CN101489574A - 内包生理活性多肽或蛋白质的高分子聚合物胶束及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种由内包生理活性多肽或蛋白质的、由亲水性链段和疏水性链段构成的嵌段共聚物所形成的高分子胶束组合物。

Description

内包生理活性多肽或蛋白质的高分子聚合物胶束及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种含有高含量的生理活性多肽或蛋白质的、可向生物体给药的、在生物体中稳定的高分子胶束及其制造方法。
背景技术
由于基因操作技术的进步，用细胞培养法能够使许多生理活性多肽及蛋白质获得稳定提供，应用于疾病治疗及预防。然而，由于这些多肽在生物体内一般非常迅速地受到酶分解、代谢等的作用，因此其半衰期较短，作为药剂进行给药时，经常达不到充分的效果。为解决此问题，迄今为止人们进行了许多高分子修饰及缓释性制剂等的研究。
例如，目前临床使用的高分子修饰技术，可以例举聚乙二醇(PEG)化。在干扰素等方面，在某种程度上可以延长其在生物体内的半衰期、提高效果的持续性。给药次数的减少实际上减轻了患者的负担，但是这些高分子修饰蛋白质，一般由于修饰导致其活性降低，产生难以很好地控制修饰部位及修饰率再现性的问题。
其次，目前微胶囊作为缓释化技术被应用于临床。这一技术是将在生物体内分解的聚乳酸或聚乳酸乙醇酸共聚物作为基料使用，通过将药物密封于微粒子内，可以达到缓释效果。然而，粒子直径一般为微米级，不适合静脉内给药。将这些微胶囊的粒子直径减小到纳米尺寸，又有报告表明由于表面修饰而抑制了静脉内给药后的肝脏及脾脏的细网内皮系的摄取(Adv.Drug Deliv.Rev.17.31-48(1995))。可是由这些方法所得到的粒子直径至少是数百纳米(Int.J.Pharm.149.43-49(1997))，且表面修饰很费工夫，具有难以很好地控制脏器分布的再现性的问题。
使用磷脂质的脂质体，也是目前临床上应用的缓释性技术的例子(Pharm.Tech.Japan 19.99-110(2003))。脂质体的优点是，磷脂质是生物体成分，故而其毒性及抗原性低，通过改变脂质组成，可以密封水溶性药物、脂溶性药物、高分子、蛋白质、核酸等许多生理活性物质。然而，这些脂质体的药物保持率未必足够。即，单位脂质体药剂中可密封的药物量不足，目前期望能开发出效率更好的方法。加之，其在生物体内的稳定性不足，难以进行工业化制造等的问题还没有完全得到解决。
为解决这些问题，作为目前临床上正在研究的缓释性技术，可以列举高分子胶束(Br.J.Cancer 93.678-697(2005)；Br.J.Cancer 92.1240-1246(2005))。高分子胶束可以使用亲水性高分子和疏水性高分子构成的嵌段共聚物制造。由于高分子胶束在水中一般形成以疏水性链段为核心的胶束，所以其相比于脂溶性药物的内包化、可溶化及缓释化，具有优越的性质(日本专利第2777530号公报)。
为使这样的高分子胶束适应于水溶性药物的内包化及缓释化，人们进行了各种研究。例如，在将水溶性的化合物阿霉素封入于高分子胶束的方面，提出了通过使药物化学性地结合于疏水性高分子的侧链上来达到封入的方法(日本专利第2694923号公报)。并且，作为另一种方法，公开了对于具有电荷性性质的药物，例如对于带正电的碱性多肽等，在嵌段共聚物中的疏水性链段的侧链上导入带负电的官能团(日本专利第2690276号公报)；或者通过使具有聚乳酸或聚乳酸乙醇酸等的羰基的生物分解性高分子共存(WO2005/023230)，通过在高分子胶束和多肽二者之间导入静电相互作用，以达到高效率封入的方法。然而，其不能应用于分子量大的水溶性药物，尤其是蛋白质及多肽。上述日本专利第2690276号公报在其实施方式中，尽管给出了了将蛋白质内包于胶束的例子，但是可以认为，其胶束不具有疏水性部分，只以电荷作用形式形成，胶束自身的稳定性弱，实际上其在对生物体内给药的情况下会立即被破坏。
作为内包高分子电解质的胶束的稳定性方法，在由包含亲水性链段及电荷性链段的嵌段共聚物与高分子电解质一起形成的核壳结构的聚离子复合胶束方面，公开了其稳定化方法，即，至少将一个巯基担载在形成核心部的电荷性链段上，该电荷性链段之间通过在它们所担载的巯基所形成的二硫键的架桥稳定作用而实现了稳定化(日本专利特开2001-146556号公报)。但是，在实际应用时，由于静脉内注射给药后的稀释作用及与血清蛋白质之间的相互作用，使得胶束分解，并可预测其与在分子内具有SS键的蛋白质会发生相互作用，这会引起了该蛋白质的失活及胶束的不稳定化，因此该方法不适用于广泛的蛋白质及多肽。
如上所述，为提高通过生理活性多肽及蛋白质的治疗效果，有必要对生理活性多肽及蛋白质进行稳定高效地内包，并使高分子胶束能够在控制速度下游离。目前还未能得到免疫应答轻微、可应用于广泛的生理活性多肽及蛋白质上的方法。
再者，迄今为止提出的如下列举的技术是为了提高生理活性多肽及蛋白质的治疗效果而进行的满足上述要求的尝试，结果并没有全部成功。
(a)日本特表2004-525939号公报，涉及以聚氨基酸的嵌段和聚乙二醇(PEG)之类的聚烯基乙二醇型的亲水聚合物的嵌段作为基料的纳米粒子的胶体悬浮液。由于药物(蛋白质和多肽)的纳米粒子化是基于对药物纳米粒子的吸附，所以在纳米粒子表面存在着蛋白质及多肽。即，可以认为在生物体内，由于消化酶等的攻击，纳米粒子表面的蛋白质等会较快地分解、失活。加之，考虑到由于内包的蛋白质及多肽的等电点，未必形成纳米粒子，因此可以认为游离会以较快速度发生，达不到持续性的效果。
(b)欧洲专利公报EP1084172B1号涉及在胆固醇存在下，使用了棕榈酰聚L-赖氨酸聚乙二醇及棕榈酰聚L-鸟氨酸聚乙二醇的尤其是核酸的输送。该技术所得到的微粒子的粒子直径最小也为数百纳米，在静脉内给药后快速集积于细网内皮系上，所以，难以达到持续性的效果。
(c)日本特开平11-269097号公报涉及一种用具有以生物体内分解性聚合物为疏水性链段的、以聚氨基酸为亲水性链段的嵌段共聚物作为基料的、具有脏器指向性及缓释效果等功能的微粒子。其特征为亲水性链段使用的是具有生物体内分解性的聚氨基酸，但是可以预测到其与聚乙二醇相比，免疫原性高，在静脉内给药后与血清蛋白质的相互作用也会增加。该微粒子的血中滞留性也缩短，不能达到长时间的效果。
(d)美国专利第6090925号公开了一种对于欲进行内包的低分子化合物和多肽的水溶液，添加聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮的醋酸或磷酸等缓冲液，使其与具有接近该缓冲液pH的等电点的血清白蛋白等高分子共存，通过加热-冷却过程而形成微颗粒的方法。由于包含70℃左右的加热过程，可以认为其难以适用于热不稳定的蛋白质等。
发明内容
生理活性多肽及蛋白质不限于碱性，例如干扰素α、G-CSF、胰岛素等，也存在许多等电点为弱酸性至中性的。至今还没有得到可应用于这样广泛的生理活性蛋白质及多肽类的、可稳定高效地内包的、且能够在控制速度下游离的高分子胶束组合物。本发明的目的在于提供满足这样要求的嵌段聚合物组合物及其制造方法。
本发明人鉴于上述现状，进行了锐意研究。通过应用具有由聚乙二醇构成的亲水性链段和由从酸性氨基酸、其疏水性衍生物以及酸性氨基酸与其疏水性衍生物的混合物中选出的聚氨基酸构成的疏水性链段的嵌段共聚物，结果发现了将生理活性多肽及蛋白质高效率地内包于高分子胶束中的方法。进而，考虑到生理活性多肽及蛋白质的等电点，对制备高分子胶束时的pH进行调整，成功实现了更为高效的内包。而且，本发明人等发现此方法不限于酸性或碱性，还可适用于许多生理活性多肽及蛋白质，通过替换所使用的嵌段共聚物，并通过调节其疏水性链段和多肽或蛋白质的疏水性相互作用，能调整药物的内包率以及释放速度，尤其是发现了嵌段共聚物中的疏水性侧链的构造对药物游离速度起到相当大的影响作用，从而完成了本发明。
本发明申请包含以下实施方式。
1.一种内包蛋白质或多肽的、由具有由聚乙二醇构成的亲水性链段和由从酸性氨基酸、其疏水性衍生物以及酸性氨基酸与其疏水性衍生物的混合物组成的群组中选出的聚氨基酸构成的疏水性链段的嵌段共聚物所构成的高分子胶束组合物。
2.根据1所述的组合物，上述酸性氨基酸的疏水性衍生物为酸性氨基酸烷基酯或酸性氨基酸烷基酰胺。
