JP2002526065A - 安定な神経幹細胞系 - Google Patents
安定な神経幹細胞系Info
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Abstract
(57)【要約】
安定な神経幹細胞系とニューロン前駆細胞系を樹立するための系統的かつ効率的方法を開示する。得られる細胞系は、正常な核型と正常なニューロン表現型を維持しながら、ヒトおよび他の哺乳動物ニューロンの強靭かつ単純で、再現性のある培養物を、商業的に有用な量で提供する。
Description
【０００１】発明の背景 1．発明の分野 本出願は、安定な神経幹細胞系とニューロン前駆細胞系を樹立するための系統
的かつ効率的方法を開示する。得られる細胞系は、正常な核型と正常なニューロ
ン表現型を維持しながら、ヒトおよび他の哺乳動物ニューロンの強靭かつ単純で
、再現性のある培養物を商業的に有用な量で提供する。
的かつ効率的方法を開示する。得られる細胞系は、正常な核型と正常なニューロ
ン表現型を維持しながら、ヒトおよび他の哺乳動物ニューロンの強靭かつ単純で
、再現性のある培養物を商業的に有用な量で提供する。
【０００２】２．関連技術の説明 発生中の胎児脳は、発達して成体脳の細胞になるすべての細胞と、これらを組
織化してニューロンの最終網状構造を作るのに必要なすべてのプログラムを含ん
でいる。発生の初期段階では、神経系は胚芽細胞で占められ、発生の以後の段階
でここから他のすべての細胞（主に、ニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞
）が誘導される。正常な脳の発達の前駆細胞であるそのような胚芽細胞は、これ
らの胚芽細胞が単離され、増殖され、成熟細胞型に分化するならば、遺伝子ベー
スの治療および細胞ベースの治療に理想的であろう。
織化してニューロンの最終網状構造を作るのに必要なすべてのプログラムを含ん
でいる。発生の初期段階では、神経系は胚芽細胞で占められ、発生の以後の段階
でここから他のすべての細胞（主に、ニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞
）が誘導される。正常な脳の発達の前駆細胞であるそのような胚芽細胞は、これ
らの胚芽細胞が単離され、増殖され、成熟細胞型に分化するならば、遺伝子ベー
スの治療および細胞ベースの治療に理想的であろう。
【０００３】 基礎的研究と治療への応用の両方に対する単離された初代細胞の有用性は、単
離された細胞が脳の中の細胞にどの程度似ているかに依存する。発生中の脳にど
れだけの異なる種類の神経前駆細胞があるかは不明である。しかし、いくつかの
特徴的な型の細胞が存在する： ニューロンのみに対する単分化能前駆体（「約束された神経前駆細胞」または
「神経芽細胞」）、 乏突起膠細胞のみに対する単分化能前駆体（「乏突起神経膠芽細胞」）、 星状細胞のみに対する単分化能前駆体（「神経膠芽細胞」）、 ニューロンまたは乏突起膠細胞、ニューロンまたは星状細胞、および乏突起膠
細胞または星状細胞のいずれかになることができる二分化能前駆体、および ３つの型の細胞のいずれかに分化する能力を維持する多分化能前駆体。
離された細胞が脳の中の細胞にどの程度似ているかに依存する。発生中の脳にど
れだけの異なる種類の神経前駆細胞があるかは不明である。しかし、いくつかの
特徴的な型の細胞が存在する： ニューロンのみに対する単分化能前駆体（「約束された神経前駆細胞」または
「神経芽細胞」）、 乏突起膠細胞のみに対する単分化能前駆体（「乏突起神経膠芽細胞」）、 星状細胞のみに対する単分化能前駆体（「神経膠芽細胞」）、 ニューロンまたは乏突起膠細胞、ニューロンまたは星状細胞、および乏突起膠
細胞または星状細胞のいずれかになることができる二分化能前駆体、および ３つの型の細胞のいずれかに分化する能力を維持する多分化能前駆体。
【０００４】 CNS幹細胞は、哺乳動物の中枢神経系（CNS）のすべての主要な型の細胞（ニュ
ーロン、星状細胞、および乏突起膠細胞を含む）に分化する固有の性質を有する
多分化能前駆細胞である。CNS幹細胞の単離と分化方法および分化した細胞型の
性状解析法は、すでに米国特許第5,753,506号（Johe）に詳細に記載されている
。簡単に説明すると、CNS幹細胞は、唯一の分裂促進因子として塩基性繊維芽細
胞増殖因子（bFGF）を含有する化学的に規定された無血清培地で増殖される。そ
の培養条件は、大量培養物およびクローン性培養物の両方として、長期間、CNS
幹細胞のほぼ純粋な集団を与える。
ーロン、星状細胞、および乏突起膠細胞を含む）に分化する固有の性質を有する
多分化能前駆細胞である。CNS幹細胞の単離と分化方法および分化した細胞型の
性状解析法は、すでに米国特許第5,753,506号（Johe）に詳細に記載されている
。簡単に説明すると、CNS幹細胞は、唯一の分裂促進因子として塩基性繊維芽細
胞増殖因子（bFGF）を含有する化学的に規定された無血清培地で増殖される。そ
の培養条件は、大量培養物およびクローン性培養物の両方として、長期間、CNS
幹細胞のほぼ純粋な集団を与える。
【０００５】 しかしCNS幹細胞の分裂促進能力は有限である。従来の培養条件では、約30回
の細胞倍加（この時点で、大多数の細胞は、神経分化能力を喪失し、多分化能幹
細胞としてよりグリア前駆体として増殖する）を超えてCNS幹細胞を増殖するこ
とは困難であった。この限界の機序はいまだに不明である。
の細胞倍加（この時点で、大多数の細胞は、神経分化能力を喪失し、多分化能幹
細胞としてよりグリア前駆体として増殖する）を超えてCNS幹細胞を増殖するこ
とは困難であった。この限界の機序はいまだに不明である。
【０００６】 本発明者らは、分裂性CNS幹細胞が、有糸分裂のG1期に細胞周期に入ることを
抑制する１種以上の自己分泌性因子を分泌すると仮定した。これは、bFGFの分裂
作用に有効に拮抗し、分化経路を開始するであろう。すなわち、これは、CNS幹
細胞の増殖を自己制御し、in vivoで発生中のニューロンとグリアの形成を制限
する作用機序である。高い細胞密度が、bFGFの存在下でもかつ継代時間に無関係
に、CNS幹細胞を迅速に分化させるという観察結果は、この作用機序に一致して
いる。
抑制する１種以上の自己分泌性因子を分泌すると仮定した。これは、bFGFの分裂
作用に有効に拮抗し、分化経路を開始するであろう。すなわち、これは、CNS幹
細胞の増殖を自己制御し、in vivoで発生中のニューロンとグリアの形成を制限
する作用機序である。高い細胞密度が、bFGFの存在下でもかつ継代時間に無関係
に、CNS幹細胞を迅速に分化させるという観察結果は、この作用機序に一致して
いる。
【０００７】 30回の細胞倍加は、細胞の109倍の増殖をもたらすが、CNS幹細胞のさらに顕著
な増殖方法は、商業的価値が高いであろう。本明細書において我々は、CNS幹細
胞中のc-mycタンパク質の構成的活性化は、高細胞密度で自然発生的分化を防止
し、グリア分化に対する抵抗性を与え、60回を超える細胞倍加分裂能を与えるこ
とを開示する。従って本方法は、CNS幹細胞の1018倍を超える増殖を与える。
な増殖方法は、商業的価値が高いであろう。本明細書において我々は、CNS幹細
胞中のc-mycタンパク質の構成的活性化は、高細胞密度で自然発生的分化を防止
し、グリア分化に対する抵抗性を与え、60回を超える細胞倍加分裂能を与えるこ
とを開示する。従って本方法は、CNS幹細胞の1018倍を超える増殖を与える。
【０００８】発明の概要 本出願は、in vitroで哺乳動物の神経前駆細胞の安定な細胞系を産生する方法
を開示する。本方法は、無血清培地中で神経前駆細胞の培養物を調製する工程；
第１の分裂促進因子の存在下で神経前駆細胞を培養する工程（ここで、第１の分
裂促進因子は、aFGF、bFGF、EGF、TGFαおよびこれらの組合せよりなる群から選
択される）；該細胞に取り込まれてc-myc遺伝子を発現することができる物質に
該細胞を接触させる工程；および第１の分裂促進因子と第２の分裂促進因子とを
含有する培地中で該細胞をさらに培養する工程（ここで、第２の分裂促進因子は
aFGF、bFGF、EGF、TGFα、血清およびこれらの組合せよりなる群から選択される
が、第２の分裂促進因子は第１の分裂促進因子とは異なるものである）を含んで
なる。
を開示する。本方法は、無血清培地中で神経前駆細胞の培養物を調製する工程；
第１の分裂促進因子の存在下で神経前駆細胞を培養する工程（ここで、第１の分
裂促進因子は、aFGF、bFGF、EGF、TGFαおよびこれらの組合せよりなる群から選
択される）；該細胞に取り込まれてc-myc遺伝子を発現することができる物質に
該細胞を接触させる工程；および第１の分裂促進因子と第２の分裂促進因子とを
含有する培地中で該細胞をさらに培養する工程（ここで、第２の分裂促進因子は
aFGF、bFGF、EGF、TGFα、血清およびこれらの組合せよりなる群から選択される
が、第２の分裂促進因子は第１の分裂促進因子とは異なるものである）を含んで
なる。
【０００９】 本方法の好適な実施形態において、c-myc遺伝子は他のDNA成分と融合されてお
り、ここで該他のDNA成分は、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、プロ
ゲステロン受容体、グルココルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノ
イド受容体、およびエクジソン受容体のリガンド結合ドメインよりなる群から選
択される少なくとも１つの成分を含んでなる。
り、ここで該他のDNA成分は、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、プロ
ゲステロン受容体、グルココルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノ
イド受容体、およびエクジソン受容体のリガンド結合ドメインよりなる群から選
択される少なくとも１つの成分を含んでなる。
【００１０】 本方法の別の好適な実施形態において、第１の分裂促進因子と第２の分裂促進
因子とを含有する培地は、β−エストラジオール、RU38486、デキサメタゾン、
甲状腺ホルモン、レチノイドおよびエクジソンよりなる群から選択されるmyc活
性化化学物質をさらに含む。
因子とを含有する培地は、β−エストラジオール、RU38486、デキサメタゾン、
甲状腺ホルモン、レチノイドおよびエクジソンよりなる群から選択されるmyc活
性化化学物質をさらに含む。
【００１１】 本方法のさらに好適な実施形態において、哺乳動物の神経前駆細胞はヒト由来
のものである。本方法の別のより好適な実施形態において、哺乳動物の神経前駆
細胞は、多能性の胚性幹細胞のin vitro培養物から得られる。
のものである。本方法の別のより好適な実施形態において、哺乳動物の神経前駆
細胞は、多能性の胚性幹細胞のin vitro培養物から得られる。
【００１２】 本出願はまた、本方法に従って産生される細胞系を開示する。この細胞系の好
