CN102321572A - 一种纯化、识别胰腺内分泌细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纯化胰腺内分泌细胞的方法，包括以下步骤组成：选择待纯化分类的候选细胞群，用检测试剂检测上述细胞群中Insm₂表达阳性的细胞；分离出Insm₂表达阳性的细胞，纯化，得到胰腺内分泌干细胞。本发明还公开了利用检测Insm₂来识别内分泌干细胞或前体细胞。

Description

一种纯化、识别胰腺内分泌细胞的方法

技术领域

本发明属于生物领域，其涉及到细胞分化，具体涉及一种纯化、识别胰腺内分泌细胞的方法。

发明背景

胰岛细胞移植方法是治疗糖尿病有效手段之一，但来源极为有限。研究如何获得足够多的人胰岛β细胞已成为当前研究的重点课题。据此，发展识别和纯化具胰岛素分泌功能的细胞以及具分化胰岛素分泌功能的干细胞或前体细胞的有效方法已成为当务之急。

胰腺内分泌干细胞(Pancreatic endocrine stem cells，例如Ngn3表达阳性的具分化能力的胰胚细胞)和前体细胞经培养后可分化或分泌胰岛素的细胞，并用于治疗糖尿病患者(Jiang，et al.，Stem Cells 2007；25：1940-53，Eshpeter，et al.，Cell Prolif 2008；41：843-58)。

发明内容

本发明的目的是提供一种纯化胰腺内分泌细胞的方法。

实现上述目的的技术方案如下：

一种纯化胰腺内分泌细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(a)选择待纯化分类的候选细胞群；

(b)用检测试剂检测该细胞群中Insm₂表达阳性的细胞；

(c)分离出Insm₂表达阳性的细胞，纯化，得到胰腺内分泌干细胞。

优选地，检测步骤(b)所用的标记检测的试剂包括抗Insm₂抗体或是Insm₂的mRNA的互补核苷酸。

本发明的另一目的是提供一种识别内分泌干细胞或前体细胞的方法，包括以下步骤

(a)一种Insm₂特异检测试剂接触待识别的细胞；

(b)检测Insm₂的表达；

(c)发现Insm₂的出现即为识别出所检出的细胞为内分泌干细胞或前体细胞。优选地，所述检测试验为含有抗Insm₂抗体或一种与Insm₂的mRNA互补的核苷酸。

本发明的另一目的是提供一种识别可调节内分泌细胞功能或启动内分泌细胞增殖化合物的方法。

实现上述目的的技术方案如下：

一种识别化合物的方法，该化合物可调节内分泌细胞功能或启动内分泌细胞增殖，该方法包括常规高通量筛查中的各个步骤如化合物与Insm₂阳性细胞接触，以及测量该化合物对内分泌细胞功能影响。

一种识别Insm₂活性调节因子的方法，包括与纯化的Insm₂接触的一组试验的化合物，选择与Insm₂特异结合的化合物，和测验所选化合物对内分泌细胞功能的影响。

本发明证实Insm₂是Snail/Gfil/Insm₁转录因子家族的新成员，与发育和疾病有重要关系。Insm₂是胰腺内分泌细胞和内分泌细胞前体细胞的标记物。这些细胞可分化成具糖诱导的分泌胰岛素的β细胞。因此，Insm₂可识别和纯化胰腺内分泌细胞和前体细胞。这些细胞经培养后可分化或分泌胰岛素的细胞并用于治疗糖尿病患者(Jiang，et al.，Stem Cells 2007；25：1940-53，Eshpeter，et al.，Cell Prolif 2008；41：843-58)。Insm₂也能用于药物靶标以识别刺激干细胞和前体细胞分化或增殖的分子。Insm₂还能用于帮助识别内分泌干细胞/前体细胞的表面标记。这样就可以采流式细胞仪(FACS)等方法来纯化内分泌干细胞或前体细胞。

