WO2011096558A1 - 易崩壊型ポリマーミセル組成物 - Google Patents

易崩壊型ポリマーミセル組成物 Download PDF

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WO2011096558A1
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block copolymer
hdl
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hydrophobic
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加藤　泰己
充訓 原田
美穂 大内
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ナノキャリア株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a polymer micelle composition and a pharmaceutical composition using the polymer micelle composition.
  • a method is known in which a block copolymer having a hydrophilic polymer chain segment and a hydrophobic polymer chain segment is used as a drug carrier, and a method of encapsulating a certain drug in a polymer micelle formed by the copolymer (for example, Patent Document 1 or 2).
  • a composition containing a homogeneous polymer micelle encapsulating a poorly water-soluble drug and a method for preparing the same are known (Patent Document 3).
  • Patent Document 1 or 2 discloses that micelles of block copolymers are formed in advance in an aqueous medium, drugs are added to these micelle solutions, and the micelles are mixed and stirred in some cases under heating or sonication. A method of encapsulating in is described.
  • Patent Document 3 describes a method of preparing a polymer micelle in which a drug is encapsulated by dissolving a block copolymer and a drug in a water-miscible polar solvent and then dialysis against water.
  • polymer micelles as a drug carrier has various advantages including sustained release of the drug.
  • the drug is very stably encapsulated in the micelle, which may inhibit the proper release of the drug.
  • the main object of the present invention is to provide a polymer micelle composition capable of stably encapsulating a drug and releasing it appropriately, and a pharmaceutical composition using the polymer micelle composition.
  • the present invention provides certain polymeric micelle compositions.
  • the polymer micelle composition contains a block copolymer having a hydrophobic polymer chain segment and a hydrophilic polymer chain segment.
  • the plurality of block copolymers are arranged radially with the hydrophobic polymer chain segment facing inward and the hydrophilic polymer chain segment facing outward.
  • the polymer micelle composition contains, as the block copolymer, a block copolymer having affinity for HDL and a block copolymer having affinity for lipoproteins other than HDL.
  • the hydrophobic polymer chain segment of the block copolymer having affinity for HDL is composed of a polyamino acid containing a repeating unit derived from a hydrophobic derivative of an amino acid.
  • the hydrophobic derivative of the amino acid is a derivative in which an aromatic group and / or a sterol residue is introduced into the side chain of the amino acid.
  • the hydrophobic polymer chain segment of the block copolymer having affinity for lipoproteins other than HDL is composed of a polyamino acid containing a repeating unit derived from a hydrophobic derivative of an amino acid.
  • the hydrophobic derivative of the amino acid is a derivative in which a hydrophobic group having a linear or branched structure is introduced into the side chain of the amino acid.
  • detachment of the block copolymer having affinity with the HDL is induced by adhesion of HDL due to the affinity.
  • the polymer micelle composition of the present invention controls the release rate of the drug by suppressing the promotion of the release of the drug to be encapsulated by reducing the gap by using a block copolymer having affinity for lipoproteins other than HDL. can do.
  • the present invention provides another predetermined polymer micelle composition from another aspect.
  • the polymer micelle composition contains a block copolymer having a hydrophobic polymer chain segment and a hydrophilic polymer chain segment.
  • the plurality of block copolymers are arranged radially with the hydrophobic polymer chain segment facing inward and the hydrophilic polymer chain segment facing outward.
  • the polymer micelle composition contains a block copolymer having affinity for HDL as the block copolymer.
  • the hydrophobic polymer chain segment of the block copolymer having affinity for HDL is composed of a polyamino acid containing a repeating unit derived from a hydrophobic derivative of an amino acid.
  • the hydrophobic derivative of the amino acid is a derivative in which a sterol residue is introduced into the side chain of the amino acid.
  • the hydrophilic polymer chain segment of the block copolymer having affinity for HDL is poly (ethylene glycol).
  • the attachment of HDL due to the affinity induces the elimination of the block copolymer having affinity with the HDL.
  • one kind of release selected from the group consisting of a water-soluble physiologically active polypeptide and protein having a molecular weight of 1500 or more, which is a drug to be encapsulated, is promoted.
  • the present invention provides a predetermined pharmaceutical composition from yet another aspect.
  • the pharmaceutical composition includes the above-described polymer micelle composition and one kind selected from the group consisting of a water-soluble physiologically active polypeptide and protein having a molecular weight of 1500 or more, which is a drug encapsulated in the polymer micelle composition. To do.
  • a polymer micelle composition capable of stably encapsulating a drug and appropriately releasing the drug, and a pharmaceutical composition using the polymer micelle composition can be provided.
  • the polymer micelle composition of the present invention contains a block copolymer having a hydrophobic polymer chain segment and a hydrophilic polymer chain segment.
  • the plurality of block copolymers are radially arranged with the hydrophobic polymer chain segment facing inward and the hydrophilic polymer chain segment facing outward.
  • the polymer micelle composition contains, as the block copolymer, a block copolymer having an affinity with HDL (high specific gravity lipoprotein) (hereinafter sometimes referred to as “HDL affinity block copolymer”).
  • the HDL affinity block copolymer is induced to be detached by the adhesion of HDL due to the affinity, and a gap is formed by the removal, thereby releasing the drug to be included. Is promoted. Adherence to HDL is confirmed by the presence of a block copolymer in the HDL fraction when the HDL fraction is purified after incubation of the polymer micelle composition in the presence of HDL (eg, in plasma). Can do.
  • Each of the “hydrophobic polymer chain segment” and the “hydrophilic polymer chain segment” is optional as long as a plurality of block copolymers having these two segments can form micelles arranged in the above-described state in an aqueous medium.
  • the degree of hydrophobicity and hydrophilicity may be as follows.
  • HDL 20 having an average particle size as small as about 10 nm contains HDL affinity block copolymer 10 having hydrophilic polymer chain segment 11 and hydrophobic polymer chain segment 12 in the blood. Can easily penetrate into the inner side of the polymer micelle (hydrophobic polymer chain segment region).
  • the HDL affinity block copolymer 10 interacts with HDL 20 that has penetrated to the hydrophobic polymer chain segment region due to its HDL affinity, and is preferentially desorbed from the polymer micelle when HDL 20 is attached. As a result, a gap is formed in the polymer micelle structure, and the encapsulated drug 50 is easily released.
  • LDL low density lipoprotein
  • VLDL very low density lipoprotein
  • the drug to be included in the polymer micelle composition is preferably one selected from the group consisting of water-soluble physiologically active polypeptides and proteins having a molecular weight of 1500 or more. Since these drugs have a relatively large size, they are difficult to leak from the small gaps between the block copolymers in conventional polymer micelles and may disappear from the blood together with the micelles without being fully released. . On the other hand, the polymer micelle composition according to the present invention exhibits a sustained release performance of a drug due to micelle formation, but is excellent in applications for promoting the release of such a relatively large drug as compared with conventional polymer micelles.
  • the polymer micelle composition according to the present invention has a block copolymer having affinity with lipoproteins other than HDL such as LDL and VLDL (hereinafter sometimes referred to as “HDL non-affinity block copolymer”).
  • HDL non-affinity block copolymer a block copolymer having affinity with lipoproteins other than HDL
  • the degree of promotion of drug release can be controlled.
  • the hydrophobic polymer chain segment of the HDL affinity block copolymer can be composed of polyamino acids.
  • the polyamino acid contains a repeating unit derived from a hydrophobic derivative in which a hydrophobic group having a cyclic structure is introduced into the side chain of the amino acid.
  • the hydrophobic derivative of an amino acid having a cyclic structure is preferably a hydrophobic derivative of an acidic amino acid such as aspartic acid and glutamic acid, and a hydrophobic group having a cyclic structure can be introduced into the carboxyl group of the acidic amino acid side chain .
  • the hydrophobic group having a cyclic structure may be a group having a monocyclic structure or a group having a polycyclic structure, and may be, for example, an aromatic group, an alicyclic group, or a sterol residue.
  • an alkyl group having a C 4 to C 16 cyclic structure, a C 6 to C 20 aryl group, a C 7 to C 20 aralkyl group, and a sterol residue are preferable.
  • a sterol means a natural, semi-synthetic or synthetic compound based on a cyclopentanone hydrophenanthrene ring (C 17 H 28 ), or a derivative thereof.
  • natural sterols include cholesterol, cholestanol, dihydrocholesterol, cholic acid, campesterol, cystosterol and the like.
  • the semi-synthetic or synthetic compounds include, for example, synthetic precursors of the natural sterols (if necessary, certain functional groups, some or all of the hydroxy groups are hydroxy groups known in the art). And a compound in which a carboxyl group is protected by carboxyl protection).
  • the sterol derivative may have a C 6 -C 12 alkyl group, a halogen atom such as chlorine, bromine and fluorine introduced into the cyclopentanone hydrophenanthrene ring within a range that does not adversely affect the object of the present invention.
  • the cyclopentanone hydrophenanthrene ring may be saturated or partially unsaturated.
  • the hydrophobic polymer chain segment of the HDL affinity block copolymer has other repeating units in addition to a repeating unit derived from a hydrophobic derivative of an amino acid having a cyclic structure, as long as the effects of the present invention are obtained. Also good.
  • Other repeating units include, for example, acidic amino acids such as glutamic acid and aspartic acid, and hydrophobic derivatives in which, for example, C 4 to C 16 unsubstituted or substituted linear or branched alkyl groups are introduced into the acidic amino acid.
  • the repeating unit derived from is mentioned.
  • the content of the repeating unit derived from the hydrophobic derivative of the amino acid having a cyclic structure is preferably 10 to 100 mol% with respect to all repeating units (100 mol%) constituting the hydrophobic polymer chain segment of the HDL affinity block copolymer. More preferably, it is 20 to 80 mol%. With such a content, affinity with HDL can be obtained more reliably.
  • hydrophilic polymer chain segment of the HDL affinity block copolymer examples include poly (ethylene glycol), polysaccharide, poly (vinyl pyrrolidone), poly (vinyl alcohol), poly (acrylamide), poly (acrylic acid), and poly (acrylic acid). Methacrylamide), poly (methacrylic acid), poly (methacrylic acid ester), poly (acrylic acid ester), polyamino acid, poly (malic acid) and derivatives thereof.
  • polysaccharides include starch, dextran, fructan and galactan.
  • the hydrophilic polymer chain segment and the hydrophobic polymer chain segment are linked by a known linking group.
  • the linking group include an ester bond, an amide bond, an imino group, a carbon-carbon bond, and an ether bond.
  • the end of the hydrophobic polymer chain segment opposite to the hydrophilic polymer chain segment side end and the end of the hydrophilic polymer chain segment opposite to the hydrophobic polymer chain segment side end adversely affect the formation of polymer micelles. There may be any chemical modification as long as it does not.
