ES2587189T3 - Líneas de células madre neurales estables - Google Patents

Abstract

Procedimiento para producir líneas celulares estables de células precursoras neurales de mamífero in vitro, que comprende las etapas de: a) preparar un cultivo de células precursoras neurales en un medio libre de suero; b) cultivar las células precursoras neurales en presencia de un primer mitógeno, en el que dicho primer mitógeno se selecciona del grupo que consiste en aFGF, bFGF, EGF, TGFα y combinaciones de los mismos; c) poner en contacto las células con un agente capaz de ser captado por las células y capaz de expresar un gen cmyc, en el que el gen c-myc está fusionado con otros elementos de ADN que comprenden ADN para al menos un dominio de unión a ligando de un receptor nuclear; y d) cultivar adicionalmente las células a través de al menos treinta duplicaciones celulares en un medio que comprende el primer mitógeno y un segundo mitógeno antes de la diferenciación de las células, en el que dicho segundo mitógeno es suero, en el que dicho medio comprende el primer mitógeno y el segundo mitógeno comprende además un agente activador de myc capaz de unirse al dominio de unión a ligando, en el que las células precursoras neurales no se originan de células embrionarias humanas.

Description

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de 12 pases desde el evento infección. Durante este período, se midió el rendimiento celular en cada pase para cuantificar el aumento aritmético real en el número de células y para determinar la estabilidad de la tasa mitótica con el tiempo (Figura 2). En general, las células experimentaron aproximadamente 54 duplicaciones que dieron lugar a un aumento de 1015 veces el número de células. El tiempo de duplicación de las células era notablemente constante a aproximadamente 40 horas por mitosis, que es invariable de la de las células madre del SNC primarias parentales humanas (Figura 2).

[0045] La misma preparación de células madre del SNC humanas también se sometió a la infección por retrovirus MycER y se cultivó en bFGF solo o en bFGF y EGF. En bFGF solo como mitógeno, las células madre del SNC que expresan MycER mostraron una mayor capacidad mitótica sobre las células no modificadas, pero sin embargo mostraron una capacidad proliferativa mucho menor que en bFGF + FBS al 1%. Como con las células parentales no modificadas, las células MycER también retuvieron un tiempo de duplicación de 60 horas en bFGF solo. Por otro lado, en bFGF + EGF, las células madre que expresan MycER mostraron una mayor tasa mitótica, una mayor capacidad mitótica, una mayor estabilidad de la capacidad de diferenciación neuronal, y eran resistentes a la diferenciación espontánea bastante similar a la condición de bFGF + FBS al 1%. En ausencia de la expresión de MycER, las mismas tres condiciones produjeron un patrón similar de crecimiento, pero con menos estabilidad. Significativamente, la condición de bFGF + BFS al 1%, aunque daba lugar a un crecimiento celular más eficiente, inevitablemente condujo a la pérdida de la capacidad de diferenciación neuronal. Esto demuestra que la función de c-myc constitutiva en estas células es sutil: proporciona una multipotencialidad más estable y una mayor capacidad mitótica, pero no una manifiesta independencia de mitógenos o transformación.

[0046] Estos efectos del c-myc constitutivamente activo también podrían extenderse a las células madre del SNC de todas las regiones de los cerebros fetales humanos y de rata.

4. Diferenciación neuronal de células madre del SNC mejoradas con MycER

[0047] Las células madre del SNC mejoradas con MycER se diferenciaron mediante la extracción de los mitógenos y -estradiol del medio y sin la adición de factores exógenos. La divergencia de morfologías neuronales y gliales comenzó a suceder en menos de dos días. Al tercer día, las morfologías neuronales eran claramente distinguibles. Las neuronas siguieron madurando en neuronas completamente funcionales durante las próximas 3-5 semanas.

[0048] Los cultivos diferenciados de las células madre del SNC humanas mejoradas con MycER en diferentes pases se analizaron por inmunohistoquímica con una variedad de diferentes anticuerpos específicos del tipo celular. A los 10 días de diferenciación, aproximadamente el 50% de las células totales expresaron las proteínas MAP2c, tau, y tubulina IIIb, todas marcadores relativamente tempranos de la diferenciación neuronal. Aproximadamente el 20-30% de las células totales expresaron los marcadores maduros de las neuronas, las proteínas MAP2a y MAP2B. Varios anticuerpos contra neurofilamentos revelaron una proporción similar de neuronas. De las neuronas, aproximadamente el 70% eran GABA-positivo. Una proporción similar de neuronas también era calretinina-positivo. Aproximadamente el 10-20% de las neuronas expresaba tirosina hidroxilasa (TH), la enzima biosintética clave para la dopamina. Todas las neuronas inmunopositivas eran de morfologías neuronales típicas y no coexpresaban el marcador glial, GFAP. De este modo, las líneas celulares mejoradas con MycER se diferencian para generar una proporción elevada de neuronas que muestran diversos fenotipos de neurotransmisores.