3.根据1所述的组合物，上述酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。
4.根据1所述的组合物，其嵌段共聚物为下式(I)或(II)所记载的组合物
Figure A200780026803D00091
上述各式中R1及R3各自独立，表示氢原子或可被保护的官能团被置换的或者未被置换的低级烷基；R2表示氢原子、饱和或不饱和的C1～C29脂肪族羰基或者芳香族羰基；R4表示羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或者芳香族-低级烷氧基；R5表示-O-或者-NH-；R6表示氢原子、苯基、-(CH2)4-苯基、未置换或者被氨基或羧基置换了的C4～C16烷基、或苄基；R7表示亚甲基，n为10～2500的整数，x为10～300的整数，m为0～300的整数(但是，m存在时，(COCHNH)的单元和(COR7CHNH)的单元是随机存在的；R6可以是在一个嵌段共聚物内的各氨基酸单元中的任意选择，是随机存在的，但R6是氢原子的情况为R6全体的60％以下)，y表示1或2的整数，L1表示从由-NH-、-O-、-O-Z-NH-、-CO-、-CH2-、-O-Z-S-Z-及-OCO-Z-NH-(此处，Z是独立的C1～C6烯基。)组成的群组中选出的连结基，L2表示从-OCO-Z-CO-及-NHCO-Z-CO-(此处，Z为C1～C6烯基)中选出的连结基。
5.根据4所述的组合物，上述嵌段共聚物的聚氨基酸侧链的酯化或酰胺化率为40～100％。
6.根据1～5中任意一项所述的组合物，上述蛋白质或多肽的等电点(pI)为3～11.5。
7.根据1～6中任意一项所述的高分子胶束组合物的制备方法，其包含将上述嵌段共聚物和上述生理活性多肽或蛋白质混合，通过将该混合液的pH调整为与该生理活性蛋白质或多肽的等电点(pI)不同的pH，使该生理活性蛋白质或多肽内包于由该嵌段共聚物构成的胶束的疏水性核中的工序；
此处，该生理活性多肽或蛋白质的pI，该嵌段共聚物的疏水性链段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的等电点(pI’)以及与上述pI不同的pH的关系为
pI>pH>pI’，
所以在该pH下，该嵌段共聚物的疏水性链段带负电，且该生理活性多肽或蛋白质带正电。
8.根据7所述的方法，上述pH与上述水溶性高分子药物的pI相离1以上。
根据本发明，能够将生理活性多肽以及蛋白质之类的高分子量的药物高效地内包于高分子胶束内，而且具有能调节其游离速度的优点。
附图说明
图1表示从各种IgG内包高分子胶束游离出来的IgG的游离率的经时变化。
图2表示各种干扰素α内包高分子胶束在给药于生物体内后的干扰素α的血浆中浓度的经时变化。
图3表示FITC标记溶菌酶内包高分子胶束或FITC标记溶菌酶溶液在静脉内给药于大鼠后的血浆中浓度的经时变化。
图4表示干扰素α内包高分子胶束或干扰素α溶液在静脉内给药于大鼠后的血浆中浓度的经时变化。
图5表示干扰素α内包高分子胶束或干扰素α溶液在静脉内给药于大鼠后的血浆中浓度的经时变化。
图6表示人粒性白细胞集落刺激因子内包高分子胶束或人粒性白细胞集落刺激因子溶液在静脉内给药于大鼠后的血浆中浓度的经时变化。
图7表示人粒性白细胞集落刺激因子内包高分子胶束或人粒性白细胞集落刺激因子溶液在静脉内给药于大鼠后的血浆中浓度的经时变化。
具体实施方式
本发明的一个较佳实施方式为用具有由聚乙二醇构成的亲水性链段和由从酸性氨基酸、其疏水性衍生物以及酸性氨基酸与其疏水性衍生物的混合物组成的群组中选出的聚氨基酸构成的疏水性链段的嵌段共聚物，能高效地将生理活性多肽和蛋白质内包于高分子胶束中。
本发明的其它较佳实施方式为根据欲内包的生理活性多肽及蛋白质的等电点(pI)，通过调整制备高分子时的pH，可以使生理活性多肽及蛋白质更高效地内包于由形成高分子胶束的嵌段共聚物构成的该胶束的疏水性核中。
为使生理活性多肽及蛋白质更高效地内包于聚合物胶束内，最好将高分子胶束制备时的pH调整为与生理活性多肽及蛋白质的pI不同的值。高分子胶束的制备时的pH，只要不使生理活性多肽及蛋白质发生变性，最好相离于该生理活性多肽及蛋白质的pI，具体而言最好相离1以上。并且，为使生理活性多肽及蛋白质更高效地进行内包，在高分子胶束制备时的pH下，最好是嵌段共聚物的疏水性链段、即形成聚合胶束的核的部分和生理活性多肽与蛋白质之间带相反的电荷。例如，在高分子胶束制备时的pH下，当生理活性多肽及蛋白质带正电荷时，嵌段共聚物的疏水性链段最好带负电荷；当生理性多肽及蛋白质带负电荷时，嵌段共聚物的疏水性链段最好带正电荷。在这样的较佳状态下，例如，生理活性多肽及蛋白质的pI、嵌段共聚物的疏水性链段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的等电点(pI’)以及高分子胶束制备时的pH的关系为
pI>pH>pI’
的时候，在该pH条件下，嵌段共聚物的疏水性链段带负电，且该生理活性多肽及蛋白质带正电。再者，酸性氨基酸的天冬氨酸、谷胺酸的等电点分别为2.77和3.22。
根据本发明的一个较佳实施方式，如果能够特定生理活性多肽及蛋白质的pI，就可以适宜地选定符合上述条件的嵌段共聚物的疏水性链段及决定高分子胶束制备时的pH，能够适用于具有广范围的pI的各种生理活性多肽及蛋白质。例如，当欲内包pI为碱性侧的生理活性多肽及蛋白质时，选定疏水性链段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的pI’为相比于该pI的酸性侧的嵌段共聚物，进而适宜地选定在该pI和pI’值之间的pH，通过在该pH下进行胶束形成，从而可高效地进行内包。反之，当欲内包药物的pI在酸性侧的时，选定上述pI’为相比于该pI在更酸性侧或更碱性侧的嵌段共聚物，进而适宜地选定在该pI值和pI’值之间的pH，通过在该pH下进行胶束形成，即可高效地进行内包。本发明的嵌段共聚物的疏水性链段的pH最好在中性区域，例如在pH5～8的范围中具有带负电的官能团。通过利用这样的嵌段共聚物，胶束形成时的pH就可选定中性区的pH，就可以避免在极端的酸性或碱性条件下处理欲内包的生理活性多肽及蛋白质。
在考虑高分子胶束制备时的pH、生理活性多肽及蛋白质的pI以及疏水性链段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的pI’时，生理活性多肽及蛋白质向高分子胶束的内包是通过准备形成高分子胶束的嵌段共聚物和欲内包的生理活性多肽及蛋白质的水性混合物，然后如上所述根据该药物的pI及嵌段共聚物的疏水性链段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的pI’适当地选定该混合物的pH，便能进行该混合物的pH的调整。
在一个较佳的实施方式中，将嵌段共聚物溶解于适当的有机溶剂中，例如，二氯甲烷、氯仿、乙醚、二丁醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯等非水溶性有机溶剂，甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、乙腈、丙酮、四氯呋喃等水溶性有机溶剂或它们的混合溶剂中。任意地，将该溶剂风干，例如在氮气流环境下干固成膜状，此外，必要时可通过减压干固除去有机溶剂。向这样处理后的嵌段共聚物中，添加、混合所要内包的水溶性高分子药物的水溶液。最后慢慢地将混合液的pH调整到所要的pH，在形成高分子胶束的同时将生理活性多肽及蛋白质内包。
高分子胶束的形成，例如，可通过搅拌上述嵌段共聚物和生理活性多肽及蛋白质的混合液进行。高分子胶束的形成最好为施加如超声波那样的能量来进行。在使用超声波时，例如使用BIODISRUPTOR(日本精机)，可以在4档位，冷冻的同时进行。照射时间只要使生理活性多肽及蛋白质不变性，就没有特别限制，通过间歇为1秒、5秒～10分钟、最好5秒～2分钟的照射即可。
另外，在另一个较佳的实施方式中，通过研钵等将干燥状态的嵌段共聚物制成均一的粉体，向该粉体中添加粉末状的生理活性多肽及蛋白质或添加溶解于少量溶液的生理活性多肽及蛋白质后，进行平稳地混合，添加适宜的缓冲液，搅拌2小时到24小时，通过超声波处理即可。
