CN103120644B - 生物功能性蛋白大分子的两亲嵌段共聚物胶束及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有治疗作用的生物功能性蛋白大分子的两亲嵌段共聚物胶束，提高有治疗作用的生物功能性蛋白大分子生物利用度，延长其半衰期；同时提供一种胶束的制备方法。本发明将生物功能性蛋白大分子（促红细胞生成素，干扰素，抗体等）成功包入嵌段聚合物胶束，粒径小于100nm,Zeta电位接近0mv,包封率显著提高。生物功能性蛋白大分子胶束大大提高了蛋白的稳定性，胶束溶液制成注射制剂或注射用冻干制剂用于临床，实现药物的长效缓释，提高生物利用度。
Description
技术领域
本发明涉及含有治疗作用的生物功能性蛋白大分子的两亲嵌段共聚物胶束及其制备方法以及该胶束在药物制剂中的应用。
背景技术
蛋白药物是生物技术药物中很重要的一类，一般通过静脉和皮下注射给药。经静脉和皮下注射后常伴有蛋白质降解，导致活性降低，生物利用度低，要达到需要的血药浓度和治疗效果需要反复给药，不仅给患者带来不便，且易产生耐受性，耐药性及免疫原性等不良反应，因此临床上需要研制长效的蛋白药物制剂。目前延长蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理：1、增大蛋白药物的分子量，减少肾小球滤过率；2、用游离型药物和结合型药物在血浆内形成平衡的特性，缓慢释放游离型蛋白药物，使结合型药物和游离型物的平衡向游离型药物方向移动；3、减少异源蛋白免疫原性，从而减少其体内清除率。方法主要有：构建突变体，PEG化修饰，血清白蛋白融合，但制备过程比较复杂，成本较高。
近几年，聚合物胶束以其制备简单，增加溶解及靶向作用等优点被越来越多的研发机构所关注。胶束粒径一般小于100nm,可以避免体内网状内皮组织(RES)的非选择性截留，从而实现药物的靶向供给, 而且避免快速的肾脏消除。
带正电的胶束很容易和血液中白蛋白发生吸附作用，带负电的有被血小板表面附着的倾向，而且电势绝对值越大，越容易吸附。胶束接近中性的表面可以减少胶束和这些成分吸附，提高在血液中稳定性。
聚合物胶束由疏水内核和亲水外壁组成，具有很多优点，如制备方法简单，增加溶解及靶向作用等。PEG，PEO是常用的亲水外壁，在胶束内核和水相外界中提供一个稳定的界面；PLA生物可降解性和生物相容性良好；目前PEG-PLA，PEG-PCL，PEO-PLA等嵌段聚合物胶束主要用于解决疏水性药物的溶解性，其中Sanyang公司Genexol PM在韩国已经上市，多柔比星与PEG-P(Asp)形成的聚合物胶束NK911在日本已经进入Phase II。但用于蛋白药物包封的报道特别是用于生物功能性蛋白大分子，目前还没有。
发明内容
本申请人经过深入研究，提供了一种含有治疗作用的生物功能性蛋白大分子的两亲嵌段共聚物胶束，所述聚合物胶束是指合成的两亲性嵌段共聚物在水相中自主装形成的一种热力学稳定的胶体溶液；所述有治疗作用的生物功能性蛋白大分子是指执行一些在体内的生物学功能，且分子量大于15K道尔顿的具有生物活性的蛋白质。胶束提高有治疗作用的生物功能性蛋白大分子生物利用度，延长其半衰期。
同时提供一种胶束的制备方法，包括将两亲性聚合物与有治疗作用的生物功能性蛋白大分子溶液注入到pH值为有治疗作用的生物功能性蛋白大分子等电点±2.0的缓冲溶剂，成功的将有治疗作用的生物功能性蛋白大分子（促红细胞生成素，干扰素，抗体等）包入嵌段聚合物形成胶束。
胶束含有治疗作用的生物功能性蛋白大分子和两亲嵌段共聚物，所述两亲嵌段共聚物为两亲性的人工合成聚合物及其衍生物，优选在生物功能性蛋白大分子中加入赖氨酸，更优选加入赖氨酸的量与生物功能性蛋白大分子的质量比至少大于1:1。
所述两亲嵌段共聚物亲水嵌段为聚乙二醇类、聚丙烯酸类、聚氧乙烯类、聚乙烯醇类，疏水嵌段为内酯类共聚物或均聚物；优选亲水嵌段是聚乙二醇，疏水嵌段是聚乳酸(PLA)或乳酸和乙醇酸的共聚物(PLGA)； 所述两亲嵌段共聚物，亲水嵌段具有500-30,000的重均分子量，疏水嵌段具有500-50,000的重均分子量；优选亲水嵌段重均分子量是4000-20,000，疏水嵌段重均分子量是5000-20,000。
所述治疗作用的生物功能的蛋白大分子为促红细胞生成素（EPO），干扰素，粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）, 曲妥珠单抗。
