WO2008010341A1 - Polypeptide physiologiquement actif, micelle de polymère ayant une protéine enfermée dans celle-ci, et procédé d'obtention de la micelle de polymère - Google Patents

Polypeptide physiologiquement actif, micelle de polymère ayant une protéine enfermée dans celle-ci, et procédé d'obtention de la micelle de polymère Download PDF

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protein
block copolymer
polypeptide
hydrophobic
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Miho Ohuchi
Mitsunori Harada
Yuko Amano
Yasuki Kato
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Nanocarrier Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a polymer micelle containing a physiologically active polypeptide or protein in a high content, which can be administered in vivo, and is stable in a clear body, and a method for producing the same.
  • polyethylene glycol PEG
  • PEG polyethylene glycol
  • interferon, etc. the in-vivo half-life is extended and the effect is sustained to some extent.
  • the number of administrations has been reduced to reduce the burden on patients.
  • these polymer-modified proteins generally have reduced activity due to modification, and it is difficult to control the modification site and modification rate with good reproducibility. is there.
  • microcapsules are currently used clinically as a sustained release technology.
  • This technology uses polylactic acid or polylactic acid that degrades in vivo. • This was achieved by encapsulating the drug in fine particles using glycolic acid copolymer as a base.
  • the particle size is generally in the micrometer range and is not suitable for intravenous administration.
  • the particle size of these microcapsules has been reduced to nano-size, and surface modification has prevented the uptake into the reticuloendothelial system such as the liver and spleen after intravenous administration (Adv. Drug) De l iv. Rev. ⁇ , 31-48 (1995)).
  • the particle size obtained by these methods is at least several hundred nanometers (Int. J. Pharm. H9, 43-49 (1997)), and it takes time and effort to modify the surface. There is a problem that it is difficult to control with good reproducibility.
  • Ribosomes using phospholipids are also an example of sustained release technology currently used in clinical practice (Pharm. Tech. Japan 19, 99-1 10 (200 3)).
  • the advantages of ribosomes are that phospholipids are low in toxicity and antigenicity because they are biological components, and many physiologically active substances such as water-soluble drugs, fat-soluble drugs, polymers, proteins, and nucleic acids are encapsulated by changing the lipid composition. This is possible.
  • these ribosomes do not always have sufficient drug retention. In other words, the amount of drug that can be encapsulated in a unit ribosomal drug is not sufficient, and a more efficient method is desired at present.
  • problems such as insufficient in vivo stability and difficulty in industrial production have not yet been fully solved.
  • polymer micelles can be cited as sustained release technologies currently being studied in clinical practice (Br. J. Cancer 93-67 8-697 (2005), Br. J. Cance r 92-1240-1246 (2005)).
  • Polymer micelles can be produced using a block copolymer consisting of a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer.
  • polymeric micelles are lipid-soluble drugs to form micelles with hydrophobic segments as the core in water. It has excellent properties for inclusion and solubilization and sustained release (Japanese Patent No. 2777530).
  • a biodegradable polymer having a carboxy group such as polylactic acid or polylactic acid glycolic acid (W02005 / 023230)
  • W02005 / 023230 a biodegradable polymer having a carboxy group
  • a method for efficiently encapsulating by introducing electrostatic interactions is disclosed.
  • it cannot be applied to water-soluble drugs with large molecular weights, especially proteins and polypeptides.
  • the above-mentioned Japanese Patent No. 2690276 shows an example in which a protein is encapsulated in a micelle in that example.
  • the micelle has no hydrophobic part and is formed only by electric charges, and the stability of the micelle itself is weak. It is considered that when it is actually administered in vivo, it immediately disintegrates.
  • a core-shell polyion complex micelle formed from a block copolymer containing a hydrophilic segment and a charged segment and a polymer electrolyte is formed.
  • a stabilizing method is disclosed in which at least one thiol group is supported on the charged segments to form cross-linking stability of the disulfide bonds via the thiol groups supported between the charged segments.
  • polymeric micelles that can stably and efficiently encapsulate bioactive polypeptides and proteins and are released at a controlled rate are required. At present, there is no immune response that can be applied to a wide range of physiologically active polypeptides and proteins.
  • JP-T-2004-525939 relates to a colloidal suspension of nanoparticles based on a block of polyamino acid and a hydrophilic polymer block of a polyalkylene glycol active such as polyethylene glycol (PEG). .
  • a polyalkylene glycol active such as polyethylene glycol (PEG).
  • the drug (protein or polypeptide) nanoparticle formation is based on the adsorption of the drug to the nanoparticle, the protein or polypeptide exists on the nanoparticle surface. That is, in the living body, it is considered that proteins on the surface of the nanoparticles are relatively quickly decomposed and inactivated by the attack of digestive enzymes and the like.
  • the nanoparticles are not formed in consideration of the isoelectric points of the proteins and polypeptides to be encapsulated, the release is considered to occur relatively quickly, and a sustained effect cannot be expected.
  • European Patent Publication ⁇ 1084 ⁇ 2 ⁇ 1 describes palmitoyl poly L lysine polyethylene glycol and palmi in the presence of cholesterol. In particular, it relates to nucleic acid delivery using Rupoli L-ornitine polyethylene glycol.
  • the particle size of the fine particles obtained by this technology is at least several hundred nanometers and accumulates rapidly in the reticuloendothelial system after intravenous administration, so it is difficult to expect a sustained effect. .
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-269097 discloses organ directivity, sustained release ability, etc. based on a block copolymer having a biodegradable polymer as a hydrophobic segment and a polyamino acid as a hydrophilic segment. It relates to fine particles having the function of It is characterized by the use of biodegradable polyamino acids in the hydrophilic segment, but is more immunogenic than polyethylene glycol and is expected to increase interaction with serum proteins after intravenous administration. Therefore, the retention of the microparticles in the blood is shortened, and an effect over a long time cannot be expected.
  • U.S. Pat.No. 6090925 adds a buffer solution such as acetic acid or phosphoric acid of polyethylene glycol and polyvinylpyrrolidone to an aqueous solution of a low molecular compound or peptide to be encapsulated, and p Disclosed is a method in which a polymer such as serum albumin having an isoelectric point in the vicinity of H coexists and microparticles are formed by heating and cooling processes. Since it includes a heating process of about 70 ° C, it is considered difficult to adapt to heat-labile proteins. Disclosure of the invention
  • Biologically active polypeptides and proteins are not limited to basic ones. For example, interferon, G-CSF, insulin, etc., many isoelectric points are weakly acidic to neutral.
  • a polymeric micelle composition that can be applied to a wide range of physiologically active proteins and peptides, can be stably and efficiently encapsulated, and can be released at a controlled rate has not yet been obtained.
  • the object of the present invention is to provide a block copolymer that satisfies such specifications. It is providing the composition and its manufacturing method.
  • the present inventors have selected from a hydrophilic segment composed of polyethylene glycol, an acidic amino acid, its hydrophobic derivative, and a mixture of an acidic amino acid and its hydrophobic derivative. It was found that bioactive polypeptides and proteins can be efficiently encapsulated in polymer micelles by using a block copolymer having a hydrophobic segment composed of polyamino acids. Furthermore, the pH at the time of preparing high molecular micelles was successfully incorporated by adjusting the pH considering the isoelectric points of bioactive polypeptides and proteins. The present inventors have found that this method can be applied to many physiologically active polypeptides and proteins, whether acidic or basic.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a polymer selected from the group consisting of a hydrophilic segment made of polyethylene glycol encapsulating a bioactive polypeptide or protein, an acidic amino acid, its hydrophobic derivative, and a mixture of an acidic amino acid and its hydrophobic derivative.
  • a polymeric micelle composition comprising a block copolymer having a hydrophobic segment comprising an amino acid.
  • composition according to [1], wherein the hydrophobic derivative of the acidic amino acid is an acidic amino acid alkyl ester or an acidic amino acid alkylamide.
  • composition according to [1] wherein the acidic amino acid is aspartic acid or glutamic acid.
  • block copolymer is represented by the following formula (I) or (II).
  • Ri and R 3 each independently represent a hydrogen atom or a lower alkyl group substituted or unsubstituted by an optionally protected functional group
  • R 2 represents a hydrogen atom, saturated or unsaturated.
  • R 4 represents a hydroxyl group, a saturated or unsaturated C i C ⁇ aliphatic oxy group or an aryl-lower alkyloxy group.
  • R 5 represents —0— or 1 NH—
  • R 6 represents a hydrogen atom, a phenyl group, one (CH 2 ) 4 —phenyl group, an unsubstituted group, or a C substituted with an amino group or a force loxyl group.
  • R 7 represents a methylene group
  • n is an integer of 10 to 2500
  • X is an integer comprised between 10 to 300
  • m is an integer comprised between 0 to 300
  • R 6 is a hydrogen atom
  • 60% of the total R 6 Y represents an integer of 1 or 2, where is one NH—, _ 0—, ten thousand Z—NH—, — CO—, — CH 2 —, — O— Z— S— Z — And 1 OC ⁇ 1 Z— NH— (wherein Z is independently a C 1, to C 6 alkylene group) represents a linking group selected from the group consisting of: L 2 is — OCO— Z— Represents a linking group selected from CO— and
  • composition according to any one of [1] to [5], wherein the protein or polypeptide has an isoelectric point (pi) of 3 to 11, 5.
  • [7] A method for preparing a polymeric micelle composition according to any one of [1] to [6], wherein the block copolymer is mixed with the physiologically active polypeptide and protein, By adjusting the pH of the mixed solution to a pH different from the isoelectric point (pi) of the polypeptide and protein, the physiologically active polypeptide or the hydrophobic core region of the micelle composed of the block copolymer Comprising the step of encapsulating the protein,
  • p I of the physiologically active polypeptide and protein the isoelectric point (p I ') of the acidic amino acid and / or its derivative in the hydrophobic segment of the block copolymer and the p I are different p H is p I> p H> p I '
  • the hydrophobic segment of the block copolymer is negatively charged, and the bioactive polypeptide and protein are positively charged.
  • Figure 1 shows the changes over time in the release rate of IgG from various types of IgG-encapsulating polymer micelles.
  • Fig. 2 shows the time course of plasma concentrations of interferon- ⁇ after in vivo administration of various interferon-encapsulating polymer micelles.
  • Fig. 3 shows FITC-labeled lysozyme-encapsulated polymer micelles or FI ⁇ C-labeled lysozyme solutions. 2 shows the time course of plasma concentration after intravenous administration to the rat.
  • FIG. 4 shows the time course of plasma concentrations after intravenous administration of interferon- ⁇ -encapsulating polymer micelles or interferon- ⁇ solution.
  • FIG. 5 shows the time course of plasma concentration after intravenous administration of interferon-I-encapsulating polymer micelles or interferon-0! Solution.
  • FIG. 6 shows the time course of plasma concentration after intravenous administration of human granulocyte colony-stimulating factor-encapsulating polymer micelles or human granulocyte colony-stimulating factor solution.
  • Figure 7 shows blood after intravenous administration of human granulocyte colony stimulating factor-encapsulating polymer micelles or human granulocyte colony stimulating factor solution to a rat. The time course of the serum concentration is shown.
  • a hydrophilic segment comprising polyethylene glycol
  • a hydrophobic segment comprising a polyamino acid selected from the group consisting of an acidic amino acid, a hydrophobic derivative thereof, and a mixture of an acidic amino acid and a hydrophobic derivative thereof
  • the pH at the time of preparing the polymeric micelle is adjusted according to the isoelectric point (p I) of the physiologically active polypeptide and protein to be encapsulated.
  • p I isoelectric point of the physiologically active polypeptide and protein to be encapsulated.
  • a physiologically active polypeptide or protein can be more efficiently encapsulated in the hydrophobic core region of the micelle composed of block copolymers that form molecular micelles.
  • the pH during the preparation of polymer micelles is preferably different from the p I of the bioactive polypeptide and protein unless the bioactive polypeptide is denatured. It is preferable that they are far apart.
  • the pH of the polymeric micelles when preparing the polymeric segment and the hydrophobic segment of the block copolymer, that is, the part that forms the core of the polymeric micelle is physiologically active.
  • Polypeptides and proteins are preferably oppositely charged.
  • the hydrophobic segment of the block copolymer is preferably negatively charged, and when the bioactive polypeptide protein is negatively charged, the hydrophobicity of the block copolymer
  • the sex segment is preferably positively charged.
  • the pI of a biologically active polypeptide or protein, the isoelectric point (pI ′) of an acidic amino acid and / or its derivative in the hydrophobic segment of a block copolymer, and the polymer micelle The pH at the time of preparation is
  • the hydrophobic segment of the block copolymer is negatively charged, and the physiologically active polypeptide and protein are positively charged.
  • the isoelectric points of aspartic acid and glutamic acid, which are acidic amino acids, are 2.77 and 3.22, respectively.
  • the acidic amino acid in the hydrophobic segment and / or its derivative p I ' is more acidic than the p I.
  • the hydrophobic segment of the block copolymer of the present invention has a functional group having a negative charge in the neutral region, for example, in the range of pH 5-8.
  • polypeptide protein is encapsulated by preparing a block copolymer that forms polymeric micelles and a bioactive polypeptide or protein to be encapsulated and an aqueous mixture, and adjusting the pH of the mixture to the pi and And the pH can be adjusted appropriately based on the p I, of the acidic amino acid and / or its derivative in the hydrophobic segment of the block copolymer.
  • the block copolymer is mixed with a suitable organic solvent such as dichloromethane, black mouth form, jetyl ether, dibutyl ether, ethyl acetate, butyl acetate, and other non-water miscible organic solvents, methanol, ethanol, propyl. It dissolves in water-miscible organic solvents such as alcohol, isopropyl alcohol, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide, acetonitrile, acetone, tetrahydrofuran, or mixed solvents thereof.
  • a suitable organic solvent such as dichloromethane, black mouth form, jetyl ether, dibutyl ether, ethyl acetate, butyl acetate, and other non-water miscible organic solvents, methanol, ethanol, propyl. It dissolves in water-miscible organic solvents such as alcohol, isopropyl alcohol, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide
  • the organic solvent may be removed by air-drying this solution, for example, by drying it into a film under a nitrogen stream atmosphere, and further by drying under reduced pressure if necessary.
  • An aqueous solution of the water-soluble polymer drug to be encapsulated is added to the block copolymer thus treated and mixed. last The pH of this mixture is adjusted to the desired pH slowly, and a polymeric micelle is formed while encapsulating a bioactive polypeptide or protein while forming a polymeric micelle. This can be done by stirring a mixed solution of a polypeptide or protein.
  • the polymer micelle is formed by applying energy such as ultrasonic waves.
  • a Pioday Slab Yuichi (Nippon Seiki) can be used at level 4 while cooling with ice.
  • the irradiation time is not particularly limited as long as the physiologically active polypeptide protein is not denatured, but the irradiation can be performed by irradiation for 1 second intermittently, for 5 seconds to 10 minutes, preferably for 5 seconds to 2 minutes.
  • the dried block copolymer is formed into a uniform powder using a mortar or the like, and then the powdered bioactive polypeptide protein or bioactive polypeptide or protein dissolved in a small amount of solution is used. Gently mix after adding quality, add appropriate buffer, stir for 2-24 hours, and sonicate.
  • a polymeric micelle containing the biologically active polypeptide or protein is prepared simply by adding the biologically active polypeptide or protein and stirring or standing.
  • a suitable buffer solution is added to the block copolymer, and sonication is performed as described above to prepare empty micelles, and then a physiologically active polypeptide or protein dissolved in the same buffer solution, or the buffer. It can also be carried out by adding a biologically active polypeptide or protein diluted with a liquid and gently stirring or standing with a stirrer.
  • the stirring time at this time is preferably 2 hours to 24 hours, and the temperature is 4 ° C to 30 ° C, particularly preferably 4 ° C. It is.
  • a suitable buffer solution preferably satisfies the above-described relationship between p I and pH.
  • bioactive polypeptide protein that can be efficiently encapsulated in the polymer micelle according to the method of the present invention is not particularly limited, but is water-soluble and has a molecular weight of 1,500 or more, preferably 2,000 or more. Peptidya protein is preferred.
  • bioactive polypeptides and proteins include interferon, ⁇ , ⁇ , erythropoietin, G-CSF, growth hormone, interleukins, tumor necrosis factor, granulocytes, macrophage colony stimulating factor, macrophage colony stimulating factor, Examples include hepatocyte growth factor, TGF-j6 superfamily, EGF, FGF, and IGF-1.
  • polymer micelles should be prepared taking into account the pH during preparation of polymer micelles, pI of bioactive polypeptide protein and pI 'of acidic amino acids and / or derivatives in the hydrophobic segment. In this case, it is desirable to determine the pH when encapsulating after obtaining the isoelectric point of protein or the like to be encapsulated by isoelectric focusing or the like.
  • the amount of the physiologically active polypeptide or protein used for micellization is not particularly limited, but in general, the weight of the water-soluble polymer drug relative to the block copolymer is preferably from 0 to 1-50, preferably from 0.1 to 10 layers % Is used.
  • the polymer that can be used to form the drug-encapsulating polymer micelle of the present invention is selected from a hydrophilic segment consisting of polyethylene glycol, an acidic amino acid, a hydrophobic derivative thereof, and a mixture of an acidic amino acid and a hydrophobic derivative thereof.