进一步，在其它实施方式中，在最初制备了空胶束后，只通过添加生理活性多肽及蛋白质后进行搅拌或静置，就可以制备成内包生理活性多肽及蛋白质的高分子胶束。具体而言，向嵌段共聚物中添加适宜的缓冲液，如上所述进行超声波处理制备出空胶束，向其中添加溶解于同种缓冲液的生理活性多肽及蛋白质或添加稀释于该缓冲液的生理活性多肽及蛋白质，通过用搅拌器平稳地搅拌或静置即可进行。此时的搅拌时间和静置时间最好为2小时到24小时，温度为4℃到30℃，尤其是最好为4℃。该方法由于无需用超声波处理生理活性多肽及蛋白质即可，从生理活性多肽及蛋白质的稳定性的观点考虑是有利的。任何情况下的适宜的缓冲液，最好都满足上述的pI和pH的关系。
根据本发明的方法，可以高效地内包于聚合胶束中的生理活性多肽及蛋白质没有特别限制，优选为水溶性的，分子量为1,500以上，最好为2,000以上的生理活性多肽及蛋白质。作为生理活性多肽及蛋白质的例子，可以列举干扰素α、β、γ、促红细胞生成素、G-CSF、生长激素、白细胞介素类、肿瘤坏死因子、粒性白细胞·巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、肝细胞增殖因子、TGF-β超家族、EGF、FGF、IGF-I等。并且，只要不损坏其活性，当然就包含列举的上述蛋白质的衍生物，例如一个以上的氨基酸被置换、添加、消除了的衍生物。
生理活性多肽及蛋白质，尤其在基因重组生产的情况下，由于糖链的有无及高阶结构的差异，即使是同种蛋白质，其等电点也不同。因此，考虑到高分子胶束的制备时的pH、生理活性多肽及蛋白质的pI以及疏水性链段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的pI’，在制备高分子胶束的时候，最好根据等电点电泳等求得所要内包的蛋白质等的等电点后，再决定内包时的pH。
为胶束化而使用的生理活性多肽及蛋白质的量没有特别限制，一般而言相对于嵌段共聚物的水溶性高分子药物的重量可使用0.01～50％重量、最好使用0.1～10％重量。
可用于形成本发明的内包药物的聚合物胶束的聚合物是由由聚乙二醇构成的亲水性链段和由从酸性氨基酸、其疏水性衍生物以及酸性氨基酸与其疏水性衍生物的混合物中选出的聚氨基酸构成的疏水性链段所构成的嵌段共聚物。作为一个实施方式，可以列举具有带电荷的官能团的疏水性链段。所谓的“具有带电荷的官能团的疏水性链段”是指，为形成由嵌段共聚物构成的聚合物胶束的核，该链段整体具有必要的疏水性，其疏水性起因于随机存在于其链段内的该疏水性部分，并且在其链段内也存在具有负电荷的区域。
本发明的嵌段共聚物的疏水性链段，通过疏水性相互作用，可以稳固地保持住所要内包的高分子药物，在疏水性链段具有电荷的情况下，通过静电的相互作用也可以保持住高分子药物。另外，本发明人发现了通过嵌段共聚物的疏水性链段中的疏水基的构造，控制被内包的生理活性多肽及蛋白质和嵌段共聚物的疏水性相互作用，可以调节释放速度。并非特别拘泥于理论，如以后的实施方式所实证的那样，向形成胶束的嵌段共聚物的疏水性段中导入的疏水基，在具有烷基那样的线性构造的时侯，相比于具有苄基及苯乙酸那样的平面构造的时候，能够更好地将生理活性多肽及蛋白质保持于胶束核内，因此可使其进行长时间的缓释。换言之，通过调节向嵌段共聚物的疏水性段中导入的疏水基的构造，可以改变生理活性多肽及蛋白质的释放速度。例如，想调快药物的释出速度时，即可提高具有苄基及苯乙酸那样的平面构造的疏水基的导入率；想调慢药物的释出速度时，即可提高具有烷基那样的线性构造的疏水基的导入率。进而，如果希望中间性的释出速度，可以通过改变具有苄基及苯乙酸那样的平面构造的疏水基和具有烷基那样的线性构造的疏水基的导入率的比例，适宜地调节释出速度。
对于本发明有用的嵌段共聚物的具体例中包含如下情况。
虽然并非特别限定，亲水性链段由聚乙二醇(或聚环氧乙烷)构成，可任意含有多糖、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚氨基酸或它们的衍生物来由的链段。此处，多糖可列举出普鲁兰多糖、葡聚糖、果聚糖、半乳聚糖等。
另一方面，作为整体，疏水性链段可列举出酸性氨基酸，特别是聚天冬氨酸及/或其衍生物、聚谷氨酸及/或其衍生物。具体而言，虽然并非限定，可列举出例如聚(天冬氨酸β-苄酯)、聚(天冬氨酸β-苄酯-共-天冬氨酸)、聚(天冬氨酸β-烷酯)、聚(天冬氨酸β-烷酯-共-天冬氨酸)、聚(天冬氨酸β-烯丙酯)、聚(天冬氨酸β-烯丙酯-共-天冬氨酸)、聚(天冬氨酸β-烯丙酯)、聚(天冬氨酸β-芳烷酯-共-天冬氨酸)、聚(天冬氨酸β-芳烷酯)、聚(谷氨酸γ-苄酯)、聚(谷氨酸γ-苄酯-共-谷氨酸)、聚(谷氨酸γ-烷酯)、聚(谷氨酸γ-烷酯-共-谷氨酸)、聚(谷氨酸γ-芳烷酯)、聚(谷氨酸γ-芳烷酯-共-谷氨酸)、聚(天冬酰胺β-烷酯-共-天冬氨酸)、聚(谷酰胺γ-芳烷酯-共-谷氨酸)等聚(酸性氨基酸衍生物)。
疏水性链段具有疏水性侧链，因此具有疏水性。相关的疏水性侧链的例子有苄基、苯基、烷基，可列举出例如未置换或被氨基或羧基置换的C4～C16烷基、-(CH2)4-苯基以及它们的任意组合。如上述，由于通过调节聚(氨基酸衍生物)链段中导入的疏水性侧链的构造能够调节内包药物的游离速度，因此在需要较高的游离速度时，疏水性侧链最好选择苯基或苄基；而当需要较慢的游离速度时，疏水性侧链最好选择烷基，例如C4～C16烷基。
这样的聚(氨基酸衍生物)链段是可以由其自身公知的聚乙二醇-共-聚天冬氨酸苄酯或聚乙二醇-共-聚谷氨酸苄酯制备出来。聚乙二醇-共-聚天冬氨酸苄酯或聚乙二醇-共-聚谷氨酸苄酯的制备以一端被保护、另一端为氨基的聚乙二醇，例如MeO-PEG-CH2CH2CH2-NH2作为起始剂，在脱水后的有机溶剂中，添加N-羧基-L-天冬氨酸β-苄酯(BLA-NCA)或N-羧基-L-谷氨酸γ-苄酯(BLG-NCA)以达到所期望的聚合度(氨基酸单体的数量)，使之反应即可得到。
上述得到的嵌段聚合物的末端在乙酰氯或无水醋酸的作用下进行乙酰化后，通过碱加水分解，除去苄基，得到聚乙二醇-共-聚天冬氨酸或聚乙二醇-共-聚谷氨酸后，在有机溶剂中，添加苄醇以达到所期望的酯化率，在缩合剂，例如N-N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或N-N’-二异丙基碳二亚胺(DIPC)存在下使之反应，由此可以得到具有部分苄酯的嵌段共聚物。
进一步，例如，如果用1-辛醇代替苄醇进行反应时，可以得到聚乙二醇-共-聚天冬氨酸辛酯、聚乙二醇-共-聚谷氨酸辛酯。同样若使用1-十二醇和1-十六醇时，就能够分别得到聚乙二醇-共-聚天冬氨酸十二烷基酯和聚乙二醇-共-聚天冬氨酸十六烷酯。
另外，通过酰胺键导入疏水性侧链时，如上述那样，对聚乙二醇-共-聚天冬氨酸苄酯或聚乙二醇-共-聚谷氨酸苄酯进行乙酰化后，通过碱加水分解而除去苄基后的羧基，使其与具有氨基的疏水性侧链反应，或者使聚乙二醇-共-聚天冬氨酸苄酯与具有一级胺的化合物进行反应，利用氨解作用将酯键变换成酰胺键即可导入。
进一步，为达到最初所期望的酰胺化率，在有机溶剂中，将1-辛胺等添加入聚乙二醇-共-聚天冬氨酸苄酯中，经过一定时间反应之后，通过对未变换的苄酯施加大过剩量的1，8-二氨基辛烷等，就可以制得疏水基末端被氨基置换的疏水性侧链和未被氨基置换的疏水基侧链混合在一起的聚(氨基酸衍生物)链段。酯化或酰胺化的比率为全体氨基酸单体的40％～100％。天冬氨酸、谷氨酸可以是具有任一种光学活性型的天冬氨酸、谷氨酸，或它们的混合物。以上的亲水性链段和疏水性链段是通过其自身公知的键，例如酯键、酰胺键、亚胺基、碳-碳键、醚键而能连接的。
特别是，容易制造的，本发明中能很好地使用的嵌段聚合物可以列举出下式(1)及(2)中所示的物质。
Figure A200780026803D00181
或
Figure A200780026803D00182