[0049] Las proporciones y fenotipos de neurotransmisores de las neuronas eran estables a través de muchos pases sucesivos (Figura 3A-L). A través de 54 duplicaciones de células madre, no hubo degradación de la capacidad de diferenciación neuronal tanto en la proporción de neuronas como en los diversos fenotipos de neurotransmisores generados.

5. Líneas de células madre específicas de región

[0050] La condición de cultivo libre de suero utilizada para el aislamiento de células madre neurales permitió una herencia estable de las identidades regionales y sus fenotipos de neurotransmisores relacionados a través de múltiples divisiones celulares. Esto implica que las células madre en el cultivo, a pesar de que son uniformes en su capacidad de diferenciarse en neuronas y células gliales, pueden ser muy diversas. Por lo tanto, si cada célula madre en el comienzo del cultivo pudiera inmortalizarse en su estado nativo y si este procedimiento fuera eficiente para muestrear miles de células madre en una sola placa, entonces los diversos fenotipos neuronales podrían “capturarse” permanentemente en forma de líneas celulares.

[0051] La modificación genética de las células madre neurales con c-myc dio lugar a un sistema de cultivo celular robusto, altamente reproducible y estable. El proceso de modificación en sí es bastante eficiente, produciendo de

5.000 a 50.000 clones independientes por infección por retrovirus durante un proceso de dos días. Esto podría escalarse fácilmente mediante el aumento de las partículas de retrovirus o el aumento del número de la densidad de células diana, si es necesario.

[0052] Con el fin de determinar si la sobreexpresión de c-myc tiene un impacto en la capacidad de diferenciación de los fenotipos de neurotransmisores, se modificaron células madre de muchas regiones diferentes de los cerebros

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fetales de rata y humano por el retrovirus MycER. Estas regiones incluían la corteza, septo, hipocampo, mesencéfalo, rombencéfalo, cuerpo estriado y médula espinal. Se examinaron múltiples ejemplos de cultivos de la zona cortical, mesencéfalo y médula espinal de varia edades gestacionales diferentes para evaluar la reproducibilidad del procedimiento. En todos los casos, los grupos de clones independientes resultantes generan proporciones altamente reproducibles de neuronascon respecto a células gliales. Como era de esperar, las morfologías, perfiles antigénicos de las neuronas y sus proporciones relativas también eran distintos de las líneas celulares de una región frente a otra.

[0053] Por lo tanto, como ejemplo de referencia, cuando se examinaron varios grupos de líneas celulares de tejidos del mesencéfalo de fetos humanos de 8 semanas, aproximadamente el 0,1% del total de células eran neuronas dopaminérgicas consistentemente TH-positivas, que también es la proporción que se encuentra en los cultivos de células madre no modificados (las células precursoras neurales de la invención no se originan de células embrionarias humanas). El análisis clonal reveló que la expresión de TH se restringió clonalmente. Es decir, la mayoría de los clones no contenían neuronas que expresaban TH. De las que lo hicieron, la proporción era variable de un clon a otro. También se examinaron varios grupos de líneas celulares de tejidos corticales de fetos humanos de 17 a 20 semanas de vida. Curiosamente, todas las líneas corticales dieron lugar a un aumento significativo de las neuronas TH-positivas en comparación con las células madre sin modificar. La proporción de neuronas TH-positivas fue del 2-4% de las células totales. Posteriormente, el análisis clonal reveló un patrón similar en la distribución de las neuronas TH-positivas. La mayoría no tenía ninguna, mientras que las que generan TH estaban presentes en proporciones variables. Este patrón también se había observado con clones de células madre sin modificar de varias regiones diferentes y con varios marcadores antigénicos diferentes.

[0054] Como ejemplo de referencia, también se establecieron líneas celulares de médula espinal de fetos de 6 a 10 semanas de vida (las células precursoras neurales de la invención no se originan de células embrionarias humanas). El patrón de diferenciación neuronal fue el mismo que en otras regiones, aunque sus características de morfología y crecimiento de células madre eran distintos.

