CN110628011B - 一种磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物，其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及实现血脑屏障穿透功能的磷脂‑聚乙二醇‑冰片(磷脂‑PEG‑BO)聚合物及其制备方法，该聚合物由“引药上行”的冰片以及磷脂‑PEG构成，可以作为药物递送载体，用于构建释药系统，发挥其穿透血脑屏障的作用。本发明将冰片作为实现脑靶向药物递送的功能分子，将其连接于磷脂‑PEG分子，提供了一种新颖、高效、低毒的脑靶向药物递送载体(磷脂‑PEG‑BO)及其制备方法与应用。

Description

一种磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物，其制备方法及应用

技术领域

本发明属于纳米生物医药材料领域，具体涉及一种对血脑屏障高穿透性的功能性聚合物载体材料制备方法及其应用。

背景技术

血脑屏障是由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞为主形成的一个实质性结构，通过脑血管内皮细胞之间的特殊蛋白，即紧密连接将细胞膜缝合为一个完整而巨大的血-脑物质交换屏障。血脑屏障阻碍了大量的大分子物质进入脑内，因而脑内的物质浓度与血浆有一定差异，尤其是脑内的大分子蛋白质及药物浓度较低。

二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)，作为科学研究中广泛使用的一种双亲性磷脂-PEG共轭物，含有亲水性PEG和疏水性DSPE。如此独特的DSPE-PEG分子，可以作为辅助型材料用来表面功能化一系列的药物传递系统如基于磷脂的纳米粒子、基于聚合物的纳米粒子、基于无机材料的纳米粒子等。PEG的引入可以降低免疫原性和抗原性，并可达到长循环的功能；DSPE用于作为纳米粒子的疏水性结构以便有效装载药物。

嵌段聚合物胶束是药剂学纳米体系研究的重要领域之一，近年来发展迅速。利用两亲型聚合物通过自组装方式形成纳米胶束，药物可以加载于内部疏水核心，也可加载于外部亲水层。

冰片是由龙脑香科植物的树脂和挥发油加工品提取获得结晶，属于芳开窍类中药。其“芳香之性走窜”，能开窍醒脑。本身为脂溶性强、相对分子极小的分子，易透过血脑屏障进入组织，并能“引药上行”，促进其他药物跨过血脑屏障。

P-gp是亲脂溶性蛋白，大量存在于血脑屏障的血管内皮细胞中，是血脑屏障组织外排的重要方式，其外排底物多为药物、毒素等异身物质。冰片发挥P-gp竞争性抑制剂的作用，当亲和力大的冰片透过血脑屏障，与P-gp结合被泵出细胞外，与P-gp结合力小的药物则在脑中蓄积。并且，冰片能使血脑屏障细胞吞饮小泡数量增多、体积增大，使细胞吞饮的物质转运加速，且作用可逆。

酯化反应一般是指醇和酸作用，生成酯和水的一种有机化学反应。费舍尔酯化法、酰氯酯化法、酸酐酯化法、梭酸盐酯化法、山口酯化法以及Steglich酯化法。与其他方法相比，Steglich酯化法合成具有反应条件温和、反应时间较短、产率高等优点。

酯化法反应机理分为两步：第一步羧酸与反应，生成活性比羧酸更强的o-酰基异脲；第二步酰基异脲受醇进攻，产生1,3-二环己基脲(DCU)和相应的酯。由于反应中的o-酰基异脲可发生1,3-重排生成N-酰基脲，从而不能与醇再发生作用，成为反应的副产物。为此需要加入强亲核性的DMAP，作为酰基转移试剂，以减少副反应的发生。在反应过程中，一方面，DCU以一定的方式与底物羧酸结合，并使其羰基碳更容易被亲核试剂进攻，利于反应的进行，同时，DCC作为反应脱水剂，除去反应副产物水，使酯化反应平衡正向移动，提高了产物得率。另一方面，由于DMAP结构上供电子的二甲氨基与母环(吡啶环)的共振，强烈地增加了吡啶环上的电于密度，使吡啶环氮原子的碱性和亲核性增强，强烈激活了环上的氮原子进行亲核取代，显著地催化高位阻、低反应性的醇类进行酯化反应，加快反应速率，缩短整个反应的周期，提高产物得率。DCU虽然可在一些溶剂中析出，但是多少都有一定的溶解度，因此很难除去干净。EDC的原理和DCC相似，但是反应之后可以用水洗掉，因此，得到产物易纯化。