  • the HDL affinity block copolymer comprises poly (ethylene glycol) as a hydrophilic polymer chain segment and is composed of a polyamino acid containing a repeating unit derived from a hydrophobic derivative of an amino acid as a hydrophobic polymer chain segment.
  • the derivative may be a derivative in which a sterol residue is introduced into the side chain of an amino acid.
  • the HDL affinity block copolymer can be represented by the following general formulas (I) and (II).
  • the polymer micelle composition of the present invention may contain two or more types of HDL affinity block copolymers.
  • R 1 and R 3 each independently represents a hydrogen atom or a lower alkyl group substituted or unsubstituted with an optionally protected functional group
  • R 2 represents a hydrogen atom, a saturated or unsaturated C 1 -C 29 aliphatic carbonyl group or an arylcarbonyl group
  • R 4 represents a hydroxyl group, a saturated or unsaturated C 1 to C 30 aliphatic oxy group or an aryl-lower alkyloxy group
  • R 5 represents —O— or —NH—
  • R 6 represents a hydrogen atom, an alkyl group having a cyclic structure of C 4 to C 16 which is unsubstituted or substituted with an amino group or a carboxyl group, an aryl group of C 6 to C
  • L 1 is —NH—, —O—, —O—Z—NH—, —CO—, —CH 2 —, —O—Z—S—Z— and —OCO—Z—NH— (where Z Each independently represents a C 1 -C 6 alkylene group.)
  • L 2 represents a linking group selected from —OCO—Z—CO— and —NHCO—Z—CO— (wherein Z is a C 1 -C 6 alkylene group).
  • the C 6 -C 20 aryl group and the C 7 -C 20 aralkyl group preferably include a phenyl group, a naphthyl group, a tolyl group, a xylyl group, a benzyl group, and a phenethyl group, and more preferably a benzyl group.
  • the sterol from which the steryl group is derived preferably includes cholesterol, cholestanol, and dihydroxycholesterol, and more preferably cholesterol.
  • N in the above formulas is preferably an integer in the range of 10 to 1000, more preferably 20 to 600, particularly preferably 50 to 500.
  • X and m in the above formulas are each preferably an integer in the range of 20 to 200, more preferably 30 to 100.
  • Functional groups that may be protected include hydroxyl groups, acetals, ketals, aldehydes, sugar residues, maleimide groups, carboxyl groups, amino groups, thiol groups and active esters.
  • the hydrophilic polymer chain segment when R 1 and R 3 represent a lower alkyl group substituted with an optionally protected functional group follows, for example, the method described in WO 96/33233, WO 96/32434, WO 97/06202 be able to.
  • the lower alkyl group means a linear or branched alkyl group having, for example, 7 or less carbon atoms, preferably 4 or less carbon atoms.
  • the HDL affinity block copolymer can be obtained, for example, by purifying a polymer having a hydrophilic polymer chain and a polymer having a polyamino acid chain as they are or, if necessary, to narrow the molecular weight distribution and then coupling by a known method. Can be.
  • an anion living polymerization is performed using an initiator capable of imparting R 1 to form a polyethylene glycol chain, and then an amino group is introduced on the growth terminal side, It can also be formed by polymerizing N-carboxylic acid anhydride (NCA) of protected amino acid such as ⁇ -benzyl-L-aspartate, ⁇ -benzyl-L-glutamate from the terminal.
  • NCA N-carboxylic acid anhydride
  • an HDL affinity block copolymer is demonstrated below.
  • a dehydrated organic solvent starting from a polyethylene glycol with one end protected and an amino group at the other end, eg, MeO-PEG-CH 2 CH 2 CH 2 —NH 2 , i) N— Carboxy- ⁇ -benzyl-L-aspartic anhydride (BLA-NCA) or ii) N-carboxy- ⁇ -benzyl-L-glutamic anhydride (BLG-NCA) with a desired degree of polymerization (number of amino acid units) To give i) polyethylene glycol-co-polyaspartic acid benzyl ester or ii) polyethylene glycol-co-polyglutamic acid benzyl ester.
  • BLA-NCA Carboxy- ⁇ -benzyl-L-aspartic anhydride
  • BLG-NCA N-carboxy- ⁇ -benzyl-L-glutamic anhydride
  • the benzyl group is removed by alkali hydrolysis to change to polyethylene glycol-co-polyaspartic acid or polyethylene glycol-co-polyglutamic acid.
  • benzyl alcohol is added in an organic solvent so as to obtain a desired esterification rate, and in the presence of a condensing agent such as NN′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and NN′-diisopropylcarbodiimide (DIPCI).
  • DCC NN′-dicyclohexylcarbodiimide
  • DIPCICI NN′-diisopropylcarbodiimide
  • polyethylene glycol-co-polyaspartic acid cholesterol ester and polyethylene glycol-co-polyglutamic acid cholesterol ester can be prepared.
  • Another specific example of the method for producing the HDL affinity block copolymer is a method of introducing a hydrophobic side chain by an amide bond.
  • the end of polyethylene glycol-co-polyaspartic acid benzyl ester or polyethylene glycol-co-polyglutamic acid benzyl ester is acetylated in the same manner as described above.
  • the benzyl group is removed by alkaline hydrolysis, and the resulting carboxyl group is reacted with a hydrophobic side chain having an amino group, or polyethylene glycol-co-polyaspartic acid benzyl ester or polyethylene glycol-co-polyglutamic acid
  • a benzyl ester and a compound having a primary amine are reacted and converted from an ester bond to an amide bond using aminolysis.
  • a hydrophobic side chain can be introduced by an amide bond.
  • a primary amine such as 1-octylamine is added to polyethylene glycol-co-polyaspartic acid benzyl ester in an organic solvent so that a desired amidation rate is obtained, and the mixture is reacted for a certain period of time.
  • a hydrophobic side chain in which the end of the hydrophobic group is substituted with an amino group and a hydrophobic side chain that is not substituted with an amino group are formed.
  • Mixed poly (amino acid derivative) segments can also be used.
  • the HDL affinity block copolymer may have an HDL transfer rate of 30% or more determined as follows due to its affinity with HDL.
  • the HDL transfer rate of the HDL affinity block copolymer is preferably 40% or more, more preferably 45% or more, and particularly preferably 50% or more.
  • the block copolymer is lysozyme-encapsulated polymer micelle and incubated in plasma at 37 ° C. for 24 hours, and then each lipoprotein fraction is purified and collected.
  • the block copolymer concentration in each fraction of VLDL, LDL, HDL and residue collected is measured. Then, based on the volume and block copolymer concentration in each fraction, the content (weight basis) of the block copolymer in each fraction is calculated. The obtained value is substituted into the following formula to determine the HDL migration rate.
  • HDL transfer rate (%) block copolymer content in HDL fraction / total block copolymer content in each fraction ⁇ 100
  • the HDL affinity block copolymer is preferably present in the HDL fraction most preferably in other lipoprotein fractions (excluding the chylomicron fraction). That is, among the HDL affinity block copolymer contents in the VLDL, LDL, HDL, and residue fractions, the content in the HDL fraction is preferably the highest.
  • the polymer micelle composition can further contain an HDL non-affinity block copolymer as a block copolymer having a hydrophobic polymer chain segment and a hydrophilic polymer chain segment.
  • the HDL non-affinity block copolymer is less likely to cause preferential detachment from the polymer micelles because lipoproteins other than HDL hardly enter the polymer micelles.
  • the polymer micelle composition is a mixed type of an HDL affinity block copolymer and an HDL non-affinity block copolymer
  • the formation of gaps due to the elimination of the block copolymer can be suppressed, and in some cases, the polymer micelle composition
  • the formation of gaps can be promoted by reducing the hydrophobic interaction between the block copolymers constituting the product.
  • the release rate of the drug from the polymer micelle composition can be controlled. That is, according to the present invention, it is possible to obtain a polymer micelle having easy disintegration that has been difficult to impart in the past, and it is also easy to control the disintegration rate.
  • the hydrophobic polymer chain segment of the HDL non-affinity block copolymer can be constituted by a polyamino acid containing a hydrophobic derivative having a hydrophobic group having a linear or branched structure introduced in the side chain of the amino acid as a repeating unit.
  • the hydrophobic derivative of the amino acid is preferably an acidic amino acid, more preferably a hydrophobic derivative of aspartic acid and / or glutamic acid.
  • hydrophobic group having a linear or branched structure examples include a C 4 to C 18 unsubstituted or substituted linear or branched alkyl group, and a C 4 to C 18 unsubstituted or substituted linear or branched group.
  • examples thereof include an alkenyl group and a C 4 to C 18 unsubstituted or substituted linear or branched alkynyl group, preferably a C 4 to C 18 unsubstituted or substituted linear or branched alkyl group.
  • hydrophilic polymer chain segment of the HDL non-affinity block copolymer As the hydrophilic polymer chain segment of the HDL non-affinity block copolymer, the same hydrophilic polymer as the hydrophilic polymer chain segment of the HDL affinity block copolymer can be selected.
  • the terminal modification of the hydrophilic polymer chain segment and the hydrophobic polymer chain segment of the HDL non-affinity block copolymer and the linking of these segments are also as described in the paragraph regarding the HDL affinity block copolymer.
  • the HDL non-affinity block copolymer can be represented by the following general formulas (III) and (IV).
  • R 9 and R 11 each independently represents a hydrogen atom or a lower alkyl group substituted or unsubstituted with an optionally protected functional group
  • R 10 represents a hydrogen atom, a saturated or unsaturated C 1 -C 29 aliphatic carbonyl group or an arylcarbonyl group
  • R 12 represents a hydroxyl group, a saturated or unsaturated C 1 to C 30 aliphatic oxy group or an aryl-lower alkyloxy group
  • R 13 represents —O— or —NH—
  • R 14 represents a hydrogen atom or an unsubstituted or linear or branched C 4 to C 18 alkyl group substituted with an amino group or a carboxyl group
  • R 15 and R 16 each independently represents a methylene group or an ethylene group
  • p is an integer in the range of 10-2500
  • q is an integer
  • P in the above formula is preferably an integer in the range of 10 to 1000, more preferably 20 to 600, particularly preferably 50 to 500.
  • Q and r in the above formula are each an integer preferably in the range of 20 to 200, more preferably 30 to 100.
  • the HDL migration rate of the HDL non-affinity block copolymer can be less than 30%, preferably 25% or less, and more preferably 20% or less.
  • the content ratio (HDL affinity block copolymer: HDL non-affinity block copolymer, weight ratio) of the HDL affinity block copolymer to the HDL non-affinity block copolymer in the polymer micelle composition of the present invention is the use of the polymer micelle composition.
  • the HDL migration rate of each block copolymer can be set.
  • the content ratio (HDL affinity block copolymer: HDL non-affinity block copolymer, weight ratio) is, for example, in the range of 1:99 to 99: 1, in the range of 3:97 to 97: 3, and in the range of 15:85 to 85. : 15 range, 40:60 to 60:40.