上述各式中R1及R3各自独立，表示氢原子或可被保护的官能团被置换的或者未被置换的低级烷基；R2表示氢原子、饱和或不饱和的C1～C29脂肪族羰基或者芳香族羰基；R4表示羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或者芳香族-低级烷氧基；R5表示-O-或者-NH-；R6表示氢原子、苯基、-(CH2)4-苯基、未置换或者被氨基或羧基置换了的C4～C16烷基、或苄基；R7表示亚甲基，n为10～2500的整数，x为成为10～300的整数，m为成为0～300的整数(但是，m存在时，(COCHNH)的单元和(COR7CHNH)的单元是随机存在的；R6可以是在一个嵌段共聚物内的各氨基酸单元中的任意选择，是随机存在的，但R6是氢原子的情况为R6全体的60％以下)，y表示1或2的整数，L1表示由-NH-、-O-、-O-Z-NH-、-CO-、-CH2-、-O-Z-S-Z-及-OCO-Z-NH-(此处，Z是独立的C1～C6烯基。)组成的群组中选出的连结基，L2表示由-OCO-Z-CO-及-NHCO-Z-CO-(此处，Z为C1～C6烯基)中选出的连结基。
可以保护的官能团可列举羟基、缩醛基、缩酮基、醛基、糖残基、马来酰亚胺基、羧基、氨基、巯基、活性酯基等。R1及R3表示可保护的官能团被置换的低级烷基的情况下，亲水性链段可以按照WO96/33233、WO96/32434、WO97/06202中记载的方法。低级烷基是指碳数为例如7个以下，最好是4个以下的直链或分支链，包括例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁级、异丁基等。
如上述那样，胶束形成是可以通过将例如嵌段共聚物和生理活性多肽和蛋白质溶解在适宜的缓冲液中进行搅拌而进行的。空胶束的形成最好是在施加如超声波那样的能量进行的。使用超声波时，可以使用例如BIODISRUPTOR(日本精机)，在4档位，在冷冻下同时进行。照射时间只要不使生理活性多肽及蛋白质发生变性就没有特别限定，可以通过照射间歇为1秒钟、5秒～10分钟之间，最好是5秒～2分钟之间的照射而进行。另外，其它的方法是用研钵等将干燥状态的嵌段共聚物制成均一的粉体，向其中添加粉末状的生理活性多肽及蛋白质或添加溶解于少量溶液中的生理活性多肽和蛋白质之后，进行平稳地混合，添加适宜的缓冲液，在4℃下搅拌2小时～24小时，在冷冻同时进行超声波处理即可。
进一步，作为其他方法，向嵌段聚合物中添加适宜的缓冲液，如前述那样进行超声波处理而制备出空胶束，向其中添加溶解于相同缓冲液的生理活性多肽及蛋白质，或添加稀释于该缓冲液中的生理活性多肽及蛋白质，通过搅拌器进行平稳地搅拌或使其静置即可。此时的搅拌时间和静置时间最好是2小时至5天，温度为4℃至30℃，特别优选4℃。该方法由于无需对生理活性多肽及蛋白质进行超声波处理即可制得，从生理活性多肽及蛋白质的稳定性的观点考虑是有利的。任何情况下，适宜的缓冲液最好是满足前述的pI和pH的关系。
这样，关于制备出的内包生理活性多肽及蛋白质的高分子胶束，其粒子直径只要是能进行生物体给药的尺寸就行，没有特别限定，但是优选10μm，最好是5μm以下。特别是在静脉给药的情况下，优选500nm以下，最好是300nm以下。必要时，将含有内包生理活性多肽及蛋白质的高分子胶束的水溶液经过所期望的孔径的亲水性滤膜进行过滤。
本发明的内包生理活性多肽及蛋白质的高分子胶束在向生物体内给药的情况下，不问其给药途径，可以列举静脉内给药、皮下给药、肌内给药、关节内给药、腹腔内给药、眼内给药等。本发明的一个较佳的实施方式进一步包含将各种糖类及/或各种聚乙二醇(Macrogol)加入除菌过滤前的内包药物的聚合物胶束水溶液(或水溶液)中的工序，由此即可制造。并不是进行限定，可使用的糖类可列举出麦芽糖、海藻糖、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露糖以及糊精等，可使用的聚乙二醇的分子量为约1000～约35000，可列举出例如Macrogol 1000、1540、4000、6000、20000、35000等。
本发明的内包生理活性多肽及蛋白质的高分子胶束制剂，只要不影响到内包的生理活性多肽及蛋白质的稳定性，就能进行冻结干燥。在进行冻结干燥的情况下，使用水或水溶液将干燥制剂重新溶解成或再构成含有内包生理活性多肽及蛋白质的高分子胶束的溶液。
冻结干燥的情况下，可以将糖类加入到冻结干燥前的溶液中至其最终浓度达到0.1～15％(w/v)；或者可以加入聚乙二醇以达到其最终浓度0.5～10％(w/v)。通常，嵌段共聚物和糖类或聚乙二醇的比率为各自重量的1:1～1:10或1:0.5～1:10。
在较佳的实施方式中，亲水性链段的末端上最好具有能与具有靶效应能的分子相结合的官能团。能与具有靶效应能的分子相结合的官能团可以列举出，虽然并非特别限定，羟基、缩醛基、缩酮基、醛基、羧基、马来酰亚胺基、氨基、巯基以及活性酯基等，官能团可以被保护。具有靶效应能的分子可以列举出，虽然并非特殊限定，配基、抗体及其功能片段、蛋白质、多肽等。向官能团结合上具有靶效应能的分子的情况下，可根据该分子的构造进行适宜选择，能以公知的方法进行结合。
以下为比较例、实施例，对本发明进行具体的说明。
以下，例如在嵌段共聚物的PEG链的平均分子量为12,000、聚氨基酸链平均有40个残基、向聚氨基酸侧链导入的苄酯的导入率约为65％的情况下，在嵌段共聚物的后面标记上12-40(65)；同样在辛酯等的导入率约为65％的情况下，标记上12-40(65)。再者，约65％是指62％～68％左右。
实施例
1)内包率的测定
实施例1(内包人IgG的胶束的制备1)
嵌段共聚物使用的是聚乙二醇-共-聚天冬氨酸苄酯(以下称为PEG-PBLA。本聚合物中，未导入苄酯的天冬氨酸残基是，其一般式(1)中的R5是-O-，R6是氢原子。以下相同。另外，以下所有的嵌段共聚物，其一般式(1)的R1为CH3、L1为-O-(CH2)3-NH、R2为COCH3。)。在玻璃样品瓶中精细称取10mg的PEG-PBLA 12-50(65)，加入二氯乙烷进行溶解。将该溶液在氮气流下干固成膜状，进一步在减压下进行1小时左右的干燥。此处，添加62μL的精制人IgG(MP BIOMEDICALS公司)(pI约为8)的20mM磷酸缓冲溶液(pH6，16.5mg/mL)，在4℃下轻轻搅拌同时，缓缓加入1.938mL的20mM磷酸缓冲溶液(pH6)或20mM的TAPS缓冲溶液(pH8)。在4℃下进行彻夜搅拌之后，利用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High Power Unit)，在冷冻下，进行约10秒钟(照射间歇为一秒，输出：低)的超声波照射之后，进行凝胶过滤(西格玛-奥德里奇公司，Sepharose(注册商标)CL-4B：～2Φ×30cm)。根据BCA ProteinAssay(PIERCE公司)确定回收的各馏分(洗脱液：20mM磷酸缓冲液(pH7.4)，流速：1.0mL/min，馏分体积：1mL)中的IgG浓度。内包率由下式求得。
Figure A200780026803D00211
在pH6条件下制备时得到的内包率为94％。另一方面，在pH8条件下制备时得到的内包率为41％。此结果表明，基于蛋白质和PEG-PBLA12-50(65)的静电相互作用，在远离内包蛋白质的等电点的pH条件下进行的胶束制备，相比于在等电点附近的pH条件下进行的制备，能高效地将蛋白质内包。
实施例2(内包人IgG的胶束的制备2)
嵌段共聚物使用的是聚乙二醇-共-聚谷氨酸苄酯(以下称为PEG-PBLG。本聚合物中，未导入苄酯的谷氨酸残基是，其一般式(1)中的R5是-O-，R6是氢原子。以下相同。)。在玻璃样品瓶中精细称取10mg的PEG-PBLG 12-40(65)，加入1mL二氯甲烷溶解。将该溶液在氮气流下干固成膜状，进一步在减压下干固1小时左右。此处，添加62μL的精制人IgG(MP BIOMEDICALS公司)(pI约为8)的磷酸缓冲溶液(pH6，16.5mg/mL)，在4℃下进行轻轻搅拌的同时，加入1.938mL的20mM磷酸缓冲溶液(pH6)或20mM的TAPS缓冲液(pH8)。在4℃下进行彻夜搅拌后，利用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High Power Unit)，在冷冻下进行约10秒钟(照射间歇为一秒，输出：低)的超声波照射之后，进行凝胶过滤(西格玛-奥德里奇公司，Sepharose(注册商标)CL-4B：～2Φ×30cm)。用BCA Protein Assay(PIERCE公司)测定回收的各馏分(洗脱液：20mM磷酸缓冲液(pH7.4)，流速：1.0mL/min，馏分体积：1mL)中的IgG浓度。内包率由下式求得。