发明内容

本发明的目的在于将冰片作为实现靶向性的分子，将其与一段PEG修饰的磷脂类长循环材料复合，提供了一种新的、高疗效、低毒性的多功能载体及其制备方法与应用。

本发明可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供了一种由冰片作为靶向配体的聚乙二醇修饰的磷脂类聚合物，由下述通式(Ⅰ)表示，其中聚乙二醇的聚合度n为5～450，优选8～230，进一步优选18～115，更优选25～55，进一步更优选30～50，最优选40～45，进一步最优选45。R为磷脂基。

其中磷脂R为选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)基、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)基、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)基、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)基、二月桂酰磷脂酰乙醇胺中(DLPE)基。

其中，R基的结构为：

二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)基：

二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)基：

二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)基：

二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)基：

二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)基：

本发明中选用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，也可用二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)替代，反应条件与使用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)相同。

优选的制备方法如下：

(1)将冰片、DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH、EDCI、DMAP在二氯甲烷中溶解，常温下反应24h。

(2)选用截留分子量为200-2500的透析袋进行透析，优选截留分子量为1000的透析袋：先于20％乙醇中透析24h，后于去离子水中透析24h。

(3)液体冷冻干燥后得冻干粉备用，得到含有冰片成分的磷脂-聚乙二醇-冰片(DSPE-PEG₂₀₀₀-BO)。

反应式如下：

其中，DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基，EDCI为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，DMAP为4-二甲氨基吡啶。

步骤(1)中所述的DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH与冰片的摩尔比为1:1-1:2，优选1:1.5，DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH/EDCI/DMAP摩尔比为1:1-1.5:0.2，优选1:1.2:0.2。

本发明中所用的冰片为右旋冰片，也可用左旋冰片或消旋冰片。

本发明将PEG修饰的磷脂类聚合物与具有血脑屏障穿透性的冰片相结合，制备了具有主动靶向作用的长循环载体材料，可以直接或者再经过其他途径用于药物载体、基因载体等用途。

本发明的再一个方面，提供了上述的磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物在作为体内、体外递送载体的应用。

在一个实施方案中，提供了聚合物胶束中包载的药物为盐酸阿霉素。

包载盐酸阿霉素的胶束制备方法参照梁伟等人的文献(参见Yiguang Wang,etal,Pharmaceutical Research,Vol.27,No.2,February 2010)，进行粒径、透射电镜、包封率的测定。

本发明提供的磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物作为体外递送载体的应用，其方法和步骤如下：

(1)体外释放实验

将阿霉素胶束溶液转移至透析袋中，两端扎紧后置于10ml的相应pH值(5.0和7.4)的等渗PBS缓冲液中(5.0、7.4)中，以中国药典2015版四部溶出度测定法之第三法(小杯法)的装置和方法37℃恒温振荡，回旋速度为100rpm。定时取出0.5ml释放介质，同时补充同温同体积新鲜释放介质。取出的释放介质离心(12000rpm，10min)，应用高效液相色谱法测定盐酸阿霉素的累积含量。

(2)溶血实验

用眼眶取血的方法取新鲜小鼠血液，用竹签迅速搅拌除去纤维蛋白后，加0.9％生理盐水洗涤，反复数次直至上清液不显红色为止，所得红细胞用0.9％生理盐水配制成2％(v/v)的红细胞混悬液，临用时摇匀，实验时新鲜配制。

取材料冻干制剂，以0.9％生理盐水分别稀释成一定浓度的溶液，各取200μl，另取同体积新鲜蒸馏水作为阳性对照管，取同体积0.9％生理盐水作为阴性对照管。向上述各管中分别加入2％红细胞混悬液200μl，轻轻摇匀后置37℃的水浴中保温1h后离心，吸取上清液在575nm处测定各管溶液的吸光度(A)。根据下式计算各浓度溶血度：