  • the weight ratio of the HDL affinity block copolymer to the total weight of the HDL affinity block copolymer and the HDL non-affinity block copolymer in the polymer micelle composition is, for example, 60% or less, 50% or less, 40% or less. 20% or less, 10% or less, 5% or less, 2% or less, or 1% or less.
  • the content ratio of the HDL affinity block copolymer is large, collapse of the polymer micelle is induced and the drug release tends to be promoted.
  • the content ratio of the HDL affinity block copolymer is small, the polymer micelles are likely to be collapsed and the drug released accordingly.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the polymer micelle composition described in the above section A and a drug encapsulated in the polymer micelle composition.
  • the drug is preferably one selected from the group consisting of water-soluble physiologically active polypeptides and proteins.
  • the molecular weight of the drug is desirably 1,500 or more, preferably 2,000 or more.
  • bioactive polypeptides and proteins examples include interferon ⁇ , ⁇ , ⁇ ; erythropoietin; G-CSF; growth hormone; interleukins; tumor necrosis factor; granulocyte / macrophage colony stimulating factor; macrophage colony stimulating factor; Examples include cell growth factor; TGF- ⁇ superfamily; EGF; FGF; IGF-I; and blood coagulation factors represented by factor VII.
  • guide_body of the protein mentioned above More specifically, the protein which substituted, added or deleted one or more amino acids may be used as a chemical
  • the drug may be a poorly water-soluble drug having a water solubility of 100 ⁇ g / mL or less.
  • the poorly water-soluble drug include anticancer agents such as paclitaxel, topotecan, camptothecin, cisplatin, daunorubicin hydrochloride, methotrexate, mitomycin C, docetaxel, vincrestine sulfate and derivatives thereof; polyene antibiotics such as amphotericin B and nystatin; And fat-soluble drugs such as their derivatives.
  • the poorly water-soluble drug is relatively small in size, but may be difficult to release from conventional polymer micelle compositions due to its high hydrophobicity.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is superior in use for promoting the release of such a poorly water-soluble drug as compared with the conventional polymer micelle composition.
  • the amount of the drug to be included can be set according to the use of the pharmaceutical composition.
  • the amount of the drug used is generally 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight, based on the total block copolymer in the polymer micelle composition.
  • the particle size of the polymer micelle encapsulating the drug is not particularly limited as long as it is a size that can be administered to a living body.
  • the particle diameter is preferably 10 ⁇ m or less, and more preferably 5 ⁇ m or less. In particular, when used intravenously, it is preferably 500 nm or less, more preferably 300 nm or less.
  • the pharmaceutical composition can be prepared, for example, as follows. First, the block copolymer is dissolved in an organic solvent. If necessary, the organic solvent may be removed by air-drying the obtained solution, for example, by drying into a film under a nitrogen stream atmosphere, and further by drying under reduced pressure if necessary. A solution of the drug to be encapsulated is added to the block copolymer thus treated and mixed. Next, polymer micelles are formed while encapsulating the drug from the obtained mixed solution.
  • organic solvent examples include non-water miscible organic solvents such as dichloromethane, chloroform, diethyl ether, dibutyl ether, ethyl acetate and butyl acetate; methanol, ethanol, propyl alcohol, isopropyl alcohol, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide, acetonitrile And water miscible organic solvents such as acetone and tetrahydrofuran; and mixed solvents thereof.
  • non-water miscible organic solvents such as dichloromethane, chloroform, diethyl ether, dibutyl ether, ethyl acetate and butyl acetate
  • methanol, ethanol, propyl alcohol isopropyl alcohol, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide, acetonitrile
  • water miscible organic solvents such as acetone and tetrahydrofuran
  • a mixed solution of a block copolymer and a drug may be stirred while applying energy by ultrasonic irradiation.
  • the ultrasonic irradiation can be performed using, for example, a biodisrupter (manufactured by Nippon Seiki Seisakusho).
  • Method for controlling the drug release rate of a pharmaceutical composition comprises changing the content ratio of the HDL affinity block copolymer to the total block copolymer in the polymer micelle composition in the pharmaceutical composition of section B above including. Since the HDL affinity block copolymer can exert the effect of promoting the release of the drug from the polymer micelle, the release rate of the drug from the polymer micelle can be controlled by changing the content ratio.
  • the content ratio of the HDL affinity block copolymer to the total block copolymer in the polymer micelle composition exceeds 0/100 and is 100/100 or less. Preferably, it is set in the range of 1/100 to 100/100. More specifically, the content ratio (HDL affinity block copolymer: HDL non-affinity block copolymer, weight ratio) of the HDL affinity block copolymer to the HDL non-affinity block copolymer in the polymer micelle composition is, for example, 1 : 99-99: 1 range, 3: 97-97: 3 range, 15: 85-85: 15 range, 40: 60-60: 40 range. Increasing the content ratio of the HDL affinity block copolymer can promote the release of the drug, and decreasing the content ratio tends to suppress the release of the drug.
  • the hydrophilic polymer chain segment of the block copolymer is composed of a PEG chain having an average molecular weight of 10,000
  • the hydrophobic polymer chain segment is composed of a polyamino acid chain having an average of 40 residues.
  • the introduction rate of the benzyl group into the side chain of the polyamino acid chain is about 65%, it is expressed as (10-40, 65% Bn) after the block copolymer.
  • the hydrophobic group introduced into the side chain of the polyamino acid chain is an octyl group or a cholesteryl group
  • the block copolymer is followed by (10-40, 65% C8) or (10-40, 65% Chol, respectively).
  • the introduction rate of hydrophobic groups is about 65%, including 62-68%.
  • the binding order of the glutamic acid unit and its hydrophobic derivative unit is arbitrary, and is present at random in one block copolymer.
  • both PEG-pGlu (10-40, 60% Bn) and PEG-pGlu (10-40, 30% Chol) have a HDL migration rate of 50% or more and high HDL affinity. showed that.
  • PEG-pGlu (10-40, 60% C8), PEG-pGlu (10-40, 60% C12), and PEG-pGlu (10-40, 60% C16) all have HDL migration rates. It was less than 20% and showed higher affinity with other lipoproteins such as LDL and VLDL than HDL.
  • Example 1 Intravenous administration test of G-CSF-encapsulated polymer micelle in rats (1) PEG-pGlu (10-40, 30% Chol) PEG-pGlu (10-40, 30% Chol) was used as the block copolymer. The block copolymer was weighed into a vial, 20 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate (MES) Buffer (pH 5) was added to a polymer concentration of 2 mg / mL, and the mixture was vigorously stirred at 4 ° C. overnight.
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate
  • the polymer solution was irradiated with ultrasonic waves (in an ice bath, Low, 1 second intermittent, 10 minutes) using a bio-disrupter (manufactured by Nippon Seiki Seisakusho, High Power Unit), and then 0.22 ⁇ m membrane filtered. This gave an empty micelle solution with a polymer concentration of 2 mg / mL.
  • a 300 ⁇ g / mL G-CSF solution (2 mL) was added so as to be 5% (w / w) with respect to the polymer. I put it.
  • the solution was purified and concentrated by ultrafiltration using a trade name “(registered trademark) Amicon Ultra” (manufactured by Millipore, cutoff molecular weight: 100,000), and the medium was a 10% (w / w) aqueous sucrose solution.
  • the collected G-CSF-encapsulated polymer micelles were stored at ⁇ 80 ° C. and melted at room temperature before use.
  • the G-CSF-encapsulating polymer micelle solution obtained above was administered into male Wistar rats via the tail vein.
  • the dose was 100 ⁇ g / kg body weight, and the number of administered samples was 3.
  • Blood was collected using a heparinized syringe from the jugular vein under ether anesthesia at 5 minutes, 1 hour, 6 hours, 1 day, 2 days, and 3 days after administration, and the G-CSF concentration in plasma was determined as G-CSF. Measurement was performed using an ELISA kit (manufactured by RayBiotech).
  • PEG-pGlu (10-40, 60% C8) Except that PEG-pGlu (10-40, 60% C8) was used as a block copolymer, and that the number of administered samples was nine, test examples using PEG-pGlu (10-40, 30% Chol) Similarly, G-CSF-encapsulating polymer micelles were prepared, and changes in plasma concentration of G-CSF were examined.
  • FIG. 3 shows mixed polymer micelles (1: 5) calculated from the results of changes in plasma concentrations in test examples of PEG-pGlu (10-40, 30% Chol) and PEG-pGlu (10-40, 60% C8). The theoretical value of plasma concentration transition for 1) is also shown.
  • Example 2 (1) C8 type micelle PEG-pGlu (10-40, 90% C8) was used as a block copolymer.
  • the block copolymer was weighed into a vial, and 20 mM MES Buffer (pH 5) containing 13.3% sucrose was added so that the polymer concentration was 10 mg / mL, followed by vigorous stirring at 4 ° C. overnight.
  • the polymer solution was irradiated with ultrasonic waves (in an ice bath, High, 1 second intermittent, 15 minutes ⁇ 3) using a bio-disrupter (Nippon Seiki Seisakusho, High Power Unit), and then 0.22 ⁇ m membrane filtered.
  • sucrose-containing 20 mM MES Buffer pH 5
  • the sucrose-containing 20 mM MES Buffer pH 5) was added to the solution to adjust the polymer concentration to 2 mg / mL to obtain an empty micelle solution.
  • a 300 ⁇ g / mL G-CSF solution 0.4 mL was added so as to be 5% (w / w) with respect to the polymer, and the mixture was inverted and stirred at 4 ° C. And then stored at ⁇ 80 ° C. and melted at room temperature before use.
  • Bn-type micelle G-CSF-encapsulated polymer micelle was prepared in the same manner as in the test example of C8-type micelle except that PEG-pGlu (10-40, 100% Bn) was used as the block copolymer.
  • G-CSF-encapsulated polymer micelle solutions were administered into the tail vein of male Wistar rats (6 weeks old) under ether light anesthesia. The dose was 100 ⁇ g / kg body weight, and the number of samples administered was three for each solution. Blood was collected with a heparin-treated syringe 24 hours after administration, and EDTA-2Na was added so that the final concentration was 1 mg / ml, and a multi-item automatic blood cell counter for animals (manufactured by Sysmex Corporation, pocH-100iV Diff) was used to measure the number of neutrophils. Based on the obtained measured value, the drug release coefficient (%) in Bn micelles and various mixed micelles was calculated according to the following formula.
  • Table 2 shows the calculated drug release coefficient of the polymer micelle. It is considered that the larger the coefficient, the stronger the action of positively releasing the drug than the C8 micelle.
  • Drug release coefficient (%) 100 ⁇ (AB) / (AC)
  • the release rate of the drug can be controlled by using mixed micelles.
  • Example 3 (1) C8 type micelle In the same manner as in the test example of the C8 type micelle of Example 2, G-CSF-encapsulated polymer micelle was prepared.