  • One embodiment includes a hydrophobic segment having a charged functional group. “Hydrophobic segment with a functional group with charge” means that the entire segment has the hydrophobicity necessary to form the core of a polymer micelle consisting of block copolymers. It means a region caused by the hydrophobic portion randomly present in the segment and also having a negatively charged portion in the segment.
  • the hydrophobic segment of the block copolymer according to the present invention can hold a macromolecular drug to be encapsulated by hydrophobic interaction, and if the hydrophobic segment has a charge, the hydrophobic segment has an electrostatic interaction. Therefore, it is possible to hold a polymer drug.
  • the present inventor can control the hydrophobic interaction between the encapsulated bioactive polypeptide or protein and the block copolymer and adjust the release rate by the structure of the hydrophobic group in the hydrophobic segment of the block copolymer. I also found what I could do.
  • the structure of the hydrophobic group introduced into the hydrophobic segment of the block copolymer forming the micelle is benzyl-phenyl.
  • a linear structure such as an alkyl group retains the bioactive polypeptide protein in the micelle core, so it is released gradually over a long period of time. It is thought that.
  • the hydrophobic segment of the block copolymer By controlling the structure of the hydrophobic group introduced into the surfactant, it is possible to change the release rate of the bioactive polypeptide.
  • the alkyl group may be increased.
  • the release rate can be controlled by changing the ratio of the introduction rate of a hydrophobic group having a planar structure such as benzyl phenyl and a hydrophobic group having a linear structure such as an alkyl group. It can be adjusted as appropriate.
  • Specific examples of the block copolymer useful in the present invention include the following.
  • the hydrophilic segment consists of poly (ethylene glycol) [or poly (ethylene oxide)] and is composed of polysaccharide, poly (pinylpyrrolidone), poly (vinyl alcohol), poly (acrylamido). Do)), poly (acrylic acid), poly (methacrylamide), poly (methacrylic acid), poly (methacrylic acid ester), poly (acrylic acid ester), polyamino acid or any segment derived from these derivatives May be included.
  • examples of the polysaccharide include pullulan, dextran, fructan, and galactan.
  • hydrophobic segments include acidic amino acids
  • poly (aspartic acid) and Z or derivatives thereof poly (glutamic acid) and / or derivatives thereof.
  • Specific examples include, but are not limited to, poly-benzilus partate, poly (j6-benzilpartate tocospartic acid), poly (; 6-alkylaspartate), poly (
  • Hydrophobic segments are hydrophobic by having hydrophobic side chains.
  • hydrophobic side chains include benzyl groups, phenyl groups, alkyl groups, eg, C 4 -C 16 alkyl groups that are unsubstituted or substituted with amino groups or force oxyl groups, — (CH 2 ) 4 —Phenyl group and any combination thereof.
  • the structure of the hydrophobic side chain introduced into the poly (amino acid derivative) segment ⁇ ⁇ ⁇ regulates the release rate of the encapsulated drug.
  • the hydrophobic side chain is preferably a phenyl or benzyl group, and if a slow release rate is desired, the hydrophobic side chain is alkyl, eg C 4 -C! A 6- alkyl group is preferred.
  • Such poly (amino acid derivative) segments can be prepared from polyethylene glycol-co-polyaspartate benzyl ester or polyethylene dallicol-co-polydaltamate benzyl ester known per se.
  • BLA-NCA N- Forced Lupoxy-j8-Benzyl-L-aspartate
  • the end of the block copolymer obtained above is acetylated with acetyl chloride or acetic anhydride, and then the benzyl group is removed by alkaline hydrolysis to remove polyethylene glycol-co-polyaspartic acid or polyethylene glycol-co-poly.
  • benzyl alcohol is added in an organic solvent so that the desired esterification rate is obtained, and a condensing agent such as ⁇ --'-dicyclohexylcal positimide (DCC) or ⁇ -N'-di-
  • DI PC I sopropyl carbodiimide
  • polyethylene glycol-co-polyaspartic acid octyl ester and polyethylene glycol-co-polyglutamic acid octyl ester are obtained.
  • 1-dodecanol polyethylene glycol-co-polyaspartic acid dodecyl ester can be obtained
  • 1_hexadenol polyethylene glycol-co-polyaspartic acid hexadecyl ester can be obtained. I can do it.
  • octylamine or the like is added to polyethylene glycol-co-polyaspartic acid benzyl ester in an organic solvent so that a desired amidation rate is obtained, and the mixture is allowed to react for a certain period of time.
  • the hydrophobic side chain substituted with an amino group at the end of the hydrophobic group and the hydrophobic side chain not substituted with an amino group are mixed. It can also be a poly (amino acid derivative) segment.
  • the proportion of esterification or amideization is 40% to 100% with respect to the total number of amino acid units.
  • Aspartic acid and glutamic acid can be of any optically active type or a mixture thereof.
  • the above hydrophilic segment and hydrophobic segment can be linked via a linking group known per se, for example, an ester bond, an amide bond, an imino group, a carbon-carbon bond, an ether bond and the like.
  • R i and R 3 each independently represent a hydrogen atom or an optionally protected lower alkyl group substituted or unsubstituted
  • R 2 represents a hydrogen atom, saturated Or an unsaturated aliphatic carbonyl group or an aryl group
  • R 4 represents a hydroxyl group, a saturated or unsaturated C 3 to C 3 Q aliphatic oxy group, or an aryl lower alkyloxy group
  • R 5 represents an O- or a NH-
  • R 6 is a hydrogen atom, phenyl group, one (CH 2) 4 - phenyl group, an unsubstituted or, C 4 ⁇ substituted by an amino group or force
  • C 16 represents an alkyl group or a benzyl group
  • R 7 represents a methylene group
  • n is an integer from 10 to 2500
  • X is an integer from 10 to 300
  • m is an integer from 0 to 300 (However, if m exists
  • Examples of functional groups that may be protected include a hydroxyl group, an alkyl group, a ketal, an aldehyde, a sugar residue, a maleimide group, a carboxyl group, an amino group, a thiol group, and an active ester.
  • the hydrophilic segment in the case where Rt and R 3 represent a lower alkyl group substituted with a functional group which may be protected can follow, for example, the method described in W096 / 33233, W096 / 32434, WO97 / 06202.
  • the lower alkyl means a linear or branched alkyl group having, for example, 7 or less carbon atoms, preferably 4 or less carbon atoms, and includes, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, and an isobutyl group.
  • Micelle formation can be performed, for example, by dissolving a block copolymer and a physiologically active polypeptide protein in a suitable buffer as described above and stirring.
  • the formation of empty micelles is performed by applying energy such as ultrasonic waves.
  • ultrasonic waves for example, Bioday Slab Yuichi (Nippon Seiki) can be used at level 4 while cooling with ice.
  • Irradiation time is not particularly limited as long as the physiologically active polypeptide or protein is not denatured, but can be performed by intermittent irradiation for 1 second, 5 seconds to 10 minutes, preferably 5 seconds to 2 minutes.
  • the dried block copolymer is made into a uniform powder using a mortar or the like, and the bioactive polypeptide or protein in powder form or the bioactive polypeptide or protein dissolved in a small amount of solution is added thereto. Mix gently later and add appropriate buffer It can also be carried out by stirring at 4 ° C for 2 to 24 hours and sonicating with ice cooling.
  • a buffer solution suitable for the block copolymer is added, sonicated as described above to prepare empty micelles, and bioactive polypeptides and proteins dissolved in the same buffer solution, Alternatively, it can also be carried out by adding a physiologically active polypeptide or protein diluted with the buffer and gently stirring or allowing to stand with a swayer.
  • the stirring time at this time is preferably 2 hours to 5 days, and the temperature is 4 ° C to 30 ° C, particularly preferably 4 ° C.
  • This method is advantageous from the viewpoint of the stability of the physiologically active polypeptide or protein because it does not require ultrasonic treatment of the physiologically active polypeptide or protein.
  • a suitable buffer solution is preferably one that satisfies the relationship between p i and pH described above.
  • the prepared bioactive polypeptide or protein-encapsulating polymer micelle is not particularly limited as long as its particle size can be administered to a living body, but is preferably lO ⁇ m or less, more preferably 5 m or less. preferable. In particular, when used intravenously, it is preferably 500 nm or less, more preferably 300 nm or less. If necessary, an aqueous solution containing a physiologically active polypeptide or protein-encapsulating polymer micelle is filtered through a hydrophilic film having a desired pore size.
  • the administration route is not limited, but intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intraarticular administration, intraperitoneal administration. And intraocular administration.
  • various sugars and / or various polyethylene glycols are used as an aqueous solution of drug-containing polymer micelles (or an aqueous solution) before sterilization filtration.
  • sugars that can be used include, but are not limited to, maltose, trehalose, xylitol, glucose, sucrose, fructose, lactose, mannitol, and dextrin. Is about 1000 to about 3500 0, and examples thereof include Macrogol 1000, 1540, 4000, 6000, 20000, and 35000.
  • bioactive polypeptide or protein-encapsulating polymer micelle preparation can be freeze-dried as long as it does not affect the stability of the encapsulated bioactive polypeptide protein.
  • the dried preparation is redissolved or reconstituted in a solution containing bioactive polypeptide protein-encapsulating polymer micelles using water or an aqueous solution.
  • saccharides When lyophilized, saccharides may be added to the solution prior to lyophilization to a final concentration of 0.1 to 15% (w / V), or polyethylene glycol may be added at a final concentration of 0.5 to It may be added to be 10% (w / V).
  • the ratio of block copolymer to saccharide or polyethylene render is 1: 1 to 1:10 or 1: 0.5 to 1:10 by weight, respectively.
  • the hydrophilic segment may have a functional group capable of binding a molecule having an evening ability at the end of the hydrophilic segment.
  • the functional group capable of binding a molecule having an evening-getting function is not particularly limited, but is a hydroxyl group, acetal group, ketal group, aldehyde group, force hydroxyl group, maleimide group, amino group, thiol group, and active ester. And the like, and the functional group may be protected.
  • the molecule having the ability to get a target is not particularly limited, and examples thereof include a ligand, an antibody or a functional fragment thereof, a protein, and a peptide. Official In the case where a molecule having an evening ability is bound to the functional group, it is appropriately selected depending on the structure of the molecule and can be bound by a known method.
  • the average molecular weight of the PEG chain of the block copolymer is 12,000
  • the average polyamino acid chain is 40 residues
  • the introduction rate of benzyl ester to the polyamino acid side chain is about 65%, 12-40 (65).
  • the introduction rate of octyl ester is about 65%, it is also expressed as 12-40 (65).
  • about 65% means about 62% to 68%.
  • Example 1 (Preparation of micelles containing human IgG 1)
  • the block copolymer includes polyethylene glycol monopolysparagyl benzyl ester (hereinafter referred to as PEG-PBLA.
  • PEG-PBLA polyethylene glycol monopolysparagyl benzyl ester
  • R 5 the aspartic acid residue into which benzyl ester is not introduced
  • R 6 is a hydrogen atom or less similar also, following all of the block copolymer of general formula (I) R, but CH 3, L gar ⁇ ⁇ CH 2 + 3 NH, R 2 Is C 0 CH 3 ).
  • 10 mg of PEG—PBLA 12-50 (65) was precisely weighed, and 1 mL of dichloromethane was added and dissolved.
  • the solution was dried to a film under a nitrogen stream and further dried for about 1 hour under reduced pressure.
  • 62 L of purified human IgG (MP BIOMEDICALS) (pi approx. 8) 20m phosphate buffer solution (pH 6, 16.5mg / mL) was added, and 20mM phosphoric acid was stirred while gently stirring at 4 ° C. 1.938 mL of buffer (pH 6) or 20 mM TAPS buffer (pH 8) was gradually added.
  • the total encapsulation rate of protein in all fractions was 94% when prepared with PH6. On the other hand, it was 41% when prepared at pH 8. This result shows that when the micelles are prepared under pH conditions away from the isoelectric point of the encapsulated protein, the electrostatic charge between the protein and PEG-PBLA 12-50 (65) is greater than when the micelles are prepared near the isoelectric point. It is shown that the protein is efficiently included based on the dynamic interaction.
  • Example 2 (Preparation of micelles containing human IgG 2)
  • the block copolymer includes a polyethylene glycol monoglycol polybenzyl ester (hereinafter referred to as PEG-PBLG.)
  • PEG-PBLG polyethylene glycol monoglycol polybenzyl ester
  • R 5 a glutamic acid residue in which benzyl ester is not introduced
  • R 6 are hydrogen atoms, and so on.
  • PEG-PBLG 12-40 10 mg was precisely weighed, and 1 mL of dichloromethane was added and dissolved. The solution was dried to a film under a nitrogen stream and further dried for about 1 hour under reduced pressure.
  • Purified human IgG MP BIOMEDICALS
  • the IgG concentration in each recovered fraction was determined by BCA Protein Assay (PIE RCE). .
  • the inclusion rate was determined from the following equation.
  • the total entrapment rate of the amount of protein in all fractions was 83% when prepared with PH6. On the other hand, it was 63% when prepared at pH 8. This result shows that when micelles are prepared under pH conditions away from the isoelectric point of the encapsulated protein, the electrostatic charge between the protein and PEG-PBLG 12-40 (65) is greater than when prepared near the isoelectric point. It is shown that the protein is efficiently included based on the dynamic interaction.
  • Example 3 (Preparation of micelles containing human IgG 3)
  • the block copolymer includes polyethylene glycol-copolyaspartic acid octyl ester (hereinafter referred to as PEG-P0LA.
  • PEG-P0LA polyethylene glycol-copolyaspartic acid octyl ester
  • R 5 in the general formula (I).
  • R 6 was a hydrogen atom.
  • 10 mg of PEG-P0LA 12-40 (65) was precisely weighed, and 1 mL of dichloromethane was added and dissolved. The solution was dried to a film under a nitrogen stream and further dried for about 1 hour under reduced pressure.
  • 62 / L of purified human IgG MP BIOMEDICALS
  • the total encapsulation rate of protein in all fractions was 97% when prepared with PH6. On the other hand, it was 24% when prepared at pH 8. This result shows that when preparing micelles under pH conditions away from the isoelectric point of the encapsulated protein, protein and PEG-P0LA 12-40 (65) It is shown that the protein is efficiently included based on the dynamic interaction.
  • the total encapsulation rate of protein in all fractions was 22% when prepared with PH6. On the other hand, it was 65% when prepared with PH8. This result shows that when PEG-PBLA 12-50 (100), which does not have a carboxy group, is used, even if micelles are prepared under pH conditions away from the isoelectric point of the encapsulated protein, the electrostatic interaction is not involved. This indicates that it is difficult to incorporate the protein efficiently.
  • the preparation near the isoelectric point indicates that the protein is encapsulated based on hydrophobic interaction.
  • Block copolymers include polyethylene glycol-polyaspartic acid (average residue number about 50 residues, non-esterified) block copolymer, PEG—PBLA 12—50 (65), or PEG—P0LA 12-40 (65 ) was used. 20 mg of polymer was precisely weighed in a glass vial and dissolved by adding 2 mL of dichloromethane. The solution was dried to a film under a nitrogen stream and further dried for about 1 hour under reduced pressure. Add FITC-labeled human immunoglobulin (FITC-IgG) phosphate buffer solution (Sigma-Aldrich, 20 mg / L), lOO ⁇ L, and gently agitate at 4 ° C.
  • FITC-IgG FITC-labeled human immunoglobulin
  • the total entrapment ratio of the protein amount in all fractions was 6% when polyethylene glycol-polyaspartic acid (average residue number about 50 residues, non-esterified) block copolymer was used. Meanwhile, PEG-PBLA 12-50 (65) or PEG-P0LA 12-40
  • PEG-PBLA 12-50 40 mg was purified in a glass vial and dissolved in 2 mL of dichloromethane. The solution was dried into a film under a nitrogen stream and further dried for about 1 hour under reduced pressure.
  • FITC sign Ushi serum albumin (Sigma Aldrich Co., Ltd.) (pi approx. 5)
  • the encapsulation rate was 16% when prepared at pH 3.5. On the other hand, it was 7% when prepared at pH 6.
  • This result shows that the protein and PEG-PBLA 12-50 (65) have a higher electrostatic capacity when preparing micelles under pH conditions away from the isoelectric point of the encapsulated protein than when preparing micelles near the isoelectric point. It is shown that the protein is efficiently included based on the dynamic interaction.
  • the total encapsulation rate of protein in all fractions was 19% when prepared at PH 6.0. On the other hand, it was 10% when prepared at pH 7.4. This result shows that when micelles are prepared under acidic conditions from the isoelectric point of the encapsulated protein, the electrostatic charge between the protein and PEG-PBLA 12-50 (65) is greater than when prepared under alkaline conditions from the isoelectric point. It is shown that the protein is efficiently included based on the dynamic interaction.
  • PEG-PBLA 12-50 2.6 mg was weighed in a glass trial and dissolved by adding 0.26 mL of dichloromethane. The solution was dried into a film under a nitrogen stream and further dried for about 1 hour under reduced pressure. Then, the same recombinant human interferon PBS solution (0.2 mg / mL 12.5 L) as described above was added, and then 100 L of 0.1 M TAPS buffer (pH 8.0) was added. The polymer was almost dissolved by gently mixing at 4 ° C, and then 400 L of 20 mM TAPS buffer (pH 8.0) was added and stirred at 4 ° C.
  • the total encapsulation rate of protein in all fractions was 27% when prepared at PH 6.0. On the other hand, it was 9% when prepared at PH 8.0.