Figure A200780026803D00221
在pH6条件下制备时得到的内包率为83％。另一方面，在pH8条件下制备时得到的内包率为63％。此结果表明，基于蛋白质和PEG-PBLG12-40(65)的静电相互作用，在远离内包蛋白质的等电点的pH条件下进行胶束的制备，相比于在等电点附近的pH条件下进行的制备，能高效地将蛋白质内包。
实施例3(内包人IgG的胶束的制备3)
嵌段共聚物使用的是聚乙二醇-共-聚天冬氨酸辛酯(以下称为PEG-POLA。本聚合物中，未导入辛酯的谷氨酸残基是，其一般式(1)中的R5是-O-，R6是氢原子。以下相同。)。在玻璃样品瓶中精细称取10mg的PEG-POLA 12-40(65)，加入1mL二氯甲烷溶解。将该溶液在氮气流下干固成膜状，进一步在减压下干固1小时左右。此处，添加62μL的精制人IgG(MP BIOMEDICALS公司)(pI约为8)的20mM磷酸缓冲溶液(pH6，16.5mg/mL)，在4℃下进行轻轻搅拌的同时，慢慢加入1.938mL的20mM磷酸缓冲溶液(pH6)或20MmTAPS缓冲液(pH约为8)。在4℃下进行彻夜搅拌后，利用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High Power Unit)，在冷冻下进行约10秒钟(照射间歇为一秒，低)的超声波照射之后，进行凝胶过滤(西格玛-奥德里奇公司，Sepharose(注册商标)CL-4B：～2Φ×30cm)。用氨基酸分析(Waters公司，AccQ Tag(商标)法)确定回收的各馏分(洗脱液：20mM磷酸缓冲液(pH7.4)，流速：1.0mL/min，馏分体积：1mL)中的IgG浓度。内包率由下式求得。
Figure A200780026803D00231
在pH6条件下制备时得到的内包率为97％。另一方面，在pH8条件下制备时得到的内包率为24％。此结果表明，基于蛋白质和PEG-POLA12-40(65)的静电相互作用，在远离内包蛋白质的等电点的pH条件下进行的胶束制备，相比于在等电点附近的pH条件下进行的制备，能高效地将蛋白质内包。
比较例1(内包人IgG的胶束的制备4)
在玻璃样品瓶中精细称取10mg的PEG-PBLA 12-50(100)，加入1mL二氯甲烷溶解。将该溶液在氮气流下干固成膜状，进一步在减压下干固1小时左右。此处，添加62μL的精制人IgG(MP BIOMEDICALS公司)(pI约为8)的20mM磷酸缓冲溶液(pH6，16.5mg/mL)，在4℃下进行轻轻搅拌的同时，慢慢加入1.938mL的20mM磷酸缓冲溶液(pH6)或20MmTAPS缓冲液(pH约为8)。在4℃下进行彻夜搅拌后，利用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High Power Unit)，在冷冻下进行约10秒钟(照射间歇为一秒，输出：低)的超声波照射之后，进行凝胶过滤(西格玛-奥德里奇公司，Sepharose(注册商标)CL-4B：～2Φ×30cm)。用BCA Protein Assay(PIERCE公司)确定回收的各馏分(洗脱液：20mM磷酸缓冲液(pH7.4)，流速：1.0mL/min，馏分体积：1mL)中的IgG浓度。内包率由下式求得。
Figure A200780026803D00241
在pH6条件下制备时得到的内包率为22％。另一方面，在pH8条件下制备时得到的内包率为65％。此结果表明，在使用不包含羧基的PEG-PBLA 12-50(100)的时候，即使在远离内包蛋白质的等电点的pH条件下进行胶束的制备，由于没有了静电相互作用的参与，难以高效地将蛋白质进行内包。也表明在等电点附近的pH条件下进行制备，基于疏水性相互作用，可将蛋白质内包。
比较例2(内包人FITC标记IgG的胶束的制备)
嵌段共聚物使用3种，即聚乙二醇-共-聚天冬氨酸(平均残基数约为50残基，非酯化)的嵌段共聚物、PEG-PBLA 12-50(65)或PEG-POLA12-40(65)。在玻璃样品瓶中精细称取20mg的聚合物，加入2mL二氯甲烷溶解。将该溶液在氮气流下干固成膜状，进一步在减压下干固1小时左右。此处，添加100μL的FITC标记人免疫球蛋白(FITC-IgG)的磷酸缓冲溶液(西格玛-奥德里奇公司，20mg/mL)，在4℃下进行轻轻搅拌的同时，慢慢加入1.9mL的20mM磷酸缓冲溶液(pH6)。在4℃下进行彻夜搅拌后，利用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High Power Unit)，在冷冻下进行约10秒钟(照射间歇为1秒，输出：低)的超声波照射之后，进行超离心(30,000rpm，1小时，4℃，贝克曼公司，MLA-130转子)。将作为沉淀回收的胶束部分在20mM磷酸缓冲液(pH6)中悬浮，进行凝胶过滤(西格玛-奥德里奇公司，Sepharose(注册商标)CL-4B：～2Φ×30cm)。使用平板读取器(大日本住友制药，Power Scan(注册商标)HT)(激发波长：485nm±20nm，发射波长：528nm±20nm)测定回收的各馏分(洗脱液：20mM磷酸缓冲液(pH7.4)，流速：1.0mL/min，馏分体积：1mL)中的FITC-IgG浓度。内包率由下式求得。
Figure A200780026803D00251
在使用聚乙二醇-共-聚天冬氨酸(平均残基数约为50残基，非酯化)的嵌段共聚物的情况下，内包率为6％，另一方面，在使用PEG-PBLA12-50(65)或PEG-POLA 12-40(65)的情况下，内包率分别为51％、60％。此结果表明，使用含疏水性的置换基和含电荷性的基共存的、整体上由疏水性链段组成的聚合物的时候，能够高效地将蛋白质内包，在内包过程中除了静电相互作用之外，疏水性相互作用等也参与了内包。另外，与实施例1-3的结果相符的上述结果表明，嵌段共聚物的疏水性链段中的疏水基的构造对内包率的影响不大。
实施例4(内包FITC标记牛血清白蛋白的胶束的制备)
在玻璃样品瓶中精细称取40mg的PEG-PBLA 12-50(65)，加入2mL二氯甲烷溶解。将该溶液在氮气流下干固成膜状，进一步在减压下干固1小时左右。此处，添加200μL的FITC标记牛血清白蛋白(西格玛-奥德里奇公司)(pI约为5)水溶液(20mg/mL)，在4℃下进行轻轻搅拌的同时，慢慢加入3.8mL的50mM柠檬酸缓冲溶液(pH3.5)或20mM磷酸缓冲液(pH6)。在4℃下进行彻夜搅拌后，利用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High Power Unit)，在冷冻下进行约10秒钟(照射间歇为一秒，输出：低)的超声波照射之后，进行超离心(30,000rpm，1小时，4℃，贝克曼公司，MLA-130转子)。使用平板读取器(大日本住友制药，PowerScan(注册商标)HT)(激发波长：485nm±20nm，发射波长：528nm±20nm)确定上清中的FITC标记牛血清白蛋白的浓度(洗脱液：20mM磷酸缓冲液(pH7.4)，流速：1.0mL/min，馏分体积：1mL)中的FITC-IgG浓度。内包率由下式求得。
Figure A200780026803D00261
在pH3.5条件下制备的情况下，内包率为16％，另一方面，在pH6条件下制备的情况下，内包率为7％。此结果表明，基于蛋白质和PEG-PBLA 12-50(65)的静电相互作用，在远离内包蛋白质的等电点的pH条件下进行的胶束制备，相比于在等电点附近的pH条件下进行胶束的制备，能高效地将蛋白质内包。
实施例5(内包牛血红蛋白的胶束的制备)