生物功能的蛋白大分子的等电点为促红细胞生成素（EPO）3.7-4.1 ；干扰素 5.7-6.2；细胞集落刺激因子 5.8-6.6；曲妥珠单抗8.5-9.2。
胶束中有治疗作用的生物功能性蛋白大分子与两亲嵌段共聚物的质量比为1:50~500，优选质量比为1:50~200。
胶束的制备方法，包括下列步骤：将两亲嵌段聚合物在有机溶剂中溶解或分散，将有治疗作用的生物功能性蛋白大分子用溶液溶解后，优选在生物功能性蛋白大分子溶液中加入赖氨酸，更优选加入赖氨酸的量与生物功能性蛋白大分子的质量比至少大于1:1，将两种溶液注入到pH值为有治疗作用的生物功能性蛋白大分子等电点±2.0的缓冲溶剂中，搅拌挥发除去有机溶剂，除去游离药物，制得粒径为10-1000nm的胶束溶液；所述有机溶剂为乙腈、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮等有机溶剂，或其混合溶剂；优选丙酮。所述缓冲溶液pH值优选为有治疗作用的生物功能性蛋白大分子等电点±1.0，最优为等电点；缓冲溶液为制剂研究及生产常用试剂，例如PBS，HEPES, 柠檬酸盐缓冲液等。
所述制备方法得到的有治疗作用的生物功能性蛋白大分子聚合物胶束制成注射液制剂或注射用冻干制剂，将胶束溶液按注射液制剂常用工艺，直接分装于安瓿或西林瓶中制得；或将胶束溶液冻干成固体粉末，按冻干制剂制备常用工艺，制成注射用冻干制剂。
实施例中采用的原料和检测方法如下：
有治疗作用的生物功能性蛋白大分子聚合物胶束的两亲嵌段共聚物制备，参考论文（硕士论文，PLA-PEG嵌段共聚物的合成及在组织工程药物释放中的应用，天津大学，2006；PEG-PCL,共聚物纳米粒降解行为及其用作药物载体的研究，上海交通大学，2008）制备PEG-PLA，PEG-PCL，PEO-PLA嵌段共聚物的方法，在辛酸亚锡催化下，PEG或PEO作为大分子引发剂，在无水无氧，120度下加热20h，引发丙交酯或己内酯聚合，最终形成PEG-PLA，PEG-PCL，PEO-PLA。
聚合物胶束的形貌的观察：用透射电镜（JEOL 100CX-II透射电子显微镜，日本电子光学公司）对胶束的形态进行观察，加速电压为80KV．将胶束的水溶液(1.0mg／m1)滴到表面附有Formar支撑膜的铜网上并用l％的磷钨酸染色，用滤纸吸去多余的水，在空气中将样品晾干后进行TEM观察。
聚合物载药胶束的平均粒径和Zeta电位： 将3ml聚合物载药胶束水溶液加入到比色皿中，采用动态光散射仪 (NicompTM380/ZLS PSS, USA)，激光源为He-Ne，波长633 nm，光散射角为90°，测试温度为25℃。测量其粒径和粒径分布。
附图说明
图1 胶束电镜图
图2 体外释放考察图
图3 大鼠体内血药浓度时间图
图4 胶束组和EPO组的血红蛋白浓度值与时间比图
图5 胶束组和EPO组的网织红百分比提高值与时间比图
图6 胶束在不同氯化钠浓度中稳定性
图7 胶束在不同pH PBS中稳定性
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 PEG-PLA(55)在pH7.4 PBS中制备EPO胶束
室温条件下（最佳低于25℃），20mg PEG-PLA(55)溶于1ml丙酮，400μl （0.2 mg ）EPO原液（50000IU/mlEPO，深圳新鹏生物工程有限公司，C20110501S），同时注入搅拌的PBS（10mM，pH7.4）中,转速1800rpm,(智能多点磁力搅拌器，ZNCL-DS，河南爱博特科技发展有限公司)搅拌挥发3小时，0.22μm膜过滤，用0.01N NaOH将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。胶束的粒径81nm,PI=0.21,Zeta电位为-0.8mv,EPO没有形成二聚体，包封率为27%。
实施例2 PEG-PLA(55)在pH4.5 PBS中制备EPO胶束
20mg PEG-PLA(55)溶于1ml丙酮，400μlEPO原液（50000IU/ml)，同时注入搅拌的PBS（10mM，pH4.5）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.22μm膜过滤，用0.01N NaOH将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径78nm,PI=0.25,Zeta电位为-1.5mv, EPO没有形成二聚体，包封率为54%。