  • This result shows that the protein and PEG-PBLA 12-40 (65) are more electrostatically prepared when micelles are prepared under pH conditions away from the isoelectric point of the encapsulated protein than when they are prepared near the isoelectric point. Based on the dynamic interaction has shown that the protein can be included efficiently.
  • Example 8 Evaluation of release from human FITC-labeled IgG-encapsulated micelles
  • PEG-PBLA 12-50 (65) or PEG-P0LA 12-40 (50) was used. 20 mg of each polymer was precisely weighed in a vial and dissolved by adding 2 mL of dichloromethane. The solution was dried into a film under a nitrogen stream, and further dried for about 1 hour under reduced pressure.
  • FITC-labeled human immunoglobulin (FITC-IgG) (Sigma-Al) 100 L of Dritz, 20 mg / mL) was added, and further, 9 mL of 20 mM phosphate buffer (pH 6.0) was gradually added while stirring gently.
  • mice After stirring at 4 ° C, use Biodislab Yuichi (Nihon Seiki Seisakusho High Power ⁇ nit) and irradiate with ice for 10 seconds (intermittently 1 second, output: Low). Micelles were obtained by ultracentrifugation (30,000 rpm, 4 ° C, 1 hour). The collected micelles were suspended in 20 mM phosphate buffer (PH6), added to rabbit serum [final rabbit serum concentration: 50% (v / v)], and incubated at 37 ° C.
  • PH6 phosphate buffer
  • a lmL sample was subjected to gel filtration (Sigma Aldrich, Sepharose (registered trademark) CL-4B: ⁇ 2 ⁇ ⁇ 30 cm) after a predetermined incubation time. .
  • the concentration of FIK-IgG in each collected fraction (eluent: 20 mM phosphate buffer (PH7.4), flow rate: 1.0 mL / min, fraction volume: 1 mL) is measured using a plate reader (Dainippon Sumitomo Pharma, Power Scan). (Registered trademark) HT) (excitation wavelength: 485 nm ⁇ 20 niii, emission wavelength: 528 nm ⁇ 20 nm), and the liberation rate was determined from the following equation.
  • the above buffer is a 20 mM phosphate buffer (pH 6).
  • the time course of the release rate is shown in FIG. This result indicates that the protein encapsulated in the micelles is sustainedly released for a long time without initial parsing even in the presence of serum.
  • the release rate depends on the structure of the hydrophobic group.
  • the structure of the hydrophobic group introduced into the hydrophobic segment of the block copolymer forming the micelle is more like an alkyl group than when it has a planar structure such as benzyl. With a more linear structure The release is thought to be achieved in a controlled manner.
  • Example 9 Interferon intravenous administration test
  • PEG-PBLA 12-50 (65) or PEG-P0LA 12-40 (65) was used. 10 mg of polymer was precisely weighed into the pial, and 1 mL of dichloromethane was added and dissolved. The solution was dried into a film under a nitrogen stream and further dried for about 3 hours under reduced pressure. To this, add recombinant human interferon_PBS solution (IFN-a, PBL Biomedical Laboratories) (0.2 ig / iL, 46 U, then add 200 L of 0.2 M MES buffer (pH 5.0).
  • IFN-a human interferon_PBS solution
  • a 6-week-old Wistar male rat was divided into 2 mice per group, and the above test solution was administered from the tail vein to a dose of 1 ⁇ 10 6 ⁇ / kg.
  • a syringe that was parin-coated from the jugular vein.
  • plasma was collected and stored at 30 ° C until analysis. Plasma concentrations were measured using a human interferon-one ELISA kit (PBL Biomedical Laboratories).
  • Vss (mL / body) 81 46 12 Micellarization increased AUC from ⁇ times to 35 times. This result indicates that the protein-encapsulating micelles stay in the blood for a long time without bursting in the initial stage even in the blood. Moreover, the protein release rate in vivo is shown to depend on the structure of the hydrophobic group, similar to the in vitro results.
  • Example 1 0 Rat intravenous administration test of FITC-labeled lysozyme-containing micelles
  • Rhizotium (derived from egg white) (Sigma Aldrich) lOOmg was dissolved in 2 mL of lOOmM borate buffer (pH 8.5), and 170 L of 50 mg / mL DMS0 solution of FITC (PIERCE) was added. After stirring for 1 hour at room temperature, unreacted FITC was removed by gel filtration (GE Healthcare Bioscience, PD-10) (eluent: 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4). After further dialysis against water at 4 ° C, purification was once again performed by gel filtration (Sigma-Aldrich. Chi Sepharose (registered trademark) CL-1B) (eluent: 20 mM sodium phosphate buffer PH7.4). did. 2) Preparation of FITC-labeled lysozyme-containing micelles and rat PK test
  • the micelle fraction recovered as a precipitate by ultracentrifugation 80, OOOrpiiu for 1 hour, 4 ° C, Beckman, MLA-80 rotor
  • 20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 Z 5% dalcose. After suspending, it was washed by the same ultracentrifugation operation, suspended again in the same buffer, and used for the following rat administration test.
  • a 6-week-old Wistar male rat was divided into 3 mice per group, and the above test solution was administered from the tail vein to a dose of 10 mg / kg FITC-labeled lysozyme.
  • Approximately 0.2 niL of blood was collected from the jugular vein-coated syringe 5 minutes, 1, 3, 6, 9 and 24 hours after administration.
  • centrifugation was performed at 4 ° C (EF-1300, ECO-Fuge TM Tomi Seige), and plasma was collected and stored together until analysis.
  • a FITC-labeled lysotium solution (20 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 Z5% glucose) was also tested in the same manner. Plasma concentration was measured under the following HPLC conditions.
  • System Waters Alliance System
  • the block copolymer includes polyethylene glycol-copolyaspartate dodecyl ester (hereinafter referred to as PEG-PDLA.
  • PEG-PDLA polyethylene glycol-copolyaspartate dodecyl ester
  • This polymer has an aspartate residue into which R 5 in the general formula (I) is not introduced.
  • R 6 is a hydrogen atom, the same shall apply hereinafter
  • PEG-PHLA polyethylene glycol-copolyaspartate hexadecyl ester
  • the residue of aspartate without introduction of xadecyl ester In the general formula, R 5 in the general formula is —O—, and R 6 is a hydrogen atom.
  • micellar solution Transfer 0.65 mL of the empty micellar solution to a microtube (Ieda Chemical), and recombinant-hydrogenase aPBS solution (IFN—, PBL Biomedical Laboratories) 65 L and 0.1 M MES buffer (PH5.0) After adding 50 L and lightly pipetting, left at 4 for 4 days.
  • the ultrafiltration unit [Millipore Amicon (registered trademark) Ultra 1 4 (fractional molecular weight: 100,000)] was washed and concentrated with a 5% glucose solution and used for the following animal experiments.
  • a 6-week-old Wistar rat was divided into 3 mice per group, and the above test solution was administered through the tail vein to a dose of 1 ⁇ 10 6 IUZkg.
  • Plasma concentrations were measured using a human interferon aEL ISA kit (PBL Biomedical Laboratories).
  • FIG. 4 shows the time course of interferon-l plasma concentration after the administration of interferon-a-encapsulating polymer micelles in vivo.
  • AUC increased 32 times when PEG-PDLA12-40 (65) was used and 27 times when PEG-PHLA12-40 (65) was used.
  • Example 1 2 Interferon-internal micelle intravenous administration test 3)
  • the block copolymer includes polyethylene glycol monopolyglycolate octyl ester (hereinafter referred to as PEG-P0LG.) This polymer has a dartamic acid residue having no octyl ester introduced in the general formula (I).
  • R 5 is ⁇ 0—
  • R 6 is a hydrogen atom, and so on.
  • 150 mg of PEG—P0LG12-40 (65) was precisely weighed, 5 mL of 20 mM MES buffer (pH 5.0) was added, and the mixture was vigorously stirred at 4 ° C. overnight.
  • the polymer dispersion is sonicated using a Bio Dislabter (High Power Unit, manufactured by Nippon Seiki Co., Ltd.) for about 15 minutes under ice cooling (intermittently 1 second, output: Low), resulting in a polymer concentration of 30 mg / mL.
  • An empty micelle solution was obtained. Transfer 0.6 mL of the empty micelle solution to a cryovial (Ieda Chemical), and recombine with the recombinant human ferro-one solution (IFN—, PBL Biomedical Laboratories) 90 L and 0.1 M MES Impulse solution (pH 5.0) 110 L was added, and after light pipetting, the mixture was allowed to stand at 4 ⁇ C for 3 days.
  • Dispense 400 mL into a microtube add 20 mM MES buffer (pH 5.0) to 500 ML, and then add ultrafiltration unit [Millipore Amicon (registered trademark) Ultra 1 4 (fractionated molecular weight: 100 , 000)] with 5% glucose solution and concentrated, and used for the following animal experiments
  • a 6-week-old Wistar rat was divided into 2 mice per group, and the above test solution was administered through the tail vein to a dose of 1 ⁇ 10 6 IUZkg.
  • Approximately 0.2 mL of blood was collected from a jugular vein-heparin-coated syringe 5 minutes, 1, 3, 6 and 24 hours after administration.
  • Immediately after centrifugation at 13,800 rpm at 4 ° C (EF-1300, ECO-Fuge TM, Tommy), plasma was collected and stored at 30 ° C until analysis. Plasma concentrations were measured using a human interferon- ⁇ ELISA kit (PBL Biomedical Laboratories).
  • FIG. 5 shows the time course of interferon- ⁇ plasma concentration after the administration of interferon- ⁇ -encapsulating polymer micelles in vivo. As a result of micellization, AUC increased 57-fold.
  • Example 1 3 Preparation of micelles containing melittin
  • PEG—P0LA 12-40 (65) or PEG—P0 LG 12-40 (65) was used as the block copolymer.
  • 150 mg of the polymer was purified in a glass vial, 5 mL of 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) was added, and the mixture was vigorously stirred at 4 ° C.
  • the polymer dispersion is sonicated using a Biodislabter (Nippon Seiki's High Power Unit) under ice cooling for about 15 minutes (1 second intermittent, output: Low) to achieve a polymer concentration of 30 mgZmL. An empty micelle solution was obtained.
  • the total entrapment rate of protein in all fractions was 71% for PEG-P0LA 12-40 (65) and 48% for PEG-P0LG 12-40 (65). This result shows that a polypeptide with a molecular weight of about 2,800 can be efficiently encapsulated.
  • Example 1 4 Rat intravenous administration test of human granulocyte colony-stimulating factor-containing micelle 1
  • the block copolymer includes polyethylene glycol monocopolyas octylamide (hereinafter referred to as PEG—P0NLA.
  • PEG—P0NLA polyethylene glycol monocopolyas octylamide
  • This polymer is an amino acid in which R 5 in the general formula (I) is —NH— and R 6 is an octyl group. 50% of amino acid residues having 50% residues, R 5 is —NH—, and R 6 is an octyl group substituted with an amino group (the same shall apply hereinafter).
  • PEG—P0NLA12—40 50 is purified in a glass vial, 2 mL of 20 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 5% glucose is added, and Aioday slabter (Nihon Seiki Seisakusho High Using the Power Unit), sonication was performed for 10 minutes (intermittent 1 second, output: Low) under ice cooling to prepare empty micelles.
  • Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF, Green Cross) (pi approx. 6.0) (300 g / mL, l mL) was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for a whole day and night. Then, by using an ultrafiltration unit [Millipore Amicon (registered trademark) Ultra-4 (fractional molecular weight: 100,000)], except for the unencapsulated G-CSF, the following micelles for animal experiments were used. .
  • mice per group Six-week-old Wistar male rats were divided into 3 mice per group (6 mice per group), and the above test solution was administered through the tail vein to a dose of 100 ⁇ g / kg. Five minutes after administration, 1, 3, 6, and 24 hours later, approximately 0.2 mL of blood was collected from the jugular vein with a heparin-coated syringe. Immediately, the mixture was centrifuged at 13,800 rpm at 4 (EF-1300, ECO-Fuge (trademark), Tomomi Sei), and plasma was collected and stored at -30 ° C until analysis. Plasma concentration was measured using RayBio (registered trademark) Human G-CSF ELISA kit (RayBiotech inc).
  • Table 2 shows pharmacokinetic parameters when human granulocyte colony-stimulating factor-encapsulating polymer micelles or human granulocyte colony-stimulating factor solution is administered intravenously. Pharmacokinetics ⁇ PEG-P0NLA
  • Vss (mL / body) 25 13
  • Example 1 5 Rat intravenous administration test of human granulocyte colony-stimulating factor-containing micelle 2
  • PEG-P0LG was used as the block copolymer.
  • Recombinant human G-CSF solution (Green Cross) (300 g ZmL, 1 mL) was added thereto, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for a whole day and night. Then, using an ultrafiltration unit [Millipore Amicon (registered trademark) Ultra 1 4 (fractional molecular weight: 100,000)], except for unencapsulated G-CSF, 5% glucose-containing 20 mM phosphate buffer Diluted with (pH 7.4) to give micelles for animal experiments. The micelles were intravenously administered as G-CSF at a dose of 100 g / mL as in Example 12. Blood was collected in the same manner, and the plasma concentration was measured.
  • Green Cross 300 g ZmL, 1 mL
  • Ultra 1 4 fractional molecular weight: 100,000
  • micellization AUC increased 15-fold, half-life was extended 5-fold, and plasma concentration could be detected even 120 hours after administration. This result shows that the protein-encapsulated micelles stay in the blood for a long time without initial burst even in the blood.
  • Table 3 shows the pharmacokinetic parameters when human granulocyte colony-stimulating factor-encapsulating polymer micelles or human granulocyte colony-stimulating factor solution is intravenously administered to rats.