  • the neutrophil count was measured in the same manner as in Example 2 except that the number of administered samples was 6. Based on the obtained measured values, the drug release coefficient (%) in the chol type micelle and various mixed type micelles was calculated in the same manner as in Example 2. Table 3 shows the calculated drug release coefficient of the polymer micelle.
  • the release rate of the drug can be controlled by using mixed micelles.
  • Example 4 Rat intravenous administration test of G-CSF-encapsulated polymer micelle (1) C8 type micelle In the same manner as in the test example of C8 type micelle of Example 2, G-CSF-encapsulated polymer micelle was prepared.
  • the G-CSF-encapsulating polymer micelle solution obtained above was administered into male Wistar rats via the tail vein.
  • the dose was 100 ⁇ g / kg body weight, and the number of samples administered was three for each solution.
  • Blood was collected using a heparinized syringe from the jugular vein under ether anesthesia at 5 minutes, 1 hour, 6 hours, 1 day, 2 days, and 3 days after administration, and the G-CSF concentration in plasma was determined as G-CSF. Measurement was performed using an ELISA kit (manufactured by RayBiotech).
  • Example 4 The results of Example 4 are shown in FIG. As shown in FIG. 4, it was found that by using mixed micelles, the residence time of the drug in plasma can be controlled, in other words, the drug release rate can be controlled. In any mixed micelle, the actual value of the plasma concentration of G-CSF was also significantly lower than the theoretical value.

Abstract

　本発明は、薬物を安定して内包し、かつ、適切に放出し得るポリマーミセル組成物、および該ポリマーミセル組成物を用いた医薬組成物を提供する。当該ポリマーミセル組成物は、疎水性ポリマー鎖セグメント１２と親水性ポリマー鎖セグメント１１とを有する複数のブロックコポリマーが、該疎水性ポリマー鎖セグメント１２を内側に、該親水性ポリマー鎖セグメント１１を外側に向けた状態で放射状に配置された構造を有する。 当該組成物は、該ブロックコポリマーとして、ＨＤＬ２０と親和性を有するブロックコポリマー１０（ポリマーＡ）とＨＤＬ以外のリポタンパクと親和性を有するブロックコポリマー（ポリマーＢ）を含有し、ＨＤＬ２０が付着したポリマーＡが脱離して隙間が形成されることにより内包される薬物５０の放出が促進され、ポリマーＡ、Ｂの配合割合を調整することによりポリマーミセルからの薬物の放出速度を制御できる。

Description

易崩壊型ポリマーミセル組成物
　本発明は、ポリマーミセル組成物および該ポリマーミセル組成物を用いた医薬組成物に関する。
　親水性ポリマー鎖セグメントと疎水性ポリマー鎖セグメントを有するブロックコポリマーを薬物担体として用いること、および該コポリマーが形成するポリマーミセルに一定の薬物を封入する方法が知られている（例えば、特許文献１または２）。また、水難溶性薬物を封入した均質なポリマーミセルを含有する組成物およびその調製方法が知られている（特許文献３）。
　特許文献１または２には、予め水性媒体中でブロックコポリマーのミセルを形成しておき、これらのミセル溶液に薬物を加え、場合によって加熱や超音波処理下で混合撹拌することによって、薬物をミセル内に封入する方法が記載されている。また、特許文献３には、ブロックコポリマーと薬物を水混和性の極性溶媒に溶解し、次いで水に対して透析することにより、薬物が封入されたポリマーミセルを調製する方法が記載されている。
　これらの従来技術によれば、薬物のキャリヤーとしてポリマーミセルを使用することには、薬物の徐放化を含む各種の利点が存在することがわかる。しかしながら、従来のポリマーミセルでは、薬物がミセル内に非常に安定して内包されることにより、薬物の適切な放出が阻害される場合がある。
特開平６－１０７５６５号公報 米国特許第５,４４９,５１３号明細書 特開平１１－３３５２６７号公報
　本発明の主たる目的は、薬物を安定して内包し、かつ、適切に放出し得るポリマーミセル組成物、および該ポリマーミセル組成物を用いた医薬組成物の提供にある。
　本発明は、所定のポリマーミセル組成物を提供する。該ポリマーミセル組成物は、疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーを含有する。複数の該ブロックコポリマーは、該疎水性ポリマー鎖セグメントを内側に向けると共に該親水性ポリマー鎖セグメントを外側に向けた状態で放射状に配置される。該ポリマーミセル組成物は、該ブロックコポリマーとして、ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーとＨＤＬ以外のリポタンパクと親和性を有するブロックコポリマーとを含有する。該ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーの疎水性ポリマー鎖セグメントは、アミノ酸の疎水性誘導体由来の繰り返し単位を含有するポリアミノ酸からなる。該アミノ酸の疎水性誘導体はアミノ酸の側鎖に芳香族基および／またはステロール残基が導入された誘導体である。該ＨＤＬ以外のリポタンパクと親和性を有するブロックコポリマーの疎水性ポリマー鎖セグメントは、アミノ酸の疎水性誘導体由来の繰り返し単位を含有するポリアミノ酸からなる。該アミノ酸の疎水性誘導体は、アミノ酸の側鎖に直鎖または分岐構造を有する疎水性基が導入された誘導体である。該ポリマーミセル組成物は、該親和性に起因するＨＤＬの付着によって該ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーの脱離が誘導される。該脱離によってポリマーミセルに隙間が形成されることにより、内包されるべき薬物である分子量１５００以上の水溶性の生理活性ポリペプチドおよびタンパク質からなる群より選択される１種の放出が促進される。本発明のポリマーミセル組成物は、該ＨＤＬ以外のリポタンパクと親和性を有するブロックコポリマーにより該隙間を小さくして、該内包されるべき薬物の放出の促進を抑制し、薬物の放出速度を制御することができる。
　本発明は、別の側面から、別の所定のポリマーミセル組成物を提供する。該ポリマーミセル組成物は、疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーを含有する。複数の該ブロックコポリマーは、該疎水性ポリマー鎖セグメントを内側に向けると共に該親水性ポリマー鎖セグメントを外側に向けた状態で放射状に配置される。該ポリマーミセル組成物は、該ブロックコポリマーとして、ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーを含有している。該ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーの疎水性ポリマー鎖セグメントは、アミノ酸の疎水性誘導体由来の繰り返し単位を含有するポリアミノ酸からなる。該アミノ酸の疎水性誘導体は、アミノ酸の側鎖にステロール残基が導入された誘導体である。該ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーの親水性ポリマー鎖セグメントは、ポリ（エチレングリコール）である。該親和性に起因するＨＤＬの付着によって該ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーの脱離が誘導される。該脱離によってポリマーミセルに隙間が形成されることにより、内包されるべき薬物である分子量１５００以上の水溶性の生理活性ポリペプチドおよびタンパク質からなる群より選択される１種の放出が促進される。
　本発明はさらに別の側面から、所定の医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、上述のポリマーミセル組成物と該ポリマーミセル組成物に内包された薬物である分子量１５００以上の水溶性の生理活性ポリペプチドおよびタンパク質からなる群より選択される１種とを含有する。
　本発明によれば、薬物を安定して内包し、かつ、適切に放出し得るポリマーミセル組成物、および該ポリマーミセル組成物を用いた医薬組成物が提供され得る。
本発明のポリマーミセル組成物とリポタンパクとの相互作用を説明する概念図である。 各リポタンパク画分中のポリマー含有量の比を表すグラフである。 実施例１のＧ－ＣＳＦの血漿中濃度時間推移を表すグラフである。 実施例４のＧ－ＣＳＦの血漿中濃度時間推移を表すグラフである。
Ａ．ポリマーミセル組成物
　本発明のポリマーミセル組成物は、疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーを含有する。複数の該ブロックコポリマーは、該疎水性ポリマー鎖セグメントを内側に向けると共に該親水性ポリマー鎖セグメントを外側に向けた状態で放射状に配置されている。当該ポリマーミセル組成物は、該ブロックコポリマーとして、ＨＤＬ（高比重リポタンパク）と親和性を有するブロックコポリマー（以下、「ＨＤＬ親和性ブロックコポリマー」と称する場合がある）を含有している。当該ポリマーミセル組成物によれば、該親和性に起因するＨＤＬの付着によってＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの脱離が誘導され、該脱離によって隙間が形成されることにより、内包されるべき薬物の放出が促進される。ＨＤＬとの付着性は、ＨＤＬの存在下（例えば、血漿中）でポリマーミセル組成物をインキュベートした後にＨＤＬ画分を精製した場合に、該ＨＤＬ画分にブロックコポリマーが存在することによって確認することができる。「疎水性ポリマー鎖セグメント」および「親水性ポリマー鎖セグメント」はそれぞれ、これらの２つのセグメントを有する複数のブロックコポリマーが、上記の状態で配置されたミセルを水性媒体中で形成し得る限り、任意の疎水性度および親水性度を有していてよい。
　ポリマーミセル組成物からの薬物の放出が促進される理由は、次のように推測される。図１（Ａ）に示すように、約１０ｎｍという小さい平均粒径を有するＨＤＬ２０は、血中において、親水性ポリマー鎖セグメント１１と疎水性ポリマー鎖セグメント１２とを有するＨＤＬ親和性ブロックコポリマー１０を含有するポリマーミセルの内側（疎水性ポリマー鎖セグメント領域）にまで容易に侵入できる。ＨＤＬ親和性ブロックコポリマー１０は、そのＨＤＬ親和性に起因して、疎水性ポリマー鎖セグメント領域まで侵入してきたＨＤＬ２０と相互作用し、ＨＤＬ２０が付着することによって、ポリマーミセルから優先的に脱離する。その結果、ポリマーミセル構造に隙間が形成され、内包された薬物５０が放出されやすくなる。また、ポリマーミセルの崩壊が起こりやすくなるので、薬物５０の放出が促進される。一方、図１（Ｂ）に示すように、約２６ｎｍという比較的大きい平均粒径を有するＬＤＬ（低比重リポタンパク）３０や、それ以上の粒径を有するＶＬＤＬ（超低比重リポタンパク）４０は、ポリマーミセルの内側にまで侵入しにくい。このため、ＨＤＬ親和性ブロックコポリマー１０は、これらＨＤＬ以外のリポタンパクとの相互作用がそもそも弱いこともあり、ＨＤＬ以外のリポタンパクの付着に起因したポリマーミセルからの脱離が生じ難いと考えられる。