溶血度(％)＝[(A_样品-A_阴性)/(A_阳性-A_阴性)]×100

(3)细胞增殖抑制

将材料冻干制剂用培养液稀释成预定浓度的溶液。每个浓度设6个复孔，并设对照组和调零组。将适量对数生长期的细胞接种于96孔板中，继续培养24h后，介质以含有不同药物浓度的新鲜培养液替换，分别继续培养24h或48h。每孔加入CCK-8试剂20μl。继续孵育2h，于450nm处测定吸收值，并以650nm为参考波长。计算细胞活力，公式如下：

细胞活力(％)＝[(OD_实验-OD_调零)/(OD_对照-OD_调零)]×100

本发明提供的磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物作为体内递送载体的应用，其方法和步骤如下：

(1)以DiR为荧光探针，BO-PEG-DSPE：mPEG-DSPE＝1:9或者0:1，采用薄膜水化法制备DiR胶束。

(2)取4周龄的ICR小鼠，将小鼠随机分为3组，每组6只，3组分别尾静脉200μl的冰片修饰的DSPE-PEG胶束溶液(其中DSPE-PEG₂₀₀₀与DSPE-PEG₂₀₀₀-BO摩尔比为9：1)，200μl的无冰片修饰的DSPE-PEG胶束溶液与生理盐水。

(3)注射0.5、2h后，将小鼠用异氟烷麻醉，用小动物活体成像仪观察体内荧光现象。

有益效果：

1、合成过程中使用了“一锅法”的合成方法，简化了操作步骤，提高了工作效率，节约了生产成本。

2、本发明制备的纳米材料具有穿透血脑屏障的功能。

3、本发明制备纳米材料具有良好的生物相容性和血液长循环的功能，从而能有效提高其诊断和治疗的效果。

4、可选用生物膜为载体包载药物(如阿霉素、紫杉醇等模式药物)，将其用本发明所制备的含有冰片成分的PEG-DSPE修饰后，具有更好的肿瘤靶向性、穿透性及抗肿瘤作用。

附图说明

图1：冰片的1H-NMR图谱

图2：DSPE-mPEG2000的1H-NMR图谱

图3：DSPE-PEG2000-BO的1H-NMR图谱

图4：DSPE-PEG2000-BO的MALDI-TOF图谱

图5：包载盐酸阿霉素的聚合物胶束的动态光散射(DLS)粒径分布图

图6：包载盐酸阿霉素的聚合物胶束透射电镜图

图7：包载阿霉素的聚合物胶束体外累计释放曲线

图8：DSPE-PEG2000-BO溶血实验结果图

图9：DSPE-PEG2000-BO对大鼠神经胶质瘤C6细胞的增殖抑制结果图

图10：DSPE-PEG2000-BO对人脑微血管内皮HBMEC细胞的增殖抑制结果图

图11：DSPE-PEG2000-BO在体内载荧光染料入脑的小动物活体成像图

图12：DSPE-PEG2000-BO在体内载荧光染料入脑的荧光强度柱形图

具体实施方式

实施例1：DSPE-PEG₂₀₀₀-BO的合成

称取10mg DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH、0.7mg右旋冰片、1.1mg EDCI以及0.1mg DMAP溶于5ml二氯甲烷中，室温搅拌反应24h。反应结束后，选用截留分子量为2500的透析袋进行透析：先于20％乙醇中透析24h，后于去离子水中透析24h。液体冷冻干燥得到冰片修饰的DSPE-PEG₂₀₀₀磷脂分子。

取冻干后的DSPE-PEG₂₀₀₀-BO溶解于CDCl₃，采用600MHz的核磁共振氢谱(¹H-NMR)进行结构确认，结果见图1-3。从图1-3可知，化学位移12.00ppm归属于DSPE-mPEG₂₀₀₀结构中的羧基(-COOH)，在的核磁图谱中已消失。并且，在DSPE-PEG₂₀₀₀-BO的核磁图谱中出现化学位移0.8-1.2ppm的归属于冰片母核三个甲基(-C-(CH₃)-C-(CH₃)-C-O)的质子峰。以上峰归属表明冰片通过与羧基反应，成功生成DSPE-PEG₂₀₀₀-BO。