適な実施形態において、該細胞は、ニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞に
分化する多分化能を保持する。この細胞系の他の好適な実施形態において、該細
胞は、ニューロンと星状細胞または星状細胞と乏突起膠細胞に分化する二分化能
を保持する。
適な実施形態において、該細胞は、ニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞に
分化する多分化能を保持する。この細胞系の他の好適な実施形態において、該細
胞は、ニューロンと星状細胞または星状細胞と乏突起膠細胞に分化する二分化能
を保持する。
【００１３】 前記細胞系のより好適な実施形態において、該細胞は、ニューロンまたは星状
細胞に分化する単分化能を保持する。
細胞に分化する単分化能を保持する。
【００１４】 本出願はまた、in vitroで哺乳動物の神経前駆細胞の安定なクローン性細胞系
を産生する方法を開示する。本方法は、無血清培地中で神経前駆細胞の培養物を
調製する工程；第１の分裂促進因子の存在下で神経前駆細胞を培養する工程（こ
こで、第１の分裂促進因子は、aFGF、bFGF、EGF、TGFαおよびこれらの組合せよ
りなる群から選択される）；該細胞に取り込まれてc-myc遺伝子と選択マーカー
を発現することができる物質に該細胞を接触させる工程；および第１の分裂促進
因子と第２の分裂促進因子とを含有する培地中で該細胞をさらに培養する工程（
ここで、第２の分裂促進因子は、aFGF、bFGF、EGF、TGFα、血清およびこれらの
組合せよりなる群から選択されるが、第２の分裂促進因子は第１の分裂促進因子
とは異なるものである）；c-myc処理細胞を回収し、これを、選択マーカーを含
まずかつ第１の分裂促進因子と第２の分裂促進因子とを含有する培地中でc-myc
処理細胞の生存を支援することができるフィーダー細胞と共培養する工程（ただ
し、第２の分裂促進因子は第１の分裂促進因子とは異なるものである）とを含ん
でなる。
を産生する方法を開示する。本方法は、無血清培地中で神経前駆細胞の培養物を
調製する工程；第１の分裂促進因子の存在下で神経前駆細胞を培養する工程（こ
こで、第１の分裂促進因子は、aFGF、bFGF、EGF、TGFαおよびこれらの組合せよ
りなる群から選択される）；該細胞に取り込まれてc-myc遺伝子と選択マーカー
を発現することができる物質に該細胞を接触させる工程；および第１の分裂促進
因子と第２の分裂促進因子とを含有する培地中で該細胞をさらに培養する工程（
ここで、第２の分裂促進因子は、aFGF、bFGF、EGF、TGFα、血清およびこれらの
組合せよりなる群から選択されるが、第２の分裂促進因子は第１の分裂促進因子
とは異なるものである）；c-myc処理細胞を回収し、これを、選択マーカーを含
まずかつ第１の分裂促進因子と第２の分裂促進因子とを含有する培地中でc-myc
処理細胞の生存を支援することができるフィーダー細胞と共培養する工程（ただ
し、第２の分裂促進因子は第１の分裂促進因子とは異なるものである）とを含ん
でなる。
【００１５】 本方法の好適な実施形態において、c-myc遺伝子は他のDNA成分と融合されてお
り、ここで該他のDNA成分は、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、プロ
ゲステロン受容体、グルココルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノ
イド受容体、およびエクジソン受容体のリガンド結合ドメインよりなる群から選
択される少なくとも１つの成分を含んでなる。
り、ここで該他のDNA成分は、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、プロ
ゲステロン受容体、グルココルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノ
イド受容体、およびエクジソン受容体のリガンド結合ドメインよりなる群から選
択される少なくとも１つの成分を含んでなる。
【００１６】 本方法の別の好適な実施形態において、第１の分裂促進因子と第２の分裂促進
因子とを含有する培地は、β−エストラジオール、RU38486、デキサメタゾン、
甲状腺ホルモン、レチノイドおよびエクジソンよりなる群から選択されるmyc活
性化化学物質をさらに含む。
因子とを含有する培地は、β−エストラジオール、RU38486、デキサメタゾン、
甲状腺ホルモン、レチノイドおよびエクジソンよりなる群から選択されるmyc活
性化化学物質をさらに含む。
【００１７】 本方法のさらに好適な実施形態において、哺乳動物の神経前駆細胞はヒト由来
のものである。本方法の別のより好適な実施形態において、哺乳動物の神経前駆
細胞は、多能性の胚性幹細胞のin vitro培養物から得られる。
のものである。本方法の別のより好適な実施形態において、哺乳動物の神経前駆
細胞は、多能性の胚性幹細胞のin vitro培養物から得られる。
【００１８】 本出願はまた、本方法に従って産生される細胞系を開示する。この細胞系の好
適な実施形態において、該細胞は、ニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞に
分化する多分化能を保持する。この細胞系の他の好適な実施形態において、該細
胞は、ニューロンと星状細胞または星状細胞と乏突起膠細胞に分化する二分化能
を保持する。
適な実施形態において、該細胞は、ニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞に
分化する多分化能を保持する。この細胞系の他の好適な実施形態において、該細
胞は、ニューロンと星状細胞または星状細胞と乏突起膠細胞に分化する二分化能
を保持する。
【００１９】 前記細胞系のより好適な実施形態において、該細胞は、ニューロンまたは星状
細胞に分化する単分化能を保持する。
細胞に分化する単分化能を保持する。
【００２０】好適な実施形態の詳細な説明 培養物中の神経細胞は形成性が高い。血清のような最適ではない培養条件下に
短時間接触させても、細胞の表現型に対して小さいが有意な長期的作用を有する
。ほとんどすべての報告された神経培養物は、分裂促進因子の主要な供給源とし
て血清を使用する。我々および他の研究者は、幹細胞と他の細胞の本質的分化能
力を維持するためには、血清への細胞の暴露を減少させることが決定的に重要で
あり、無血清培地中の別個の増殖因子（特に、bFGF）および／または表皮増殖因
子EGF）は、種々の異なる型の細胞を、単一の培養物中で増殖させることができ
ることを証明した（Johe、米国特許第5,735,506号；Weissら、米国特許第5,851,
832号）。
短時間接触させても、細胞の表現型に対して小さいが有意な長期的作用を有する
。ほとんどすべての報告された神経培養物は、分裂促進因子の主要な供給源とし
て血清を使用する。我々および他の研究者は、幹細胞と他の細胞の本質的分化能
力を維持するためには、血清への細胞の暴露を減少させることが決定的に重要で
あり、無血清培地中の別個の増殖因子（特に、bFGF）および／または表皮増殖因
子EGF）は、種々の異なる型の細胞を、単一の培養物中で増殖させることができ
ることを証明した（Johe、米国特許第5,735,506号；Weissら、米国特許第5,851,
832号）。
【００２１】 各型の細胞についての特定の分子マーカーの非存在下では、単一の培養物中に
存在しうる何千もの可能な異なる型の神経細胞を単離することは現実的ではなか
った。以前の研究で我々は、培養物中に種々の異なるニューロンを与える方法お
よび別個のCNS幹細胞集団の組成物を記載した。ここでは、神経細胞の分化能を
安定化させかつ安定なクローン性細胞系を単離するための、c-myc遺伝子の過剰
発現を利用する再現性がありかつ効率的な方法を説明する。
存在しうる何千もの可能な異なる型の神経細胞を単離することは現実的ではなか
った。以前の研究で我々は、培養物中に種々の異なるニューロンを与える方法お
よび別個のCNS幹細胞集団の組成物を記載した。ここでは、神経細胞の分化能を
安定化させかつ安定なクローン性細胞系を単離するための、c-myc遺伝子の過剰
発現を利用する再現性がありかつ効率的な方法を説明する。
【００２２】 連続的継代でCNS幹細胞は、ニューロンに分化する能力を徐々に喪失して、グ
リア前駆細胞になる。このプロセスを加速する条件には、増殖中の高細胞密度、
細胞外マトリックス被覆表面への細胞の付着の不足、グリア促進因子（例えば、
CNTF（毛様体神経栄養因子）、LIF（白血病阻害因子）、BMP（骨形態発生因子）
および血清）への暴露がある。CNS幹細胞の神経分化能のこの不安定性を克服す
るために、我々は、その活性が細胞外分子であるβ−エストラジオールの有無に
より制御することができる、細胞性癌原遺伝子c-mycを細胞に導入した。
リア前駆細胞になる。このプロセスを加速する条件には、増殖中の高細胞密度、
細胞外マトリックス被覆表面への細胞の付着の不足、グリア促進因子（例えば、
CNTF（毛様体神経栄養因子）、LIF（白血病阻害因子）、BMP（骨形態発生因子）
および血清）への暴露がある。CNS幹細胞の神経分化能のこの不安定性を克服す
るために、我々は、その活性が細胞外分子であるβ−エストラジオールの有無に
より制御することができる、細胞性癌原遺伝子c-mycを細胞に導入した。
【００２３】 融合遺伝子を有するヒトおよびラットCNS幹細胞を、培養培地中の分裂促進因
子とβ−エストラジオールの継続的存在下で増殖させた。細胞の増殖は、有意に
より強固であり、より速い分裂速度、自然分化への抵抗、および増殖中のより大
きな全体的安定性を示す。細胞は、新生物性形質転換または異常増殖パターンも
しくは形態の兆候を示さなかった。分裂促進因子とβ−エストラジオールを除去
すると、細胞は速やかに分化を開始し、ニューロンとグリアに特徴的な不均質な
形態を示した。神経分化は効率的であり、未改変の親CNS幹細胞と本質的に区別
できない分子発現パターン、ニューロン特異的タンパク質の局在化、および細胞
形態と挙動を示した。
子とβ−エストラジオールの継続的存在下で増殖させた。細胞の増殖は、有意に
より強固であり、より速い分裂速度、自然分化への抵抗、および増殖中のより大
きな全体的安定性を示す。細胞は、新生物性形質転換または異常増殖パターンも
しくは形態の兆候を示さなかった。分裂促進因子とβ−エストラジオールを除去
すると、細胞は速やかに分化を開始し、ニューロンとグリアに特徴的な不均質な
形態を示した。神経分化は効率的であり、未改変の親CNS幹細胞と本質的に区別
できない分子発現パターン、ニューロン特異的タンパク質の局在化、および細胞
形態と挙動を示した。
【００２４】 ニューロン集団は、種々の神経伝達物質表現型から構成され、ニューロン中に
チロシンヒドロキシラーゼ陽性ドーパミン作動性表現型を10〜20％含んでいた。
かかる神経分化能は、60回の細胞倍加を超えて安定であり、幹細胞由来のニュー
ロンとグリアの数が少なくとも１×1018倍増加した。すなわち、本明細書に記載
の遺伝的改変と幹細胞培養法は、発生中の哺乳動物の脳のすべての領域に由来す