　ポリマーミセル組成物が内包すべき薬物としては、分子量が１５００以上の水溶性の生理活性ポリペプチドおよびタンパク質からなる群より選択される１種が望ましい。これらの薬物は、相対的に大きなサイズを有しているので、従来型ポリマーミセルにおけるブロックコポリマー間の小さな隙間から漏れ出しにくく、十分に放出されないままミセルと共に血中から消失してしまう場合がある。他方、本発明によるポリマーミセル組成物は、ミセル化による薬物の徐放性能を発揮する一方で、従来型ポリマーミセルに比べて、こうした相対的に大きな薬物の放出を促進させる用途に優れている。また、後述するように、本発明によるポリマーミセル組成物は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ等のＨＤＬ以外のリポタンパクと親和性を有するブロックコポリマー（以下、「ＨＤＬ非親和性ブロックコポリマー」と称する場合がある）をさらに含むことによって、薬物放出の促進の程度を制御することもできる。
　ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの疎水性ポリマー鎖セグメントは、ポリアミノ酸によって構成できる。該ポリアミノ酸は、アミノ酸の側鎖に環式構造を有する疎水性基が導入された疎水性誘導体由来の繰り返し単位を含有する。該環式構造を有するアミノ酸の疎水性誘導体は、好ましくはアスパラギン酸およびグルタミン酸といった酸性アミノ酸の疎水性誘導体であり、該酸性アミノ酸側鎖のカルボキシル基に環式構造を有する疎水性基が導入され得る。
　環式構造を有する疎水性基は、単環式構造を有する基および多環式構造を有する基であってよく、例えば、芳香族基、脂環式基、ステロールの残基であってもよい。当該疎水性基としては、Ｃ４～Ｃ１６の環状構造を有するアルキル基、Ｃ６～Ｃ２０のアリール基、Ｃ７～Ｃ２０のアラルキル基、およびステロールの残基が好ましい。ステロールとは、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環（Ｃ１７Ｈ２８）をベースとする天然、半合成または合成の化合物、さらにはそれらの誘導体を意味する。例えば、天然のステロールとしては、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸、カンペステロール、シストステロール等が挙げられる。該半合成または合成の化合物としては、例えば、該天然のステロールの合成前駆体（必要により、存在する場合には、一定の官能基、ヒドロキシ基の一部もしくは全部が当該技術分野で既知のヒドロキシ保護基により保護されているか、またはカルボキシル基がカルボキシル保護により保護されている化合物を包含する）が挙げられる。ステロール誘導体とは、本発明の目的に悪影響を及ぼさない範囲内で、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環にＣ６～Ｃ１２アルキル基、塩素、臭素およびフッ素といったハロゲン原子が導入されていてもよい。シクロペンタノンヒドロフェナントレン環は、飽和または部分不飽和であってよい。
　ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの疎水性ポリマー鎖セグメントは、本発明の効果が得られる範囲において、環式構造を有するアミノ酸の疎水性誘導体由来の繰り返し単位に加えて、他の繰り返し単位を有していてもよい。他の繰り返し単位としては、例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸といった酸性アミノ酸、また、例えば、該酸性アミノ酸にＣ４～Ｃ１６の未置換もしくは置換された直鎖または分岐アルキル基が導入された疎水性誘導体由来の繰り返し単位が挙げられる。
　ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの疎水性ポリマー鎖セグメントを構成する全繰り返し単位（１００モル％）に対する、環式構造を有するアミノ酸の疎水性誘導体由来の繰り返し単位の含有量は、好ましくは１０～１００モル％、さらに好ましくは２０～８０モル％である。このような含有量であれば、ＨＤＬとの親和性がより確実に得られる。
　ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの親水性ポリマー鎖セグメントとしては、例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリアミノ酸、ポリ（リンゴ酸）およびこれらの誘導体が挙げられる。ポリサッカライドの具体例としては、デンプン、デキストラン、フルクタンおよびガラクタンが挙げられる。
　ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーにおいて、親水性ポリマー鎖セグメントと疎水性ポリマー鎖セグメントは、公知の連結基によって連結されている。該連結基としては、例えば、エステル結合、アミド結合、イミノ基、炭素－炭素結合およびエーテル結合が挙げられる。疎水性ポリマー鎖セグメントの親水性ポリマー鎖セグメント側末端とは反対側の末端、および、親水性ポリマー鎖セグメントの疎水性ポリマー鎖セグメント側末端とは反対側の末端には、ポリマーミセルの形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の化学修飾があってもよい。
　ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーは、親水性ポリマー鎖セグメントとしてポリ（エチレングリコール）を有し、疎水性ポリマー鎖セグメントとしてアミノ酸の疎水性誘導体由来の繰り返し単位を含有するポリアミノ酸からなり、該アミノ酸の疎水性誘導体がアミノ酸の側鎖にステロール残基が導入された誘導体であってよい。
　ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーは、以下の一般式（Ｉ）および（ＩＩ）で表され得る。本発明のポリマーミセル組成物は、２種類以上のＨＤＬ親和性ブロックコポリマーを含有していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
上記各式中、Ｒ１およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子または保護されていてもよい官能基で置換されたもしくは未置換の低級アルキル基を表し；
Ｒ２は水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ１～Ｃ２９脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し；
Ｒ４は水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ１～Ｃ３０脂肪族オキシ基またはアリール－低級アルキルオキシ基を表し；
Ｒ５は－Ｏ－または－ＮＨ－を表し；
Ｒ６は、水素原子、未置換またはアミノ基もしくはカルボキシル基で置換されたＣ４～Ｃ１６の環状構造を有するアルキル基、Ｃ６～Ｃ２０のアリール基、Ｃ７～Ｃ２０のアラルキル基あるいはステリル基を表し；
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、メチレン基またはエチレン基を表し；
ｎは１０～２５００の範囲にある整数であり；
ｘは１０～３００の範囲にある整数であり；
ｍは０～３００の範囲にある整数であり（但し、ｍが１以上である場合、繰り返し数がｘである繰り返し単位と繰り返し数がｍである繰り返し単位との結合順は任意であり、Ｒ６は１つのブロックコポリマー内の各繰り返し単位において各々独立に選択され、ランダムに存在するが、Ｒ６全体の１０％以上は、未置換またはアミノ基もしくはカルボキシル基で置換されたＣ４～Ｃ１６の環状構造を有するアルキル基、Ｃ６～Ｃ２０のアリール基、Ｃ７～Ｃ２０のアラルキル基、およびステリル基から各々独立に選択される）；
Ｌ１は－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｏ－Ｚ－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ２－、－Ｏ－Ｚ－Ｓ－Ｚ－および－ＯＣＯ－Ｚ－ＮＨ－（ここで、Ｚは独立してＣ１～Ｃ６アルキレン基である。）からなる群より選ばれる連結基を表し；
Ｌ２が－ＯＣＯ－Ｚ－ＣＯ－および－ＮＨＣＯ－Ｚ－ＣＯ－（ここで、ＺはＣ１～Ｃ６アルキレン基である。）から選択される連結基を表す。
　Ｃ６～Ｃ２０のアリール基およびＣ７～Ｃ２０のアラルキル基としては、好ましくはフェニル基、ナフチル基、トリル基、キシリル基、ベンジル基、およびフェネチル基、さらに好ましくはベンジル基が挙げられる。また、ステリル基が由来するステロールとしては、好ましくはコレステロール、コレスタノール、およびジヒドロキシコレステロール、さらに好ましくはコレステロールが挙げられる。
　上記各式中のｎは、好ましくは１０～１０００、さらに好ましくは２０～６００、特に好ましくは５０～５００の範囲にある整数である。上記各式中のｘおよびｍはそれぞれ、好ましくは２０～２００、さらに好ましくは３０～１００の範囲にある整数である。
　保護されていてもよい官能基としては、ヒドロキシル基、アセタール、ケタール、アルデヒド、糖残基、マレイミド基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基および活性エステルが挙げられる。Ｒ１およびＲ３が保護されていてもよい官能基で置換された低級アルキル基を表す場合の親水性ポリマー鎖セグメントは、例えば、ＷＯ９６／３３２３３、ＷＯ９６／３２４３４、ＷＯ９７／０６２０２に記載の方法に従うことができる。低級アルキル基とは、炭素数が例えば７個以下、好ましくは４個以下の直鎖または分枝鎖アルキル基を意味する。
　ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーは、例えば、親水性ポリマー鎖を有するポリマーおよびポリアミノ酸鎖を有するポリマーをそのまま、または必要により分子量分布を狭くするように精製した後、公知の方法によりカップリングすることによって得られ得る。一般式（Ｉ）のブロックコポリマーについては、例えば、Ｒ１を付与できる開始剤を用いてアニオンリビング重合を行うことによりポリエチレングリコール鎖を形成した後、成長末端側にアミノ基を導入し、そのアミノ末端からβ－ベンジル－Ｌ－アスパルテート、γ－ベンジル－Ｌ－グルタメート等の保護されたアミノ酸のＮ－カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させることによっても形成できる。
　ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの製造方法の具体例を以下に説明する。片末端が保護され、もう一方の末端がアミノ基であるポリエチレングリコール、例えば、ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ２を開始剤として、脱水された有機溶媒中で、ｉ）Ｎ－カルボキシ－β－ベンジル－Ｌ－アスパルギン酸無水物（ＢＬＡ－ＮＣＡ）、または、ｉｉ）Ｎ－カルボキシ－γ－ベンジル－Ｌ－グルタミン酸無水物（ＢＬＧ－ＮＣＡ）を所望の重合度（アミノ酸ユニット数）となるように添加し、反応させることにより、ｉ）ポリエチレングリコール－コ－ポリアスパラギン酸ベンジルエステル、または、ｉｉ）ポリエチレングリコール－コ－ポリグルタミン酸ベンジルエステルを得る。さらに、得られたブロックコポリマーの末端をアセチルクロライドまたは無水酢酸によりアセチル化した後、アルカリ加水分解によりベンジル基を除去してポリエチレングリコール－コ－ポリアスパラギン酸またはポリエチレングリコール－コ－ポリグルタミン酸に変化させた後、有機溶媒中で、所望のエステル化率となるようにベンジルアルコールを添加し、Ｎ－Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ－Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）といった縮合剤の存在下で反応させることより、部分的にベンジルエステルを有するブロックコポリマーを得る。
　ベンジルアルコールの代わりにコレステロールを反応させれば、ポリエチレングリコール－コ－ポリアスパラギン酸コレステロールエステル、ポリエチレングリコール－コ－ポリグルタミン酸コレステロールエステルを調製できる。
　ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの製造方法の別の具体例としては、アミド結合により疎水性側鎖を導入する方法が挙げられる。該製造方法においては、上記と同様にしてポリエチレングリコール－コ－ポリアスパラギン酸ベンジルエステル、または、ポリエチレングリコール－コ－ポリグルタミン酸ベンジルエステルの末端をアセチル化する。次いで、アルカリ加水分解によりベンジル基を除去し、生成したカルボキシル基にアミノ基を有する疎水性側鎖を反応させるか、または、ポリエチレングリコール－コ－ポリアスパラギン酸ベンジルエステルもしくはポリエチレングリコール－コ－ポリグルタミン酸ベンジルエステルと一級アミンを有する化合物とを反応させ、アミノリシスを利用してエステル結合からアミド結合へ変換する。これにより、アミド結合により疎水性側鎖を導入することができる。さらに、はじめに所望のアミド化率になるように有機溶媒中で１－オクチルアミン等の一級アミンをポリエチレングリコール－コ－ポリアスパラギン酸ベンジルエステルに添加して一定時間反応させた後、未変換のベンジルエステルに対して大過剰量の１，８－ジアミノオクタン等を加えることにより、疎水性基の末端がアミノ基で置換された疎水性側鎖とアミノ基で置換されていない疎水性側鎖とが混在するポリ（アミノ酸誘導体）セグメントにすることもできる。
　ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーは、そのＨＤＬとの親和性に起因して、下記のようにして決定されるＨＤＬ移行率が３０％以上であり得る。ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーのＨＤＬ移行率は、好ましくは４０％以上、さらに好ましくは４５％以上、特に好ましくは５０％以上である。
[ＨＤＬ移行率の決定方法]
　ブロックコポリマーをリゾチーム内包ポリマーミセルとし、血漿中で３７℃、２４時間インキュベートした後、各リポタンパク画分を精製および回収する。回収されたＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬおよび残渣の各画分中のブロックコポリマー濃度を測定する。次いで、各画分中の容量およびブロックコポリマー濃度に基づいて、各画分中のブロックコポリマーの含有量（重量基準）を算出する。得られた値を下記式に代入し、ＨＤＬ移行率を決定する。
　ＨＤＬ移行率（％）＝ＨＤＬ画分中のブロックコポリマー含有量／各画分中のブロックコポリマー含有量の合計×１００
　ＨＤＬ移行率を決定する際、ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーは、好ましくは他のリポタンパク画分中（ただし、カイロミクロン画分を除く）、ＨＤＬ画分に最も多く存在する。すなわち、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ、および残渣の各画分中のＨＤＬ親和性ブロックコポリマー含有量の中では、ＨＤＬ画分中の含有量が最も多いことが好ましい。
　ポリマーミセル組成物は、疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーとして、ＨＤＬ非親和性ブロックコポリマーをさらに含有できる。ＨＤＬ非親和性ブロックコポリマーは、ＨＤＬ以外のリポタンパクがポリマーミセルの内側にまで侵入しにくいことに起因して、ポリマーミセルからの優先的な脱離が生じにくい。このため、ポリマーミセル組成物をＨＤＬ親和性ブロックコポリマーとＨＤＬ非親和性ブロックコポリマーとの混合型にすると、ブロックコポリマーの脱離に起因した隙間の形成を抑制できたり、場合によっては、ポリマーミセル組成物を構成するブロックコポリマー間の疎水性相互作用が低下することで隙間の形成をかえって促進できる場合もある。このように、ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーとＨＤＬ非親和性ブロックコポリマーの含有量を調整することにより、ポリマーミセル組成物からの薬物の放出速度を制御し得る。すなわち、本発明によれば、従来は付与することが困難であった易崩壊性を有するポリマーミセルを得ることができ、さらには、その崩壊速度を制御することも容易となる。
　ＨＤＬ非親和性ブロックコポリマーの疎水性ポリマー鎖セグメントは、アミノ酸の側鎖に直鎖または分岐構造を有する疎水性基が導入された疎水性誘導体を繰り返し単位として含有するポリアミノ酸によって構成できる。該アミノ酸の疎水性誘導体は、好ましくは酸性アミノ酸、さらに好ましくはアスパラギン酸および／またはグルタミン酸の疎水性誘導体である。
　直鎖または分岐構造を有する疎水性基としては、例えば、Ｃ４～Ｃ１８の未置換もしくは置換された直鎖または分岐アルキル基、Ｃ４～Ｃ１８の未置換もしくは置換された直鎖または分岐アルケニル基、およびＣ４～Ｃ１８の未置換もしくは置換された直鎖または分岐アルキニル基等が挙げられ、好ましくはＣ４～Ｃ１８の未置換もしくは置換された直鎖または分岐アルキル基が挙げられる。
　ＨＤＬ非親和性ブロックコポリマーの親水性ポリマー鎖セグメントとしては、ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの親水性ポリマー鎖セグメントと同様の親水性ポリマーを選択できる。また、ＨＤＬ非親和性ブロックコポリマーの親水性ポリマー鎖セグメントおよび疎水性ポリマー鎖セグメントの末端修飾ならびにこれらのセグメントの連結についても、ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーに関する段落において記載した通りである。
　ＨＤＬ非親和性ブロックコポリマーは、以下の一般式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）で表され得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
上記各式中、Ｒ９およびＲ１１は、それぞれ独立して、水素原子または保護されていてもよい官能基で置換されたもしくは未置換の低級アルキル基を表し；
Ｒ１０は水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ１～Ｃ２９脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し；
Ｒ１２は水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ１～Ｃ３０脂肪族オキシ基またはアリール－低級アルキルオキシ基を表し；
Ｒ１３は－Ｏ－または－ＮＨ－を表し；
Ｒ１４は、水素原子あるいは未置換もしくはアミノ基またはカルボキシル基で置換された直鎖または分岐のＣ４～Ｃ１８アルキル基を表し；
Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ独立して、メチレン基またはエチレン基を表し；
ｐは１０～２５００の範囲にある整数であり；
ｑは１０～３００の範囲にある整数であり；
ｒは０～３００の範囲にある整数であり（但し、ｒが１以上である場合、繰り返し数がｑである繰り返し単位と繰り返し数がｒである繰り返し単位との結合順は任意であり、Ｒ１４は１つのブロックコポリマー内の各アミノ酸ユニットにおいて各々独立に選択され、ランダムに存在するが、Ｒ１４が水素である場合はＲ１４全体の４０％以下である）；
Ｌ３は－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｏ－Ｚ－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ２－、－Ｏ－Ｚ－Ｓ－Ｚ－および－ＯＣＯ－Ｚ－ＮＨ－（ここで、Ｚは独立してＣ１～Ｃ６アルキレン基である。）からなる群より選ばれる連結基を表し；
Ｌ４が－ＯＣＯ－Ｚ－ＣＯ－および－ＮＨＣＯ－Ｚ－ＣＯ－（ここで、ＺはＣ１～Ｃ６アルキレン基である。）から選択される連結基を表す。
　上記式中のｐは、好ましくは１０～１０００、さらに好ましくは２０～６００、特に好ましくは５０～５００の範囲にある整数である。上記式中のｑおよびｒはそれぞれ、好ましくは２０～２００、さらに好ましくは３０～１００の範囲にある整数である。
　保護されていてもよい官能基は、式（Ｉ）および（ＩＩ）に関する段落において記載した通りである。
　ＨＤＬ非親和性ブロックコポリマーのＨＤＬ移行率は、３０％未満であり得、好ましくは２５％以下であり、さらに好ましくは２０％以下である。
　本発明のポリマーミセル組成物中のＨＤＬ非親和性ブロックコポリマーに対するＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの含有量比（ＨＤＬ親和性ブロックコポリマー：ＨＤＬ非親和性ブロックコポリマー、重量比）は、ポリマーミセル組成物の用途、各ブロックコポリマーのＨＤＬ移行率等に応じて設定され得る。該含有量比（ＨＤＬ親和性ブロックコポリマー：ＨＤＬ非親和性ブロックコポリマー、重量比）は、例えば、１：９９～９９：１の範囲、３：９７～９７：３の範囲、１５：８５～８５：１５の範囲、４０：６０～６０：４０の範囲であってよい。このように、ポリマーミセル組成物における、ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーとＨＤＬ非親和性ブロックコポリマーの総重量に対する、ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの重量割合は、例えば、６０％以下、５０％以下、４０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、１％以下であってもよい。ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの含有量比が大きいと、ポリマーミセルの崩壊が誘起され薬物の放出が促進される傾向がある。また、ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの含有量比が小さいと、ポリマーミセルの崩壊およびそれに伴う薬物の放出が抑制される傾向にある。
Ｂ．医薬組成物
　本発明の医薬組成物は、上記Ａ項に記載のポリマーミセル組成物と、該ポリマーミセル組成物に内包された薬物とを含有する。該薬物としては、水溶性の生理活性ポリペプチドおよびタンパク質からなる群より選択される１種が望ましい。そして、当該薬物の分子量は１，５００以上が望ましく、好ましくは２，０００以上である。好ましい生理活性ポリペプチドおよびタンパク質の例としては、インターフェロンα、β、γ；エリスロポエチン；Ｇ－ＣＳＦ；成長ホルモン；インターロイキン類；腫瘍壊死因子；顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子；マクロファージコロニー刺激因子；肝細胞増殖因子；ＴＧＦ－βスーパーファミリー；ＥＧＦ；ＦＧＦ；ＩＧＦ－Ｉ；第ＶＩＩ因子に代表される血液凝固因子が挙げられる。また、その活性が損なわれない限り、上述したタンパク質の誘導体、より具体的には、１つ以上のアミノ酸を置換、付加または削除したタンパク質を薬剤として用いてもよい。
　薬物は、水に対する溶解度が１００μｇ／ｍＬ以下である水難溶性薬物であってもよい。該水難溶性薬物としては、例えば、パクリタキセル、トポテカン、カンプトテシン、シスプラチン、塩酸ダウノルビシン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ドセタキセル、硫酸ビンクレスチンおよびこれらの誘導体といった制癌剤；アンホテリシンＢおよびナイスタチンといったポリエン系抗生物質；プロスタグランジン類およびそれらの誘導体といった脂溶性薬物が挙げられる。水難溶性薬物は、サイズは比較的小さいが、その疎水性の高さに起因して、従来型のポリマーミセル組成物からは放出されにくい場合がある。他方、本発明の医薬組成物は、従来型ポリマーミセル組成物に比べて、こうした水難溶性薬物の放出を促進させる用途にも優れている。
　内包される薬物の量は、医薬組成物の用途等に応じて設定され得る。薬物の使用量は、ポリマーミセル組成物中の全ブロックコポリマーに対して、一般的には０．０１～５０重量％、好ましくは０．１～１０重量％である。
　薬物を内包したポリマーミセルの粒子径は、生体に投与できるサイズであれば特に限定されない。該粒子径は、１０μｍ以下が好ましく、５μｍ以下であることがさらに好ましい。特に、静脈内投与で用いる場合は、５００ｎｍ以下であることが好ましく、３００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。
　医薬組成物は、例えば、次のようにして調製できる。まず、上記ブロックコポリマーを有機溶媒に溶解する。必要に応じて、得られた溶液を風乾、例えば窒素気流雰囲気下でフィルム状に乾固し、さらに必要であれば減圧下で乾固することで有機溶媒を除去してもよい。このようにして処理したブロックコポリマーに、内包すべき薬物の溶液を添加し、混合する。次いで、得られた混合液から薬物を内包させながらポリマーミセルを形成する。
　有機溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチルおよび酢酸ブチルといった非水混和性有機溶媒；メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、アセトンおよびテトラヒドロフランといった水混和性有機溶媒；ならびにこれらの混合溶媒が挙げられる。
　薬物を内包したポリマーミセルの形成は、例えば、ブロックコポリマーと薬物との混合液を、超音波照射によるエネルギーをかけながら撹拌するとよい。超音波照射は、例えばバイオディスラプター（日本精機製作所製）を用いて実施できる。
Ｃ．医薬組成物の薬物放出速度を制御する方法