实施例3 PEG-PLA(55)在pH3.8 PBS中制备EPO胶束
20mg PEG-PLA(55)溶于1ml丙酮，400μlEPO原液（50000IU/ml)，同时注入搅拌的PBS（10mM，pH3.8）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.22μm膜过滤，用0.01N NaOH将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径76nm,PI=0.19,Zeta电位为-0.3mv,EPO没有形成二聚体，包封率为71%，胶束电镜图见附图1。
实施例4 PEG-PCL（54） 在pH2.5 PBS中制备EPO胶束
20mg PEG-PCL(54)溶于1ml丙酮，400μl EPO原液（50000IU/ml)，同时注入搅拌的PBS（10mM，pH2.5）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.22μm膜过滤，用0.01N NaOH将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径78nm,PI=0.32,Zeta电位为-0.9mv,EPO没有形成二聚体，包封率为51%。
实施例5 PEG-PLA(55)在pH1.5 PBS中制备EPO胶束
20mg PEG-PLA(55)溶于1ml丙酮，400μl EPO原液（50000IU/ml)，同时注入搅拌的PBS（10mM，pH1.5）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.22μm膜过滤，用0.01N NaOH将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径66nm,PI=0.39,Zeta电位为-1.9mv,EPO没有形成二聚体，包封率为28%。
实施例6 PEG-PLA(82)在pH3.8 PBS中制备EPO胶束
40mg PEG-PLA（82）溶于1ml丙酮，400μl EPO原液（50000IU/ml)，同时注入搅拌的HEPES（pH3.8）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.22μm膜过滤，用0.01N NaOH将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径166nm,PI=0.23,Zeta电位为-4mv, EPO没有形成二聚体，包封率为70%。
实施例7 PEG-PLA(82)在pH3.8 PBS中制备EPO胶束
100mg PEG-PLA（82）溶于1ml丙酮，400μl EPO原液（50000IU/ml)，同时注入搅拌的HEPES（pH3.8）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.22μm膜过滤，用0.01N NaOH将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径161nm,PI=0.27,Zeta电位为-3.8mv, EPO没有形成二聚体，包封率为68%。
实施例8 PEG-PLA(105)在pH3.8 PBS中制备EPO胶束
10mg PEG-PLA(105)溶于1ml丙酮，400μl EPO原液（50000IU/ml)，同时注入搅拌的柠檬酸盐缓冲液（pH3.8）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.45μm膜过滤，用0.01N NaOH将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径94nm,PI=0.246,Zeta电位为-2.3mv,EPO没有形成二聚体，包封率为57%。
实施例9 PEO-PLA(57) 在pH3.8 PBS中制备EPO胶束