る実質的に無限な数のCNS幹細胞の安定な単離を可能にし、各CNS幹細胞クローン
は、潜在的に異なるニューロンのサブタイプを無限に生み出す。その結果として
、成熟脳の多様な細胞表現型を示す異なる分子／遺伝子レパートリーを有する哺
乳動物ニューロン（ヒトを含む）のライブラリーが得られる。
チロシンヒドロキシラーゼ陽性ドーパミン作動性表現型を10〜20％含んでいた。
かかる神経分化能は、60回の細胞倍加を超えて安定であり、幹細胞由来のニュー
ロンとグリアの数が少なくとも１×1018倍増加した。すなわち、本明細書に記載
の遺伝的改変と幹細胞培養法は、発生中の哺乳動物の脳のすべての領域に由来す
る実質的に無限な数のCNS幹細胞の安定な単離を可能にし、各CNS幹細胞クローン
は、潜在的に異なるニューロンのサブタイプを無限に生み出す。その結果として
、成熟脳の多様な細胞表現型を示す異なる分子／遺伝子レパートリーを有する哺
乳動物ニューロン（ヒトを含む）のライブラリーが得られる。
【００２５】実施例 c-Myc-エストロゲン受容体発現レトロウイルスの構築 SV40プロモーター制御下にネオマイシン耐性遺伝子を含有するレトロウイルス
ベクターをEcoRIで線状化し、ヒトc-Myc cDNAとヒトエストロゲン受容体cDNAと
の融合遺伝子をコードするDNAのEcoRI断片に連結した（Eilerら、1989, Nature
340: 60-68）。融合遺伝子を、MMLV長末端反復配列（LTR）の制御下に置いた。
最終的なレトロウイルスベクターpMycERの全体的配列を、図１に示す。
ベクターをEcoRIで線状化し、ヒトc-Myc cDNAとヒトエストロゲン受容体cDNAと
の融合遺伝子をコードするDNAのEcoRI断片に連結した（Eilerら、1989, Nature
340: 60-68）。融合遺伝子を、MMLV長末端反復配列（LTR）の制御下に置いた。
最終的なレトロウイルスベクターpMycERの全体的配列を、図１に示す。
【００２６】プロデューサー細胞系の作成 MycERレトロウイルスを安定に産生する細胞系を樹立するために、両栄養性パ
ッケージング細胞系を、pMycERプラスミドでトランスフェクションした。安定な
クローンをG418（１mg/ml、Life Technology Inc.,メリーランド州）で４週間か
けて選択した。常法に従ってHela細胞に対する高力価産生について、20個のクロ
ーンをスクリーニングした。ラット線条体幹細胞の感染による測定で、105pfu/m
lのレトロウイルス力価を有する細胞系MycER.10を以後の実験のために選択した
。
ッケージング細胞系を、pMycERプラスミドでトランスフェクションした。安定な
クローンをG418（１mg/ml、Life Technology Inc.,メリーランド州）で４週間か
けて選択した。常法に従ってHela細胞に対する高力価産生について、20個のクロ
ーンをスクリーニングした。ラット線条体幹細胞の感染による測定で、105pfu/m
lのレトロウイルス力価を有する細胞系MycER.10を以後の実験のために選択した
。
【００２７】ラットとヒトのCNS幹細胞の感染 ラットとヒトのCNS幹細胞を、既に報告された方法（米国特許第5,753,506号）
に従って調製した。継代１の細胞を、100mmのプレートにつき0.5×106細胞でプ
レートし、無血清N2培地＋10ng/ml bFGF中でさらに３日間増殖させた。MycER.10
細胞を、DMEM/10％胎児牛血清中で50〜75％コンフルエンスになるまで増殖させ
、次にDMEMで３回洗浄し、レトロウイルス採取培地（IFM）中で４〜16時間イン
キュベートした。IFMは、DMEM中の標準的N2成分（25mg/Lヒト組換えインスリン
、100mg/Lヒトアポトランスフェリン、プロゲステロン、プトレッシン、亜セレ
ン酸ナトリウム）＋10ng/ml bFGFと１μg/mlのヒト血漿フィブロネクチン（hFN
）から成っていた。IFMを含有するレトロウイルスを、1400rpmと3000rpmで２回
遠心分離して清澄化した。上清を、最終濃度がそれぞれ10ng/mlと１μg/mlの新
鮮なbFGFとhFNと、１：１の比で新鮮なN2に混合させ、50〜75％コンフルエント
なCNS幹細胞培養物にアプライした。感染期間は典型的には６時間であった。ヒ
トCNS幹細胞は、２〜３日の期間で１〜３回感染させて、その遅い分裂速度を補
った。次に細胞を、Ca2+とMg2+を含まないハンクス平衡塩類溶液（HBSS）で３回
洗浄し、継代し、さらにN2＋10ng/ml bFGFで増殖した。
に従って調製した。継代１の細胞を、100mmのプレートにつき0.5×106細胞でプ
レートし、無血清N2培地＋10ng/ml bFGF中でさらに３日間増殖させた。MycER.10
細胞を、DMEM/10％胎児牛血清中で50〜75％コンフルエンスになるまで増殖させ
、次にDMEMで３回洗浄し、レトロウイルス採取培地（IFM）中で４〜16時間イン
キュベートした。IFMは、DMEM中の標準的N2成分（25mg/Lヒト組換えインスリン
、100mg/Lヒトアポトランスフェリン、プロゲステロン、プトレッシン、亜セレ
ン酸ナトリウム）＋10ng/ml bFGFと１μg/mlのヒト血漿フィブロネクチン（hFN
）から成っていた。IFMを含有するレトロウイルスを、1400rpmと3000rpmで２回
遠心分離して清澄化した。上清を、最終濃度がそれぞれ10ng/mlと１μg/mlの新
鮮なbFGFとhFNと、１：１の比で新鮮なN2に混合させ、50〜75％コンフルエント
なCNS幹細胞培養物にアプライした。感染期間は典型的には６時間であった。ヒ
トCNS幹細胞は、２〜３日の期間で１〜３回感染させて、その遅い分裂速度を補
った。次に細胞を、Ca2+とMg2+を含まないハンクス平衡塩類溶液（HBSS）で３回
洗浄し、継代し、さらにN2＋10ng/ml bFGFで増殖した。
【００２８】MycER発現CNS幹細胞の選択 MycERレトロウイルスの安定に取り込んだCNS幹細胞を、感染後１〜２日に継代
し、0.5×106細胞／100mmプレートで再度プレートし、感染の２日後から0.1〜0.
2mg/mlのG418（pH7.4）で選択した。完全な最適増殖培地（IGM）は、DMEM/F12（
1:1）、25mg/Lヒト組換えインスリン、100mg/Lヒトアポトランスフェリン、プロ
ゲステロン、プトレッシン、亜セレン酸ナトリウム、10ng/ml bFGF、0.2μM β
−エストラジオール、0.1mg/ml G418、および10ng/ml EGFまたは１％胎児牛血清
から成っていた。新鮮なbFGF（10ng/ml、最終濃度）を毎日加え、培地を２日毎
に交換した。細胞を、HBSSで3回洗浄し、トリプシン（１×）処理して、約50〜7
5％コンフルエンスで継代した。トリプシン活性は、大豆トリプシンインヒビタ
ー（１mg/ml最終濃度）を加えて停止させた。
し、0.5×106細胞／100mmプレートで再度プレートし、感染の２日後から0.1〜0.
2mg/mlのG418（pH7.4）で選択した。完全な最適増殖培地（IGM）は、DMEM/F12（
1:1）、25mg/Lヒト組換えインスリン、100mg/Lヒトアポトランスフェリン、プロ
ゲステロン、プトレッシン、亜セレン酸ナトリウム、10ng/ml bFGF、0.2μM β
−エストラジオール、0.1mg/ml G418、および10ng/ml EGFまたは１％胎児牛血清
から成っていた。新鮮なbFGF（10ng/ml、最終濃度）を毎日加え、培地を２日毎
に交換した。細胞を、HBSSで3回洗浄し、トリプシン（１×）処理して、約50〜7
5％コンフルエンスで継代した。トリプシン活性は、大豆トリプシンインヒビタ
ー（１mg/ml最終濃度）を加えて停止させた。
【００２９】クローンの単離 14日間のG418処理の最後に、細胞を継代し、100mmプレート当たり約200〜1000
細胞を再度プレートした。プレートした24時間以内に、充分単離した1種類の細
胞を、培養プレートの底に３mmの丸でマークした。時に、完全な培養培地を、細
胞の生存理率を高めるために高細胞密度の同じ細胞により調整した培地の等量と
混合した。マークしたクローンを、クローニングリングの使用とトリプシン処理
により採取した。個々のクローンを、大量培養して増殖し、凍結保存した。
細胞を再度プレートした。プレートした24時間以内に、充分単離した1種類の細
胞を、培養プレートの底に３mmの丸でマークした。時に、完全な培養培地を、細
胞の生存理率を高めるために高細胞密度の同じ細胞により調整した培地の等量と
混合した。マークしたクローンを、クローニングリングの使用とトリプシン処理
により採取した。個々のクローンを、大量培養して増殖し、凍結保存した。
【００３０】 培養条件は、高密度培養物のためのものと同じであったが、こうして作成した
ほとんどすべてのクローンは、結局グリア形態を取り、ニューロンに分化しなか
った。すなわち、血清の存在下でのMycER改変細胞は、その本来の分化能力を維
持し生存するために、比較的高細胞密度を必要とすることが明らかになった。従
って、MycER発現細胞のクローン性密度を未改変初代幹細胞で補足することによ
り、細胞密度を、0.5×106〜1.0×106細胞／100mmプレートの範囲で維持した。0
.1mg/ml G418で５〜８日間にわたっって抗生物質選択を維持することにより、フ
ィーダー細胞集団は徐々に死滅し、一方その最適増殖を維持するためにG418耐性
MycER細胞の局所的細胞密度は徐々に上昇した。抗生物質選択は、以後の増殖の
間維持され、すべての残存細胞がMycER改変細胞であることを確実にした。
ほとんどすべてのクローンは、結局グリア形態を取り、ニューロンに分化しなか
った。すなわち、血清の存在下でのMycER改変細胞は、その本来の分化能力を維
持し生存するために、比較的高細胞密度を必要とすることが明らかになった。従
って、MycER発現細胞のクローン性密度を未改変初代幹細胞で補足することによ
り、細胞密度を、0.5×106〜1.0×106細胞／100mmプレートの範囲で維持した。0
.1mg/ml G418で５〜８日間にわたっって抗生物質選択を維持することにより、フ
ィーダー細胞集団は徐々に死滅し、一方その最適増殖を維持するためにG418耐性
MycER細胞の局所的細胞密度は徐々に上昇した。抗生物質選択は、以後の増殖の
間維持され、すべての残存細胞がMycER改変細胞であることを確実にした。
【００３１】 神経幹細胞に加え、ヒトおよびラット起源の未成熟グリア細胞および成熟星状
細胞とも有効であった。繊維芽細胞も有効であったが、その急速な増殖速度とG4
18に対する強い耐性のために、管理が困難であった。ニューロンもまた有効であ
りうるが、分裂後の性質のために、G418に対してより耐性になった。ガンマ線照
射したかまたは分裂インヒビター（例えば、アラビノシドＣまたはマイトマイシ
ン）で処理した非分裂性繊維芽細胞および他の非神経細胞もまた、c-myc改変神
経細胞を維持するのに有効でありうる。
細胞とも有効であった。繊維芽細胞も有効であったが、その急速な増殖速度とG4