　当該方法は、上記Ｂ項に記載の医薬組成物において、該ポリマーミセル組成物中の全ブロックコポリマーに対するＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの含有量比を変化させることを含む。ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーは、ポリマーミセルからの薬物の放出を促進する効果を発揮し得るので、その含有量比を変化させることにより、ポリマーミセルからの薬物の放出速度を制御することができる。
　例えば、ポリマーミセル組成物中の全ブロックコポリマーに対するＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの含有量比（ＨＤＬ親和性ブロックコポリマー含有量／全ブロックコポリマー含有量、重量比）を０／１００を超えて１００／１００以下、好ましくは１／１００～１００／１００の範囲に設定する。より具体的には、ポリマーミセル組成物中のＨＤＬ非親和性ブロックコポリマーに対するＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの含有量比（ＨＤＬ親和性ブロックコポリマー：ＨＤＬ非親和性ブロックコポリマー、重量比）を、例えば、１：９９～９９：１の範囲、３：９７～９７：３の範囲、１５：８５～８５：１５の範囲、４０：６０～６０：４０の範囲に設定する。ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーの含有量比を大きくすると薬物の放出を促進でき、当該含有量比を小さくすると薬物の放出を抑制できる傾向がある。
　以下の説明では表示を簡略化するために、例えば、ブロックコポリマーの親水性ポリマー鎖セグメントが平均分子量１０，０００のＰＥＧ鎖からなり、疎水性ポリマー鎖セグメントが平均４０残基のポリアミノ酸鎖からなり、該ポリアミノ酸鎖の側鎖へのベンジル基の導入率が約６５％である場合、ブロックコポリマーの後に、（１０－４０、６５％Ｂｎ）と表記する。同様に、ポリアミノ酸鎖の側鎖に導入される疎水基がオクチル基またはコレステリル基である場合はそれぞれ、ブロックコポリマーの後に、（１０－４０、６５％Ｃ８）または（１０－４０、６５％Ｃｈｏｌ）と表記する。疎水性基の導入率が約６５％とは、６２～６８％を含む。
［参考例１］リゾチーム内包ポリマーミセルの調製
　ブロックコポリマーとして、下記の一般式（Ｖ）および表１に記載のブロックコポリマーを用いた。各ブロックコポリマーをバイアルに秤量し、ポリマー濃度が５ｍｇ／ｍＬになるよう精製水を加えた。次いで、該ポリマー溶液を４℃にて一晩激しく攪拌した。該ポリマー溶液をバイオディスラプター（日本精機製作所製、Ｈｉｇｈ　Ｐｏｗｅｒ　Ｕｎｉｔ）を用いて超音波照射（氷浴中、Ｌｏｗ、１秒間欠、１０分）し、次いで、０．２２μｍメンブレンフィルター処理した。これにより、５ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度の空ミセル溶液を得た。各空ミセル溶液（０．６ｍＬ）に、ポリマーに対して５％（ｗ/ｗ）になるよう１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液（０．１５ｍＬ）、２００ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６)、および精製水を加え、最終的に３ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度、０．１５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム濃度、２０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液の組成になるよう、またｐＨ６となるよう０．１Ｎ　ＨＣｌで調整した。この溶液を２、３度転倒撹拌した後、４℃にて一晩静置した。このように調製したリゾチーム内包ミセルを室温まで加温して用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 上記式中、グルタミン酸ユニットとその疎水性誘導体ユニットとの結合順は任意であり、１つのブロックコポリマー内においてランダムに存在する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［参考例２］ＨＤＬ移行率
　参考例１で調製したリゾチーム内包ポリマーミセルを用いて、各ブロックコポリマーのＨＤＬ移行率を求めた。具体的な実験方法は、次のとおりである。雄性Ｗｉｓｔａｒラットから８週齢時にヘパリン採血し、遠心後－８０℃で保存していたラット血漿８１０μＬに対し、リゾチーム内包ポリマーミセルを９０μＬ加え、３７℃で２４時間インキュベーションした（リゾチーム最終濃度：１５μｇ／ｍＬ、ポリマー最終濃度：３００μg／ｍＬ）。次いで、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｘｉｓ－ｓｈｉｅｌｄ－ｄｅｎｓｉｔｙ－ｇｒａｄｉｅｎｔ－ｍｅｄｉａ．ｃｏｍ／ＣＤ２００９／ｍａｃｒｏｍｏｌ／Ｍ０７．ｐｄｆからダウンロード可能なＡｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｍｅｄｉａ社のプロトコールに従って、商品名「ＯｐｔｉｍａＭＡＸ」（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて４５，０００ｒｐｍ（約１００，０００ｇ）、１５分、４℃の条件で超遠心した（Ｒｏｔａｒ：ＭＬＡ－１３０、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　ｔｕｂｅ：肉厚ポリアロマーチューブ）。次いで、超遠心後の血漿から最上層のカイロミクロン画分を取り除き、その後、商品名「（登録商標）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ」（Ａｘｉｓ－ｓｈｉｅｌｄ社製）を血漿の１／４容になるように、血漿７２０μＬに対して１８０μＬ添加および混合し、８５，０００ｒｐｍ（約３５０，０００ｇ）、３時間、１６℃の条件で超遠心した。超遠心の際、０．８５％（ｗ／ｖ）　ＮａＣｌ／１０ｍＭ　２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてバランス調整した。超遠心後、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬおよび残渣（Ｏｔｈｅｒ）の画分を回収し、ＰＥＧ－ＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｆｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用い、各画分中のブロックコポリマー濃度を測定した。得られたポリマー濃度および各画分の容量に基づいて、各画分中のブロックコポリマーの含有量およびその割合（すなわち、各画分へのブロックコポリマーの移行率）を算出した。結果を図２に示す。
　図２から分かるとおり、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、６０％Ｂｎ）、および、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、３０％Ｃｈｏｌ）はともに、ＨＤＬ移行率が５０％以上であり、高いＨＤＬ親和性を示した。一方、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、６０％Ｃ８）、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、６０％Ｃ１２）、および、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、６０％Ｃ１６）はいずれも、ＨＤＬ移行率が２０％未満であり、ＨＤＬよりもＬＤＬやＶＬＤＬ等の他のリポタンパクとより高い親和性を示した。
［実施例１］Ｇ－ＣＳＦ内包ポリマーミセルのラット静脈内投与試験
（１）ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、３０％Ｃｈｏｌ）
　ブロックコポリマーとして、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、３０％Ｃｈｏｌ）を用いた。該ブロックコポリマーをバイアルに秤量し、ポリマー濃度が２ｍｇ／ｍＬになるよう２０ｍＭ　２－モルホリノエタンスルホン酸・一水和物（ＭＥＳ）　Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５)を加え、４℃にて一晩激しく攪拌した。該ポリマー溶液をバイオディスラプター（日本精機製作所製、Ｈｉｇｈ　Ｐｏｗｅｒ　Ｕｎｉｔ）を用いて超音波照射（氷浴中、Ｌｏｗ、１秒間欠、１０分）し、次いで、０．２２μｍメンブレンフィルター処理した。これにより、２ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度の空ミセル溶液を得た。得られた空ミセル溶液（６ｍＬ）に、ポリマーに対して５％（ｗ/ｗ）になるよう３００μｇ／ｍＬのＧ－ＣＳＦ溶液（２ｍＬ）を加え、転倒撹拌して４℃にて一晩静置した。その後、該溶液を商品名「（登録商標）Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ」（ミリポア社製、カットオフ分子量：１００，０００）による限外ろ過にて精製および濃縮し、媒体を１０％（ｗ/ｗ）スクロース水溶液に置換した。回収したＧ－ＣＳＦ内包ポリマーミセルは－８０℃にて保存し、用時に室温で融解して用いた。
　上記で得られたＧ－ＣＳＦ内包ポリマーミセル溶液を雄性Ｗｉｓｔａｒラットに尾静脈内投与した。投与量は、１００μｇ／ｋｇ体重であり、投与サンプル数は３検体であった。投与後５分、１時間、６時間、１日、２日、および、３日にエーテル麻酔下で頸静脈からヘパリン処理したシリンジを用いて採血し、血漿中のＧ－ＣＳＦ濃度をＧ－ＣＳＦ－ＥＬＩＳＡキット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて測定した。
（２）ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、６０％Ｃ８）
　ブロックコポリマーとして、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、６０％Ｃ８）を用いたこと、および、投与サンプル数を９検体としたこと以外はＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、３０％Ｃｈｏｌ）による試験例と同様にしてＧ－ＣＳＦ内包ポリマーミセルを調製し、Ｇ－ＣＳＦの血漿中濃度推移を調べた。
（３）混合ポリマーミセル
　ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、３０％Ｃｈｏｌ）とＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、６０％Ｃ８）とを等量ずつ秤量し、両ポリマーをジクロロメタンに溶解し、完全に均一化した。その後、振とう濃縮器を用いて溶媒を留去してフィルムを作製した後、常法に従い空ミセルを得た。次いで、常法に従ってポリマーに対し５％（ｗ／ｗ）となるようにＧ－ＣＳＦを空ミセルに内包させた。得られたＧ－ＣＳＦ内包ポリマーミセルをラットに投与してＧ－ＣＳＦの血漿中濃度推移を調べた。
（４）Ｇ－ＣＳＦ直接投与
　Ｇ－ＣＳＦ内包ポリマーミセル溶液の代わりに、Ｇ－ＣＳＦ溶液（１００μｇ／ｍＬ）を用いたこと、および、投与サンプル数を５検体としたこと以外はＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、３０％Ｃｈｏｌ）による試験例と同様にして、Ｇ－ＣＳＦの血漿中濃度推移を調べた。
　実施例１の結果（ａｖｅｒａｇｅ±ＳＤ）を図３に示す。図３には、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、３０％Ｃｈｏｌ）とＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、６０％Ｃ８）の試験例による血漿中濃度推移の結果から算出した、混合ポリマーミセル（１：１）についての血漿中濃度推移の理論値も示す。
　図３に示すとおり、Ｇ－ＣＳＦを直接投与した場合、Ｇ－ＣＳＦは非常に速やかに分解または代謝され、血漿中の滞留時間は極めて短い。他方、Ｇ－ＣＳＦをポリマーミセルに内包させて投与した場合、血漿中の滞留時間が大幅に長くなった。そして、ポリマーミセルがＨＤＬ親和性ブロックコポリマーによって構成されている場合は、ＨＤＬ非親和性ブロックコポリマーによって構成されている場合に比べてＧ－ＣＳＦの放出が促進されていた。また、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、３０％Ｃｈｏｌ）とＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、６０％Ｃ８）とを１：１で含有する混合ポリマーミセルは、Ｇ－ＣＳＦの血漿中濃度の実側値が理論値よりも顕著に低かった。このことから、リポタンパクとの親和性が異なる複数のブロックコポリマーを混合した場合には、ポリマー混合比からは予期できない意外な薬物の放出促進作用が得られることが分かった。