20mg PEO-PLA(57)溶于1ml乙腈，400μl EPO原液（50000IU/ml)，同时注入搅拌的PBS（10mM，pH3.8）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.22μm膜过滤，用0.01N NaOH将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径81nm,PI=0.22,Zeta电位为-2.3mv,EPO没有形成二聚体，包封率为64%。
实施例10 载干扰素(IFN)的PEG-PLA（55）胶束制备
20mg PEG-PLA(55)溶于1ml二甲基甲酰胺， 100μl IFN原液（2mg/ml, 大连保税区联合博泰生物技术有限公司）同时注入搅拌的PBS（10mM，pH6.0）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.45μm膜过滤，用0.01N NaOH将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径83nm,PI=0.24,Zeta电位为-1.7mv,包封率为71%。
实施例11 载粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)的PEG-PLA（55）胶束制备
20mg PEG-PLA(55)溶于1ml乙腈，1ml粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)原液（0.2mg/ml,深圳新鹏生物工程有限公司），同时注入搅拌的PBS（10mM，pH6.2）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.45μm膜过滤，用0.01N HCL将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径82nm,PI=0.22,Zeta电位为-0.9mv,包封率为70%。
实施例12 载曲妥珠单抗的PEG-PLA（55）胶束制备
20mg PEG-PLA（55）溶于1ml丙酮，100μl曲妥珠单抗原液（0.1mg/ml，新加坡A-Bio有限公司）同时注入搅拌的PBS（10mM，pH9.0）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.45μm膜过滤，用0.01N HCL将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径90nm,PI=0.28,Zeta电位为-0.8mv,包封率为68%。
实施例13 载曲妥珠单抗的PEG-PLA（55）胶束制备
20mg PEG-PLA（55）溶于1ml丙酮，100μl曲妥珠单抗原液（0.1mg/ml，新加坡A-Bio有限公司）同时注入搅拌的PBS（10mM，pH6.0）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.45μm膜过滤，用0.01N HCL将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径97nm,PI=0.33,Zeta电位为-1.2mv,包封率为32%。
实施例14 PEG-PLA(55)在pH3.8 PBS中制备EPO胶束
20mg PEG-PLA(55)溶于1ml丙酮，400μl EPO溶液（50000IU/ml），溶液中含有0.2mg 赖氨酸，同时注入搅拌的PBS（10mM，pH3.8）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.22μm膜过滤，用0.01N NaOH将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径74nm,PI=0.17,Zeta电位为-0.35mv,EPO没有形成二聚体，包封率为73%。
实施例15 PEG-PLA(55)在pH3.8 PBS中制备EPO胶束
20mg PEG-PLA(55)溶于1ml丙酮，400μl EPO溶液（50000IU/ml），溶液中含有1 mg赖氨酸，同时注入搅拌的PBS（10mM，pH3.8）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.22μm膜过滤，用0.01N NaOH将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径76nm,PI=0.20,Zeta电位为-0.28mv,EPO没有形成二聚体，包封率为72%。