18に対する強い耐性のために、管理が困難であった。ニューロンもまた有効であ
りうるが、分裂後の性質のために、G418に対してより耐性になった。ガンマ線照
射したかまたは分裂インヒビター（例えば、アラビノシドＣまたはマイトマイシ
ン）で処理した非分裂性繊維芽細胞および他の非神経細胞もまた、c-myc改変神
経細胞を維持するのに有効でありうる。
【００３２】分裂が増強されたCNS幹細胞の分化と特性評価 100,000細胞/cm2またはより高細胞密度で細胞をプレートし、増殖培地をbFGF
、血清、およびβ−エストラジオールを含まないN2で置換することにより、MycE
Rを安定に発現するCNS幹細胞を分化させた。典型的には、免疫組織学的分析の６
〜30日前に、細胞を分化させた。
、血清、およびβ−エストラジオールを含まないN2で置換することにより、MycE
Rを安定に発現するCNS幹細胞を分化させた。典型的には、免疫組織学的分析の６
〜30日前に、細胞を分化させた。
【００３３】結果 １．CNS幹細胞の分裂能力を強化する追加因子の探索 唯一の分裂促進因子としてbFGFを含むN2培地中のヒトCNS幹細胞の倍加時間は
約60時間であり、これは、同一培養条件下のラットCNS幹細胞の24時間よりも著
しく遅い。これは、特定の細胞の自律性における種差、例えば、DNA複製速度ま
たは細胞周期の他の分裂期（G1またはG2）の差によるものかも知れない。我々は
、ヒトCNS幹細胞の分裂速度を加速する他の因子を調査した。
約60時間であり、これは、同一培養条件下のラットCNS幹細胞の24時間よりも著
しく遅い。これは、特定の細胞の自律性における種差、例えば、DNA複製速度ま
たは細胞周期の他の分裂期（G1またはG2）の差によるものかも知れない。我々は
、ヒトCNS幹細胞の分裂速度を加速する他の因子を調査した。
【００３４】 bFGFの分裂活性を強化する能力に関して、多くの精製組換えヒト増殖因子を試
験した。ヒトCNS幹細胞の分裂速度は、分裂標識物であるブロモデオキシウリジ
ン（BrdU）を24時間で取り込んだ細胞の割合を測定することにより評価した。bF
GFに加えて各増殖因子を、１日１回培養物に供給した。bFGF＋EGFおよびbFGF＋T
GFα（トランスフォーミング増殖因子α）の組合せだけが、ヒトCNS幹細胞のbFG
F誘導分裂速度を超えて加速した。両方の条件において、細胞の倍加時間は、bFG
F単独の1.5倍の40時間に増大した。bFGFと１％又は10％の胎児牛血清との組合せ
もまた、CNS幹細胞のbFGF誘導分裂速度としてのBrdU取り込み速度を、同様な速
度まで加速させた。
験した。ヒトCNS幹細胞の分裂速度は、分裂標識物であるブロモデオキシウリジ
ン（BrdU）を24時間で取り込んだ細胞の割合を測定することにより評価した。bF
GFに加えて各増殖因子を、１日１回培養物に供給した。bFGF＋EGFおよびbFGF＋T
GFα（トランスフォーミング増殖因子α）の組合せだけが、ヒトCNS幹細胞のbFG
F誘導分裂速度を超えて加速した。両方の条件において、細胞の倍加時間は、bFG
F単独の1.5倍の40時間に増大した。bFGFと１％又は10％の胎児牛血清との組合せ
もまた、CNS幹細胞のbFGF誘導分裂速度としてのBrdU取り込み速度を、同様な速
度まで加速させた。
【００３５】２．自然分化に対するCNS幹細胞の抵抗性 EGF、TGFα、１％ FBS、または10％ FBS＋bFGFは、ヒトCNS幹細胞の分裂速度
を増大させたが、このような条件下でさえ、CNS幹細胞は、コンフルエントに近
い細胞密度では自然分化を受けやすく、また、多回継代培養ではグリア前駆細胞
状態に陥りがちである。CNS幹細胞の分裂能力の強化およびニューロン分化能力
に対する安定性を向上させるために、我々は、MMLV長末端反復配列の下にヒトc-
mycとヒトエストロゲン受容体遺伝子との融合タンパク質を発現するレトロウイ
ルスベクターを構築した（図１）。
を増大させたが、このような条件下でさえ、CNS幹細胞は、コンフルエントに近
い細胞密度では自然分化を受けやすく、また、多回継代培養ではグリア前駆細胞
状態に陥りがちである。CNS幹細胞の分裂能力の強化およびニューロン分化能力
に対する安定性を向上させるために、我々は、MMLV長末端反復配列の下にヒトc-
mycとヒトエストロゲン受容体遺伝子との融合タンパク質を発現するレトロウイ
ルスベクターを構築した（図１）。
【００３６】 分裂している哺乳動物CNS幹細胞を、高い効率で両栄養性レトロウイルスに感
染させ、生じた細胞をG418処理に対する耐性により選択した。融合タンパク質（
MycER）におけるc-mycの転写活性は、培地中のエストロゲン受容体リガンドであ
るβ−エストラジオールの有無により制御した。さらに、長末端反復配列のプロ
モーター活性は、ニューロンへのCNS幹細胞分化中は封じられており、有効にMyc
ER転写産物を排除している。分裂促進因子の除去、β−エストラジオールの欠失
、及びLTRの転写活性の制限の組合せによって、未改変親細胞と区別がつかない
ような、CNS幹細胞の効率的な構成的分化が起こった。
染させ、生じた細胞をG418処理に対する耐性により選択した。融合タンパク質（
MycER）におけるc-mycの転写活性は、培地中のエストロゲン受容体リガンドであ
るβ−エストラジオールの有無により制御した。さらに、長末端反復配列のプロ
モーター活性は、ニューロンへのCNS幹細胞分化中は封じられており、有効にMyc
ER転写産物を排除している。分裂促進因子の除去、β−エストラジオールの欠失
、及びLTRの転写活性の制限の組合せによって、未改変親細胞と区別がつかない
ような、CNS幹細胞の効率的な構成的分化が起こった。
【００３７】 ヒト胎児脳の種々の部位および発生段階のものに由来するCNS幹細胞を、継代
１でMycER発現レトロウイルスで感染させた。感染細胞をG418耐性により選択し
て、bFGF、10ng/mlのEGFまたは１％のFBS、およびβ−エストラジオールを含むN
2B培地（フェノールレッドを含まないN2）中で増殖させた。MycER自体の発現は
、細胞の分裂速度に有意な変化を引き起こさなかった；しかしEGFおよび／また
はFBSの添加によって、分裂速度が有意に増大して、培養物の総合的な安定性が
強化された。強固に増殖した細胞は、安定な形態を多数回の連続的継代培養にわ
たって維持し、そしてコンフルエントに近い細胞密度においてさえ、自然分化を
伴わないその多分化能性を持続していた。増殖培地を、分裂促進因子とβ−エス
トラジオールを含まないN2Bで置換すると、幹細胞は急速に分化して、ニューロ
ン、星状細胞および乏突起膠細胞が生じた。
１でMycER発現レトロウイルスで感染させた。感染細胞をG418耐性により選択し
て、bFGF、10ng/mlのEGFまたは１％のFBS、およびβ−エストラジオールを含むN
2B培地（フェノールレッドを含まないN2）中で増殖させた。MycER自体の発現は
、細胞の分裂速度に有意な変化を引き起こさなかった；しかしEGFおよび／また
はFBSの添加によって、分裂速度が有意に増大して、培養物の総合的な安定性が
強化された。強固に増殖した細胞は、安定な形態を多数回の連続的継代培養にわ
たって維持し、そしてコンフルエントに近い細胞密度においてさえ、自然分化を
伴わないその多分化能性を持続していた。増殖培地を、分裂促進因子とβ−エス
トラジオールを含まないN2Bで置換すると、幹細胞は急速に分化して、ニューロ
ン、星状細胞および乏突起膠細胞が生じた。
【００３８】３．分裂強化CNS幹細胞系の増殖能力 MycER改変ヒトCNS幹細胞系の分裂および分化能力の程度を確かめるために、細
胞を連続80日間増殖させ、感染から12回の継代培養により増殖させた。この間そ
の時点の細胞数の計算上の増大分を定量し、各継代時の細胞収量を測定して分裂
速度の経時的安定性を測定した（図２）。全体的に、細胞は約54回の倍加を重ね
て細胞数が1015倍増大した。細胞の倍加時間は、１分裂あたり約40時間と顕著に
一定であり、親の初代ヒトCNS幹細胞の時間と同じである（図２）。
胞を連続80日間増殖させ、感染から12回の継代培養により増殖させた。この間そ
の時点の細胞数の計算上の増大分を定量し、各継代時の細胞収量を測定して分裂
速度の経時的安定性を測定した（図２）。全体的に、細胞は約54回の倍加を重ね
て細胞数が1015倍増大した。細胞の倍加時間は、１分裂あたり約40時間と顕著に
一定であり、親の初代ヒトCNS幹細胞の時間と同じである（図２）。
【００３９】 また、同じヒトCNS幹細胞調製物を、MycERレトロウイルスに感染させ、bFGF単
独、またはbFGFとEGF中で増殖させた。分裂促進因子としてbFGF単独では、MycER
発現CNS幹細胞は、未改変細胞よりも強化された分裂能力を示したが、bFGF＋１
％FBSよりもはるかに小さい増殖能力であった。未改変親細胞と同様に、MycER細
胞もまた、bFGF単独で60時間の倍加時間を保持した。一方、bFGF＋EGFでは、Myc
ER発現幹細胞は、分裂速度の増大、分裂能力の増大、ニューロン分化能力の安定
性の増大を示し、そしてbFGF＋１％FBS条件と全く同様に自然分化に対して抵抗
性であった。MycER発現がないとき、同じ３つの条件によって、増殖の同様なパ
ターンが得られたが、安定性は低かった。重要なことに、bFGF＋１％FBS条件は
、より効率的な細胞増殖を引き起こすが、必ずニューロン分化能力の消失をもた
らした。これは、これらの細胞における構成的c-myc機能は非常に小さいことを
証明している：これは、より安定な多分化能と分裂能力の強化を提供するが、明
白な分裂促進因子非依存性や形質転換は提供しない。
独、またはbFGFとEGF中で増殖させた。分裂促進因子としてbFGF単独では、MycER
発現CNS幹細胞は、未改変細胞よりも強化された分裂能力を示したが、bFGF＋１
％FBSよりもはるかに小さい増殖能力であった。未改変親細胞と同様に、MycER細
胞もまた、bFGF単独で60時間の倍加時間を保持した。一方、bFGF＋EGFでは、Myc
ER発現幹細胞は、分裂速度の増大、分裂能力の増大、ニューロン分化能力の安定
性の増大を示し、そしてbFGF＋１％FBS条件と全く同様に自然分化に対して抵抗
性であった。MycER発現がないとき、同じ３つの条件によって、増殖の同様なパ
ターンが得られたが、安定性は低かった。重要なことに、bFGF＋１％FBS条件は
、より効率的な細胞増殖を引き起こすが、必ずニューロン分化能力の消失をもた
らした。これは、これらの細胞における構成的c-myc機能は非常に小さいことを
証明している：これは、より安定な多分化能と分裂能力の強化を提供するが、明
白な分裂促進因子非依存性や形質転換は提供しない。
【００４０】 構成的に活性なc-mycのこれらの効果もまた、ラットおよびヒト胎児脳の全て
の部位に由来するCNS幹細胞にも拡張できるであろう。
の部位に由来するCNS幹細胞にも拡張できるであろう。
【００４１】４．MycER強化CNS幹細胞のニューロン分化 MycER強化CNS幹細胞を、外来因子の添加なしに、分裂促進因子とβ−エストラ
ジオールを培地から除去することにより分化させた。ニューロンおよびグリア細