在玻璃样品瓶中精细称取20mg的PEG-PBLA 12-50(65)，加入2mL二氯甲烷溶解。将该溶液在氮气流下干固成膜状，进一步在减压下干固1小时左右。此处，添加100μL的牛血红蛋白(西格玛-奥德里奇公司)(pI约为7)水溶液(20mg/mL)，在4℃下进行轻轻搅拌的同时，慢慢加入1.9mL的20mM磷酸缓冲液(pH6)或20mM磷酸缓冲液(pH7.4)。在4℃下进行彻夜搅拌后，利用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High PowerUnit)，在冷冻下进行约10秒钟(照射间歇为一秒，输出：低)的超声波照射之后，进行凝胶过滤(西格玛-奥德里奇公司，Sepharose(注册商标)CL-4B：～2Φ×30cm)。使用平板读取器(大日本住友制药，Power Scan(注册商标)HT)测定回收的各馏分(洗脱液：20mM磷酸缓冲液(pH7.4)，流速：1.0mL/min，馏分体积：1mL)中的牛血红蛋白浓度。内包率由下式求得。
Figure A200780026803D00262
在pH6条件下制备的情况下，内包率为19％，另一方面，在pH7.4条件下制备的情况下，内包率为10％。此结果表明，基于蛋白质和PEG-PBLA 12-50(65)的静电相互作用，在相对于内包蛋白质的等电点的酸性条件下进行的胶束制备，相比于在相对于等电点的碱性条件下进行胶束的制备，能高效地将蛋白质内包。
实施例6(内包重组人干扰素-α的胶束的制备)
在玻璃样品瓶中精细称取7.0mg的PEG-PBLA 12-50(65)，加入0.7mL二氯甲烷溶解。将该溶液在氮气流下干固成膜状，进一步在减压下干固1小时左右。此处，向其中添加重组人干扰素-α(pI约为6.0)的PBS溶液(IFN-α，PBL Biomedical Laboratories)(0.2mg/mL 35μL)，接着添加200μL的0.1M的MES缓冲液(pH5.0)。在4℃下缓慢混合使聚合物差不多溶解，接着添加20mM的MES缓冲液(pH5.0)，使全体积量为1.4mL，在4℃下进行彻夜搅拌。搅拌完后，进行超离心(30,000rpm，1小时，4℃，贝克曼公司，MLA-130转子)。使用ELISA试剂盒(PBL BiomedicalLaboratories)测定上清中的IFN-α的浓度。
另一方面，在玻璃样品瓶中精细称取2.6mg的PEG-PBLA 12-50(65)，加入0.26mL二氯甲烷溶解。将该溶液在氮气流下干固成膜状，进一步在减压下干固1小时左右。此处，向其中添加同上的重组人干扰素-α(0.2mg/mL 12.5μL)，接着添加100μL的0.1M的TAPS缓冲液(pH8.0)。在4℃下缓慢混合使聚合物差不多溶解，接着添加400μL的20mM的TAPS缓冲液(Ph8.0)，在4℃下进行彻夜搅拌。搅拌完后，进行超离心(30,000rpm，1小时，4℃，贝克曼公司，MLA-130转子)。使用ELISA试剂盒(PBL Biomedical Laboratories)测定上清中的IFN-α的浓度。从各个试验的测定值，根据下式求出内包率。
Figure A200780026803D00271
在pH5.0条件下制备的情况下，内包率为100％，另一方面，在pH8.0条件下制备的情况下，内包率为3.6％。此结果表明，基于蛋白质和PEG-PBLA 12-50(65)的静电相互作用，在相对于内包蛋白质的等电点的酸性条件下进行的胶束制备，相比于在相对于等电点的碱性条件下进行的制备，能高效地将蛋白质内包。
实施例7(内包木瓜蛋白酶的胶束的制备)
在玻璃样品瓶中精细称取20mg的PEG-PBLA 12-40(65)，加入2mL二氯甲烷溶解。将该溶液在氮气流下干固成膜状，进一步在减压下干固1小时左右。此处，添加100μL的木瓜蛋白酶(西格玛-奥德里奇公司)(pI约为8.8)的水溶液(20mg/mL)，接着添加200μL的0.1M MES缓冲液(pH5.0)。在4℃下轻轻搅拌的同时，慢慢加入1.9mL的20mM磷酸缓冲液(pH6.0)或20mM的TAPS缓冲液(pH8.0)。在4℃下进行彻夜搅拌后，使用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High Power Unit)在冷冻下进行约10秒钟(照射间歇为一秒，输出：低)的超声波照射之后，进行凝胶过滤(西格玛-奥德里奇公司，Sepharose(注册商标)CL-4B：～2Φ×30cm)。用BCA Protein Assay(PIERCE公司)测定回收的各馏分(洗脱液：20mM磷酸缓冲液(pH7.4)，流速：1.0mL/min，馏分体积：1mL)中的木瓜蛋白酶浓度。通过下式求出内包率。
Figure A200780026803D00281
在pH6.0条件下制备的情况下，内包率为27％，另一方面，在pH8.0条件下制备的情况下，内包率为9％。此结果表明，基于蛋白质和PEG-PBLA 12-40(65)的静电相互作用，在远离内包蛋白质的等电点的pH条件下进行的胶束制备，相比于在等电点附近的pH条件下进行的胶束制备，能高效地将蛋白质内包。
2)从胶束中游离的蛋白质的游离率的评价
实施例8(从内包人FITC标记IgG的胶束中游离的游离评价)
嵌段共聚物使用PEG-PBLA 12-50(65)或PEG-POLA 12-40(50)。在玻璃样品瓶中分别精细称取20mg的聚合物，加入2mL二氯甲烷溶解。将该溶液在氮气流下干固成膜状，进一步在减压下干固1小时左右。此处，添加100μL的FITC标记人免疫球蛋白(FITC-IgG)(西格玛-奥德里奇公司，20mg/mL)。轻轻搅拌同时，进一步缓慢加入3.9mL的20mM磷酸缓冲液(pH6.0)。在4℃下进行彻夜搅拌后，使用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High Power Unit)在冷冻下进行约10秒钟(照射间歇为一秒，输出：低)的超声波照射之后，进行超离心分离(30,000rpm，4℃，1小时)而得到胶束。将回收的胶束在20mM磷酸缓冲液中(pH6)悬浮，向牛血清中添加[牛血清终浓度：50％(v/v)]，在37℃下培育。为了评价内包的FITC-IgG的游离，在预先决定的培育时间之后，将1mL样品进行凝胶过滤(西格玛-奥德里奇公司，Sepharose(注册商标)CL-4B：～2Φ×30cm)。使用平板读取器(大日本住友制药，Power Scan(注册商标)HT)(激发波长：485nm±20nm，发射波长：528nm±20nm)测定回收的各馏分(洗脱液：20mM磷酸缓冲液(pH7.4)，流速：1.0mL/min，馏分体积：1mL)中的FITC-IgG的浓度。
Figure A200780026803D00291
(但是，上述缓冲液为20mM磷酸缓冲液(pH6)。)
图1表示游离率的经时变化。该结果表明，内包于胶束的蛋白质即使在血清存在下不会在初期一下释放出来，而是长时间缓慢地释放。也表明游离速度依赖于疏水基的构造。并非特别拘泥于理论，形成胶束的嵌段共聚物的疏水性链段中所导入的疏水基在具有如烷基那样的线形构造的时候，相比于具有如苄基那样的平面构造的时候，能稳固地保持药物，能够达到控制药物释放的状态。
实施例9(干扰素-α的静脉内给药试验)
嵌段共聚物使用PEG-PBLA 12-50(65)或PEG-POLA 12-40(50)。在玻璃样品瓶中精细称取10mg的聚合物，加入1mL二氯甲烷溶解。将该溶液在氮气流下干固成膜状，进一步在减压下干固3小时左右。此处，添加重组人干扰素-α的PBS溶液(IFN-α，PBL Biomedical Laboratories)(0.2mg/mL，46μL)。接着添加200μL的0.2M的MES缓冲液(pH5.0)。在4℃下进行缓缓搅拌，使聚合物差不多溶解，接着添加20mM的MES缓冲液(5.0)，使全体积量达到2mL，在4℃下进行一昼夜搅拌。对样品进行超离心(30,000rpm，1小时，4℃，贝克曼公司，MLA-130转子)，去除未内包的IFN-α，将胶束作为沉淀回收。将该胶束在5％葡萄糖水溶液中悬浮，用于进行以下的动物实验。
将6周龄的Wistar系雄性大鼠按1组2只进行划分，将上述的被试验液以1×106IU/Kg的给药量进行尾静脉给药。在给药后的5分钟、1、3、6、9及24小时后，使用涂抹了肝素的注射器从颈静脉采集约0.2mL血。之后立即进行13800rpm、4℃下的离心分离(EF-1300，ECO-Fuge(商标)，TOMY精工)，将血浆进行回收，在分析之前保存在-30℃下。使用ELISA试剂盒(PBL Biomedical Laboratories)，测定血浆中的浓度。
