM的11阶段）。对于得到的稀释系列的各siRNA溶液50μL，以以下的方法测定荧光强度，制作标准曲线。即，在50μL各siRNA溶液中加入750μL 10mM的HEPES缓冲液和200μL 1%TRITONX-100水溶液，充分混合。将得到的混合液之中的100μL移入96孔板（黑色）的孔中。在各孔中加入100μL PicoGreen(注册商标）溶液（以10mM的HEPES缓冲液稀释200倍的溶液）混合，在遮光下、室温放置5分钟后，利用酶标仪测定荧光强度，制作标准曲线。得到的标准曲线中，siRNA浓度从1.48μM到2nM的的范围为线性，因此在该范围进行试样的测定。
II－2－2.试样的测定：
利用10mM的HEPES缓冲液（pH7.4）稀释各试样，使得siRNA浓度为1μM（标准化）后使用。将500μL该溶液超速离心（100,000×g、4℃、1小时）处理，使胶束沉淀，小心地收集50μL上清。对于得到的上清，以上述“II－2－1.标准曲线的制作”中记载的方法测定荧光强度，通过将得到的荧光强度对照上述的标准曲线，算出在来自各试样的上清中存在的作为siRNA浓度标准化的非内包siRNA浓度。根据下式，求出各试样中的胶束的siRNA内包率。
siRNA内包率（%）＝（1－x）×100
x：标准化的非内包siRNA浓度（μM）
II－2－3.结果：
在表2中表示所得到的siRNA内包率的结果。在使用参考例1和2、实施例1～4中的任意一种医药组合物时，超速离心后的上清中几乎没有存在的siRNA，几乎全部siRNA都内包在胶束中。
[表2]
医药组合物  内包率（%）
参考例1（PEG-PBLG，未处理）  99.1
实施例1（PEG-PBLG，冻结熔融1次）  99.5
实施例2（PEG-PBLG，冻结熔融2次）  99.5
实施例3（PEG-PBLG，冻结熔融3次）  99.4
参考例2（PEG-pGlu（Bn），未处理）  96.6
实施例4（PEG-pGlu（Bn），冻结干燥） 98.3
II－3.封入稳定性的评价：
作为siRNA使用siRNA（Luc），将按照上述“I.颗粒状医药组合物的制备”的方法、作为嵌段共聚物单元使用PEG-PBLG（中性聚合物）制备的参考例1（未处理）和实施例3（冻结熔融3次）的各医药组合物、以及使用PEG-pGlu（Bn）（阳离子性聚合物）制备的参考例2（未处理）和实施例4（冻结干燥）的各医药组合物作为试样，提供给以下的测定。
对于各试样，添加作为阴离子性高分子的硫酸葡聚糖，通过与硫酸葡聚糖的取代测定从胶束放出的siRNA的比率（siRNA放出率），评价各试样的封入稳定性。更具体而言，如下进行评价。对各试样加入过剩量（相对于siRNA，以电荷比计为80倍）硫酸葡聚糖后，利用10mM的HEPES缓冲液（pH7.4）进行稀释（标准化），使得siRNA浓度为1μM。将该溶液500μL进行超速离心（100,000×g、4℃、1小时）处理，使胶束沉淀，收集上清50μL。对该上清，以上述“II－2－1.标准曲线的制作”中记载的方法测定荧光强度，通过将得到的荧光强度对照上述“II－2.内包率的测定”的标准曲线，算出存在于来自各试样的上清中的标准化的siRNA浓度，将其作为从各试样的胶束中放出的siRNA量。根据下式，求出siRNA放出率（由与硫酸葡聚糖的取代造成的从胶束中放出的siRNA相对于内包在胶束中的siRNA的比率）。
siRNA放出率（%）＝｛（y－x）／1｝｛y－x｝×100
x：标准化的非内包siRNA浓度（μM），y：从胶束中放出的siRNA量（μM）
在图3中表示结果。若比较作为嵌段共聚物单元使用PEG-PBLG（中性聚合物）的实施例3的医药组合物和参考例1的医药组合物，经过冻结操作得到的实施例3的医药组合物，与没有经过冻结操作的参考例1的医药组合物相比，siRNA放出率减少到约一半。另外，在比较作为嵌段共聚物单元使用PEG-pGlu（Bn）（阳离子性聚合物）的实施例4的医药组合物和参考例2的医药组合物时，经过冻结操作得到的实施例4的医药组合物，与没有经过冻结操作的参考例2的医药组合物相比，siRNA放出率也减少到约30%。
II－4.血液中滞留性评价：
作为siRNA使用F－siRNA（Luc），将按照上述“I.颗粒状医药组合物的制备”的方法、作为嵌段共聚物单元使用PEG－PBLG（中性聚合物）制备的参考例1（未处理）和实施例3（冻结熔融3次）的各医药组合物、以及使用PEG-pGlu（Bn）（阳离子性聚合物）制备的参考例2（未处理）和实施例4（冻结干燥）的各医药组合物作为试样，提供给以下的测定。
在Balb/c小鼠（日本Charles River）的尾静脉投与各试样，在之后的1小时后从下腔静脉采集血液200μl。各样品的给药量调整为F－siRNA相对于小鼠体重的比率为1mg/kg。将收集的血液在4℃、2000×g离心10分钟，从上清得到80μl的血浆。利用酶标仪（POWERSCANHT，大日本制药）测定（激发波长485nm、荧光波长528nm）该血浆的荧光强度，对血液中残存的F－siRNA进行定量，作为血液中残存性的指标。
在图4中表示结果。若比较作为嵌段共聚物单元使用PEG-PBLG（中性聚合物）的实施例3的医药组合物和参考例1的医药组合物，经过冻结操作得到的实施例3的医药组合物在血液中残存的F－siRNA量多，血液中滞留性高。另外，在比较作为嵌段共聚物单元使用PEG-pGlu（Bn）（阳离子性聚合物）的实施例4的医药组合物和参考例2的医药组合物时，经过冻结操作得到的实施例4的医药组合物，在血液中残存的F－siRNA量多，血液中滞留性高。
Figure IDA00001996299300011
Figure IDA00001996299300021

Claims (4)

1.一种颗粒状医药组合物，其特征在于：
含有具有疏水性聚合物链段和亲水性聚合物链段的嵌段共聚物单元、药物、带有与药物的电荷相反的电荷的带电脂质，
所述药物至少含有选自蛋白质和核酸中的生物体高分子，
多个所述嵌段共聚物单元以所述疏水性聚合物链段朝向内侧并且所述亲水性聚合物链段朝向外侧的状态配置为放射状，所述带电脂质以吸引在所述疏水性聚合物链段侧的状态配置，所述药物存在于比所述疏水性聚合物链段更靠颗粒的内侧，由此防止该药物向颗粒外脱落。
2.如权利要求1所述的颗粒状医药组合物，其特征在于：
所述疏水性聚合物链段为源自聚氨基酸链的链段。
3.如权利要求2所述的颗粒状医药组合物，其特征在于：
所述聚氨基酸链的一部分或全部形成为α螺旋。
4.如权利要求3所述的颗粒状医药组合物，其特征在于：
所述带电脂质分散于所述α螺旋的周围。
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