胞の形態の分岐は、２日以内に起こり始めた。第３日目には、ニューロンの形態
は明らかに識別可能であった。ニューロンは、そこから３〜５週間かけて完全に
機能性のニューロンへ成熟し続けた。
ジオールを培地から除去することにより分化させた。ニューロンおよびグリア細
胞の形態の分岐は、２日以内に起こり始めた。第３日目には、ニューロンの形態
は明らかに識別可能であった。ニューロンは、そこから３〜５週間かけて完全に
機能性のニューロンへ成熟し続けた。
【００４２】 異なる継代数でのMycER強化ヒトCNS幹細胞からの分化培養物を、種々の異なる
細胞型特異的抗体を用いる免疫組織化学により分析した。分化の10日目に、全細
胞の約50％が、MAP2c、タウ、およびチューブリンIIIbタンパク質（全て、比較
的初期のニューロン分化のマーカー）を発現した。全細胞の約20〜30％は、ニュ
ーロンの成熟マーカーであるMAP2aおよびMAP2bタンパク質を発現した。種々の神
経フィラメント抗体が、ニューロンの同様の比を示した。ニューロンの中で、約
70％がGABA陽性であった。また同様の比率のニューロンがカルレチニン（calret
inin）陽性であった。ニューロンの約10〜20％が、ドーパミンの重要な生合成酵
素であるチロシンヒドロキシラーゼ（TH）を発現した。すべての免疫陽性ニュー
ロンは典型的なニューロンの形態を示し、グリア細胞マーカーGFAPを同時発現し
なかった。すなわち、MycER強化細胞系は、種々の神経伝達物質表現型を示すニ
ューロンを高率に発生させるように分化する。
細胞型特異的抗体を用いる免疫組織化学により分析した。分化の10日目に、全細
胞の約50％が、MAP2c、タウ、およびチューブリンIIIbタンパク質（全て、比較
的初期のニューロン分化のマーカー）を発現した。全細胞の約20〜30％は、ニュ
ーロンの成熟マーカーであるMAP2aおよびMAP2bタンパク質を発現した。種々の神
経フィラメント抗体が、ニューロンの同様の比を示した。ニューロンの中で、約
70％がGABA陽性であった。また同様の比率のニューロンがカルレチニン（calret
inin）陽性であった。ニューロンの約10〜20％が、ドーパミンの重要な生合成酵
素であるチロシンヒドロキシラーゼ（TH）を発現した。すべての免疫陽性ニュー
ロンは典型的なニューロンの形態を示し、グリア細胞マーカーGFAPを同時発現し
なかった。すなわち、MycER強化細胞系は、種々の神経伝達物質表現型を示すニ
ューロンを高率に発生させるように分化する。
【００４３】 ニューロンの割合と神経伝達物質表現型は、多数回の継代を通じて安定であっ
た（図3A〜L）。54回の幹細胞倍加の初めから終わりまで、ニューロンの割合と
種々の生成する神経伝達物質表現型の両方において、ニューロン分化能力の低下
はなかった。
た（図3A〜L）。54回の幹細胞倍加の初めから終わりまで、ニューロンの割合と
種々の生成する神経伝達物質表現型の両方において、ニューロン分化能力の低下
はなかった。
【００４４】５．領域特異的幹細胞系 神経幹細胞の単離に使用される無血清培養条件は、多数回の細胞分裂を通じて
、領域同一性およびその関連神経伝達物質表現型の安定な遺伝を可能とした。こ
のことは、ニューロンとグリア細胞に分化するその能力において同じではあって
も、培養中の幹細胞が極めて多様であることを意味する。すなわち、培養開始時
の各幹細胞を、その未変性状態で不死化することができ、かつこの方法が、単一
の培養皿において何千もの幹細胞をサンプリングするのに好適であれば、多様な
ニューロン表現型は、細胞系の形で永久に「捕捉」することができるであろう。
、領域同一性およびその関連神経伝達物質表現型の安定な遺伝を可能とした。こ
のことは、ニューロンとグリア細胞に分化するその能力において同じではあって
も、培養中の幹細胞が極めて多様であることを意味する。すなわち、培養開始時
の各幹細胞を、その未変性状態で不死化することができ、かつこの方法が、単一
の培養皿において何千もの幹細胞をサンプリングするのに好適であれば、多様な
ニューロン表現型は、細胞系の形で永久に「捕捉」することができるであろう。
【００４５】 c-mycによる神経幹細胞の遺伝子改変によって、強固で非常に再現性が高くか
つ安定な細胞培養系が得られた。改変プロセス自体は、非常に効率的であり、２
日間にわたって１回のレトロウイルス感染あたり5,000〜50,000個の独立クロー
ンが得られる。これは、必要であれば、レトロウイルス粒子を増大させるか、ま
たは標的細胞密度の数を増大させることにより、容易にスケールアップできるで
あろう。
つ安定な細胞培養系が得られた。改変プロセス自体は、非常に効率的であり、２
日間にわたって１回のレトロウイルス感染あたり5,000〜50,000個の独立クロー
ンが得られる。これは、必要であれば、レトロウイルス粒子を増大させるか、ま
たは標的細胞密度の数を増大させることにより、容易にスケールアップできるで
あろう。
【００４６】 c-mycの過剰発現が、神経伝達物質表現型の分化能力に影響するかどうかを確
かめるために、ラットおよびヒトの胎児脳の多くの異なる領域からの幹細胞を、
MycERレトロウイルスにより改変した。これらの領域は、皮質、中隔、海馬、中
脳、菱脳 、線条、および脊髄を含んでいた。本方法の再現性を評価するために
、いくつかの異なる在胎齢からの皮質、中脳、および脊髄培養物の多数の例を検
査した。全てのケースで、得られる独立したクローンのプールは、非常に再現性
の高いニューロン対グリア細胞の比を示した。予想されるように、ニューロンの
形態、抗原性プロフィール、およびその相対比もまた、領域毎に細胞系で明確に
識別できた。
かめるために、ラットおよびヒトの胎児脳の多くの異なる領域からの幹細胞を、
MycERレトロウイルスにより改変した。これらの領域は、皮質、中隔、海馬、中
脳、菱脳 、線条、および脊髄を含んでいた。本方法の再現性を評価するために
、いくつかの異なる在胎齢からの皮質、中脳、および脊髄培養物の多数の例を検
査した。全てのケースで、得られる独立したクローンのプールは、非常に再現性
の高いニューロン対グリア細胞の比を示した。予想されるように、ニューロンの
形態、抗原性プロフィール、およびその相対比もまた、領域毎に細胞系で明確に
識別できた。
【００４７】 すなわち、８週齢のヒト胎児の中脳組織由来のいくつかの細胞系のプールを検
査すると、全細胞の約0.1％が一貫してTH陽性ドーパミン作動性ニューロンであ
ったが、これはまた未改変幹細胞培養物において見い出される比である。クロー
ン分析によって、TH発現はクローン的に制限されていることが明らかになった。
すなわち、大多数のクローンは、THを発現するニューロンを含まなかった。これ
らを含有したものでは、その比はクローンごとに様々であった。17〜20週齢のヒ
ト胎児の皮質組織由来の細胞系のいくつかのプールも検査した。興味深いことに
全ての皮質細胞は、未改変幹細胞に比較して著しく増大したTH陽性ニューロンを
発生させた。TH陽性ニューロンの比は、全細胞の２〜４％であった。次にクロー
ン分析によって、TH陽性ニューロンの分布における類似したパターンが明らかに
なった。大多数はなにも含んでいなかったが、THを生成するものは、種々の比で
存在していた。このパターンはまた、いくつかの異なる領域由来の未改変幹細胞
のクローン、およびいくつかの異なる抗原マーカーで観察されていた。
査すると、全細胞の約0.1％が一貫してTH陽性ドーパミン作動性ニューロンであ
ったが、これはまた未改変幹細胞培養物において見い出される比である。クロー
ン分析によって、TH発現はクローン的に制限されていることが明らかになった。
すなわち、大多数のクローンは、THを発現するニューロンを含まなかった。これ
らを含有したものでは、その比はクローンごとに様々であった。17〜20週齢のヒ
ト胎児の皮質組織由来の細胞系のいくつかのプールも検査した。興味深いことに
全ての皮質細胞は、未改変幹細胞に比較して著しく増大したTH陽性ニューロンを
発生させた。TH陽性ニューロンの比は、全細胞の２〜４％であった。次にクロー
ン分析によって、TH陽性ニューロンの分布における類似したパターンが明らかに
なった。大多数はなにも含んでいなかったが、THを生成するものは、種々の比で
存在していた。このパターンはまた、いくつかの異なる領域由来の未改変幹細胞
のクローン、およびいくつかの異なる抗原マーカーで観察されていた。
【００４８】 ６〜10週齢のヒト胎児の脊髄由来の細胞系も樹立した。ニューロン分化のパタ
ーンは、他の領域由来のものと同じであったが、これらの幹細胞形態および増殖
特性は特異的であった。
ーンは、他の領域由来のものと同じであったが、これらの幹細胞形態および増殖
特性は特異的であった。
【００４９】 このように、c-mycによる神経幹細胞の遺伝子改変は、本来備わっている分化
能力を変化させない。全ての細胞系において長期連続培養期間を通して、腫瘍形
成または他の異常形質転換の証拠は得られなかった。継代14の１つのプールのヒ
ト皮質細胞系の核型分析により、異常型再配列を伴わない正常倍数染色体パター
ンが観察された。すなわち、通常すべての真核生物細胞に存在する細胞遺伝子で
あり、かつ細胞周期機構の周知の重要なレギュレーターであるc-mycによる分裂
能力の制御は発ガン性ではなく、かつv-mycやSV40ラージＴ抗原のようなウイル
ス癌遺伝子を使用する他の方法よりも著しく有利である。
能力を変化させない。全ての細胞系において長期連続培養期間を通して、腫瘍形
成または他の異常形質転換の証拠は得られなかった。継代14の１つのプールのヒ
ト皮質細胞系の核型分析により、異常型再配列を伴わない正常倍数染色体パター
ンが観察された。すなわち、通常すべての真核生物細胞に存在する細胞遺伝子で
あり、かつ細胞周期機構の周知の重要なレギュレーターであるc-mycによる分裂
能力の制御は発ガン性ではなく、かつv-mycやSV40ラージＴ抗原のようなウイル
ス癌遺伝子を使用する他の方法よりも著しく有利である。
【００５０】６．他の細胞型 c-mycによる遺伝子改変は、培養期間のいつでも行うことができる。c-myc自体
の発現は分裂促進性ではなく非形質転換性であるため、特定の神経前駆細胞集団
の増殖を促進する培養条件が必要である。aFGF（酸性繊維芽細胞増殖因子）、bF
GF、EFGおよびTGFαのような精製した増殖因子は、種々の異なる神経細胞型を増
殖させることができる。上記の説明の多くは、１つの優勢な細胞集団としての多
分化能CNS幹細胞に関するものであったが、クローン分析中にいくつかの異なる
細胞型が観察された。
の発現は分裂促進性ではなく非形質転換性であるため、特定の神経前駆細胞集団
の増殖を促進する培養条件が必要である。aFGF（酸性繊維芽細胞増殖因子）、bF
GF、EFGおよびTGFαのような精製した増殖因子は、種々の異なる神経細胞型を増
殖させることができる。上記の説明の多くは、１つの優勢な細胞集団としての多
分化能CNS幹細胞に関するものであったが、クローン分析中にいくつかの異なる
細胞型が観察された。
【００５１】 １つの重要な細胞集団は、分化すると、乏突起膠細胞が明らかに存在せずに、
ニューロンと星状細胞が発生する二分化能前駆細胞であった。これらの二分化能