测定结果如图2所示。通过胶束化提高在血浆中的浓度的滞留性。进一步根据非房室模型计算的药物动态参数如下所示。
Figure A200780026803D00301
通过胶束化，AUC增加了17倍至35倍。该结果表明，内包蛋白质的胶束在血中不会在初期发生爆裂，而是在血中长时间滞留。另外，与在体外的试验结果相同，这也表明生物体内的蛋白质游离速度依赖于疏水基的构造。
实施例10(内包FITC标记溶菌酶的胶束的大鼠静脉内给药试验)
1)溶菌酶的FITC标记
将100mg溶菌酶(来自蛋白)(西格玛-奥德里奇公司)溶解于2mL的100mM硼酸缓冲液(Ph8.5)之后，添加170μL的FITC(PIERCE)的50mg/mL的DMSO溶液。在室温中进行1小时搅拌之后，通过凝胶过滤(GE Healthcare bioscience公司，PD-10)(洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液pH7.4)去除未反应的FITC。进一步，在4℃下在水中进行透析之后，通过再一次凝胶过滤(西格玛-奥德里奇公司，Sepharose(注册商标)CL-4B)(洗脱液：20mM磷酸钠缓冲液pH7.4)进行精制。
2)内包FITC标记溶菌酶的胶束的制备和大鼠PK试验
在玻璃样品瓶中精细称取40mg的嵌段共聚物、PEG-POLA 12-40(65)，添加4mg的FITC标记溶菌酶(29.2mg/mL，137μL)，接着添加500μL的20mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)。在4℃下搅拌一夜后，使用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High Power Unit)在冷冻下进行约10秒钟(照射间歇为1秒，输出：低)的超声波照射。将通过超离心分离(80,000rpm，1小时，4℃，贝克曼公司，MLA-80转子)而作为沉淀回收的胶束部分悬浮在20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)/5％乙二醇中之后，通过同样的超离心操作而洗净，再次在相同的缓冲液中悬浮之后，用于进行以下的大鼠给药试验。
将6周龄的Wistar系雄性大鼠按1组3只进行划分，将上述的被试验液以10mg/Kg的FITC标记溶菌酶的给药量进行尾静脉给药。在给药后的5分钟、1、3、6、9及24小时后，使用涂抹了肝素的注射器从颈静脉采集约0.2mL血。立即进行4℃下的离心分离(EF-1300，ECO-Fuge(商标)，TOMY精工)，将血浆进行回收，在分析之前保存在-30℃下。FITC标记溶菌酶溶液(20mM磷酸钠缓冲pH7.4/5％乙二醇)也进行同样的试验。在以下的HPLC条件下，测定血浆中浓度。
系统：Waters Alliance System
柱：Tosoh TSK-gel Super SW3000(4.6Φ×300mm)(30℃)
移动相：20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)
流速：0.25mL/min
检测：荧光(Ex：492nm，Em：520nm)
注射液体积：10μL
测定结果如图3所示。与溶液给药的情况相比，通过胶束化，AUC增加了约15倍。该结果表明内包在胶束中的蛋白质在血中不会初期爆裂出来，而是在血中长时间滞留。
实施例11(内包干扰素-α的胶束的静脉给药试验2)
嵌段共聚物使用的是聚乙二醇-共-聚天冬氨酸十二烷基酯(以下称为PEG-PDLA。本聚合物中，未导入十二烷基酯的天冬氨酸残基，其一般式(1)中的R5表示-O-；R6表示氢原子。以下相同。)或者聚乙二醇-共-聚天冬氨酸十六烷基酯(以下称为PEG-PHLA。再者，未导入十六烷基酯的天冬氨酸残基，其一般式(1)中的R5表示-O-；R6表示氢原子。以下相同。)在玻璃样品瓶中精细称取200mg的PEG-PDLA 12-40(65)或PEG-PHLA 12-40(65)，加入10mL的20mM的MES缓冲液(pH5.0)，在4℃下激烈搅拌一夜。使用BIODISRUPTOR(日本精机制作所HighPower Unit)在冷冻下对聚合物分散液进行约15分钟(照射间歇为一秒，输出：低)的超声波照射，使聚合物浓度达到20mg/mL，得到空的胶束溶液。向冻存管(家田化学)移入0.65mL空胶束溶液，在此，加入65μL的重组人干扰素-α的PBS溶液(IFN-α，PBL Biomedical Laboratories)和50μL的0.1M的MES缓冲液(pH5.0)，轻轻移液后，在4℃下静置4天。使用超滤管[Millipore Amicon(注册商标)ultra-4(截止分子量：100,000)]在5％葡萄糖溶液中洗净、浓缩，用于进行以下的动物实验。
将6周龄的Wistar系大鼠按1组3只进行划分，将上述的被试验液以1×106IU/Kg的给药量进行尾静脉给药。在给药后的5分钟、1、3、6及24小时后，使用涂抹了肝素的注射器从颈静脉采集约0.2mL血。之后立即进行13,800rpm、4℃下的离心分离(EF-1300，ECO-Fuge(商标)，TOMY精工)，将血浆进行回收，在分析之前保存在-30℃下。使用人干扰素-αELISA试剂盒(PBL Biomedical Laboratories)，测定血浆中的浓度。
干扰素-α内包高分子胶束在生物体给药之后的干扰素-α的血浆中浓度的经时变化如图4所示。通过胶束化，AUC在使用PEG-PDLA 12-40(65)的情况下增加了32倍，在使用PEG-PHLA 12-40(65)的情况下增加了27倍。
实施例12(内包干扰素-α的胶束的静脉给药试验3)
嵌段共聚物使用的是聚乙二醇-共-聚谷氨酸辛酯(以下称为PEG-POLG。本聚合物中，未导入辛酯的谷氨酸残基，其一般式(1)中的R5表示-O-；R6表示氢原子。以下相同。)。在玻璃样品瓶中精细称取150mg的PEG-POLG 12-40(65)，加入5mL的20mM的MES缓冲液(pH5.0)，在4℃激烈搅拌一夜。使用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High Power Unit)在冷冻下对聚合物分散液进行约15分钟(照射间歇为一秒，输出：低)的超声波处理，使聚合物浓度达到30mg/mL，得到空的胶束溶液。向冻存管(家田化学)中移入0.6mL空胶束溶液，在此，加入90μL的重组人干扰素-α溶液(IFN-α，PBL Biomedical Laboratories)和110μL的0.1M的MES缓冲液(pH5.0)，轻轻移液后，在4℃下静置3天。向微管中分注入400μL，加入20mM的MES缓冲液(pH5.0)使达到500μL之后，使用超滤管[Millipore Amicon(注册商标)ultra-4(截止分子量：100,000)]在5％葡萄糖溶液中洗净·浓缩，用于进行以下的动物实验。
将6周龄的Wistar系大鼠按1组2只进行划分，将上述的被试验液以1×106IU/Kg的给药量进行尾静脉给药。在给药后的5分钟、1、3、6及24小时后，使用涂抹了肝素的注射器从颈静脉采集约0.2mL血。之后立即进行13,800rpm、4℃下的离心分离(EF-1300，ECO-Fuge(商标)，TOMY精工)，将血浆进行回收，在分析之前保存在-30℃下。使用人干扰素-αELISA试剂盒(PBL Biomedical Laboratories)，测定血浆中的浓度。
干扰素-α内包高分子胶束在生物体给药之后的干扰素-α的血浆中浓度的经时变化如图5所示。通过胶束化，AUC增加了57倍。
实施例13(内包蜂毒肽的胶束的制备)