实施例16 PEG-PLA(55)在pH3.8 PBS中制备EPO胶束
20mg PEG-PLA(55)溶于1ml丙酮，400μl EPO溶液（50000IU/ml），溶液中含有20 mg赖氨酸，同时注入搅拌的PBS（10mM，pH3.8）中,转速1800rpm,搅拌挥发3小时，0.22μm膜过滤，用0.01N NaOH将制得的溶液pH调为7.0即得载药胶束。粒径75nm,PI=0.19,Zeta电位为-0.33mv,EPO没有形成二聚体，包封率为74%。
实施例17 注射剂
取实施例3制备得到的蛋白药物胶束溶液1000ml，灭菌，调节渗透压，分装于安瓿或西林瓶中，制成 1000瓶。
实施例18 注射用冻干制剂
取实施例3制备得到的蛋白药物胶束溶液1000ml，灭菌，调节渗透压，分装于安瓿或西林瓶中，冻干，制成 1000瓶。
试验例1：体外释放性能的研究
量取1ml载药胶束（所述胶束参照实施例3制备，所述加入赖氨酸胶束参照实施例14-16制备）溶液和EPO原液封于透析袋（Spectra/Por CE Biotech Membrane, 300K MWCO）中，置于40ml 的体外释放液（PBS,100mM,120mOsm/kg,pH7.4）中（平行3份），37℃恒温摇床（哈东联水浴恒温振荡器HZS-H，50rpm）中振荡24h，每隔一段时间取出5ml释放介质，同时补充等体积的新鲜体外释放液。SEC-HPLC测定蛋白的含量，体外释放考察图见附图2 。
表一 体外累积释放-时间（一）
表一 加入赖氨酸的胶束体外累积释放-时间（二）
结果显示：生物功能性蛋白大分子（例如EPO）形成胶束后，可以明显提高稳定性。释放5小时，EPO原液组只有16.68%的原药释放出来，且之后便不再释放。透析袋内有大量的二聚体产生。而胶束组，5小时释放42.7%，10小时释放43.8%，赖氨酸胶束组，5小时释放78.63%，10小时释放98.92%，胶束与原液相比，有更多的药物释放，且透析袋内，EPO聚合体含量也较少。因此胶束有利于临床应用，减少药物的用量和副反应。
试验例2：大鼠药代动力学
SD大鼠体重（250-280g, n=5）,共2组，分别为EPO胶束（所述胶束参照实施例3制备，所述加入赖氨酸胶束参照实施例14-16制备）和EPO原液给药组。给药剂量约为2000IU/KG。在预定时间进行眼眶取血，约300μl血样, 13000rpm, 离心5分钟，得到血浆样品，-70℃保存备用。大鼠促红细胞生成素ELISA试剂盒（R&D Systems,Minneapolis, USA)测定血浆样品中EPO的含量，大鼠体内血药浓度时间图见附图3。
表二 药代动力学参数（一）
表二 加入赖氨酸的胶束药代动力学参数（二）
结果显示：生物功能性蛋白大分子（例如EPO）形成胶束后，与EPO原液相比相对生物利用度为170%。胶束大大提高了EPO的AUC，且延长半衰期约2.5倍。加入赖氨酸的胶束在体内释放比较平缓，AUC 提高4.5倍。
试验例3：血红蛋白浓度结果
EPO胶束（所述胶束为实施例3制备），药剂量2000IU/KG,静脉给药，血样制得方法参见试验例2，立刻与分析仪提供的缓冲液混合，分析仪进行测定，血样中血红蛋白浓度通过动物血细胞分析仪 (HEMAVET950, DREW SCIENTIFIC GROUP PLC, USA) 测定，通过students’t- test，第二天的血红蛋白浓度，2组数据相比P<0.05, 有差异，胶束组和EPO组的血红蛋白浓度值与时间比图见附图4。
表三 血红蛋白浓度提高值
结果显示：生物功能性蛋白大分子（例如EPO）形成胶束后，血红蛋白浓度在第二天时胶束组的大鼠血红蛋白浓度达到21g/L，而原液组的血红蛋白浓度只有12g/L，提高了75%。
试验例4：、提高网织红细胞百分比测定
EPO胶束（所述胶束为实施例3制备），血样制得方法参见试验例2，立刻与适量快速网织红细胞染色液（山东潍坊市康华生物技术有限公司）混合，然后滴在载玻片上涂板。于显微镜（奥林巴斯，IX71）下计数1000个红细胞中网织红细胞的个数，计算其百分数，通过students’t- test，2组数据相比，P<0.05, 有差异。胶束组和EPO组的网织红百分比提高值与时间比图见附图5。