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Description

生理活性ポリペプチドまたはタンパク質内包高分子ポリマーミセル およびその製造方法
技術分野
本発明は、 生理活性ポリペプチドまたはタンパク質を高含量で含 有する、 生体投与可能で、 生明体中において安定な、 高分子ミセルお よびその製造方法に関する。
田
書
背景技術
遺伝子操作技術の進歩により多くの生理活性ポリペプチド及び夕 ンパク質が細胞培養法で安定に供給できるようになり、 疾病の治療 や予防へと活用されつつある。 しかし、 これらポリペプチドは、 一 般に生体内で酵素分解、 代謝等を非常に速やかに受けるため半減期 が短く、 薬剤として投与した場合、 十分な効果が得られないことが 多い。 この問題を解決するため今日まで、 高分子による修飾ゃ徐放 性製剤等、 数多くの研究が成されてきた。
例えば、 現在臨床で使われている高分子修飾技術として、 ポリエ チレングリコール ( PEG) 化が挙げられる。 インターフェロン等に おいて、 生体内の半減期を延長し、 効果の持続化をある程度達成で きている。 実際、 投与回数を減らし患者の負担を軽減しているが、 これら高分子修飾タンパク質は、 一般に修飾により活性が低下し、 修飾部位及び修飾率を再現性よくコントロールするのが難しいとい う問題点がある。
次に、 徐放化技術としては、 マイクロカプセルが現在臨床で使わ れている。 この技術は、 生体内で分解するポリ乳酸またはポリ乳酸 • グリコール酸共重合体を基剤に用いて薬物を微粒子内に封入する ことにより、 達成できたものである。 しかし、 粒子径は一般にマイ クロメートルの領域であり、 静脈内投与には適さない。 これらマイ クロカプセルの粒子径をナノサイズにまで小さく し、 また、 表面修 飾により、 静脈内投与後の肝臓や脾臓等の細網内皮系への取り込み を抑制したという報告もある （Adv. Drug De l iv. Rev. ϋ, 31-48 ( 1995) ) 。 しかしながら、 これらの方法で得られる粒子径は小さ く とも数百ナノメートルであり （I n t . J. Pharm. H9, 43-49 ( 19 97) ) 、 また表面修飾に手間がかかる上、 臓器分布を再現性よくコ ントロールすることも難しいという問題点がある。
リ ン脂質を用いるリボソームも、 現在臨床で使われている徐放化 技術の例として挙げられる （Pharm. Tech. J apan 19, 99- 1 10 (200 3) ) 。 リボソームの利点は、 リン脂質が生体成分のため毒性や抗原 性が低いこと、 脂質組成を変えることにより、 水溶性薬物、 脂溶性 薬物、 高分子、 タンパク質、 核酸等の多くの生理活性物質が封入可 能という点である。 しかしながら、 これらリボソームは薬物の保持 率が必ずしも十分ではない。 即ち、 単位リボソーム薬剤の中に封入 できる薬物量が十分ではなく、 さらに効率のよい方法が望まれてい るのが現状である。 加えて、 生体内での安定性が十分ではない、 ェ 業的な製造が困難である等の問題点は、 未だ十分には解決されてい ない。
これらの問題を解決するため、 現在臨床で検討されつつある徐放 化技術として、 高分子ミセルが挙げられる （B r. J. Cance r 93- 67 8-697 (2005)、 B r. J. Cance r 92- 1240- 1246 ( 2005) ) 。 高分子 ミセルは親水性高分子と疎水性高分子からなるプロックコポリマー を用いて製造することが可能である。 一般に、 水中で疎水性セグメ ントをコアとしたミセルを形成するため、 高分子ミセルは脂溶性薬 物の内包化 · 可溶化及び徐放化に対し、 優れた性質を有する （特許 第 2777530号公報） 。
このような高分子ミセルを水溶性薬物の内包化および徐放化に適 応するため、 種々の検討が成されている。 例えば、 水溶性の化合物 であるアドリアマイシンの高分子ミセルへの封入に関しては、 疎水 性高分子の側鎖に薬物を化学的に結合させることによって封入させ る方法が提案されている （特許第 2694923号公報） 。 また、 別法と して、 荷電性の性質を有する薬物、 たとえば正荷電を有する塩基性 のペプチドなどに対しては、 ブロックコポリマー中の疎水性セグメ ントの側鎖に負荷電を有する官能基を導入する （特許第 2690276号 公報） 、 或いはポリ乳酸またはポリ乳酸グリコール酸等のカルポキ シル基を有する生分解性高分子を共存させること （W02005/023230 ) で、 高分子ミセルとペプチド両者の間に静電的な相互作用を導く ことによって効率よく封入する方法が開示されている。 しかしなが ら、 分子量の大きな水溶性薬物、 特にタンパク質やポリペプチドに 応用できるものではない。 上記特許第 2690276号公報はその実施例 においてタンパク質をミセルに内包させる例を示しているが、 ミセ ルは疎水性部分をもたず、 電荷のみで形成されており、 ミセル自体 の安定性が弱く、 実際に生体内に投与した場合、 直ちに崩壊するも のと考えられる。
高分子電解質を内包するミセルの安定化方法として、 親水性セグ メント及び荷電性セグメントとを含むブロックコポリマーと高分子 電解質とから形成されるコア一シェル構造のポリイオンコンプレツ クスミセルに関し、 コア部を形成する荷電性セグメントに少なく と も 1個のチオール基を担持させ、 該荷電性セグメント間でそれらに 担持させたチオール基を介するジスフィ ド結合の架橋安定を形成さ せることによる安定化方法が開示されている （特開 20(H- 146556号 公報） 。 しかし、 実際の使用に際しては、 静脈内注射による投与後 の希釈や血清タンパク質との相互作用によってミセルが解離してし まうことや、 分子内に SS結合を有する夕ンパク質との相互作用が予 測され、 該当タンパク質の失活ゃミセルの不安定化が起こるため、 広範なタンパク質やポリペプチドに適応できるものではない。
上記のように、 生理活性ポリペプチド及びタンパク質による治療 効果を高めるためには、 生理活性ポリペプチド及びタンパク質を安 定に効率よく内包させ、 制御された速度で遊離できる高分子ミセル が必要であり、 免疫応答が軽微で、 広範な生理活性ポリペプチド及 びタンパク質に応用できるものは未だ得られていないのが現状であ る。
また、 これまでに提案された次に挙げる技術は、 生理活性ポリべ プチド及びタンパク質による治療効果を高めるため、 上述の仕様を 満たそうと試みているが全てに成功している訳ではない。
( a) 特表 2004-525939号公報は、 ポリアミノ酸のブロックと、 ポリ エチレングリコール ( PEG) のようなポリアルキレングリコール夕 イブの親水ポリマーのブロックをベースとするナノ粒子のコロイ ド 懸濁液に関する。 薬物 （タンパク質やポリペプチド） のナノ粒子化 が、 薬物のナノ粒子への吸着に基づいているため、 ナノ粒子表面に タンパク質やポリペプチドが存在することになる。 すなわち、 生体 内では消化酵素等の攻撃により、 ナノ粒子表面のタンパク質等は比 較的速やかに分解され、 失活すると考えられる。 加えて、 内包させ るタンパク質及びポリペプチドの等電点を考慮してナノ粒子を形成 している訳ではないため、 遊離が比較的速やかに起こると考えられ 、 持続的な効果は期待できない。
( b) 欧州特許公報 ΕΡ 1084 Π2Β 1号は、 コレステロール存在下のもと 、 パルミ トイルポリ Lリジンポリエチレングリコールやパルミ 卜ィ ルポリ Lオル二チンポリエチレングリコールを用いた、 特に核酸の デリバリーに関する。 この技術で得られる微粒子の粒子径は、 小さ く とも数百ナノメートルであり、 静脈内投与後に細網内皮系に速や かに集積してしまうため、 持続的な効果を期待するのは難しい。
( c) 特開平 1 1-269097号公報は、 疎水性セグメントとして生体内分 解性ポリマーを、 親水性セグメントとしてポリアミノ酸を有するブ ロックコポリマーを基剤とする、 臓器指向性及び徐放能などの機能 を有する微粒子に関する。 親水性セグメントに生体内分解性のポリ アミノ酸を使用する点が特徴であるが、 ポリエチレングリコールと 比較し、 免疫原性が高く、 静脈内投与後の血清タンパク質との相互 作用も増加することが予想され、 該微粒子の血中滞留性は短縮し、 長時間に亘る効果は期待できない。
( d) 米国特許第 6090925号は、 内包させたい低分子化合物やべプチ ドの水溶液に対し、 ポリエチレングリコールとポリ ビニルピロリ ド ンの酢酸またはリン酸等の緩衝液を添加し、 その緩衝液の p H付近 に等電点を持つ血清アルブミン等の高分子を共存させ、 加熱一冷却 行程によりマイクロパーティクルを形成させる方法を開示する。 70 °C程度の加熱行程が含まれるため、 熱に不安定なタンパク質等には 適応が難しいと考えられる。 発明の開示
生理活性ポリぺプチド及びタンパク質は塩基性に限らず、 例えば 、 インタ一フエロン 、 G— CSF、 インスリン等、 等電点が弱酸性か ら中性のものが多く存在する。 このように広範な生理活性タンパク 質やペプチド類にも応用可能で、 安定に効率よく内包でき、 かつ制 御された速度で遊離できる高分子ミセル組成物は未だ得られていな い。 本発明の目的は、 このような仕様を満たすブロックコポリマー 組成物およびその製造方法を提供することにある。
本発明者らは、 上記現状を鑑み、 鋭意研究を行った結果、 ポリエ チレングリコールからなる親水性セグメントと、 酸性アミノ酸、 そ の疎水性誘導体及び酸性アミノ酸とその疎水性誘導体の混合物から 選択されるポリアミノ酸からなる疎水性セグメントを有するブロッ クコポリマ一を用いることで、 生理活性ポリペプチド及びタンパク 質を効率よく高分子ミセルに内包させることを見出した。 更に、 高 分子ミセルを調製する際の pHを、 生理活性ポリペプチド及び夕ンパ ク質の等電点を考慮し調整することで、 より効率よく内包すること に成功した。 そして、 本発明者らは、 この方法は酸性または塩基性 に関わらず多くの生理活性ポリべプチド及びタンパク質に適応可能 であり、 用いるブロックコポリマーを代えることで、 その疎水性セ グメントとポリペプチドまたはタンパク質の疎水的相互作用も関与 させることにより、 薬物の内包率並びに放出速度を調整できること 、 特に、 ブロックコポリマー中の疎水性側鎖の構造が薬物遊離速度 に大きく関与することを見出し、 本発明を完成するに至った。
本願発明は以下の態様を含む。
[ 1 ] 生理活性ポリペプチドまたはタンパク質が内包された、 ポリ エチレングリコールからなる親水性セグメントと、 酸性アミノ酸、 その疎水性誘導体及び酸性アミノ酸とその疎水性誘導体の混合物よ りなる群から選択されるポリアミノ酸からなる疎水性セグメントを 有するブロックコポリマーからなる高分子ミセル組成物。
[ 2 ] 前記酸性アミノ酸の疎水性誘導体が、 酸性アミノ酸アルキル エステルまたは酸性アミノ酸アルキルアミ ドである、 [ 1 ] 記載の 組成物。
[ 3 ] 前記酸性アミノ酸が、 ァスパラギン酸またはグルタミン酸で ある、 [ 1 ] 記載の組成物。 [4 ] ブロックコポリマーが、 下記式（I)または （II) である [ 1 ] 記載の組成物。
R,—— (OCH2CH2^L,- (COCHNHh—— (C0R7 CHNH 一 R2
( I )
(CH山 c=o
C=0
または
(0CH2 CH2> - L2 (NHCHCO —— (NHCHR7 CO)
I I (ID
(CH2) y C=0
Re 上記各式中 Riおよび R3は、 それぞれ独立して、 水素原子または 保護されていてもよい官能基が置換したもしくは未置換の低級アル キル基を表し、 R2は水素原子、 飽和もしくは不飽和の C ,〜 C 29脂 肪族カルポニル基またはァリール力ルポ二ル基を表し、 R4は水酸 基、 飽和もしくは不飽和の C i C ^脂肪族ォキシ基またはァリー ル—低級アルキルォキシ基を表し、 R5は—0—または一 NH—を 表し、 R6は、 水素原子、 フエニル基、 一 （CH2) 4—フエニル基 、 未置換もしくは、 アミノ基または力ルポキシル基で置換された C 4〜C16アルキル基、 またはベンジル基を表し、 R7はメチレン基を 表し、 nは 10〜2500の整数であり、 Xは 10〜300となる整数であり 、 mは 0〜300となる整数であり （但し、 mが存在する場合、 （C OCHNH)のユニッ トと （C〇R7CHNH) のユニッ トはランダ ムに存在し、 R6は 1つのプロックコポリマー内の各アミノ酸ュニ ッ トにおいて任意に選択可能であり、 ランダムに存在するが、 R6 が水素原子である場合は R6全体の 6 0 %以下である） 、 yは 1又 は 2の整数を表し、 は一 NH—、 _ 0—、 一〇一 Z— NH―、 — C O—、 — C H2—、 — O— Z— S— Z—および一 O C〇一 Z— NH— (ここで、 Zは独立して C ,〜 C6アルキレン基である。 ） か らなる群より選ばれる連結基を表し、 L2が— O C O— Z— C O— および—NH C O— Z - C O— (ここで、 Zは C ,〜 C6アルキレン 基である。 ） から選択される連結基を表す。
[ 5 ] 前記ブロックコポリマーが、 ポリアミノ酸側鎖のエステル化 又はアミ ド化率 40〜 100%である、 [ 4 ] 記載の組成物。
[ 6 ] 前記タンパク質またはポリペプチドの等電点 （ p i ) が 3〜 11, 5である、 [ 1 ] 〜 [ 5 ] のいずれか 1項記載の組成物。
[ 7 ] [ 1 ] 〜 [ 6 ] のいずれかに記載の高分子ミセル組成物の調 製方法であって、 前記プロックコポリマーと前記生理活性ポリぺプ チド及びタンパク質とを混合し、 当該生理活性ポリペプチド及び夕 ンパク質の等電点 （ p i ) とは異なる pHに当該混合液の pHを調整す ることで当該ブロックコポリマーから構成されるミセルの疎水性コ ァ領域に当該生理活性ポリペプチドまたはタンパク質を内包させる 工程を含んでなり、
ここで当該生理活性ポリぺプチド及び夕ンパク質の p I、 当該ブ ロックコポリマ一の疎水性セグメント中の酸性アミノ酸及び/又は その誘導体の等電点 （ p I ' ) 及び前記 p I とは異なる p Hは、 p I > p H> p I '
の関係にあり、 故に当該 pHにおいて当該ブロックコポリマーの疎 水性セグメントは負に帯電し、 かつ当該当該生理活性ポリペプチド 及びタンパク質は正に帯電する、 ことを特徴とする、 方法。
[ 8 ] 前記 p Hが前記水溶性高分子薬物の p I から 1以上離れてい る、 [ 7 ] 記載の方法。
本発明により、 生理活性ポリペプチド及びタンパク質といった高 分子量の薬物を高分子ミセル内に効率よく内包させることができ、 しかもその遊離速度も調節できるという利点が享受される。 図面の簡単な説明
図 1 は、 各種 I gG内包高分子ミセルからの I gGの遊離率の経時的変 化を示す。
図 2は、 各種インターフェロン一 内包高分子ミセルを生体内投 与した後のインターフェロン— αの血漿中濃度の経時的変化を示す 図 3は、 F I T C標識リゾチウム内包高分子ミセルまたは F I Τ C標識リゾチウム溶液をラッ 卜に静脈内投与した後の血漿中濃度の 経時変化を示す。
図 4は、 インターフェロン一 α内包高分子ミセルまたはィンター フエロン一 α溶液をラッ 卜に静脈内投与した後の血漿中濃度の経時 変化を示す。
図 5は、 インターフェロン一 a内包高分子ミセルまたはインター フエロン— 0!溶液をラッ 卜に静脈内投与した後の血漿中濃度の経時 変化を示す。
図 6は、 ヒ 卜顆粒球コロニー刺激因子内包高分子ミセル、 または ヒ ト顆粒球コロニー刺激因子溶液をラッ 卜に静脈内投与した後の血 漿中濃度の経時変化を示す。
図 7は、 ヒ ト顆粒球コロニー刺激因子内包高分子ミセル、 または ヒ ト顆粒球コロニー刺激因子溶液をラッ トに静脈内投与した後の血 漿中濃度の経時変化を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の一つの好ましい形態では、 ポリエチレングリコールから なる親水性セグメントと、 酸性アミノ酸、 その疎水性誘導体及び酸 性アミノ酸とその疎水性誘導体の混合物からなる群より選択される ポリアミノ酸からなる疎水性セグメントを有するブロックコポリマ 一を用いることで、 生理活性ポリペプチドやタンパク質を効率よく 高分子ミセルに内包させることができる。
本発明の他の好ましい形態では、 内包させたい生理活性ポリぺプ チド及びタンパク質の等電点 （ p I ) に応じて、 高分子ミセルを調 製する際の p Hを調整することで、 高分子ミセルを形成するブロッ クコポリマーから構成される当該ミセルの疎水性コア領域に生理活 性ポリペプチドやタンパク質をより効率よく内包させることができ る。
生理活性ポリペプチドやタンパク質をポリマーミセル内により効 率よく内包させるには、 高分子ミセルの調製の際の p Hを生理活性 ポリペプチドやタンパク質の p I とは異なる値に調整することが好 ましい。 高分子ミセルの調製の際の p Hは、 その生理活性ポリぺプ チドゃタンパク質が変性しない限り当該生理活性ポリべプチド及び タンパク質の p I とは離れていることが望ましく、 具体的には 1以 上離れていることが好ましい。 また、 生理活性ポリペプチドやタン パク質をより効率よく内包させるには、 高分子ミセルを調製する際 の p Hにおいて、 ブロックコポリマーの疎水性セグメント、 即ちポ リマーミセルのコアを形成する部分と生理活性ポリペプチドやタン パク質は反対の電荷を帯びていることが好ましい。 例えば、 高分子 ミセルの調製の際の p Hにおいて、 生理活性ポリペプチドやタンパ ク質が正電荷を帯びている場合、 ブロックコポリマーの疎水性セグ メントは負電荷を帯びていることが好ましく、 生理活性ポリぺプチ ドゃタンパク質が負電荷を帯びている場合、 ブロックコポリマーの 疎水性セグメントは正電荷を帯ぴていることが好ましい。 このよう な好ましい状態において、 例えば生理活性ポリペプチドやタンパク 質の p I 、 ブロックコポリマ一の疎水性セグメント中の酸性アミノ 酸及び/又はその誘導体の等電点 （ p I ' ) 及び高分子ミセルの調 製の際の p Hが、