基质辅助激光解析串联飞行时间质谱用于检测DSPE-PEG₂₀₀₀-BO的分子量，即为2955.7Da，检测基质为3-吲哚乙酸。

实施例2：包载阿霉素的DSPE-PEG胶束的制备

在25ml圆底烧瓶中，将5mg盐酸阿霉素与25mg DSPE-mPEG₂₀₀₀粉末(或22.5mgDSPE-mPEG₂₀₀₀、2.5mg DSPE-PEG₂₀₀₀-BO粉末)溶于5ml去离子水中，摇匀。瓶中充满氮气，在60℃条件下搅拌30分钟，即得到包载盐酸阿霉素的无冰片修饰的聚合物胶束以及有冰片修饰的聚合物胶束。

冰片修饰的聚合物胶束的物理性质：粒径：以动态光散射法测定，为14.95nm；包封率：经高效液相色谱法测定，为95.69％；载药量：经高效液相色谱法测定，为14.62％。

无冰片修饰的聚合物胶束的物理性质：粒径：以动态光散射法测定，为13.86nm；包封率：经高效液相色谱法测定，为94.37％；载药量：经高效液相色谱法测定，为14.24％。

实施例3：包载阿霉素的聚合物胶束体外累计释放度的测定

将阿霉素胶束溶液(含盐酸阿霉素1mg)转移至透析袋中，两端扎紧后置于10ml的相应pH值(5.0和7.4)的等渗PBS缓冲液中，以中国药典2015版四部溶出度测定法之第三法(小杯法)的装置和方法，37℃恒温振荡，回旋速度为100rpm。在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、27、30、33、36、48、56、71、79h定时取出0.5ml释放介质，同时补充同温同体积新鲜释放介质。取出的释放介质离心(12000rpm，10min)，应用高效液相色谱法测定盐酸阿霉素的累积含量，结果如图7所示。

图7显示，随着pH值的降低，盐酸阿霉素释放速率增加。特别是：包载阿霉素的聚合物胶束在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中进行体外释放实验，在79小时内活性药物的累计释放量率低于50％；在pH值为5.0的磷酸盐缓冲液中进行体外释放实验，在79小时内活性药物的累计释放量率高于60％。

释放速率的增加是由于：阿霉素解离程度提高，正电荷数目增多，药物分子之间的静电排斥作用增强；DSPE-PEG₂₀₀₀由荷负点转为荷正电，丧失了与药物之间的静电吸引作用。

药理实验：

实验例1：磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物的溶血实验

用眼眶取血的方法取新鲜ICR小鼠血液，用竹签迅速搅拌除去纤维蛋白后，加0.9％生理盐水于转速为1200rpm离心机离心洗涤15min，反复数次直至上清液不显红色为止，所得红细胞用0.9％生理盐水配制成2％(v/v)的红细胞混悬液，临用时摇匀，实验时新鲜配制。

取材料冻干制剂，以0.9％生理盐水分别稀释成浓度为0.1、0.25、0.5、0.75、1mg/ml的溶液，各取200μl，另取同体积新鲜蒸馏水作为阳性对照管，取同体积0.9％生理盐水作为阴性对照管。向上述各管中分别加入2％红细胞混悬液200μl，轻轻摇匀后置37℃的水浴中保温1h，后取出Ep管，将取出的Ep管1200rpm离心15min，吸取上清液在575nm处测定各管溶液的吸光度(A)。根据下式计算各浓度溶血度：

溶血度(％)＝[(A_样品-A_阴性)/(A_阳性-A_阴性)]×100

表1为各个浓度磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物的溶血情况

浓度(mg/ml)	0.1	0.25	0.5	0.75	1
						溶血度(％)	1.33±0.46	1.84±0.13	2.26±0.14	2.31±0.09	3.52±0.16

图8与表1表明，磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物在浓度为0.1，0.25，0.5，0.75和1mg/ml时均不存在溶血现象，溶血度均小于5％，表明该空白胶束具有良好的安全性和相容性。