嵌段共聚物使用的是PEG-POLA 12-40(65)或PEG-POLG 12-40(65)。在玻璃样品瓶中精细称取150mg的聚合物，加入5mL的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.4)，在4℃激烈搅拌一夜。使用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High Power Unit)在冷冻下对聚合物分散液进行约15分钟(照射间歇为一秒，输出：低)的超声波处理，使聚合物浓度达到30mg/mL，得到空的胶束溶液。加入20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.4)调整为10mg/mL(1mL)，加入碱性多肽的蜂毒肽(西格玛-奥德里奇公司)(1mg)，在4℃下静置一夜后，进行凝胶过滤(GE Healthare bioscience公司，Sepharose(注册商标)CL-4B：～1Φ×30cm)。用BCA Protein Assay(PIERCE公司)测定回收的馏分(洗脱液：20mM磷酸缓冲液(pH7.4)，流速：1.0mL/min，馏分体积：1mL)中的蜂毒肽浓度。通过下式求出内包率。
Figure A200780026803D00341
内包率在使用PEG-POLA 12-40(65)时为71％，在使用PEG-POLG12-40(65)时为48％。此结果表明，能够高效内包分子量约为2,800的多肽。
实施例14(内包人粒性白细胞集落刺激因子的胶束的大鼠静脉内给药试验1)
嵌段共聚物使用的是聚乙二醇-共-聚天冬氨酸辛酰胺(以下称为PEG-PONLA。本聚合物中，50％具有其一般式(1)中的R5为-NH-、R6为辛基的氨基酸残基，另50％具有的R5为-NH-、R6为被氨基酸置换了的辛基的氨基酸残基。以下相同。)。在玻璃样品瓶中精细称取30mg的PEG-PONLA 12-40(50)，加入2mL含有5％葡萄糖的20mM磷酸缓冲溶液(Ph7.4)之后，利用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High Power Unit)，在冷冻下进行约10分钟(照射间歇为一秒，低)的超声波照射，制备得空胶束。此处，加入重组人粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF，Green Cross公司)(pI约为6.0)(300μg/mL，1mL)，在4℃下静置一昼夜。此后，使用超滤管[Millipore Amicon(注册商标)ultra-4(截止分子量：100,000)]去除未内包的G-CSF，制成以下的动物实验用胶束。
将6周龄的Wistar系雄性大鼠按1组3只(溶液时为1组6只)进行划分，将上述的被试验液以100μg/Kg的给药量进行尾静脉给药。在给药后的5分钟、1、3、6及24小时后，使用涂抹了肝素的注射器从颈静脉采集约0.2mL血。之后立即进行13,800rpm、4℃下的离心分离(EF-1300，ECO-Fuge(商标)，TOMY精工)，将血浆进行回收，在分析之前保存在-30℃下。使用BayBio(注册商标)Human G-CSF ELISA kit(RayBiotech inc)，测定血浆中的浓度。
测定结果如图6所示，根据非房室模型计算的药物动态参数如表2所示。通过胶束化，AUC增加了3倍，半衰期延长了2倍。
表2表示将内包人粒性白细胞集落刺激因子的高分子胶束或人粒性白细胞集落刺激因子溶液对大鼠进行静脉内给药时的药物动态参数。
Figure A200780026803D00351
实施例15(内包人粒性白细胞集落刺激因子的胶束的大鼠静脉内给药试验2)
嵌段共聚物使用的是PEG-POLG。在玻璃样品瓶中精细称取30mg的PEG-POLG 12-40(65)，加入2mL的20mM的MES缓冲液(pH5.0)之后，利用BIODISRUPTOR(日本精机制作所High Power Unit)，在冷冻下进行约10分钟(照射间歇为一秒，低)的超声波照射，制备得空胶束。此处，加入重组人G-CSF溶液(Green Cross公司)(300μg/mL，1mL)，在4℃下静置一昼夜。此后，使用超滤管[Millipore Amicon(注册商标)ultra-4(截止分子量：100,000)]去除未内包的G-CSF，在含有5％葡萄糖的20mM磷酸缓冲液(pH7.4)中稀释，制成动物实验用胶束。胶束，与实施例12同样地作为G-CSF，以100μg/mL的给药量对大鼠进行静脉内给药。同样地进行采血，测定血浆中的浓度。
测定结果如图7所示，根据非房室模型计算得到的药物动态参数如表3所示。通过胶束化，AUC增加了15倍，半衰期延长了5倍，即使在给药120小时之后也能检出血浆中浓度。此结果表明，内包蛋白质的胶束即使在血中也不会发生初期爆裂，能长时间滞留在血中。
表3表示将内包人粒性白细胞集落刺激因子的高分子胶束或人粒性白细胞集落刺激因子溶液向大鼠进行静脉内给药时的药物动态参数。
Figure A200780026803D00361
至此为止的本发明的说明是以实例和说明为目的的例示。应当理解在不离开本发明的主旨及范围的条件下可进行种种改变。因此，可以理解本发明请求权利保护的范围是包含了所有这样的改变的。

Claims (8)

1.一种内包蛋白质或多肽的、由具有由聚乙二醇构成的亲水性链段和由从酸性氨基酸、其疏水性衍生物以及酸性氨基酸与其疏水性衍生物的混合物组成的群组中选出的聚氨基酸构成的疏水性链段的嵌段共聚物所构成的高分子胶束组合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，上述酸性氨基酸的疏水性衍生物为酸性氨基酸烷基酯或酸性氨基酸烷基酰胺。
3.根据权利要求1所述的组合物，上述酸性氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。
4.根据权利要求1所述的组合物，嵌段共聚物为下式(I)或(II)所记载的组合物
Figure A200780026803C00021
Figure A200780026803C00022
上述各式中R1及R3各自独立，表示氢原子或可被保护的官能团被置换的或者未被置换的低级烷基；R2表示氢原子、饱和或不饱和的C1～C29脂肪族羰基或者芳香族羰基；R4表示羟基、饱和或不饱和的C1～C30脂肪族氧基或者芳香族-低级烷氧基；R5表示-O-或者-NH-；R6表示氢原子、苯基、-(CH2)4-苯基、未置换或者被氨基或羧基置换了的C4～C16烷基、或苄基；R7表示亚甲基，n为10～2500的整数，x为10～300的整数，m为0～300的整数(但是，m存在时，(COCHNH)的单元和(COR7CHNH)的单元是随机存在的；R6可以是在一个嵌段共聚物内的各氨基酸单元中的任意选择，是随机存在的，但R6是氢原子的情况为R6全体的60％以下)，y表示1或2的整数，L1表示从由-NH-、-O-、-O-Z-NH-、-CO-、-CH2-、-O-Z-S-Z-及-OCO-Z-NH-(此处，Z是独立的C1～C6烯基。)组成的群组中选出的连结基，L2表示从-OCO-Z-CO-及-NHCO-Z-CO-(此处，Z为C1～C6烯基)中选出的连结基。
5.根据权利要求4所述的组合物，上述嵌段共聚物的聚氨基酸侧链的酯化或酰胺化率为40～100％。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的组合物，上述蛋白质或多肽的等电点(pI)为3～11.5。
7.一种权利要求1～6中任意一项所述的高分子胶束组合物的制备方法，其特征在于，包含将上述嵌段共聚物和上述生理活性蛋白质或多肽混合，通过将该混合液的pH调整为与该生理活性蛋白质或多肽的等电点(pI)不同的pH，使该生理活性蛋白质或多肽内包于由该嵌段共聚物构成的胶束的疏水性核中的工序；
此处，该蛋白质或多肽的pI，该嵌段共聚物的疏水性链段中的酸性氨基酸及/或其衍生物的等电点(pI’)以及与上述pI不同的pH的关系为
pI>pH>pI’，
所以在该pH下，该嵌段共聚物的疏水性链段带负电，且该蛋白质或多肽带正电；
或者为pI’>pH>pI，
所以在该pH下，该嵌段共聚物的疏水性链段带正电，且该蛋白质或多肽带负电。
8.根据权利要求7所述的方法，上述pH与上述水溶性高分子药物的pI相离1以上。
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