p I > p H > p I '
の関係にあるとき、 当該 p Hにおいてブロックコポリマーの疎水 性セグメントは負に帯電し、 かつ当該生理活性ポリペプチドやタン パク質は正に帯電することとなる。 尚、 酸性アミノ酸であるァスパ ラギン酸、 グルタミン酸の等電点はそれぞれ、 2. 77と 3. 22である。 本発明の一つの好ましい態様に従えば、 生理活性ポリペプチドや 夕ンパク質の p Iが特定できれば、 上記条件に適合したプロックコ ポリマーの疎水性セグメン卜の選定及び高分子ミセルの調製の際の p Hの決定を適宜行うことができることなり、 広範の p I を有する 種々の生理活性ポリペプチドやタンパク質に適用できる。 例えば、 p I が塩基性側にある生理活性ポリべプチドゃタンパク質を内包さ せたい場合、 疎水性セグメント中の酸性アミノ酸及び/又はその誘 導体の p I ' が当該 p I よりも酸性側にあるブロックポリマーを選 定し、 更には当該 p I値と p I ' 値の間にある p Hを適宜選定し、 その p Hでミセル形成を行う ことで内包を効率よく行う ことができ る。 その逆で、 p Iが酸性側にある薬物を内包させたい場合、 上 己 p I ' が当該 p I よりもより酸性側又はより塩基性側にあるプロッ クポリマーを選定し、 更には当該 p I値と p I ' 値の間にある p H を適宜選定し、 その p Hでミセル形成を行うことで内包を効率よく 行う ことができる。 好ましくは、 本発明のブロックコポリマーの疎 水性セグメントは中性域、 例えば p H 5〜 8の範囲において負電荷 を持つ官能基を有するものである。 このようなブロックコポリマー を利用することで、 ミセル形成の際の p Hとしてかかる中性域の p Hを選定することが可能となり、 内包すべき生理活性ポリペプチド やタンパク質を極端な酸性又はアルカリ性で取り扱わずにすむこと なる。
高分子ミセルの調製の際の p H、 生理活性ポリペプチドやタンパ ク質の P I及び疎水性セグメン卜中の酸性アミノ酸及び/又はその 誘導体の p i ' を考慮する場合、 高分子ミセルへの生理活性ポリべ プチドゃタンパク質の内包は、 高分子ミセルを形成するブロックコ ポリマーと内包すべき生理活性ポリペプチドやタンパク質と水性混 合物を用意し、 その混合物の P Hを上述のとおり当該薬物の p i及 びブロックコポリマーの疎水性セグメント中の酸性アミノ酸及び/ 又はその誘導体の p I ， に基づき適宜選定した p Hに調整すること で行う ことができる。
一つの好ましい態様においては、 ブロックコポリマーを適当な有 機溶媒、 例えばジクロロメタン、 クロ口ホルム、 ジェチルエーテル 、 ジブチルエーテル、 酢酸ェチル、 酢酸プチル、 などの非水混和性 有機溶媒、 メタノール、 エタノール、 プロピルアルコール、 イソプ 口ピルアルコール、 ジメチルスルホキシド、 ジメチルホルムアミ ド 、 ジメチルァセトアミ ド、 ァセトニトリル、 アセトン、 テトラヒ ド 口フラン、 などの水混和性有機溶媒又はこれらの混合溶媒に溶解す る。 任意に、 この溶液を風乾、 例えば窒素気流雰囲気下でフィルム 状に乾固し、 さらに必要であれば減圧下で乾固することで有機溶媒 を除去してよい。 このようにして処理したブロックコポリマーに、 内包すべき水溶性高分子薬物の水性溶液を添加し、 混合する。 最後 にこの混合液の p Hをゆつく り と所望の p Hに調整し、 高分子ミセ ルを形成しながら生理活性ポリペプチドやタンパク質を内包させる 高分子ミセル形成は、 例えば上記プロックコポリマーと生理活性 ポリペプチドやタンパク質の混合液を攪拌することで行うことがで きる。 好ましくは、 高分子ミセルの形成は超音波の如きエネルギー をかけて行う。 超音波を使用する場合、 例えばパイオデイスラブ夕 一 （日本精機） を用い、 レベル 4にて、 氷冷しながら行うことがで きる。 照射時間は生理活性ポリぺプチドゃタンパク質が変性しない 限り特に限定されないが、 1秒間欠、 5秒〜 10分間、 好ましくは 5 秒〜 2分間照射することによって行う ことができる。
また、 別の好ましい態様においては、 乾燥状態のブロックコポリ マーを乳鉢などによって均一の粉体とし、 そこへ粉末の生理活性ポ リベプチドゃタンパク質または、 少量の溶液に溶解した生理活性ポ リペプチドや夕ンパク質を添加した後に穏やかに混合し、 適した緩 衝液を添加して 2時間から 24時間撹拌し、 超音波処理することによ つても行う ことができる。
更に、 別の好ましい態様においては、 最初に空ミセルを調製した 後に生理活性ポリペプチドやタンパク質を添加し撹拌または静置す るだけで生理活性ポリペプチドやタンパク質を内包した高分子ミセ ルを調製することができる。 具体的には、 ブロックコポリマーへ適 した緩衝液を添加し、 前述のように超音波処理して空ミセルを調製 し、 そこへ同じ緩衝液に溶解した生理活性ポリペプチドやタンパク 質、 または当該緩衝液で希釈した生理活性ポリペプチドやタンパク 質を添加し、 スターラーで穏やかに撹拌するか静置することによつ ても行うことができる。 この際の撹拌時間ゃ静置する時間は 2時間 から 24時間が好ましく、 温度は 4 °Cから 30°C、 特に好ましくは 4 °C である。 この方法では、 生理活性ポリペプチドやタンパク質を超音 波処理せずに済むため生理活性ポリべプチドゃタンパク質の安定性 の観点から有利である。 いずれの場合も適した緩衝液とは、 前述の p I と p Hの関係を満たすものであることが好ましい。
本発明の方法に従い、 ポリマーミセルに効率よく内包できる生理 活性ポリベプチドゃタンパク質は特に限定されないが、 水溶性であ り、 分子量 1, 500以上、 好ましくは 2, 000以上の分子量を有する生理 活性ポリべプチドゃタンパク質が好ましい。 生理活性ポリベプチド やタンパク質の例としては、 インターフェロンお、 β、 γ、 エリス ロポェチン、 G— CSF、 成長ホルモン、 インターロイキン類、 腫瘍壊 死因子、 顆粒球 . マクロファージコロニー刺激因子、 マクロファ一 ジコロニー刺激因子、 肝細胞増殖因子、 TGF- j6スーパーファミリ一 、 EGF、 FGF、 I GF- 1等が挙げられる。 また、 その活性が損なわれな い限り、 例示した上記タンパク質の誘導体、 例えば 1つ以上のアミ ノ酸を置換、 付加、 削除したものが含まれることは言うまでも無い 生理活性ポリペプチドやタンパク質は、 特に、 遺伝子組換えで生 産した場合、 同じタンパク質であっても糖鎖の有無や高次構造によ つてその等電点は異なる。 従って、 高分子ミセルの調製の際の p H 、 生理活性ポリぺプチドゃタンパク質の p I及び疎水性セグメント 中の酸性アミノ酸及び/又はその誘導体の p I ' を考慮して高分子 ミセルを調製する場合は、 等電点電気泳動などによって内包させる タンパク質等の等電点を求めてから内包させる際の p Hを決定する ことが望ましい。
ミセル化のために使用する生理活性ポリペプチドやタンパク質の 量は特に制限されないが、 一般的にはブロックコポリマーに対する 水溶性高分子薬物の重量として、 0. 0 1〜50、 好ましくは 0. 1〜 10重 量％が使用される。
本発明の薬物内包ポリマーミセルを形成するのに用いることので きるポリマーは、 ポリエチレングリコールからなる親水性セグメン 卜と、 酸性アミノ酸、 その疎水性誘導体及び酸性アミノ酸とその疎 水性誘導体の混合物から選択されるポリアミノ酸からなる疎水性セ グメントをからなるブロックコポリマ一であり、 一つの態様として は、 電荷を持つ官能基を有する疎水性セグメントが挙げられる。 「 電荷を持つ官能基を有する疎水性セグメント」 とは、 ブロックコポ リマ一からなるポリマ一ミセルのコアを形成するために必要となる 疎水性をそのセグメント全体として有しており、 その疎水性は、 そ のセグメント内にランダムに存在する該疎水性部分に起因しており 、 且つ、 そのセグメント内に、 負の電荷を有する部分も存在する領 域を意味する。
本発明に係るブロックコポリマーの疎水性セグメントは疎水性相 互作用により内包すべき高分子薬物をしつかりと保持することがで き、 疎水性セグメントに電荷を有する場合は、 静電的相互作用によ つても高分子薬物を保持が可能となる。 また、 本発明者はブロック コポリマーの疎水性セグメント中の疎水基の構造により、 内包され た生理活性ポリペプチドやタンパク質とブロックコポリマーとの疎 水的相互作用を制御し、 放出速度を調節することができることも見 出した。 特に理論に拘束されるものではないが、 以降の実施例にお いても実証されているとおり、 ミセルを形成するプロックコポリマ 一の疎水性セグメントに導入された疎水基の構造がベンジルゃフエ ニルのような平面的構造を有する場合よりも、 アルキル基のような 線形構造を有する方が、 生理活性ポリべプチドゃタンパク質がしつ かり とミセルコア内に保持されるため、 長時間かけて徐放されるも のと考えられる。 換言すれば、 ブロックコポリマーの疎水性セグメ ントに導入された疎水基の構造を調節することで、 生理活性ポリべ プチドゃタンパク質の放出速度を変えることが可能となる。 例えば 、 薬物の放出速度を速めに調節したい場合、 ベンジルゃフエニルの ような平面的構造を有する疎水基の導入率を高くすればよく、 薬物 の放出速度を遅めに調節したい場合、 アルキル基のような線形構造 を有する疎水基の導入率を高くすればよい。 さらに、 中間的な放出 速度が所望される場合、 ベンジルゃフエニルのような平面的構造を 有する疎水基とアルキル基のような線形構造を有する疎水基の導入 率の割合を変えることで放出速度を適宜調節することができる。 本発明において有用なブロックコポリマーの具体例には次のよう なものが包含される。
限定されるものでないが、 親水性セグメントは、 ポリ （エチレン グリコール） [またはポリ （エチレンォキシド） ] からなり、 ポリ サッカライ ド、 ポリ （ピニルピロリ ドン） 、 ポリ （ビニルアルコー ル） 、 ポリ (アクリルアミ ド—) 、 ポリ (アクリル酸) 、 ポリ (メタ クリルアミ ド） 、 ポリ （メタクリル酸） 、 ボリ （メタクリル酸エス テル） 、 ポリ （アクリル酸エステル） 、 ポリアミノ酸あるいはこれ らの誘導体由来のセグメントを任意的に含んでいてもよい。 ここで ポリサッカライ ドとしては、 プルラン、 デキス トラン、 フルクタン 、 ガラクタン等が挙げられる。
他方、 全体として、 疎水性のセグメントとしては、 酸性アミノ酸
、 特に、 ポリ （ァスパラギン酸） 及び Z又はその誘導体、 ポリ （グ ル夕ミン酸） 及び/又はその誘導体を挙げることができる。 具体的 には、 限定されるものではないが、 例えばポリ —べンジルァス パルテート） 、 ポリ （ j6—べンジルァスパルテートーコーァスパラ ギン酸） 、 ポリ （ ;6—アルキルァスパルテート） 、 ポリ （ |6—アル キルァスパルテートーコ—ァスパラギン酸） 、 ポリ （；6—ァリルァ スパルテー ト） 、 ポリ （ |S —ァリルァスパルテート—コーァスパラ ギン酸） 、 ポリ （ i8 —ァリルァスパルテー ト） 、 ポリ （；6 —ァラル キルァスパルテートーコーァスパラギン酸） 、 ポリ （ |6 —ァラルキ ルァスパルテー ト） 、 ポリ （ r一べンジルダル夕メー ト） 、 ポリ （ ァ一べンジルダル夕メー トーコ—グルタミ ン酸） 、 ポリ （ァーアル キルダル夕メー ト） 、 ポリ （ァーアルキルダルタメ一 トーコーダル 夕ミン酸） 、 ポリ （ァーァラルキルダル夕メー ト） 、 ポリ （ァ ーァ ラルキルダル夕メー トーコーグルタミ ン酸） 、 ポリ （ |S —アルキル ァスパルタミ ド—コ —ァスパラギン酸） 、 ポリ (ァーァラルキルグ ル夕ミ ドーコーグルタミン酸） などのポリ （酸性アミノ酸誘導体） を挙げることができる。
疎水性セグメントは疎水性側鎖を有することで疎水性を帯びる。 かかる疎水性側鎖の例としては、 ベンジル基、 フエニル基、 アルキ ル基、 例えば、 未置換もしくは、 アミノ基または力ルポキシル基で 置換された C 4〜 C 1 6アルキル基、 ― （ C H 2 ) 4—フエニル基及び それらの任意の組み合わせが挙げられる。 上述のとおり、 ポリ （ァ ミノ酸誘導体） セグメン卜に導入される疎水性側鎖の構造により内 包される薬物の遊離速度が調節されることから、 速い遊離速度が所 望される場合、 疎水性側鎖はフエニル又はべンジル基が好ましく、 また遅い遊離速度が所望される場合、 疎水性側鎖はアルキル、 例え ば C 4〜 C！ 6ァルキル基が好ましい。
このようなポリ （アミノ酸誘導体） セグメン トは、 それ自体公知 の、 ポリエチレングリコール-コ-ポリアスパラギン酸べンジルエス テルまたは、 ポリエチレンダリコール-コ-ポリダルタミ ン酸べンジ ルエステルから調製することができる。 ポリエチレングリコール - コ-ポリアスパラギン酸べンジルエステルまたは、 ポリエチレング リコール-コ-ポリグルタミン酸べンジルエステルの調製は、 片末端 が保護され、 もう一方の末端がアミノ基であるポリエチレングリコ ール、 例えば、 Me O- PEG- CH2 CH2 CH2 -匪 2を開始剤として、 脱水され たの有機溶媒中で、 N-力ルポキシ - j8 -ベンジル- L-ァスパルテート (BLA-NCA)もしくは、 N-力ルポキシ-ァ -ベンジル -L -ダルタメ一ト （B LG- NCA)を所望の重合度 （アミノ酸ユニッ ト数） となるように添加 し、 反応させることにより得ることができる。
上記で得られたブロックコポリマーの末端をァセチルクロライ ド または無水酢酸によりァセチル化を施した後、 アルカ リ加水分解に よりベンジル基を除去してポリエチレングリコール-コ-ポリアスパ ラギン酸またはポリエチレングリコール-コ-ポリ グルタミン酸とし た後、 有機溶媒中で、 所望のエステル化率となるようにベンジルァ ルコールを添加し、 縮合剤、 例えば、 Ν-Ν ' -ジシクロへキシルカル ポジィミ ド (DCC)または Ν - N ' -ジィソプロピルカルポジィミ ド (D I PC I )存在下で反応させることより、 部分的にベンジルエステルを有す るブロックコポリマーを得ることができる。
さらに、 例えば、 ベンジルアルコールの代わりに、 1 -ォク夕ノー ルを反応させれば、 ポリエチレングリ コール-コ-ポリ アスパラギン 酸ォクチルエステル、 ポリエチレングリコール -コ-ポリグルタミン 酸ォクチルエステルが得られ、 同様に 1 -ドデカノールを用いれば、 ポリエチレングリ コール-コ-ポリアスパラギン酸ドデシルエステル が、 1 _へキサデ力ノールを用いればポリエチレングリコール-コ-ポ リアスパラギン酸へキサデシルエステルをそれぞれ得ることが出来 る。
また、 アミ ド結合により疎水性側鎖を導入する場合は、 前述の通 り、 ポリエチレングリコール-コ-ポリアスパラギン酸べンジルエス テルまたは、 ポリエチレンダリコール-コ-ポリグルタミン酸べンジ ルエステルをァセチル化を施した後、 アルカ リ加水分解によりベン ジル基を除去した力ルポキシル基にアミノ基を有する疎水性側鎖を 反応させるか、 ポリエチレングリコール-コ-ポリアスパラギン酸べ ンジルエステルと一級アミ ンを有する化合物を反応させ、 アミノ リ シスを利用してエステル結合からアミ ド結合へ変換して導入するこ とができる。
さ らに、 はじめに所望のアミ ド化率になるように有機溶媒中で卜 ォクチルァミ ンなどをポリエチレングリコール-コ-ポリアスパラギ ン酸べンジルエステルに添加して一定時間反応させた後、 未変換の ベンジルエステルに対して大過剰量の 1， 8-ジァミ ノオクタンなどを 加えることにより、 疎水性基の末端がァミノ基で置換された疎水性 側鎖とァミノ基で置換されていない疎水性側鎖が混在するポリ （ァ ミノ酸誘導体） セグメン トにすることもできる。 エステル化又はァ ミ ド化の割合は、 アミ ノ酸ュニッ ト数全体に対して 40 %〜 100 %で ある。 ァスパラギン酸、 グルタミン酸は、 いずれかの光学活性型の ものであるか、 それらの混合物であることができる。 以上の親水性 セグメン トと疎水性のセグメン トは、 それ自体既知の連結基、 例え ば、 エステル結合、 アミ ド結合、 イミノ基、 炭素一炭素結合、 エー テル結合等を介して連結されうる。
特に、 製造容易であり、 本発明で都合よく使用できるブロックコ ポリマーとしては、 下記式 （ I ) および （ I I ) で示すことのでき るものを挙げることができる。
(OCH2CH2V-L, (COCHNHh—— (C0R7 CHNH)
Figure imgf000022_0001
6
I
R6
または
(OCH2 CH2lr- (NHCHCOh—— (NHCHR7 CO)
(II)
(CH2)y c=o
J
C=0
1
1
1