前駆細胞は、増殖中の形態が多分化能幹細胞とほとんど同様であった。分化パタ
ーンも同様であって、約50％のニューロンと50％の星状細胞が発生した。すなわ
ち、２つの細胞集団の間の重要な確定的な差は、分化培養物に乏突起膠細胞が存
在しないことである。
ニューロンと星状細胞が発生する二分化能前駆細胞であった。これらの二分化能
前駆細胞は、増殖中の形態が多分化能幹細胞とほとんど同様であった。分化パタ
ーンも同様であって、約50％のニューロンと50％の星状細胞が発生した。すなわ
ち、２つの細胞集団の間の重要な確定的な差は、分化培養物に乏突起膠細胞が存
在しないことである。
【００５２】 初代神経培養物のc-myc改変に由来して発生する第２の細胞集団は、ニューロ
ンのみからなる単分化能ニューロン前駆細胞クローンであった。これらのニュー
ロン前駆細胞クローンは、クローンサイズが小さく、増殖中に識別し得る未成熟
なニューロンの形態をとっており、そしてタウタンパク質および／またはベータ
−チューブリンIIIを発現した。例を図５に示す。２つの識別し得る細胞型が観
察された（図5A）。１つの型は、細胞体から分岐した非常に短い単一の突起を有
する小型の細胞であり、これらは密な集団になった。分裂中、これらの細胞は、
抗タウ抗体と免疫反応性であったが、抗チューブリンIIIb抗体とは反応しなかっ
た（図5b）。他の型の細胞は、拡張的な分岐なしに識別し得るように延長した神
経突起を有する細胞であり、より小さくばらつきあるパターンを示し、高い遊走
能力を示唆した。第１の型とは対照的に、これらはまた抗タウ抗体と抗チューブ
リンIIIb抗体の両方と免疫反応性であった（それぞれ図5Cおよび5D）。しばしば
第２の細胞型は、第１の細胞型の近くにまたはこれと混合して見い出されたが、
このことは、これらがニューロン前駆細胞になることが約束された、単一の連続
的系統の２つの段階であることを示唆している（タウ＋／TuJ1＋状態がより成熟
した状態）。
ンのみからなる単分化能ニューロン前駆細胞クローンであった。これらのニュー
ロン前駆細胞クローンは、クローンサイズが小さく、増殖中に識別し得る未成熟
なニューロンの形態をとっており、そしてタウタンパク質および／またはベータ
−チューブリンIIIを発現した。例を図５に示す。２つの識別し得る細胞型が観
察された（図5A）。１つの型は、細胞体から分岐した非常に短い単一の突起を有
する小型の細胞であり、これらは密な集団になった。分裂中、これらの細胞は、
抗タウ抗体と免疫反応性であったが、抗チューブリンIIIb抗体とは反応しなかっ
た（図5b）。他の型の細胞は、拡張的な分岐なしに識別し得るように延長した神
経突起を有する細胞であり、より小さくばらつきあるパターンを示し、高い遊走
能力を示唆した。第１の型とは対照的に、これらはまた抗タウ抗体と抗チューブ
リンIIIb抗体の両方と免疫反応性であった（それぞれ図5Cおよび5D）。しばしば
第２の細胞型は、第１の細胞型の近くにまたはこれと混合して見い出されたが、
このことは、これらがニューロン前駆細胞になることが約束された、単一の連続
的系統の２つの段階であることを示唆している（タウ＋／TuJ1＋状態がより成熟
した状態）。
【００５３】 c-myc改変神経細胞培養物から発生する第３の細胞集団は、グリア細胞のみか
らなるクローンの集団であった。これらのクローンの多くは、ほとんどまたは全
く乏突起膠細胞を含まない星状細胞であった。
らなるクローンの集団であった。これらのクローンの多くは、ほとんどまたは全
く乏突起膠細胞を含まない星状細胞であった。
【００５４】 これらの結果は、多くの神経前駆細胞系統が、c-mycの過剰発現に対して同様
に応答することを示している。哺乳動物の神経系組織から調製した初代神経培養
物に加えて、胚性幹細胞培養物における最近の進歩は、種々の神経前駆細胞が、
in vitroで分化全能または分化多能胚性幹細胞および長期培養で維持される細胞
系の分化の間に生じることを示している（Renoncourtら, Mech. Dev. (1998) 78
, 185；Svendsenら, Trends Neurosci. (1999) 22, 357；Brustleら, Science (
1999) 285, 754）。これらの培養物は、ネスティング陽性神経前駆細胞を生じさ
せることができ、次にこれらを無血清培地に移し、次いでbFGFおよび／またはEG
Fと共に短期間増殖させることができる。初期の神経前駆細胞の形成が効率的で
ないため、長期の大量増殖は未だ実現可能になっていない。しかし本明細書に記
載されるc-myc遺伝子による遺伝子改変法を利用することにより、これらの一時
的な神経前駆細胞を、安定な細胞系に変えることができる。
に応答することを示している。哺乳動物の神経系組織から調製した初代神経培養
物に加えて、胚性幹細胞培養物における最近の進歩は、種々の神経前駆細胞が、
in vitroで分化全能または分化多能胚性幹細胞および長期培養で維持される細胞
系の分化の間に生じることを示している（Renoncourtら, Mech. Dev. (1998) 78
, 185；Svendsenら, Trends Neurosci. (1999) 22, 357；Brustleら, Science (
1999) 285, 754）。これらの培養物は、ネスティング陽性神経前駆細胞を生じさ
せることができ、次にこれらを無血清培地に移し、次いでbFGFおよび／またはEG
Fと共に短期間増殖させることができる。初期の神経前駆細胞の形成が効率的で
ないため、長期の大量増殖は未だ実現可能になっていない。しかし本明細書に記
載されるc-myc遺伝子による遺伝子改変法を利用することにより、これらの一時
的な神経前駆細胞を、安定な細胞系に変えることができる。
【００５５】 多分化能神経幹細胞を含む神経前駆細胞は、成体の脳から単離することができ
、かつ無血清条件で培養することができる。しかしこの方法は、効率的でなく少
数の増殖性細胞しか得られない。しかし本明細書に記載されるようなc-myc遺伝
子の移送により、神経組織生検試料から得られるこのような少数の細胞から安定
な細胞系を樹立することができる。
、かつ無血清条件で培養することができる。しかしこの方法は、効率的でなく少
数の増殖性細胞しか得られない。しかし本明細書に記載されるようなc-myc遺伝
子の移送により、神経組織生検試料から得られるこのような少数の細胞から安定
な細胞系を樹立することができる。
【００５６】 c-mycは、細胞周期制御の他に、アポトーシスのような多くの異なる細胞内プ
ロセスに関与している。c-mycは従来は、非神経由来細胞を形質転換するために
使用されてきた。しかし、これらの以前の研究は、3T3繊維芽細胞系のような既
に安定な細胞系を用いて、そして、分裂促進因子非依存性を与える自然の染色体
異常に基づき選択されていた細胞系の腫瘍状態を発生させるために行われた。他
の研究は、分裂後ニューロンを再び細胞周期に入れるための不死化プロセスを利
用しようとした。
ロセスに関与している。c-mycは従来は、非神経由来細胞を形質転換するために
使用されてきた。しかし、これらの以前の研究は、3T3繊維芽細胞系のような既
に安定な細胞系を用いて、そして、分裂促進因子非依存性を与える自然の染色体
異常に基づき選択されていた細胞系の腫瘍状態を発生させるために行われた。他
の研究は、分裂後ニューロンを再び細胞周期に入れるための不死化プロセスを利
用しようとした。
【００５７】 CNS幹細胞は既に分裂性であり、そして30回の細胞倍加までの長期増殖のため
の分裂促進性培養条件が既に確立している。すなわち我々の目的は、30回の細胞
倍加を十分に超えて、少なくとも、60〜80回の細胞周期の間で起こると考えられ
ている老化の開始時まで増殖能力を増大させることである。60回の細胞倍加とは
、細胞数の１×1018倍の増大に相当するが、これはそれぞれが500,000種の化合
物からなる100万個の化学物質ライブラリーをスクリーニングするのに十分な、
または500億人のパーキンソン病患者に細胞治療を提供するのに十分な大きさで
ある。重要な概念は、初代CNS幹細胞について確立された培養条件下で増殖能力
を強化しながら、その本来備わっているニューロン分化能力を破壊しない、細胞
の「穏やかな」改変法を見い出すことである。
の分裂促進性培養条件が既に確立している。すなわち我々の目的は、30回の細胞
倍加を十分に超えて、少なくとも、60〜80回の細胞周期の間で起こると考えられ
ている老化の開始時まで増殖能力を増大させることである。60回の細胞倍加とは
、細胞数の１×1018倍の増大に相当するが、これはそれぞれが500,000種の化合
物からなる100万個の化学物質ライブラリーをスクリーニングするのに十分な、
または500億人のパーキンソン病患者に細胞治療を提供するのに十分な大きさで
ある。重要な概念は、初代CNS幹細胞について確立された培養条件下で増殖能力
を強化しながら、その本来備わっているニューロン分化能力を破壊しない、細胞
の「穏やかな」改変法を見い出すことである。
【００５８】 活性c-mycタンパク質の濃度を増大させることにより、安定なヒトCNS幹細胞系
の生成へとつながる。この効果は、細胞周期の分裂性パラメーターおよび分化パ
ラメーターを明白に脱制御することによってではなく、グリア前駆細胞状態への
多分化能性の制限を誘導するオートクリンおよびパラクリン因子に対する抵抗性
を提供することによって生じる。この結果は、細胞の発ガン性形質転換ではなく
、むしろ細胞増殖の安定化である。すなわち、コンフルエントな細胞密度で存在
するもののような、分化を引き起こす内因性シグナルは、なお有効である。細胞
分裂はさらに、bFGFおよび／またはEGFおよび／または血清のような適正な外因
性の分裂促進因子の供給に依存している。成熟機能性ニューロンへの幹細胞系の
分化は、60回の細胞倍加の最後でも未改変初代細胞と同様の効率である。種々の
神経伝達物質表現型およびそれらの相対比は、増殖の間を通して維持される。
の生成へとつながる。この効果は、細胞周期の分裂性パラメーターおよび分化パ
ラメーターを明白に脱制御することによってではなく、グリア前駆細胞状態への
多分化能性の制限を誘導するオートクリンおよびパラクリン因子に対する抵抗性
を提供することによって生じる。この結果は、細胞の発ガン性形質転換ではなく
、むしろ細胞増殖の安定化である。すなわち、コンフルエントな細胞密度で存在
するもののような、分化を引き起こす内因性シグナルは、なお有効である。細胞
分裂はさらに、bFGFおよび／またはEGFおよび／または血清のような適正な外因
性の分裂促進因子の供給に依存している。成熟機能性ニューロンへの幹細胞系の
分化は、60回の細胞倍加の最後でも未改変初代細胞と同様の効率である。種々の
神経伝達物質表現型およびそれらの相対比は、増殖の間を通して維持される。
【００５９】 これらの例の中のc-myc活性は、エストロゲン受容体タンパク質の断片に融合
したc-mycのキメラタンパク質を構築することにより制御された（Eilerら, Natu
re (1988) 340, 60）。エストロゲンの意図される役割は、細胞で誘導される機