实验例2：细胞增殖抑制

将材料冻干制剂用培养液稀释成预定浓度的溶液。每个浓度设6个复孔，并设对照组和调零组。将大鼠神经胶质瘤C6细胞、人脑微血管内皮HBMEC细胞以3×10³密度接种于96孔板中，继续培养24h后，介质以含有0.0005、0.005、0.05、0.25、0.5、5、50μg/ml的空白胶束浓度的新鲜培养液替换，分别继续培养24h或48h。每孔加入CCK-8试剂20μl。继续孵育2h，于450nm处测定吸收值，并以650nm为参考波长。计算细胞活力，公式如下：

细胞活力(％)＝[(OD_实验-OD_调零)/(OD_对照-OD_调零)]×100

表2为磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物对大鼠神经胶质瘤C6细胞的增殖抑制情况

表3为磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物对人脑微血管内皮HBMEC细胞的增殖抑制情况

图9-10与表2-3表明，空白胶束在所测定的浓度范围内，C6、HMBEC细胞的活力均在85％以上，表明材料本身对细胞毒性较小。说明本专利提供的磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物在安全性方面存在优势。

实验例3：磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物在体内穿透血脑屏障的效率

以DiR为荧光探针，BO-PEG-DSPE：mPEG-DSPE＝1:9或者0:1，采用薄膜水化法制备DiR胶束。

取4周龄的ICR小鼠，将小鼠随机分为3组，每组6只，3组分别尾静脉200μl的冰片修饰的DSPE-PEG胶束溶液(其中DSPE-PEG与DSPE-PEG-BO摩尔比为9：1)，200μl的无冰片修饰的DSPE-PEG胶束溶液与生理盐水。注射0.5、2h后，将小鼠用异氟烷麻醉，用小动物活体成像仪观察体内荧光现象。结果见图11(每组分别选取一只代表性小鼠拍照)、图12。

表4为ICR小鼠脑部荧光强度值。

由表4及图11-12可知，与无靶头的纳米胶束相比，带靶头的纳米胶束在2h内脑内荧光强度显著高于无靶头的纳米胶束，2h内两组载DiR胶束在脑内荧光强度具有显著性差异，表明冰片连接到载体上后可显著提高纳米胶束穿透血脑屏障的能力，确证了冰片修饰的纳米胶束具有脑靶向性能。

Claims (9)

1.一种式(Ⅰ)所示的磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物，其结构组成为：聚乙二醇分子链的一端连接冰片分子，分子链另一端连接磷脂分子R的胺基端，R选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺基、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺基、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺基、二油酰磷脂酰乙醇胺基或二月桂酰磷脂酰乙醇胺基，聚乙二醇的聚合度n为5～450，

2.根据权利要求1的磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物，其特征在于，所选用的冰片为右旋冰片、左旋冰片或消旋冰片。

3.一种权利要求1的磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物的制备方法，制备步骤如下：1)将冰片、磷脂-聚乙二醇-COOH、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶用二氯甲烷溶解，室温下反应24h；2)选用一定截留分子量的透析袋进行透析：先于20％乙醇中透析24h，后于去离子水中透析24h；3)液体冷冻干燥后得冻干粉备用，得到含有冰片成分的磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物。

4.根据权利要求3所述的磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物的制备方法，其特征在于，磷脂-聚乙二醇-COOH与冰片的摩尔比为1:1-1:2，磷脂-聚乙二醇-COOH/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/4-二甲氨基吡啶摩尔比为1:1-1.5:0.2。

5.权利要求1所述的磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物用于制备在体外和体内递送药物的载体的应用。

6.根据权利要求5所述的聚合物应用，磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物本身可在溶液中形成聚合物胶束，胶束加载活性药物形成纳米制剂。

7.根 据权利要求5所述的聚合物应用，磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物作为其中一个组分，配合使用其他非主药成分，可制备含有该聚合物的纳米制剂，纳米制剂加载活性药物。

8.根据权利要求6或7的所述聚合物应用，所述的纳米制剂中加载的药物包括脂溶性药物和疏水性药物。

9.根据权利要求6或7所述的聚合物应用，所加载的药物包括抗肿瘤药物阿霉素、紫杉醇或羟基喜树碱。

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