R6 上記各式中 R iおよび R3は、 それぞれ独立して、 水素原子または 保護されていてもよい官能基が置換したもしくは未置換の低級アル キル基を表し、 R2は水素原子、 飽和もしくは不飽和の 脂 肪族カルポニル基またはァリール力ルポ二ル基を表し、 R4は水酸 基、 飽和もしくは不飽和の C ,〜 C3 Q脂肪族ォキシ基またはァリー ルー低級アルキルォキシ基を表し、 R5は一 O—または一 NH—を 表し、 R6は、 水素原子、 フエニル基、 一 （C H2) 4—フエニル基 、 未置換もしくは、 アミノ基または力ルポキシル基で置換された C 4〜 C 16アルキル基、 またはベンジル基を表し、 R7はメチレン基を 表し、 nは 10〜2500の整数であり、 Xは 10〜300となる整数であり 、 mは 0〜300となる整数であり （但し、 mが存在する場合、 （C O C HNH)のユニッ トと （C O R7 C HNH) のユニッ トはランダ ムに存在し、 R6は 1つのブロックコポリマー内の各アミノ酸ュニ ッ トにおいて任意に選択可能であり、 ランダムに存在するが、 R6 が水素原子である場合は R6全体の 6 0 %以下である） 、 yは 1又 は 2の整数を表し、 は— NH―、 一 O—、 一〇— Z— NH—、 — C O—、 — C H2—、 _〇— Z— S — Z—および一 O C O— Z— NH— （ここで、 Zは独立して ,〜（ 6アルキレン基である。 ） か らなる群より選ばれる連結基を表し、 L2がー〇 C〇一 Z— C O— および一 NH C O— Z— C O— （ここで、 Zは C i Ceアルキレン 基である。 ） から選択される連結基を表す。
保護されていてもよい官能基としては、 ヒ ドロキシル基、 ァセ夕 —ル、 ケタール、 アルデヒ ド、 糖残基、 マレイミ ド基、 カルボキシ ル基、 アミノ基、 チオール基、 活性エステル等が挙げられる。 Rt および R 3が保護されていてもよい官能基が置換した低級アルキル 基を表す場合の親水性セグメントは、 例えば、 W096/ 33233、 W096 /32434, WO97/06202に記載の方法に従うことができる。 低級アル キルとは炭素数が例えば 7個以下、 好ましくは 4個以下の直鎖又は 分枝鎖アルキル基を意味し、 例えばメチル、 ェチル、 プロピル、 ィ ソプロピル、 プチル、 イソブチル基などが含まれる。
ミセル形成は、 例えばブロックコポリマーと生理活性ポリぺプチ ドゃタンパク質を、 前述の通り、 適した緩衝液に溶解して攪拌する ことで行うことができる。 好ましくは、 空ミセルの形成は超音波の 如きエネルギーをかけて行う。 超音波を使用する場合、 例えばバイ オデイスラブ夕一 （日本精機） を用い、 レベル 4にて、 氷冷しなが ら行う ことができる。 照射時間は生理活性ポリペプチドやタンパク 質が変性しない限り特に限定されないが、 1秒間欠、 5秒〜 10分間 、 好ましくは 5秒〜 2分間照射することによって行うことができる 。 また、 別の方法としては、 乾燥状態のブロックコポリマーを乳鉢 などによって均一の粉体とし、 そこへ粉末の生理活性ポリぺプチド やタンパク質または、 少量の溶液に溶解した生理活性ポリベプチド やタンパク質を添加した後に穏やかに混合し、 適した緩衝液を添加 して 2時間から 24時間、 4 °Cで撹拌し、 氷冷しながら超音波処理す ることによつても行うことができる。
更に、 別の方法としては、 プロックコポリマーへ適した緩衝液を 添加し、 前述のように超音波処理して空ミセルを調製し、 そこへ同 じ緩衝液に溶解した生理活性ポリペプチドやタンパク質、 または当 該緩衝液で希釈した生理活性ポリペプチドやタンパク質を添加し、 ス夕—ラーで穏やかに撹拌するか静置することによつても行うこと ができる。 この際の撹袢時間ゃ静置する時間は 2時間から 5 日間が 好ましく、 温度は 4 °Cから 30°C、 特に好ましくは 4 °Cである。 この 方法では、 生理活性ポリペプチドやタンパク質を超音波処理せずに 済むため生理活性ポリペプチドやタンパク質の安定性の観点から有 利である。 いずれの場合も適した緩衝液とは、 前述の p i と p Hの 関係を満たすものであることが好ましい。
こうして、 調製した生理活性ポリペプチドやタンパク質内包高分 子ミセルについて、 その粒子径は生体に投与できるサイズであれば 特に限定されないが、 l O ^ m以下が好ましく、 5 m以下であるこ とがより好ましい。 特に、 静脈内投与で用いる場合は、 500 n m以 下であることが好ましく、 300 n m以下であることがより好ましい 。 必要であれば、 生理活性ポリペプチドやタンパク質内包高分子ミ セルを含有する水性溶液を所望の孔径の親水性フィル夕一で濾過す る。
本発明に係る生理活性ポリペプチドやタンパク質内包高分子ミセ ルを生体内に投与する場合は、 その投与ルートは問わないが、 静脈 内投与、 皮下投与、 筋肉内投与、 関節内投与、 腹腔内投与、 眼内投 与などが挙げられる。 本発明の好適な態様の一つとして、 各種の糖 類および または各種のポリエチレングリコール （マクロゴール） を、 除菌濾過前の薬物内包ポリマーミセル水溶液 （または水性溶液 ) に加える工程をさらに含んでなる方法により製造できる。 限定さ れるものでないが、 使用できる糖類としては、 マルトース、 トレハ ロース、 キシリ トール、 グルコース、 スクロース、 フルク ト一ス、 ラク トース、 マンニトールおよびデキス トリン等が挙げられ、 使用 できるポリエチレングリコールとしては、 分子量が約 1000〜約 3500 0であって、 例えば、 マクロゴール 1000、 1540、 4000、 6000、 20000 および 35000等が挙げられる。
本発明に係る生理活性ポリペプチドやタンパク質内包高分子ミセ ル製剤は、 内包させた生理活性ポリべプチドゃタンパク質の安定性 に影響を及ぼさない限り凍結乾燥することもできる。 凍結乾燥した 場合には、 乾燥製剤を水または水性溶液を用いて生理活性ポリぺプ チドゃタンパク質内包高分子ミセル含有溶液に再溶解または再構成 する。
凍結乾燥する場合、 凍結乾燥前の溶液に糖類を、 その最終濃度が 0. ト 15 % ( w / V ) になるように加えてよく、 またはポリエチレ ングリコールを、 その最終濃度が 0. 5〜 10 % ( w / V ) になるよう に加えてもよい。 通常、 ブロックコポリマーと糖類またはポリェチ レンダリコールとの割合は、 それぞれ重量で 1 ： 1〜 1 ： 10または 1 ： 0. 5〜 1 ： 10である。
好ましい態様において、 親水性セグメントの末端に夕一ゲッ ト能 を有する分子を結合可能な官能基を有していても良い。 夕ーゲッ ト 能を有する分子を結合可能な官能基としては、 特に限定されないが 、 ヒ ドロキシル基、 ァセタール基、 ケタール基、 アルデヒド基、 力 ルポキシル基、 マレイミ ド基、 アミノ基、 チオール基及び活性エス テル基などが挙げられ、 官能基は、 保護されていてもよい。 夕ーゲ ッ ト能を有する分子としては、 特に限定されないがリガンド、 抗体 またはその機能断片、 タンパク質、 ペプチドなどが挙げられる。 官 能基に夕ーゲッ ト能を有する分子を結合させる場合は、 該分子の構 造によって適宜選択され、 公知の方法で結合させることができる。
以下に比較例、 実施例を示し、 本発明を具体的に示す。
以下においては、 例えばブロックコポリマーの PEG鎖の平均分子 量 12, 000、 ポリアミノ酸鎖の平均が 40残基、 ポリアミノ酸側鎖への ベンジルエステルの導入率が約 65%の場合、 ブロックコポリマーの 後に、 12— 40 (65)と表記し、 同様にォクチルエステル等の導入率が 約 65%の場合も 12— 40 (65)と表記する。 尚、 約 65%とは、 62%〜68 %の程度を意味する。 実施例
1 ) 内包率の測定
実施例 1 (ヒ ト IgG内包ミセルの調製 1 )
ブロックコボリマーには、 ポリエチレングリコール一コーポリア スパラギン酸べンジルエステル （以下、 PEG— PBLAという。 本ポリ マ一において、 ベンジルエステルが導入されていないァスパラギン 酸残基は、 一般式 （ I ) 中の R5が— O—、 R6が水素原子である。 以下同様。 また、 以下全てのブロックコポリマーは一般式 （ I ) の R ,が C H 3、 L！がー〇 ~ C H 2+ 3 N H、 R 2が C〇 C H 3である。 ) を用いた。 ガラスバイアル中に 10m gの PEG— PBLA 12 - 50 (65) を精秤し、 ジクロロメタン 1 mLを加え溶解した。 その溶液を窒素 気流下でフィルム状に乾固し、 さらに減圧下で 1時間程度乾固させ た。 ここに、 精製ヒ ト IgG (MP BIOMEDICALS社） （pi約 8 ) 20m リン酸緩衝溶液（pH 6、 16.5mg/mL)を 62 L添加し、 4 °Cで軽く撹 拌しながら、 20mMリン酸緩衝液（pH6 )または 20mM TAPS緩衝液（pH 8 )を徐々に 1.938mL加えた。 4°Cで終夜撹拌した後、 バイオディ スラブ夕一 （日本精機製作所 High Power Unit) を用い、 氷冷下 、 約 10秒間 （ 1秒間欠、 出力 ： Low) の超音波照射後、 ゲルろ過 （ シグマ一アルドリッチ社、 Sepharose (登録商標） CL— 4B: 〜 2 φ Χ30 cm) を行った。 回収した各フラクション（溶離液： 20mM リン 酸緩衝液 （PH7.4) 、 流速： 1.0 mL/min, フラクション体積： 1 mL) 中の IgG濃度を BCA Protein Assay (PIERCE社） により決定した。 内 包率は以下の式から求めた。
(ミセル画分中のタンパク量） X100
内包率 (%) =
全画分中のタンパク量の総和 内包率は PH6で調製した時 94%であった。 一方、 pH8で調製した時 41%であった。 この結果は、 内包タンパク質の等電点から離れた p H条件下でミセルを調製する方が、 等電点近くで調製するよりも、 タンパク質と PEG- PBLA 12-50 (65)との静電的相互作用に基づき、 効率よくタンパク質が内包されることを示している。
実施例 2 (ヒ ト IgG内包ミセルの調製 2 )
ブロックコポリマーには、 ポリエチレングリコ一ルーコーポリグ ル夕ミン酸べンジルエステル （以下、 PEG- PBLGという。 本ポリマー において、 ベンジルエステルが導入されていないグルタミン酸残基 は、 一般式 （ I ) 中の R5が— O—、 R6が水素原子である。 以下同 様。 ） を用いた。 ガラスバイアル中に 10mgの PEG-PBLG 12-40 (65) を精秤し、 ジクロロメタン 1 mLを加え溶解した。 その溶液を窒素気 流下でフィルム状に乾固し、 さらに減圧下で 1時間程度乾固させた 。 ここに、 精製ヒ ト IgG (MP BIOMEDICALS社） （ p i約 8 ) リ ン酸 緩衝溶液（pH6、 16.5mg/mL)を 添加し、 4°Cで軽く撹拌しなが ら、 20mMリン酸緩衝液（pH6)または 20mM TAPS緩衝液（pH8)を 1.938mL 加えた。 4°Cで終夜撹拌した後、 バイオディスラブ夕一 （日本精機 製作所 High Power Unit) を用い、 約 10秒間 （1秒間欠、 出力 ： Lo w) の超音波照射後、 ゲルろ過 （シグマ一アルドリッチ社、 Sepharo se (登録商標） CL-4B: 〜2Φ Χ30 cm) を行った。 回収した各フラ クシヨ ン（溶離液： 20mM リン酸緩衝液 （pH7.4) 、 流速： 1.0 mL/mi n、 フラクション体積： linL)中の IgG濃度を BCA Protein Assay (PIE RCE社） により決定した。 内包率は以下の式から求めた。
(ミセル画分中のタンパク量） X 100
内包率 (%) =
全画分中の夕ンパク量の総和 内包率は PH6で調製した時 83%であった。 一方、 pH8で調製した時 63%であった。 この結果は、 内包タンパク質の等電点から離れた p H条件下でミセルを調製する方が、 等電点近くで調製するよりも、 タンパク質と PEG- PBLG 12-40 (65)との静電的相互作用に基づき、 効率よくタンパク質が内包されることを示している。
実施例 3 (ヒ ト IgG内包ミセルの調製 3 )
ブロックコポリマーには、 ポリエチレングリコール—コーポリア スパラギン酸ォクチルエステル （以下、 PEG-P0LAという。 本ポリマ 一において、 ォクチルエステルが導入されていないァスパラギン酸 残基は、 一般式 （ I ) 中の R5がー〇一、 R6が水素原子である。 以 下同様） を用いた。 ガラスバイアル中に 10mgの PEG- P0LA 12-40 (65 )を精秤し、 ジクロロメタン 1 mLを加え溶解した。 その溶液を窒素 気流下でフィルム状に乾固し、 さらに減圧下で 1時間程度乾固させ た。 ここに、 精製ヒ ト IgG (MP BIOMEDICALS社） （pi約 8 ) 20mMリ ン酸緩衝溶液（pH6、 16.5mg/iiiL)を 62/ L添加し、 4°C下で軽く撹拌し ながら、 20mMリン酸緩衝液（pH6)または 20mM TAPS緩衝液（pH8)を徐 々に 1.938mL加えた。 4°Cで終夜撹拌した後、 バイオディスラブ夕 一 （日本精機製作所 High Power Unit) を用い、 氷冷下、 約 10秒 間 （1秒間欠、 Low) の超音波照射後、 ゲルろ過 （シグマ—アルドリ ツチ社、 Sepharose (登録商標） CL- 4B: 〜2φ Χ30 cm) を行った 。 回収した各フラクショ ン（溶離液： 20mM リン酸緩衝液 （pH7.4) 、 流速： 1.0 mL/min、 フラクション体積： 1 mL)中の IgG濃度をアミ ノ酸分析 （Waters社、 AccQ Tag (商標）法） により決定した。 内包 率は以下の式から求めた。
(ミセル画分中のタンパク量） X100
内包率 （％) =
全画分中のタンパク量の総和 内包率は PH6で調製した時 97%であった。 一方、 pH8で調製した時 24%であった。 この結果は、 内包タンパク質の等電点から離れた p H条件下でミセルを調製する方が、 等電点近くで調製するよりも、 タンパク質と PEG-P0LA 12-40 (65)との静電的相互作用に基づき、 効率よくタンパク質が内包されることを示している。
比較例 1 (ヒ ト IgG内包ミセルの調製 4)
ガラスバイアル中に lOmgの PEG - PBLA 12- 50 (100)を精秤し、 ジク ロロメタン 1 mLを加え溶解した。 その溶液を窒素気流下でフィルム 状に乾固し、 さらに減圧下で 1時間程度乾固させた。 ここに、 精製 ヒ ト IgG (MP BIOMEDICALS社） （pi約 8 ) 20mMリン酸緩衝溶液（pH6 、 16.5mg/mL)を 62 L添加し、 4 °C下で軽く撹拌しながら、 20mMリ ン酸緩衝液（PH6)または 20mM TAPS緩衝液（pH8)を徐々に 1.938mL加え た。 4 で終夜撹拌した後、 バイオディスラブ夕一 （日本精機製作 所 High Power Unit) を用い、 氷冷下、 約 10秒間 （ 1秒間欠、 出 力 ： Low) の超音波照射後、 ゲルろ過 （シグマ一アルドリ ッチ社、 S epharose (登録商標） CL- 4B: 〜2φ Χ30 cm) を行った。 回収した 各フラクション（溶離液： 20mM リン酸緩衝液 （pH7.4) 、 流速： 1.0 mL/fflin, フラクショ ン体積： 1 mL)中の IgG濃度を BCA Protein Ass ay (PIERCE社） から決定した。 内包率は以下の式から求めた。
(ミセル画分中のタンパク量） X 100
内包率 (%) =
全画分中のタンパク量の総和 内包率は PH6で調製した時 22%であった。 一方、 PH8で調製した時 65%であった。 この結果は、 カルボキル基を持たない PEG-PBLA 12- 50 (100)を用いる時、 内包タンパク質の等電点から離れた pH条件下 でミセルを調製しても、 静電的相互作用の関与はなく、 効率よく夕 ンパク質を内包させるのは難しいことを示している。 等電点付近で 調製する方が疎水的相互作用に基づき、 タンパク質が内包されるこ とを示している。
比較例 2 (ヒ ト FITC標識 IgG内包ミセルの調製）
ブロックコポリマーには、 ポリエチレングリコール—ポリアスパ ラギン酸 （平均残基数が約 50残基、 非エステル化） ブロック共重合 体、 PEG— PBLA 12— 50 (65)、 または PEG— P0LA 12 - 40 (65)の 3種 を用いた。 ガラスバイアル中に 20mgのポリマーを精秤し、 ジクロロ メタン 2 mLを加え溶解した。 その溶液を窒素気流下でフィルム状に 乾固し、 さらに減圧下 1時間程度乾固させた。 ここに、 FITC標識ヒ トイムノグロプリ ン （FITC- IgG) リン酸緩衝溶液 （シグマ—アルド リ ッチ社、 20 mg/ L) を lOO^L添加し、 4°Cで軽く撹拌しながら、 2 OmMリン酸緩衝液（pH6)を徐々に 1.9mL加えた。 4 °Cで終夜撹拌した 後、 バイオディスラブ夕一 （日本精機製作所 High Power Unit) を用い、 氷冷下、 約 10秒間 （ 1秒間欠、 出力 ： Low) の超音波照射 後、 超遠心 （ 30, 000 rpm、 1時間、 4 °C、 ベックマン社、 MLA- 130 ローター） した。 沈殿として回収したミセル画分を 20mMリン酸緩衝 液（PH6)で懸濁し、 ゲルろ過 （シグマ—アルドリ ッチ社、 Sepharose