[0055] Por lo tanto, la modificación genética de las células madre neurales con c-myc no altera sus capacidades de diferenciación intrínseca. En todas las líneas celulares a través de extensos períodos de cultivo continuo, no se observó ninguna evidencia de formación de tumor u otra transformación anormal. Tras el análisis del cariotipo de un grupo de líneas de células corticales humanos en el paso 14, se observó un patrón cromosómico diploide normal sin reordenamiento aberrante. De este modo, la regulación de la capacidad mitótica por c-myc, que es un gen celular normalmente presente en todas las células eucariotas y un conocido regulador clave de la maquinaria del ciclo celular, no es oncogénico y proporciona ventajas significativas sobre otros procedimientos que utilizan oncogenes virales, tales como v-myc o antígeno T SV40 grande.

6. Otros tipos de células

[0056] La modificación genética con c-myc se puede realizar en cualquier momento durante el período de cultivo. Dado que la expresión de c-myc en sí no es mitogénica, es decir, no transformante, una condición de cultivo que promueve la proliferación de una población precursora neural particular es un requisito previo. Los factores de crecimiento purificados, tales como aFGF (factor de crecimiento fibroblástico ácido), bFGF, EFG y TGF, pueden proliferar una variedad de diferentes tipos de células neuronales. Aunque la mayor parte de las descripciones anteriores eran en células madre del SNC multipotentes como población predominante, se observaron varios tipos de células diferentes durante el análisis clonal.

[0057] Una población significativa era una población de clones progenitores bipotenciales que, después de la diferenciación, daba lugar a neuronas y astrocitos con aparente ausencia de oligodendrocitos. Estos progenitores bipotenciales eran bastante similares a las células madre multipotenciales en su morfología durante el crecimiento. El patrón de diferenciación era también similar dando lugar a aproximadamente un 50% de neuronas y un 50% de astrocitos. Por lo tanto, la diferencia de definición clave entre las dos poblaciones es la ausencia de oligodendrocitos en cultivos diferenciados.

[0058] Una segunda población de células derivadas de la modificación con c-myc de cultivos neurales primarios era una población de clones progenitores neuronales unipotenciales que consistían sólo en neuronas. Estos clones progenitores neuronales eran de tamaño más pequeño y asumían morfologías neuronales inmaduras y distintas durante la proliferación y expresaban proteínas tau y/o beta-tubulina III. Se proporcionan ejemplos en la Figura 5. Se observaron dos tipos distintos de células (Figura 5A). Un tipo eran células de cuerpo pequeño con un único proceso muy corto que se ramificaba del cuerpo celular, que crecían en grupos apretados. Estas células eran inmunorreactivas con el anticuerpo anti-tau, pero no con el anticuerpo anti-tubulina IIIb durante la división (Figura 5B). El otro tipo de células eran células con neuritas distintivamente alargadas sin una gran ramificación, que crecieron en un patrón más pequeño y más disperso, sugiriendo una mayor capacidad migratoria. A diferencia del primer tipo, también eran inmunorreactivas con el anticuerpo anti-tau y el anticuerpo anti-tubulina IIIb (figuras 5C y 5D, respectivamente). Muchas veces, se observó que los segundos tipos de células estaban próximas o estaban entremezcladas con el primer tipo de células, lo que sugiere que se trata de dos fases de progenitores neuronales comprometidos en un único linaje continuo, siendo el estado tau+/TuJ1+ el estado más maduro.

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[0059] Una tercera población de células derivadas de cultivo de células neuralas modificadas por c-myc era una población de clones que consistían únicamente de células gliales. La mayoría de estos clones eran astrocitos con pocos o ningún oligodendrocito.

[0060] Estos resultados indican que muchos linajes de células precursoras neurales responden de manera similar a la sobreexpresión de c-myc. Además de los cultivos neurales primarios preparados a partir de tejidos del sistema nervioso de mamíferos, los recientes avances en cultivos de células madre embrionarias indican que diversas células precursoras neurales se forman in vitro durante la diferenciación de células madre embrionarias totipotenciales o pluripotenciales y las líneas celulares se mantienen en cultivo durante mucho tiempo (Renoncourt et al., Mech Dev (1998) 78, 185; Svendsen et al, Trends Neurosci (1999) 22, 357; Brustle et al, Science (1999) 285, 754.). Estos cultivos pueden generar células precursoras neurales de anidación positiva, que a continuación pueden transferirse a un medio libre de suero y posteriormente expandirse con bFGF y/o EGF durante poco tiempo. La expansión en masa a largo plazo no ha sido factible debido a que la formación de céulas precursoras neurales iniciales es ineficiente. Sin embargo, mediante la utilización del procedimiento de modificación genética con el gen cmyc descrito en el presente documento, las células precursoras neurales transitorias pueden convertirse en líneas celulares estables.