能的に活性なc-mycの量を制御することである。キメラタンパク質のエストロゲ
ン受容体部分は、β−エストラジオールまたはタモキシフェンのような細胞透過
性アゴニストまたはアンタゴニストと結合すると、活性化される。
したc-mycのキメラタンパク質を構築することにより制御された（Eilerら, Natu
re (1988) 340, 60）。エストロゲンの意図される役割は、細胞で誘導される機
能的に活性なc-mycの量を制御することである。キメラタンパク質のエストロゲ
ン受容体部分は、β−エストラジオールまたはタモキシフェンのような細胞透過
性アゴニストまたはアンタゴニストと結合すると、活性化される。
【００６０】 核受容体スーパーファミリーの多くのメンバーは同様に作用し、細胞透過性リ
ガンドがプラズマ二重層を通って拡散してその受容体に結合し、次に複合体とし
て核まで輸送され、種々の転写関連イベントを誘導する。これらの核受容体タン
パク質のリガンド結合ドメインとそのリガンドは、融合c-mycタンパク質残基の
機能を制御するために、エストロゲン受容体とβ−エストラジオールを置換する
ことができる。このような核受容体の例は、グルココルチコイド受容体、プロゲ
ステロン受容体、アンドロゲン受容体、ビタミンＤ受容体、甲状腺ホルモン受容
体、レチノイン酸受容体、およびエクジソン受容体である。これらの受容体はそ
れぞれ、培地にその適切なリガンドを添加することにより、細胞内で活性化する
ことができる。かかるリガンドの例は、グルココルチコイドまたはデキサメタゾ
ンのようなステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、レチノイン酸のようなレチノ
イド、ビタミンＤ、および昆虫脱皮ホルモン、エクジソン、さらにはそれぞれの
受容体において作用するように設計されたこれらの合成類似体である。これら全
ての化合物は、一旦細胞の外から供給されると、細胞膜を通り抜けることのでき
る疎水性低分子である。
ガンドがプラズマ二重層を通って拡散してその受容体に結合し、次に複合体とし
て核まで輸送され、種々の転写関連イベントを誘導する。これらの核受容体タン
パク質のリガンド結合ドメインとそのリガンドは、融合c-mycタンパク質残基の
機能を制御するために、エストロゲン受容体とβ−エストラジオールを置換する
ことができる。このような核受容体の例は、グルココルチコイド受容体、プロゲ
ステロン受容体、アンドロゲン受容体、ビタミンＤ受容体、甲状腺ホルモン受容
体、レチノイン酸受容体、およびエクジソン受容体である。これらの受容体はそ
れぞれ、培地にその適切なリガンドを添加することにより、細胞内で活性化する
ことができる。かかるリガンドの例は、グルココルチコイドまたはデキサメタゾ
ンのようなステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、レチノイン酸のようなレチノ
イド、ビタミンＤ、および昆虫脱皮ホルモン、エクジソン、さらにはそれぞれの
受容体において作用するように設計されたこれらの合成類似体である。これら全
ての化合物は、一旦細胞の外から供給されると、細胞膜を通り抜けることのでき
る疎水性低分子である。
【００６１】 いくつかの受容体−リガンド系は、過剰発現c-mycを制御するという目的には
、他のものよりも適している。例えば、疾患の治療としてc-myc改変細胞を組織
中に移植するという目的には、c-myc受容体キメラタンパク質が内因性の生理的
リガンドに応答しないことが望ましいであろう。本明細書に記載されるc-myc−
エストロゲン受容体は、女性患者に存在する潜在的に高レベルのエストロゲンが
、予期しない作用を細胞に及ぼしうるという欠点がある。別の例では、培養物中
のc-myc活性を調節するために使用されるリガンドは、内因性受容体に対するそ
れ自身の関連のない作用を持つかもしれない。このように、理想的な受容体−リ
ガンド系は、融合タンパク質の受容体部分は内因性リガンドを認識せず、かつリ
ガンドが細胞に有害な作用を及ぼさない合成化合物である。このような１つの可
能な系は、ヒトプロゲステロン受容体とそのアンタゴニストリガンドであるRU38
486である。ヒトプロゲステロン受容体のリガンド結合断片は、内因性リガンド
であるプロゲステロンには応答しないが、プロゲステロンの合成類似体であるRU
38486により高感度に活性化され、一方RU38486は、内因性の全長プロゲステロン
受容体を活性化しないことが確立されている（Wangら, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1994) 91, 8180）。
、他のものよりも適している。例えば、疾患の治療としてc-myc改変細胞を組織
中に移植するという目的には、c-myc受容体キメラタンパク質が内因性の生理的
リガンドに応答しないことが望ましいであろう。本明細書に記載されるc-myc−
エストロゲン受容体は、女性患者に存在する潜在的に高レベルのエストロゲンが
、予期しない作用を細胞に及ぼしうるという欠点がある。別の例では、培養物中
のc-myc活性を調節するために使用されるリガンドは、内因性受容体に対するそ
れ自身の関連のない作用を持つかもしれない。このように、理想的な受容体−リ
ガンド系は、融合タンパク質の受容体部分は内因性リガンドを認識せず、かつリ
ガンドが細胞に有害な作用を及ぼさない合成化合物である。このような１つの可
能な系は、ヒトプロゲステロン受容体とそのアンタゴニストリガンドであるRU38
486である。ヒトプロゲステロン受容体のリガンド結合断片は、内因性リガンド
であるプロゲステロンには応答しないが、プロゲステロンの合成類似体であるRU
38486により高感度に活性化され、一方RU38486は、内因性の全長プロゲステロン
受容体を活性化しないことが確立されている（Wangら, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1994) 91, 8180）。
【００６２】 すなわち、安定な細胞系を生成させるための１つの強化c-myc発現系とは、ヒ
トc-myc遺伝子が、12個のアミノ酸がＣ末端で欠失してヒトプロゲステロン受容
体のリガンド結合ドメインに融合しているプラスミドを構築し、融合DNA（c-myc
PR）を切り出し、5'LTRの下流でレトロウイルスプラスミドpLXSNに連結し、そし
てキメラタンパク質であるc-myc−プロゲステロン受容体（MycPR）を発現する無
傷のレトロウイルスを作製するというものであろう。
トc-myc遺伝子が、12個のアミノ酸がＣ末端で欠失してヒトプロゲステロン受容
体のリガンド結合ドメインに融合しているプラスミドを構築し、融合DNA（c-myc
PR）を切り出し、5'LTRの下流でレトロウイルスプラスミドpLXSNに連結し、そし
てキメラタンパク質であるc-myc−プロゲステロン受容体（MycPR）を発現する無
傷のレトロウイルスを作製するというものであろう。
【００６３】 分裂強化CNS幹細胞の商業的有用性は、以下の通りである：パーキンソン病を
治療するためのTH陽性ドーパミン作動性ニューロンの細胞移植；可能性ある薬理
学的化合物をスクリーニングするための基質；特異的薬剤によりまたは疾患過程
を表す／模倣するように設計されたプロトコールにより影響される、細胞の遺伝
子とタンパク質レベルの再現性ある供給源；新規な遺伝子およびタンパク質の再
現性ある供給源；３次元の組織および神経プロテーゼの操作のためのニューロン
とグリア細胞の再現性ある供給源；アルツハイマー病を治療するためのNGFのよ
うな、可能性ある治療用高分子化合物の送達ビヒクル；および、増殖性TH発現ニ
ューロン細胞のような、種々のニューロン前駆細胞集団になることが約束された
種々の細胞を、in vitroでさらに誘導するための出発細胞集団。
治療するためのTH陽性ドーパミン作動性ニューロンの細胞移植；可能性ある薬理
学的化合物をスクリーニングするための基質；特異的薬剤によりまたは疾患過程
を表す／模倣するように設計されたプロトコールにより影響される、細胞の遺伝
子とタンパク質レベルの再現性ある供給源；新規な遺伝子およびタンパク質の再
現性ある供給源；３次元の組織および神経プロテーゼの操作のためのニューロン
とグリア細胞の再現性ある供給源；アルツハイマー病を治療するためのNGFのよ
うな、可能性ある治療用高分子化合物の送達ビヒクル；および、増殖性TH発現ニ
ューロン細胞のような、種々のニューロン前駆細胞集団になることが約束された
種々の細胞を、in vitroでさらに誘導するための出発細胞集団。
【００６４】 本発明は、現在最も実際的で好ましい実施形態と考えられるものに関して記述
したが、本発明は開示された実施形態に限定されるのではなく、添付される請求
の範囲の精神と範囲の中に含まれる種々の改変および同等な組合せをカバーする
ことが意図されると理解されたい。すなわち、本発明では、請求の範囲に定義さ
れる本発明の新規な側面から逸脱することなく、変法を実施できると理解された
い。本明細書に引用される全ての特許や論文は、参照することによりその全体を
本明細書の一部とする。
したが、本発明は開示された実施形態に限定されるのではなく、添付される請求
の範囲の精神と範囲の中に含まれる種々の改変および同等な組合せをカバーする
ことが意図されると理解されたい。すなわち、本発明では、請求の範囲に定義さ
れる本発明の新規な側面から逸脱することなく、変法を実施できると理解された
い。本明細書に引用される全ての特許や論文は、参照することによりその全体を
本明細書の一部とする。
【図１】 レトロウイルスプラスミドpMycERの配列。ヒトエストロゲン受容体遺伝子（Ei
lerら、1989, Nature 340: 60-68）のリガンド結合ドメインに融合したヒトc-my
c遺伝子を含有する線状化EcoRI断片を、pLXSNレトロウイルス発現プラスミド（C
lontech）の5'LTRの下流に連結した。最終構築体はまた、SV40プロモーター（PS V40 ）の下に選択マーカー、ネオマイシン耐性遺伝子（Neor）を含有する。
lerら、1989, Nature 340: 60-68）のリガンド結合ドメインに融合したヒトc-my
c遺伝子を含有する線状化EcoRI断片を、pLXSNレトロウイルス発現プラスミド（C
lontech）の5'LTRの下流に連結した。最終構築体はまた、SV40プロモーター（PS V40 ）の下に選択マーカー、ネオマイシン耐性遺伝子（Neor）を含有する。
【図２】 MycER改変ヒトCNS幹細胞の増殖能。増殖速度と増殖能を測定するために、18週
令のヒト胎児皮質組織から得られたMycER改変ヒトCNS幹細胞系のプール（HK18.2
）を、約80日間培養物中で連続的に増殖した。各継代（黒丸）で、細胞を採取し
、計測し、一部を新しいプレートに再度プレートした。この操作を12継代繰り返
した。最初の摂取密度から採取の時までに増加した細胞数を、１継代当たりの培
養時間で割って、およその倍加時間を推定した（白三角）。グラフを横切る点線
は、全培養期間の平均倍加時間である。各継代で増加した細胞数の倍数を掛けて