(登録商標） CL-4B: 〜2Φ Χ30 cm) を行った。 回収した各フラク シヨ ン（溶離液： 20mM リン酸緩衝液 （pH7.4) 、 流速： 1.0 niL/min 、 フラクショ ン体積： 1 mL)中の FITC- IgG濃度をプレートリーダー
(大日本住友製薬、 パワースキャン （登録商標） HT) を用い （励起 波長 ： 485ηπι±20ηπι、 発光波長 ： 528nm±20n]ii) 測定し、 内包率を以 下の式から求めた。
(ミセル画分中のタンパク量） X100
内包率 （％) =
全画分中のタンパク量の総和 内包率は、 ポリエチレングリコールーポリアスパラギン酸 (平均 残基数が約 50残基、 非エステル化） ブロック共重合体を用いた場合 、 6 %であった。 一方、 PEG-PBLA 12- 50 (65)または PEG-P0LA 12-40
(65)を用いた場合、 内包率はそれぞれ 51%、 60%であった。 この 結果は、 疎水性を有する置換基と荷電性を有する基が共存する、 全 体として疎水性セグメントからなるポリマ一を用いる方が効率よく タンパク質を内包でき、 内包には静電相互作用以外に、 疎水的相互 作用等も関与していることを示している。 また、 実施例 1— 3の結 果も合わせた上記の結果は、 ブロックコポリマーの疎水性セグメン ト中の疎水基の構造は、 内包率には大きく関与しないことを示して いる。
実施例 4 (FITC標識ゥシ血清アルブミン内包ミセルの調製）
ガラスバイアル中に 40mgの PEG- PBLA 12- 50 (65)を精抨し、 ジクロ ロメタン 2mLを加え溶解した。 その溶液を窒素気流下でフィルム状 に乾固し、 さらに減圧下 1時間程度乾固させた。 ここに、 FITC標識 ゥシ血清アルブミン （シグマ一アルドリ ッチ社） （p i約 5 ) 水溶 液（20mg/mL)を 200 L添加し、 4 °C下で軽く撹拌しながら、 50mMク ェン酸緩衝液（PH3.5)または 20mM リン酸緩衝液（pH6)を徐々に 3.8mL 加えた。 4°Cで終夜撹拌した後、 パイオデイスラブタ一 （日本精機 製作所 High Power Unit) を用い、 氷冷下、 約 10秒間 （1秒間欠、 出力 ： Low) の超音波照射後、 超遠心 （ 30, 000 rpm、 1時間、 4 °C 、 ベックマン社、 MLA- 130口一ター） を行った。 上清中の FITC標識 ゥシ血清アルブミン濃度をプレートリーダー （大日本住友製薬、 パ ワースキャン （登録商標） HT) を用い （励起波長 ： 485nm±20M、 発光波長 ： 528nm±20nni) 測定し、 内包率を以下の式から求めた。
(超遠心前のタンパク量—上清中のタンパク量） X 100 内包率 (%) =
超遠心前の夕ンパク量 内包率は PH3.5で調製した時 16%であった。 一方、 pH6で調製した 時 7%であった。 この結果は、 内包タンパク質の等電点から離れた p H条件下でミセルを調製する方が、 等電点近くで調製するより も 、 タンパク質と PEG-PBLA 12- 50 (65)との静電的相互作用に基づき、 効率よくタンパク質が内包されることを示している。
実施例 5 (ゥシヘモグロビン内包ミセルの調製）
ガラスバイアル中に 20mgの PEG- PBLA 12- 50 (65)を精秤し、 ジクロ ロメタン 2mLを加え溶解した。 その溶液を窒素気流下でフィルム状 に乾固し、 さらに減圧下 1時間程度乾固させた。 ここに、 ゥシへモ グロビン （シグマ一アルドリッチ社） （p i約 7) 水溶液（20mg/mL )を IOO L添加し、 4°C下で軽く撹拌しながら、 20mMリ ン酸緩衝液（ pH 6.0)または 20mM リン酸緩衝液（pH 7.4)を徐々に 1.9mL加えた。 4 で終夜撹拌した後、 バイオディスラブ夕一 （日本精機製作所 High Power Unit) を用い、 氷冷下、 約 10秒間 （1秒間欠、 出力 ： Lo w) の超音波照射後、 ゲルろ過 （シグマ—アルドリ ッチ社、 Sepharo se (登録商標） CL-4B: 〜2φ Χ30 cm) を行った。 回収した各フラ クシヨン（溶離液： 20mM リン酸緩衝液 （pH7.4) 、 流速： 1.0 mL/mi n、 フラクション体積： 1 mL)中のヘモグロビン濃度をプレートリー ダー （大日本住友製薬、 パワースキャン （登録商標） HT) を用い、 測定した。 内包率は以下の式から求めた。
(ミセル画分中のタンパク量） X100
内包率 （％) = :
全画分中のタンパク量の総和 内包率は PH6.0で調製した時 19%であった。 一方、 pH7.4で調製し た時 10%であった。 この結果は、 内包タンパク質の等電点より酸性 条件下でミセルを調製する方が、 等電点よりアルカリ条件下で調製 するよりも、 タンパク質と PEG-PBLA 12-50 (65)との静電的相互作用 に基づき、 効率よくタンパク質が内包されることを示している。
実施例 6 (リコンビナント ヒ トインターフェロン一 α内包ミセ ルの調製）
ガラスバイアル中に、 7. Omgの PEG- PBLA 12- 50 (65)を精秤し、 ジ クロロメタンを 0.7mL加えて溶解した。 その溶液を窒素気流下でフ イルム状に乾固し、 更に減圧下で 1時間程度乾固させた。 そこに、 リコンビナント ヒ トインタ一フエロン一 a (pi約 6.0)の PBS溶液（I FN-a , PBL Biomedical Laboratories) (0.2mg/mL 35 を加え、 続いて 0.1M MES緩衝液（pH 5.0)を 200 L添加した。 4 °Cで緩やかに 混和してポリマ一をほぼ溶解させ、 続いて 20mMの MES緩衝液（pH 5.0 )を添加し、 全量を 1.4mLとし、 4°Cで一晩撹拌した。 撹拌終了後、 超遠心（30， 000rpm、 1時間、 4^、 ベックマン社、 MLA- 130ローター） し、 上清中の IFN- a;濃度を ELISAキッ ト （PBL Biomedical Laborator ies)で測定した。
他方、 ガラスパイアル中に、 2.6mgの PEG- PBLA 12- 50 (65)を秤量 し、 ジクロロメタンを 0.26mL加えて溶解した。 その溶液を窒素気流 下でフィルム状に乾固し、 更に減圧下で 1時間程度乾固させた。 そ こに、 前述と同様のリコンビナント ヒ トインターフェロン一ひの PBS溶液（0.2mg/mL 12.5 L)を加え、 続いて 0. 1M TAPS緩衝液（pH 8. 0)を 100 L添加した。 4 °Cで緩やかに混和してポリマ一をほぼ溶解 させ、 続いて 20mMの TAPS緩衝液（pH 8. 0)を 400 L添加し、 4 °Cで一 晚撹拌した。 撹拌終了後、 超遠心（30, ΟΟθΓρηκ 1時間、 4 °C、 べッ クマン社、 MLA- 130ローター）し、 上清中の IFN- 濃度を ELISAキッ ト （PBL Biomedical Laboratories)で測定した。 それぞれの実験の 測定値から、 下記の式により内包率を求めた。
(調製時に用いたタンパク量一上清中のタンパク量） X 100 内包率 ( % ) =
調製時に用いたタンパク量 内包率は PH5.0で調製した時 100%であった。 一方、 pH8.0で調製 した時 36%であった。 この結果は、 内包タンパク質の等電点より酸 性条件下でミセルを調製する方が、 等電点よりアルカリ条件下で調 製するよりも、 タンパク質と PEG-PBLA 12- 50 (65)との静電的相互作 用に基づき、 効率よくタンパク質が内包されることを示している。 実施例 7 (パパィン内包ミセルの調製）
ガラスバイアル中に 20mgの PEG-PBLA 12-40 (65)を精秤し、 ジクロ ロメタン 2 mLを加え溶解した。 その溶液を窒素気流下でフィルム状 に乾固し、 さらに減圧下 1時間程度乾固させた。 ここに、 パパイン (シグマ一アルドリ ッチ社） （ p i約 8.8) 水溶液（20mg/mL)を 100 L添加し、 4 下で軽く撹拌しながら、 20mMリン酸緩衝液（pH 6.0 )または 20mM TAPS緩衝液（pH 8.0)を徐々に 1.9mL加えた。 4 °Cで終 夜撹拌した後、 バイオディスラブター （日本精機製作所 High Pow er Unit) を用い、 氷冷下、 約 10秒間 （1秒間欠、 出力 ： Low) の超 音波照射後、 ゲルろ過 （シグマ一アルドリッチ社、 Sepharose (登 録商標） CL- 4B: 〜2Φ Χ30 cm) を行った。 回収した各フラクショ ン（溶離液： 20mM リン酸緩衝液 （pH7.4) 、 流速： 1. 0 mL/min、 フ ラクシヨン体積： 1 mL)中のパパイン濃度を BCA Protein Assay (P IERCE社） で測定した。 内包率は以下の式から求めた。
(ミセル画分中のタンパク量） X 100
内包率 （％) =
全画分中のタンパク量の総和 内包率は PH6.0で調製した時 27%であった。 一方、 PH8.0で調製し た時 9%であった。 この結果は、 内包タンパク質の等電点から離れ た p H条件下でミセルを調製する方が、 等電点近くで調製するより も、 タンパク質と PEG - PBLA 12 - 40 (65)との静電的相互作用に基づき 、 効率よくタンパク質を内包できることを示している。
また、 これまでの実施例の結果は、 本発明に基づき広範囲のタン パク質を効率よく高分子ミセルに内包できることを示している。 2 ) ミセルからのタンパク質遊離率の評価
実施例 8 (ヒ ト FITC標識 IgG内包ミセルからの遊離評価）
ブロックコポリマーには、 PEG- PBLA 12-50 (65)または PEG- P0LA 12-40 (50)を用いた。 バイアルにポリマーをそれぞれ 20mgずつ精秤 し、 ジクロロメタン 2mLを添加して溶解した。 その溶液を窒素気流 下でフィルム状に乾固させ、 減圧下でさらに 1時間程度乾固させた 。 F I T C標識ヒ トイムノグロブリン （FITC- IgG) (シグマ—アル ドリ ツチ社、 20 mg/mL) を 100 L添加し、 軽く撹拌しながら、 さら に 20mMリン酸緩衝液（pH6.0) 3, 9mLを徐々に加えた。 4°Cにてー晚攒 拌した後、 バイオディスラブ夕一 （日本精機製作所 High Power ϋ nit) を用い、 氷冷下、 約 10秒間 （1秒間欠、 出力 ： Low) で超音波 照射後、 超遠心分離（30, 000rpm、 4°C、 1時間）にてミセルを得た。 回収したミセルを 20mMリン酸緩衝液（PH6)で懸濁し、 ゥシ血清中に 添加し [最終ゥシ血清濃度 ： 50%(v/v)]、 37°Cでィンキュベーショ ン した。 内包した FITC- IgGの遊離を評価するため、 予め決めたインキ ュベーシヨ ン時間の後にサンプル lmLをゲルろ過 （シグマ一アルド リ ッチ社、 Sepharose (登録商標） CL - 4B： 〜2φ Χ30 cm) した。 回収した各フラクション（溶離液： 20mM リ ン酸緩衝液 （PH7.4) 、 流速： 1.0 mL/min、 フラクション体積： 1 mL)中の FIK- IgG濃度を プレートリーダー （大日本住友製薬、 パワースキャン （登録商標） HT) を用い （励起波長 ： 485nm±20niii、 発光波長 ： 528nm±20nm) 測 定し、 遊離率を以下の式から求めた。
FITC標識ヒ ト IgG画分中のタンパク量 X 100 遊離率 （％) =
緩衝液と混合直後にゲルろ過し、 回
収したミセル画分中のタンパク量
(ただし、 上記の緩衝液は 20mMリン酸緩衝液 （pH6) である。 ） 遊離率の経時変化を図 1 に示した。 この結果は、 ミセルに内包さ れたタンパク質が血清存在下においても初期にパース 卜することな く、 長時間徐放されることを示している。 また、 遊離速度は、 疎水 基の構造に依存することを示している。 特に理論に拘束されるもの ではないが、 ミセルを形成するブロックコポリマーの疎水性セグメ ン卜に導入された疎水基の構造がベンジルのような平面的構造を有 する場合よりも、 アルキル基のような線形構造を有する方が、 薬物 をしつかりと保持し、 その放出は制御された状態で達成されると考 えられる。 実施例 9 (インターフェロン一 ひ静脈内投与試験）
ブロックコポリマーには、 PEG- PBLA 12-50 (65)または PEG- P0LA 12-40 (65)を用いた。 パイアル中に 10mgのポリマーを精秤し、 ジク ロロメタン 1 mLを加え溶解した。 その溶液を窒素気流下フィルム状 に乾固し、 さらに減圧下 3時間程度乾固させた。 ここに、 リコンビ ナント ヒ トインターフェロン _ PBS溶液（IFN- a， PBL Biomedic al Laboratories) (0. 2 ig/iL, 46 Uを加え、 続いて 0. 2M MES 緩衝液（pH 5.0) 200 Lを添加した。 4°Cでゆるやかに撹拌して、 ポ リマーをほぼ溶解させ、 続いて 20 mM MES緩衝液（pH 5.0)を添加し て全量を 2mLとし、 4°Cで一昼夜撹拌した。 サンプルを超遠心 （30, 0 00 rpm、 1時間、 4。C、 ベックマン社、 MU-130ロー夕一） し、 内 包されなかった IFN- αを除き、 ミセルを沈殿として回収した。 この ミセルを 5 %グルコース水溶液で懸濁し、 以下の動物実験に用いた
6週齢の Wis tar系雄性ラッ トを 1群 2匹に区分し、 上記の被験液 を 1X106 Ιϋ/kgの投与量になるよう尾静脈より投与した。 投与から 5分、 1、 3、 6、 9及び 24時間後に頸静脈からへパリンコートしたシ リンジを用い、 約 0.2mLを採血した。 直ちに、 13800rpm、 4 °Cにて 遠心分離し（EF- 1300、 ECO- Fuge (商標）、 トミー精ェ）、 血漿を回収 し、 分析まで一 30°Cで保存した。 ヒ トインターフェロン一 ELISA キッ ト （PBL Biomedical Laboratories)を用い、 血漿中濃度を測定 した。
測定結果を図 2に示した。 ミセル化により血漿中濃度の滞留性が 向上した。 さらにノンコンパ一トメントモデルに従い計算した薬物 動態パラメーターを下に示す。 薬物動態 0.9% NaCl PEG-POLA PEG-PBLA パラメーター 溶液 12-40 (65)ミセル 12-50 (65)ミセル
AUCin[ (% dose/mL-h) 0.20 7.0 3.5
Figure imgf000038_0001
CI (mL/h/body) 491 14.4 28.9
MRTint (h) 0.2 3.2 0.4
Vss (mL/body) 81 46 12 ミセル化により AUCは Π倍から 35倍増加した。 この結果は、 タン パク質内包ミセルが血中においても初期にバース トすることなく、 長時間に亘り血中に滞留することを示している。 また、 生体内にお けるタンパク遊離速度は、 インビトロの結果と同様に、 疎水基の構 造に依存することを示している。 実施例 1 0 (FITC標識リゾチウム内包ミセルのラッ ト静脈内投与 試験）
1 ) リゾチウムの FITC標識化
リゾチウム （卵白由来） （シグマ一アルドリ ッチ） lOOmgを lOOmM ホウ酸緩衝液 （pH8.5) 2 mLに溶解後、 FITC (PIERCE)の 50mg/mL D MS0溶液 170 Lを添加した。 室温にて 1時間攪拌後、 ゲルろ過 （G Eヘルスケアバイオサイエンス社、 PD— 10) (溶離液 ·· 20mMリン酸 ナトリウム緩衝液 pH7.4) にて未反応の FITCを除いた。 さらに水 に対し 4°Cで透析した後、 もう一度ゲルろ過 （シグマ一アルドリツ. チ社、 Sepharose (登録商標） CL一 4B) (溶離液 ： 20mMリン酸ナト リウム緩衝液 PH7.4) にて精製した。 2 ) FITC標識リゾチウム内包ミセルの調製とラッ ト P K試験
40m gのブロックコポリマー、 PEG— P0LA 12— 40 (65)をガラス バイアル中に精秤し、 FITC標識リゾチウム 4mg(29.2mgZmL、 137 L) 、 続いて 20mMリン酸ナトリウム緩衝液 （pH6.0) 500 Lを添加 した。 4°Cで一晩攪拌した後、 パイオデイスラブター （日本精機製 作所 High Power Unit) を用い、 氷冷下、 約 10秒間 （ 1秒間欠 、 出力 ： Low) 超音波照射した。 超遠心 （80， OOOrpiiu 1時間、 4 °C 、 ベックマン社、 MLA— 80ロータ一） により、 沈殿として回収した ミセル画分を 20mMリン酸ナトリウム緩衝液 （pH7.4) Z 5 %ダルコ ースに懸濁した後、 同様の超遠心操作にて洗浄し、 再び、 同緩衝液 に懸濁した後、 以下のラッ 卜投与試験に用いた。
6週齢の Wis tar系雄性ラッ トを 1群 3匹に区分し、 上記の被験液 を 10mg/kgの FITC標識リゾチウム投与量になるよう尾静脈より投与 した。 投与から 5分、 1、 3、 6、 9及び 24時間後に頸静脈からへ パリンコートしたシリ ンジを用い、 約 0.2niL採血した。 直ちに、 4 °Cにて遠心分離して （EF— 1300、 ECO-Fuge (商標） トミ一精ェ） 、 血漿を回収し、 分析まで一 で保存した。 FITC標識リゾチウム 溶液 （20mMリン酸ナトリウム緩衝 pH7.4Z5%グルコース） も同様 に実験した。 以下の HPLC条件にて、 血漿中濃度を測定した。 システム ： Waters Alliance System
カラム ： Tosoh TSK- gel Super SW3000 (4.6 X 300mm) (30