［実施例２］
（１）Ｃ８型ミセル
　ブロックコポリマーとして、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、９０％Ｃ８）を用いた。該ブロックコポリマーをバイアルに秤量し、ポリマー濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように１３．３％スクロース含有２０ｍＭ　ＭＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）を加え、４℃にて一晩激しく撹拌した。該ポリマー溶液をバイオディスラプター（日本精機製作所、Ｈｉｇｈ　Ｐｏｗｅｒ　Ｕｎｉｔ）を用いて超音波照射（氷浴中、Ｈｉｇｈ、1秒間欠、１５分×３）し、次いで０．２２μｍメンブレンフィルター処理した。該溶液に上記スクロース含有２０ｍＭ　ＭＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）を加え、ポリマー濃度２ｍｇ／ｍＬとなるよう調整し、空ミセル溶液を得た。得られた空ミセル溶液（１．２ｍＬ）に、ポリマーに対して５％（ｗ／ｗ）になるように３００μｇ／ｍＬのＧ－ＣＳＦ溶液（０．４ｍＬ）を加え、転倒撹拌して４℃にて一晩静置した後、－８０℃にて保存し、用時に室温で融解して用いた。
（２）Ｂｎ型ミセル
　ブロックコポリマーとして、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、１００％Ｂｎ）を用いたこと以外はＣ８型ミセルの試験例と同様にして、Ｇ－ＣＳＦ内包ポリマーミセルを調製した。
（３）混合型ミセル
　ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、９０％Ｃ８）とＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、１００％Ｂｎ）をそれぞれバイアルに秤量し、ポリマー濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるようにアセトンで完全溶解し、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、９０％Ｃ８）とＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、１００％Ｂｎ）の重量比が１９：１、４：１、１：１になるようにそれぞれ混合した。その後、振とう濃縮器を用いて溶媒を留去したフィルムを作製した後、常法に従って空ミセルを得た。次いで、常法に従って、ポリマーに対して５％（ｗ／ｗ）となるようにＧ－ＣＳＦを空ミセルに内包させた。
　これらＧ－ＣＳＦ内包ポリマーミセル溶液を、エーテル軽麻酔下で雄性Ｗｉｓｔａｒラット（６週齢）に尾静脈内投与した。投与量は１００μｇ／ｋｇ体重であり、投与サンプル数は各溶液に３検体ずつとした。ヘパリン処理したシリンジで投与から２４時間後に採血し、終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるようにＥＤＴＡ－２Ｎａを加えた状態で、動物用多項目自動血球計数装置（シスメックス社製、ｐｏｃＨ－１００ｉＶ　Ｄｉｆｆ）を用いて好中球数を測定した。得られた測定値に基づき、下記式に従い、Ｂｎ型ミセルと各種混合型ミセルにおける薬物放出係数（％）を算出した。算出したポリマーミセルの薬物放出係数を表２に示す。当該係数が大きいほど、Ｃ８型ミセルよりも薬物を積極的に放出する作用が強いことを意味すると考えられる。
薬物放出係数（％）＝１００×（Ａ－Ｂ）／（Ａ－Ｃ）
Ａ：Ｃ８型ミセル投与検体の好中球数
Ｂ：各種混合型ミセル投与検体の好中球数
Ｃ：無処置検体の好中球数
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　このように、ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーとしてベンジル型ポリマーを選択した場合についても、混合型ミセルにすることで薬物の放出速度を制御できる。
［実施例３］
（１）Ｃ８型ミセル
　実施例２のＣ８型ミセルの試験例と同様にして、Ｇ－ＣＳＦ内包ポリマーミセルを調製した。
（２）Ｃｈｏｌ型ミセル
　ブロックコポリマーとして、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、２５％Ｃｈｏｌ）を用いたこと以外はＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、３０％Ｃｈｏｌ）の試験例と同様にして、Ｇ－ＣＳＦ内包ポリマーミセルを調製した。
（３）混合型ミセル
　ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、１００％Ｂｎ）に代えて、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、２５％Ｃｈｏｌ）を用いたこと、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、９０％Ｃ８）を溶解する溶媒としてジクロロメタンを用いたこと、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、９０％Ｃ８）とＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、２５％Ｃｈｏｌ）の重量比が１９：１、４：１になるようにそれぞれ混合した以外は実施例２と同様にして、Ｇ－ＣＳＦを空ミセルに内包させた。
　投与サンプル数を６検体とした以外は、実施例２と同様にして、好中球数を測定した。得られた測定値に基づき、実施例２と同様にして、Ｃｈｏｌ型ミセルと各種混合型ミセルにおける薬物放出係数（％）を算出した。算出したポリマーミセルの薬物放出係数を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　このように、ＨＤＬ親和性ブロックコポリマーとしてコレステロール型ポリマーを選択した場合についても、混合型ミセルにすることで薬物の放出速度を制御できる。
［実施例４］Ｇ－ＣＳＦ内包ポリマーミセルのラット静脈内投与試験
（１）Ｃ８型ミセル
　実施例２のＣ８型ミセルの試験例と同様にして、Ｇ－ＣＳＦ内包ポリマーミセルを調製した。
（２）Ｃｈｏｌ型ミセル
　実施例３のＣｈｏｌ型ミセルの試験例と同様にして、Ｇ－ＣＳＦ内包ポリマーミセルを調製した。
（３）混合ポリマーミセル
　実施例３の混合ポリマーミセルの試験例と同様にして、ＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、９０％Ｃ８）とＰＥＧ－ｐＧｌｕ（１０－４０、２５％Ｃｈｏｌ）の重量比が１９：１、４：１、１：１になるようにそれぞれ混合して、Ｇ－ＣＳＦ内包ポリマーミセルを調製した。
　上記で得られたＧ－ＣＳＦ内包ポリマーミセル溶液を雄性Ｗｉｓｔａｒラットに尾静脈内投与した。投与量は、１００μｇ／ｋｇ体重であり、投与サンプル数は各溶液に３検体ずつとした。投与後５分、１時間、６時間、１日、２日、および、３日にエーテル麻酔下で頸静脈からヘパリン処理したシリンジを用いて採血し、血漿中のＧ－ＣＳＦ濃度をＧ－ＣＳＦ－ＥＬＩＳＡキット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて測定した。
　実施例４の結果を図４に示す。図４に示すとおり、やはり混合型ミセルにすることで、薬物の血漿中の滞留時間を制御できる、換言すれば、薬物の放出速度を制御できることが分かった。なお、いずれの混合型ミセルについても、やはりＧ－ＣＳＦの血漿中濃度の実側値が理論値よりも顕著に低かった。

Claims (7)

  1. 　疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーを含有し、複数の該ブロックコポリマーが該疎水性ポリマー鎖セグメントを内側に向けると共に該親水性ポリマー鎖セグメントを外側に向けた状態で放射状に配置された、ポリマーミセル組成物であって、
    　該ブロックコポリマーとして、ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーとＨＤＬ以外のリポタンパクと親和性を有するブロックコポリマーとを含有しており、
    　該ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーの疎水性ポリマー鎖セグメントが、アミノ酸の疎水性誘導体由来の繰り返し単位を含有するポリアミノ酸からなり、該アミノ酸の疎水性誘導体がアミノ酸の側鎖に芳香族基および／またはステロール残基が導入された誘導体であり、
    　該ＨＤＬ以外のリポタンパクと親和性を有するブロックコポリマーの疎水性ポリマー鎖セグメントが、アミノ酸の疎水性誘導体由来の繰り返し単位を含有するポリアミノ酸からなり、該アミノ酸の疎水性誘導体がアミノ酸の側鎖に直鎖または分岐構造を有する疎水性基が導入された誘導体であり、
    　該親和性に起因するＨＤＬの付着によって該ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーの脱離が誘導され、該脱離によって隙間が形成されることにより、内包されるべき薬物である分子量１５００以上の水溶性の生理活性ポリペプチドおよびタンパク質からなる群より選択される１種の放出が促進され、該ＨＤＬ以外のリポタンパクと親和性を有するブロックコポリマーにより該隙間を小さくして、該内包されるべき薬物の放出の促進を抑制し、薬物の放出速度を制御することができる、ポリマーミセル組成物。
  2. 　疎水性ポリマー鎖セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーを含有し、複数の該ブロックコポリマーが該疎水性ポリマー鎖セグメントを内側に向けると共に該親水性ポリマー鎖セグメントを外側に向けた状態で放射状に配置された、ポリマーミセル組成物であって、
    　該ブロックコポリマーとして、ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーを含有しており、該ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーの疎水性ポリマー鎖セグメントが、アミノ酸の疎水性誘導体由来の繰り返し単位を含有するポリアミノ酸からなり、該アミノ酸の疎水性誘導体がアミノ酸の側鎖にステロール残基が導入された誘導体であり、該ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーの親水性ポリマー鎖セグメントが、ポリ（エチレングリコール）であり、該親和性に起因するＨＤＬの付着によって該ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマーの脱離が誘導され、該脱離によって隙間が形成されることにより、内包されるべき薬物である分子量１５００以上の水溶性の生理活性ポリペプチドおよびタンパク質からなる群より選択される１種の放出が促進される、ポリマーミセル組成物。
  3. 　前記アミノ酸の疎水性誘導体が、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される酸性アミノ酸の誘導体である、請求項１または２に記載のポリマーミセル組成物。
  4. 　リゾチームを内包させて、血漿中で３７℃、２４時間インキュベートした後に求めたＨＤＬ画分中の前記ＨＤＬと親和性を有するブロックコポリマー含有量が、他のリポタンパク画分（ただし、カイロミクロン画分を除く）中の含有量よりも多い、請求項１から３のいずれかに記載のポリマーミセル組成物。
  5. 　前記直鎖または分岐構造を有する疎水性基がＣ４～Ｃ１８の未置換もしくは置換された直鎖または分岐アルキル基、Ｃ４～Ｃ１８の未置換もしくは置換された直鎖または分岐アルケニル基、およびＣ４～Ｃ１８の未置換もしくは置換された直鎖または分岐アルキニル基である、請求項１、３および４のいずれかに記載のポリマーミセル組成物。
  6. 　前記ＨＤＬ以外のリポタンパクと親和性を有するブロックコポリマーのアミノ酸の疎水性誘導体が、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される酸性アミノ酸の誘導体である、請求項１および３から５のいずれかに記載のポリマーミセル組成物。
  7. 　請求項１から６のいずれかに記載のポリマーミセル組成物と該ポリマーミセル組成物に内包された薬物である分子量１５００以上の水溶性の生理活性ポリペプチドおよびタンパク質からなる群より選択される１種とを含有する、医薬組成物。
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