、細胞の累積増殖を算出し、０日での初期細胞数に対する「累積増殖倍数」とし
て表した。０日の初期の出発細胞数は、5.0×106細胞であった。
令のヒト胎児皮質組織から得られたMycER改変ヒトCNS幹細胞系のプール（HK18.2
）を、約80日間培養物中で連続的に増殖した。各継代（黒丸）で、細胞を採取し
、計測し、一部を新しいプレートに再度プレートした。この操作を12継代繰り返
した。最初の摂取密度から採取の時までに増加した細胞数を、１継代当たりの培
養時間で割って、およその倍加時間を推定した（白三角）。グラフを横切る点線
は、全培養期間の平均倍加時間である。各継代で増加した細胞数の倍数を掛けて
、細胞の累積増殖を算出し、０日での初期細胞数に対する「累積増殖倍数」とし
て表した。０日の初期の出発細胞数は、5.0×106細胞であった。
【図３】 MycER改変ヒトCNS幹細胞のニューロン分化の安定性。 Ａ．分化し、抗MAP2ab抗体で免疫染色した未改変CNS幹細胞； Ｂ．分化し、抗TH抗体で免疫染色した未改変CNS幹細胞； Ｃ．分化し、抗MAP2ab抗体で免疫染色し、低倍率で見た、継代４でのMycER改
変ヒト皮質細胞； Ｄ．分化し、抗MAP2ab抗体で免疫染色し、高倍率で見た、継代４でのMycER改
変ヒト皮質細胞； Ｅ．分化し、抗TH抗体で免疫染色し、低倍率で見た、継代４でのMycER改変ヒ
ト皮質細胞； Ｆ．分化し、抗TH抗体で免疫染色し、高倍率で見た、継代４でのMycER改変ヒ
ト皮質細胞； Ｇ．分化し、抗GABA抗体で免疫染色し、低倍率で見た、継代４でのMycER改変
ヒト皮質細胞； Ｈ．分化し、抗GABA抗体で免疫染色し、高倍率で見た、継代４でのMycER改変
ヒト皮質細胞； Ｉ．分化し、抗MAP2ab抗体で免疫染色し、低倍率で見た、継代９でのMycER改
変ヒト皮質細胞； Ｊ．分化し、抗MAP2ab抗体で免疫染色し、高倍率で見た、継代９でのMycER改
変ヒト皮質細胞； Ｋ．分化し、抗TH抗体で免疫染色し、低倍率で見た、継代９でのMycER改変ヒ
ト皮質細胞； Ｌ．分化し、抗TH抗体で免疫染色し、高倍率で見た、継代９でのMycER改変ヒ
ト皮質細胞。
変ヒト皮質細胞； Ｄ．分化し、抗MAP2ab抗体で免疫染色し、高倍率で見た、継代４でのMycER改
変ヒト皮質細胞； Ｅ．分化し、抗TH抗体で免疫染色し、低倍率で見た、継代４でのMycER改変ヒ
ト皮質細胞； Ｆ．分化し、抗TH抗体で免疫染色し、高倍率で見た、継代４でのMycER改変ヒ
ト皮質細胞； Ｇ．分化し、抗GABA抗体で免疫染色し、低倍率で見た、継代４でのMycER改変
ヒト皮質細胞； Ｈ．分化し、抗GABA抗体で免疫染色し、高倍率で見た、継代４でのMycER改変
ヒト皮質細胞； Ｉ．分化し、抗MAP2ab抗体で免疫染色し、低倍率で見た、継代９でのMycER改
変ヒト皮質細胞； Ｊ．分化し、抗MAP2ab抗体で免疫染色し、高倍率で見た、継代９でのMycER改
変ヒト皮質細胞； Ｋ．分化し、抗TH抗体で免疫染色し、低倍率で見た、継代９でのMycER改変ヒ
ト皮質細胞； Ｌ．分化し、抗TH抗体で免疫染色し、高倍率で見た、継代９でのMycER改変ヒ
ト皮質細胞。
【図４】 ニューロン分化の安定性。MycER改変ヒト皮質細胞系は継代４と11で分化した
。MAP2abまたはTHタンパク質について免疫染色したニューロンの数を定量し、総
細胞に対するその比率を報告する。
。MAP2abまたはTHタンパク質について免疫染色したニューロンの数を定量し、総
細胞に対するその比率を報告する。
【図５】 MycER改変ニューロン前駆細胞。 Ａ．抗tau抗体で免疫染色した、MycER改変ラット線条体前駆細胞； Ｂ．抗tau抗体で免疫染色した、tau+/TuJ1-ニューロン前駆細胞の形態と配列
。 Ｃ．抗tau抗体で免疫染色した、tau+/TuJ1+ニューロン前駆細胞の形態と配列
。 Ｄ．抗TuJ1抗体で免疫染色した、Ｃのtau+/TuJ1+ニューロン前駆細胞の形態と
配列。
。 Ｃ．抗tau抗体で免疫染色した、tau+/TuJ1+ニューロン前駆細胞の形態と配列
。 Ｄ．抗TuJ1抗体で免疫染色した、Ｃのtau+/TuJ1+ニューロン前駆細胞の形態と
配列。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョー、カール、ケイ． アメリカ合衆国 20854 メリーランド州、 ポトマック、スタンモア ドライブ 10841 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA04 DA03 EA02 HA17 4B065 AA91X AA91Y AA93X AA93Y AB05 AB06 BB34 CA44
Claims (22)
- 【請求項１】 in vitroで哺乳動物の神経前駆細胞の安定な細胞系を産生す
る方法であって、 ａ）無血清培地中で神経前駆細胞の培養物を調製する工程； ｂ）第１の分裂促進因子の存在下で神経前駆細胞を培養する工程、ここで、第
１の分裂促進因子はaFGF、bFGF、EGF、TGFαおよびこれらの組合せよりなる群か
ら選択されること； ｃ）該細胞により取り込まれてc-myc遺伝子を発現することができる物質に該
細胞を接触させる工程；および ｄ）第１の分裂促進因子と第２の分裂促進因子とを含有する培地中で該細胞を
さらに培養する工程、ここで、第２の分裂促進因子はaFGF、bFGF、EGF、TGFα、
血清およびこれらの組合せよりなる群から選択されるが、第２の分裂促進因子は
第１の分裂促進因子とは異なるものであること； を含んでなる上記方法。 - 【請求項２】 c-myc遺伝子は他のDNA成分と融合されており、ここで該他の
DNA成分は、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、プロゲステロン受容体
、グルココルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイド受容体、およ
びエクジソン受容体のリガンド結合ドメインよりなる群から選択される少なくと
も１つの成分を含んでなる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 第１の分裂促進因子と第２の分裂促進因子とを含有する培地
は、β−エストラジオール、RU38486、デキサメタゾン、甲状腺ホルモン、レチ
ノイドおよびエクジソンよりなる群から選択されるmyc活性化化学物質をさらに
含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 哺乳動物の神経前駆細胞はヒト由来のものである、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項５】 哺乳動物の神経前駆細胞は多能性の胚性幹細胞のin vitro培
養物に由来するものである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 請求項１に記載の方法に従って産生される細胞系。
- 【請求項７】 前記細胞はニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞に分化
する多分化能を保持する、請求項６に記載の細胞系。 - 【請求項８】 前記細胞はニューロンと星状細胞とに分化する二分化能を保
持する、請求項６に記載の細胞系。 - 【請求項９】 前記細胞は星状細胞と乏突起膠細胞とに分化する二分化能を
保持する、請求項６に記載の細胞系。 - 【請求項１０】 前記細胞はニューロンに分化する単分化能を保持する、請
求項６に記載の細胞系。 - 【請求項１１】 前記細胞は星状細胞に分化する単分化能を保持する、請求
項６に記載の細胞系。 - 【請求項１２】 in vitroで哺乳動物の神経前駆細胞の安定なクローン性細
胞系を産生する方法であって、 ａ）無血清培地中で神経前駆細胞の培養物を調製する工程； ｂ）第１の分裂促進因子の存在下で神経前駆細胞を培養する工程、ここで、第
１の分裂促進因子は、aFGF、bFGF、EGF、TGFαおよびこれらの組合せよりなる群
から選択されること； ｃ）該細胞に取り込まれてc-myc遺伝子と選択マーカーを発現することができ
る物質に該細胞を接触させる工程； ｄ）第１の分裂促進因子と第２の分裂促進因子とを含有する培地中で細胞をさ
らに培養する工程、ここで、第２の分裂促進因子は、aFGF、bFGF、EGF、TGFα、
血清およびこれらの組合せよりなる群から選択されるが、第２の分裂促進因子は
第１の分裂促進因子とは異なるものであること；および ｅ）c-myc処理細胞を回収し、これを、選択マーカーを含まずかつ第１の分裂
促進因子と第２の分裂促進因子とを含有する培地中でc-myc処理細胞の生存を支
援することができるフィーダー細胞と共培養する工程、ただし、第２の分裂促進
因子は第１の分裂促進因子とは異なるものであること； を含んでなる上記方法。 - 【請求項１３】 c-myc遺伝子は他のDNA成分と融合されており、ここで該他
のDNA成分は、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、プロゲステロン受容
体、グルココルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイド受容体、お
よびエクジソン受容体のリガンド結合ドメインよりなる群から選択される少なく
とも１つの成分を含んでなる、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１４】 第１の分裂促進因子と第２の分裂促進因子とを含有する培
地は、β−エストラジオール、RU38486、デキサメタゾン、甲状腺ホルモン、レ
チノイドおよびエクジソンよりなる群から選択されるmyc活性化化学物質をさら
に含む、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１５】 哺乳動物の神経前駆細胞はヒト由来のものである、請求項
12に記載の方法。 - 【請求項１６】 哺乳動物の神経前駆細胞は多能性の胚性幹細胞のin vitro
培養物に由来するものである、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１７】 請求項12に記載の方法に従って産生される細胞系。
- 【請求項１８】 前記細胞はニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞に分
化する多分化能を保持する、請求項17に記載の細胞系。 - 【請求項１９】 前記細胞はニューロンと星状細胞とに分化する二分化能を
保持する、請求項17に記載の細胞系。 - 【請求項２０】 前記細胞は星状細胞と乏突起膠細胞とに分化する二分化能
を保持する、請求項17に記載の細胞系。 - 【請求項２１】 前記細胞はニューロンに分化する単分化能を保持する、請
求項17に記載の細胞系。 - 【請求項２２】 前記細胞は星状細胞に分化する単分化能を維持する、請求
項17に記載の細胞系。
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