°C )
移動相 ： 20mMリン酸ナトリゥム緩衝液 （pH7.4)
流速 ： 0.25mL/min
検出 ： 蛍光 （Ex： 492nm, Em： 520nm)
インジェクション体積 ： 10 L 測定結果を図 3に示した。 溶液投与の場合と比較し、 ミセル化に よりに AUCは約 15倍増加した。 この結果は、 ミセルに内包された夕 ンパク質が血中においても初期にバース トすることなく、 長時間に 亘り血中に滞留することを示している。 実施例 1 1 (インターフェロン— 内包ミセルの静脈投与試験 2 )
ブロックコポリマーには、 ポリエチレングリコールー コ 一ポリア スパラギン酸ドデシルエステル （以下、 PEG— PDLAという。 本ポリ マーは、 ドデシルエステルが導入されていないァスパラギン酸残基 は、 一般式 （ I ) 中の R5がー〇—、 R6が水素原子である。 以下同 様。 ） またはポリエチレングリコール—コーポリアスパラギン酸へ キサデシルエステル (以下、 PEG— PHLAという。 尚、 キサデシルェ ステルが導入されていないァスパラギン酸残基は、 一般式中の R5 が— O —、 R6が水素原子である。 以下同様） を用いた。 ガラスバ ィアル中に 200mgの PEG— PDLA12— 40 ( 65) または PEG— PHLA12— 40 (65) を精秤し、 20mM MES緩衝液 （pH5.0) を 10mL加え、 4 °Cで激 しく終夜撹拌した。 ポリマー分散液をバイオディスラブ夕一 （日本 精機製作 High Power Unit) を用い、 氷冷下、 約 15分間 （ 1秒 間欠、 出力 ： Low) 超音波処理し、 20mgZmLのポリマ一濃度となる よう、 空ミセル溶液を得た。 マイクロチューブ （家田化学） に空ミ セル溶液 0.65mLを移し、 ここにリコンビナン卜ヒ トインタ一フエ口 ンー aPBS溶液 （IFN— 、 PBL Biomedical Laboratories) 65 L と 0. 1M MES緩衝液 （PH5. 0) 50 Lを加え、 軽く ピペッティ ングし た後、 4 で 4 日間静置した。 限外ろ過ユニッ ト [ミ リポア アミ コン （登録商標） ウルトラ一 4 (分画分子量 ： 100, 000) ] で 5 % グルコース溶液にて洗浄 · 濃縮し、 以下の動物実験に用いた。 6週齢の Wistar系ラッ トを 1群 3匹に区分し、 上記の被験液を 1 X106 IUZkgの投与量になるように尾静脈より投与した。 投与から 5分、 1、 3、 6および 24時間後に頸静脈からへパリンコートした シリンジを用い、 約 0.2mL採血した。 直ちに、 13, 800rpm、 4 °Cにて 遠心分離して（EF— 1300、 ECO-Fuge (商標） トミ一精ェ） 、 血漿を 回収し、 分析まで一 30°Cで保存した。 ヒ トインタ一フエロン一 aEL ISAキッ ト （PBL Biomedical Laboratories) を用い、 血漿中濃度を 測定した。
インターフェロン— a内包高分子ミセルを生体投与した後のイン ターフェロン一 血漿中濃度の経時変化を図 4に示した。 ミセル化 により AUCは、 PEG— PDLA12— 40 ( 65) を用いた場合では 32倍、 PEG -PHLA12 - 40 (65) を用いた場合では 27倍増加した。 実施例 1 2 (インターフェロン一 内包ミセルの静脈投与試験 3 )
ブロックコポリマーには、 ポリエチレングリコール一コーポリグ ル夕ミン酸ォクチルエステル （以下、 PEG— P0LGという。 本ポリマ 一は、 ォクチルエステルが導入されていないダルタミン酸残基は、 一般式 （ I ) 中の R5がー 0—、 R6が水素原子である。 以下同様。 ) を用いた。 ガラスバイアル中に 150mgの PEG— P0LG12— 40 ( 65) を 精秤し、 20mM MES緩衝液 （pH5.0) を 5 m L加え、 4 °Cで激しく終 夜撹拌した。 ポリマー分散液をバイオディスラブター （日本精機製 作 High Power Unit) を用い、 氷冷下、 約 15分間 （ 1秒間欠、 出 力 ： Low) 超音波処理し、 30 mg/mLのポリマー濃度となるよう、 空 ミセル溶液を得た。 クライオバイアル （家田化学） に空ミセル溶液 0.6mLを移し、 ここにリコンビナントヒ トイン夕一フエロン一 a溶 液 （IFN— 、 PBL Biomedical Laboratories) 90 Lと 0. 1M MES緩 衝液 （pH5.0) 110 Lを加え、 軽く ピペッティ ングした後、 4^Cで 3 日間静置した。 マイクロチューブに 400 M L分注し、 20mM MES緩 衝液（pH5.0)を加えて 500 M Lとした後、 限外ろ過ユニッ ト [ミ リポ ァ アミコン （登録商標） ウルトラ一 4 (分画分子量 ： 100， 000) ] で 5 %グルコース溶液にて洗浄 · 濃縮し、 以下の動物実験に用いた
6週齢の Wis tar系ラッ トを 1群 2匹に区分し、 上記の被験液を 1 X106 IUZkgの投与量になるように尾静脈より投与した。 投与から 5分、 1、 3、 6および 24時間後に頸静脈からへパリンコートした シリンジを用い、 約 0.2mL採血した。 直ちに、 13, 800rpm、 4°Cにて 遠心分離して （EF— 1300、 ECO— Fuge (商標）、 トミー精ェ） 、 血漿 を回収し、 分析まで一 30°Cで保存した。 ヒ トインターフェロン一 α ELISAキッ ト （PBL Biomedical Laboratories) を用い、 血漿中濃度 を測定した。
インターフェロン一 α内包高分子ミセルを生体投与した後のイン ターフェロン一 α血漿中濃度の経時変化を図 5に示した。 ミセル化 により AUCは 57倍増加した。 実施例 1 3 (メリチン内包ミセルの調製）
ブロックコポリマーには、 PEG— P0LA 12— 40 (65)または PEG—P0 LG 12— 40 (65)を用いた。 ガラスバイアル中にポリマーを 150mg精 抨し、 20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4)を 5 mL加え、 4 °Cで 激しく撹拌した。 ポリマー分散液をバイオディスラブター （日本精 機製作 High Power Unit) を用い、 氷冷下、 約 1 5分間 （ 1秒 間欠、 出力 ： Low) 超音波処理し、 30 mgZmLのポリマ一濃度となる よう、 空ミセル溶液を得た。 20 リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4) を加えて lOmg/mUlmL)に調整し、 塩基性のポリべプチドであるメ リチン （シグマ一アルドリ ッチ社） （ l m g) を加え、 4で下で終 夜静置した後、 ゲルろ過 （GEヘルスケアバイオサイエンス社、 Seph arose (商標登録） CL一 4B： 1 φ X30c m) を行った。 回収したフ ラクシヨン （溶離液 ： 20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4)、 流速 ： 1. OmL/min, フラクショ ン体積 ： 1 mL ) 中のメリチン濃度を BC A Protein Assay (PIERCE社）で測定した。 内包率は以下の式から 求めた。
(ミセル画分中のタンパク量） X 100
内包率 (%) =
全画分中のタンパク量の総和 内包率は PEG— P0LA 12— 40 (65)で 71%、 PEG-P0LG 12 - 40 (65) で 48%であった。 この結果は、 分子量が約 2， 800のポリペプチドを 効率よく内包できることを示している。
実施例 1 4 (ヒ ト顆粒球コロニー刺激因子内包ミセルのラッ ト静 脈内投与試験 1 )
ブロックコポリマーには、 ポリエチレングリコール一コーポリア スパラギン酸ォクチルアミ ド （以下、 PEG— P0NLAという。 本ポリマ —は、 一般式 （ I ) 中の R5が— NH—、 R6がォクチル基であるァ ミノ酸残基を 50%有し、 R5がー NH―、 R6がアミノ基で置換され たォクチル基であるアミノ酸残基を 50%有する。 以下同様） を用い た。 ガラスバイアル中に 30mgの PEG— P0NLA12— 40 (50)を精枰し、 5 %グルコース含有 20mMリン酸緩衝液（pH7.4)を 2 mL加えた後、 A ィオデイスラブター （日本精機製作所 High Power Unit) を用 い、 氷冷下、 10分間 （ 1秒間欠、 出力 ： Low) の超音波照射を行い 、 空ミセルを調製した。 ここに、 リコンビナント ヒ ト顆粒球コロ ニー刺激因子 （G— CSF、 Green Cross社） （ p i約 6.0) ( 300 g /mL、 l mL) を加え、 4 °Cで一昼夜静置した。 その後、 限外ろ 過ユニッ ト [ミ リポア アミコン （登録商標） ウルトラ— 4 (分画 分子量 ： 100, 000) ] により、 内包されなかった G— CSFを除き、 以 下の動物実験用ミセルとした。
6週齢の Wistar系雄性ラッ トを 1群 3匹 （溶液は 1群 6匹） に区 分し、 上記の被験液を 100^ g / k gの投与量になるよう尾静脈よ り投与した。 投与から 5分、 1、 3、 6、 24時間後に頸静脈からへ パリンコートしたシリンジを用い、 約 0.2mLを採血した。 直ちに、 1 3, 800rpm、 4でにて遠心分離し （EF— 1300、 ECO-Fuge (商標） 、 トミ一精ェ） 、 血漿を回収し、 分析まで— 30°Cで保存した。 RayBio (登録商標） Human G—CSF ELISA kit (RayBiotech inc)を用 い、 血漿中濃度を測定した。
測定結果を図 6に、 ノンコンパートメントモデルに従い計算した 薬物動態パラメーターを表 2に示す。 ミセル化により AUCは 3倍に 増加し、 半減期は 2倍に延長した。
表 2 ヒ ト顆粒球コロニー刺激因子内包高分子ミセル、 またはヒ ト 顆粒球コロニー刺激因子溶液をラッ 卜に静脈内投与した際の薬物動 態パラメ一ターを示す。 薬物動態 饰 PEG-P0NLA
パラメ一夕一 滅 12- 40 (50)ミセル
AUCinI (% dose/mL-h) 7.4 22
T1/2 (h) 2.6 4.1
CI (mL/h/body) 13 4.4
MRTinJ (h) 1.9 2.8
Vss (mL/body) 25 13 実施例 1 5 (ヒ ト顆粒球コロニー刺激因子内包ミセルのラッ ト静 脈内投与試験 2 ) プロックコポリマーには、 PEG— P0LGを用いた。 ガラスバイアル 中に 30mgの PEG— P0LG12— 40 (65)を精秤し、 20mM MES緩衝液（pH5.0 )を 2 mL加えた後、 バイオディスラブター （日本精機製作所 Hig h Power Unit) を用い、 氷冷下、 10分間 （ 1秒間欠、 出力 ： Low ) の超音波照射を行い、 空ミセルを調製した。 ここに、 リコンビナ ント ヒ ト G— CSF溶液（Green Cross社） （ 300 g ZmL、 1 m L ) を加え、 4 °Cで一昼夜静置した。 その後、 限外ろ過ユニッ ト [ミ リポア アミコン （登録商標） ウルトラ一 4 (分画分子量 ： 100, 000 ) ] により、 内包されなかった G— CSFを除き、 5 %グルコース含有 20mMリ ン酸緩衝液（pH7.4)で希釈し、 動物実験用ミセルとした。 ミ セルは、 実施例 12と同様に G— CSFとして 100 g /mLの投与量で ラッ 卜に静脈内投与した。 同じように採血し、 血漿中濃度を測定し た。
測定結果を図 7に、 ノンコンパートメントモデルに従い計算した 薬物動態パラメーターを表 3に示す。 ミセル化により AUCは 15倍に 増加、 半減期は 5倍に延長し、 投与 120時間後においても血漿中濃 度を検出することができた。 この結果は、 タンパク質内包ミセルが 血中においても初期バース トすることなく、 長時間に亘り血中に滞 留することを示している。
表 3 ヒ ト顆粒球コロニ一刺激因子内包高分子ミセル、 またはヒ 卜 顆粒球コロニー刺激因子溶液をラッ 卜に静脈内投与した際の薬物動 態パラメ一夕一を示す。 薬物動態 PEG-P0LG
パラメーター 12-40 (65)ミセル
AUCint (% dose/mL-h) 7. 4 111
Τ1/2 (h) 2. 6 14
CI (mL/h/body) 13 0. 90
MRTinf ( ) 1. 9 12
Vss (mL/body) 25 11 これまでの本発明の説明は実例と説明のための例示的なものであ る。 本発明の概念及び範囲を逸脱することなく種々の改変を行い得 ることが理解されるべきである。 従って、 請求の範囲はそのような 改変の全てを包含するものと解されることを意図するものである。

Claims

1. タンパク質またはポリペプチドが内包された、 ポリエチレン グリ コールからなる親水性セグメン トと、 酸性アミノ酸、 その疎水 性誘導体及び酸性アミノ酸とその疎水性誘導体の混合物から選択さ れるポリアミノ酸からなる疎水性セグメン トを有するブロックコポ リマーを含有する高分子ミセル組成物。
育
2. 前記酸性アミ ノ酸の疎水性誘導体が、 酸性アミノ酸アルキル エステルまたは酸性アミノ酸アル 4キルアミ ドである、 請求項 1記載
5
の組成物。
3. 前記酸性アミノ酸が、 ァスパラギン酸またはグルタミ ン酸で
西
ある、 請求項 1記載の組成物。
4. ブロックコポリマーが、 下記式（I)または （II) である請求 項 1記載の組成物。
(0CH2
Figure imgf000047_0001
CHNHh一 R2
I I ( I )
(CH2) y C=0
I I
C=0 R5
I I
R5 R6
R6
または
(0CH2 CH2½- L2 (NHCHCOh—— (NHCH 7 CO ~~ R4
I I (ID
(CH2)y C=0
I i
C=0 5
I I I
R6 上記各式中 および R3は、 それぞれ独立して、 水素原子または 保護されていてもよい官能基が置換したもしくは未置換の低級アル キル基を表し、 R2は水素原子、 飽和もしくは不飽和の C；〜 C 2 !)脂 肪族カルポニル基またはァリ一ルカルポ二ル基を表し、 R4は水酸 基、 飽和もしくは不飽和の C ,〜 C3 Q脂肪族ォキシ基またはァリー ルー低級アルキルォキシ基を表し、 R 5は一 O—または一 N H—を 表し、 R6は、 水素原子、 フエニル基、 一 （C H2) 4—フエニル基 、 未置換もしくは、 アミノ基または力ルポキシル基で置換された C 4〜 C 16アルキル基、 またはベンジル基を表し、 R7はメチレン基を 表し、 nは 10〜2500の整数であり、 Xは 10〜300となる整数であり 、 mは 0〜300となる整数であり （但し、 mが存在する場合、 （C O C HNH)のユニッ トと （C〇 R7 C HNH) のュニッ 卜はランダ ムに存在し、 R6は 1つのブロックコポリマ一内の各アミノ酸ュニ ッ トにおいて任意に選択可能であり、 ランダムに存在するが、 R6 が水素原子である場合は R6全体の 6 0 %以下である） 、 yは 1又 は 2の整数を表し、 は— NH—、 一〇一、 — 0— Z— NH—、 一 C O—、 一 C H2—、 一 O— Z— S— Z—および一 O C O— Z— NH - (ここで、 Zは独立して C i〜C6アルキレン基である。 ） か らなる群より選ばれる連結基を表し、 L2がー O C O— Z— C O— および一 NH C〇一 Z— C O— (ここで、 Zは C ,〜 C6アルキレン 基である。 ） から選択される連結基を表す。
5. 前記ブロックコポリマーが、 ポリアミノ酸側鎖のエステル化 又はアミ ド化率 40〜100%である、 請求項 4記載の組成物。
6. 前記タンパク質またはポリペプチドの等電点 （ p i ) が 3〜 1 1. 5である、 請求項 1〜 5のいずれか 1項記載の組成物。
7. 請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の高分子ミセル組成物の 調製方法であって、 前記ブロックコポリマーと前記タンパク質また はポリペプチドとを混合し、 当該タンパク質またはポリペプチドの 等電点 （ p i ) とは異なる p Hに当該混合液の p Hを調整すること で当該ブロックコポリマーから構成されるミセルの疎水性コア領域 —に当該タンパク質またはポリペプチドを内包させる工程を含んでな り、
ここで当該タンパク質またはポリペプチドの p I 、 当該ブロック コポリマーの,疎水性セグメント中の酸性アミノ酸及び Z又はその誘 導体の等電点 （ p I ' ) 及び前記 p I とは異なる p Hは、
p I > p H > p I '
の関係にあり、 故に当該 p Hにおいて当該ブロックコポリマーの 疎水性セグメントは負に帯電し、 かつ当該タンパク質またはポリべ プチドは正に帯電するか、 または
p i ' > p H > p I
の関係にあり、 故に当該 p Hにおいて当該ブロックコポリマーの 疎水性セグメントは正に帯電し、 かつ当該タンパク質またはポリべ プチドは負に帯電する、
ことを特徴とする、 方法。
8 . 前記 p Hが前記夕ンパク質またはポリペプチドの p I から 1 以上離れている、 請求項 7記載の方法。
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