表四 网织红细胞百分比提高值
结果显示：生物功能性蛋白大分子（例如EPO）形成胶束后，胶束组网织红细胞百分比在第六天时，与EPO原液相比仍提高了27%；一直到给药后第7天，胶束组的网织红细胞百分比始终高于原液组。
试验例5： 胶束在4℃稳定性试验
将10ml胶束（所述胶束为实施例3制备）溶液置于4℃冰箱内保存，分别于第0，3,7,14,30,60,90,120,150d,测定胶束粒径大小变化。
表五 胶束在4℃稳定性
结果显示：生物功能性蛋白大分子（例如EPO）形成胶束后，在五个月内，在4℃条件下胶束是稳定的，因此，蛋白药物形成胶束后适宜制成注射剂或冻干制剂。
试验例6： 胶束在不同pH,不同氯化钠浓度溶液中稳定性
2ml胶束（所述胶束为实施例3制备）溶液与2ml PBS（pH为2.0，4.5,7.4,10.4；氯化钠浓度为0,80,150,300,600mM）混合，测定胶束溶液粒径的变化，考察其在不同pH，不同氯化钠浓度的PBS中的稳定性，胶束在不同氯化钠浓度中稳定性见附图6，胶束在不同pH PBS中稳定性见附图7。
表六 胶束在不同pH PBS中稳定性
表七 胶束在不同氯化钠浓度PBS中稳定性
结果显示：生物功能性蛋白大分子（例如EPO）形成胶束后，在pH 2.0-10.4中试验结果可知，胶束均稳定。 在氯化钠浓度0-300mM的PBS中,胶束粒径，分布系数均没有显著变化，因此，蛋白药物形成胶束后适宜制成注射剂或冻干制剂。
试验例7包封率的测定
包封率的测定方法：1ml丙酮加入至1ml胶束溶液，混合破坏胶束结构，通过PBS（10Mm,pH7.4）进行2次萃取，使蛋白溶液充分溶入水相中，SEC-HPLC测定水溶液中蛋白浓度，从而计算胶束溶液中蛋白浓度；与胶束溶液总体积的乘积即为加入蛋白的总量。胶束溶液通过超滤管（MWCO=100K）3500rpm， 20min离心（离心机, Sorvall Biofuge Primo R）除去游离药物。测定胶束内的蛋白浓度，方法同前。测定除去游离药物后的胶束体积，计算包入胶束内的蛋白含量。根据下列公式计算包封率。
表八 包封率结果
结果显示：在制备生物功能性蛋白大分子胶束时，缓冲溶剂的 pH值对包封率的影响最大，控制其它因素不变，调整缓冲溶剂pH值，当pH值为生物功能性蛋白大分子等电点±2.0时，胶束的包封率显著提高；当pH值为生物功能性蛋白大分子等电点时，胶束的包封率最高。
Claims (8)
1.一种胶束，其特征在于含有有治疗作用的生物功能性蛋白大分子和两亲嵌段共聚物，所述有治疗作用的生物功能性蛋白大分子是指执行一些在体内的生物学功能，且分子量大于15K道尔顿的具有生物活性的蛋白质，所述两亲嵌段共聚物为两亲性的人工合成聚合物及其衍生物，共聚物的亲水嵌段为聚乙二醇类、聚丙烯酸类、聚氧乙烯类、聚乙烯醇类，疏水嵌段为内酯类共聚物或均聚物，共聚物亲水嵌段具有500-30,000的重均分子量，疏水嵌段具有500-50,000的重均分子量，所述胶束中含有赖氨酸，赖氨酸与有治疗作用的生物功能性蛋白大分子的质量比大于1:1。
2.根据权利要求1所述的胶束，其特征在于所述亲水嵌段是聚乙二醇，疏水嵌段是聚乳酸或乳酸和乙醇酸的共聚物。
3.根据权利要求1所述的胶束，其特征在于所述亲水嵌段重均分子量是4000-2,0000，疏水嵌段重均分子量是5000-20,000。
4.根据权利要求1所述的胶束，其特征在于所述有治疗作用的生物功能性蛋白大分子为促红细胞生成素，干扰素，粒细胞集落刺激因子,曲妥珠单抗。
5.根据权利要求1所述的胶束，其特征在于所述有治疗作用的生物功能性蛋白大分子与两亲嵌段共聚物的质量比为1：50-500。
6.根据权利要求1所述的胶束，其特征在于所述有治疗作用的生物功能性蛋白大分子与两亲嵌段共聚物的质量比为1：50-200。
7.根据权利要求1所述的胶束的制备方法，包括下列步骤：将两亲嵌段聚合物在有机溶剂中溶解或分散，将有治疗作用的生物功能性蛋白大分子用溶液溶解后，将两种溶液注入到pH值为有治疗作用的生物功能性蛋白大分子等电点的缓冲溶剂中，搅拌挥发除去有机溶剂，除去游离药物，制得胶束溶液。
8.根据权利要求7的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为丙酮。
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