[0061] Los precursores neuronales que incluyen células madre neurales multipotenciales pueden aislarse de cerebros de adultos y pueden cultivarse en condiciones libres de suero. Sin embargo, este proceso es ineficiente, dando como resultado sólo un pequeño número de células proliferativas. Sin embargo, con la transferencia del gen c-myc tal como se describe en el presente documento, se pueden establecer líneas celulares estables a partir de dicho pequeño número de células obtenidas de biopsias de tejido neural.

[0062] c-myc está implicado en muchos procesos celulares diferentes, tal como apoptosis, además de la regulación del ciclo celular. c-myc se ha utilizado anteriormente para transformar las células de origen no neural. Sin embargo, estos estudios previos se realizaron con líneas celulares ya estables, tales como líneas de células de fibroblastos 3T3 y para producir el estado neoplásico de las líneas celulares, que habían sido seleccionadas en base a aberraciones cromosómicas espontáneas que conferían independencia de mitógeno. Otros estudios trataron de utilizar un proceso de inmortalización para activar las neuronas post-mitóticas para volver a entrar en el ciclo celular.

[0063] Las células madre del SNC ya son mitóticas y ya se han establecido las condiciones de cultivo mitogénico para una expansión a largo plazo de hasta 30 duplicaciones celulares. Por lo tanto, nuestro objetivo ha sido el de incrementar la capacidad de expansión más allá de las 30 duplicaciones celulares por lo menos hasta el comienzo de la senescencia que se cree que ocurre entre 60 y 80 ciclos celulares. Sesenta duplicaciones celulares representan un aumento 1x1018 veces en el número de células, que es lo suficientemente grande para el cribado de un millón de bibliotecas químicas, consistiendo cada una en 500.000 compuestos, o lo suficientemente grande como para proporcionar terapias celulares para 50 mil millones de pacientes de Parkinson. El concepto clave ha sido encontrar una modificación "suave" de las células a fin de no perturbar su capacidad de diferenciación neuronal intrínseca, a la vez que se proporciona una capacidad de crecimiento mejorada bajo las condiciones de cultivo establecidas para las células madre primarias del SNC.

[0064] El aumento de la concentración de proteína c-myc activa conduce a la generación de líneas de células madre humanas del SNC estables. Este efecto no se produce por la desregulación manifiesta de parámetros mitóticos y de diferenciación del ciclo celular, sino proporcionando resistencia a factores autocrinos y paracrinos que inducen la restricción de la multipotencialidad hacia un estado progenitor glial. La consecuencia no es una transformación oncogénica de las células, sino más bien una estabilización del crecimiento de las células. Por lo tanto, las señales endógenas que desencadenan la diferenciación, tales como las presentes en la densidad de células confluentes, siguen siendo eficaces. La división celular es todavía dependiente del suministro de mitógenos exógenos adecuados, tales como bFGF y/o EGF y/o suero. La diferenciación de las líneas de células madre para madurar neuronas funcionales es tan eficiente al final de las 60 duplicaciones celulares como en las células primarias no modificadas. Una variedad de fenotipos neurotransmisores y sus proporciones relativas se mantienen a lo largo de la expansión.

[0065] La actividad de c-myc en estos ejemplos se controlaba mediante la construcción de una proteína quimérica de c-myc fusionada a un fragmento de proteína del receptor de estrógeno (Eiler et. Al., Nature (1988) 340, 60). El papel previsto del estrógeno es proporcionar un control sobre la cantidad de c-myc funcionalmente activa inducida en la célula. La porción de receptor de estrógeno de la proteína quimérica se activa cuando se une con un agonista

o antagonista permeable a las células, tal como -estradiol o tamoxifeno.

[0066] La mayoría de los miembros de la superfamilia de receptores nucleares actúan de manera similar en que los ligandos permeables a las células se difunden a través de la bicapa de plasma y se unen a su receptor que después se transporta al núcleo como un complejo e induce una variedad de eventos relacionados con la transcripción. El dominio de unión a ligando de estas proteínas de receptores nucleares y sus ligandos puede sustituir el receptor de estrógeno y -estradiol con el fin de regular las funciones del resto de proteína c-myc fusionado. Ejemplos de tales receptores nucleares son receptor de glucocorticoides, receptor de progesterona, receptores de andrógenos,

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