附图说明

图1是INSM2基因分析。

图2是人的INSM2和小鼠的Insm2在发育过程中和成年期组织表达水平的检测。

图3是Insm2表达在成年人和小鼠的胰岛细胞中。

图4是Insm2在斑马鱼胚胎发育期的表达。

图5是Ngn3和NeuroD1对Insm2的活化作用。

图6是Ngn3和NeuroD1诱导胰腺mPANC细胞的内源性Insm2的表达。

图7是Insm2在小鼠胚胎发育过程和成年胰岛表达调控的模式图。

具体实施方式

I.引言

本发明证实Insm₂是内分泌干细胞或前体细胞的一种标记。因此，Insm₂可用于纯化和识别该类细胞，而在经体外培养后，可回置于病人体内。这些细胞在体外可诱导增殖或分化成对糖反应的分泌胰岛素的细胞。Insm₂也能用于药物试验的靶标。这样的试验可用于识别和选择能诱导内分泌干细胞或前体细胞分化和/或增殖的药物。Insm₂还能用于帮助识别内分泌干细胞或前体细胞的表面标记物。这些表面标记物可用于流式细胞仪纯化细胞以及药物试验的靶标。

一旦有足够的具功能的人的β细胞，即可对糖尿病的治疗和研究有重要的影响。其中一个直接的应用就是进一步研究β细胞的生物学功能。高通量筛选糖尿病药物也是应用范围之一。也可用于筛选能诱导内分泌细胞分化的小分子或其它化合物。另外，这些细胞也可用于糖尿病的移植治疗。

II.定义

本发明所用术语及其定义符合本领域科学研究的常规范畴。举例如下：“胰腺干细胞”是未分化的细胞，具有变成广泛特殊细胞的潜能(如胰腺内分泌细胞和β细胞)。胰腺干细胞包括胰胚干细胞、成年胰腺干细胞、前体细胞，和胰腺来源的多潜能前体细胞(Calne，et al.，Nat Rev Endocrinol 2010；6：173-7)。

“内分泌细胞”是来源于成年或胚胎内分泌腺(在胰腺或胰岛)的一种细胞。“内分泌胰腺细胞”是指来源于成年或胚胎胰腺，特别是胰岛细胞的细胞。“培养”内分泌胰腺细胞是指原代培养以及表达重组核苷酸的细胞。培养内分泌细胞也包括已经转型的细胞，即使用癌基因等(如SV40T抗原，ras，或端粒酶基因等)。其它所用术语还包括多种“胰岛细胞”，“诱导细胞分化”，“β细胞特异基因”，“糖反应的分泌胰岛素”，“转录因子”，“调节β细胞功能”，“I型或II型糖尿病”，“免疫反应”，“过表达”，“报道基因”，“Insm₂”，“Insm₂多肽”，“启动子(promoter)”，“试验化合物”，“候选药物”，“抑制剂”，“激活剂”，“小的有机分子”，“RNAi分子”，“siRNA”等等。

III.本发明的细胞

本发明提供一种方法，用以诱导细胞分化(如胰胚干细胞，胰腺来源的多潜能iPS细胞和内分泌细胞)，该方法就是采用Insm₂作为标记来纯化这些细胞。本发明所述的细胞可以是原代细胞也可能是维持培养的细胞。建立一种原代细胞培养的方法和技术可参见文献(Chao，et al.，Cell Transplant 2008；17：657-64，Qi，et al.，J Vis Exp 2009；pii：1343)。合适的细胞包括内分泌细胞和干细胞(如胰胚干细胞，成年干细胞和胰腺来源的多潜能前体细胞)。合适的内分泌细胞包括胰腺细胞，胰岛细胞(如β细胞和δ细胞)。胰岛细胞可来源于成年胰腺组织，发育期的胰腺组织和胰岛样细胞团。

细胞可来源于任何合适的哺乳动物或发育期的组织。例如，细胞可以从啮齿类动物(小鼠、大鼠、天竺鼠和兔子)和非啮齿类动物(如狗、猫、猪、羊、马、牛和山羊)；灵长类动物如猩猩和人等。

本发明在重组遗传学方面采用常规的技术。常用的方法见Sambrook等的“分子克隆”中的基本内容(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A LaboratoryManual 1989；2nd ed.)。

IV.细胞培养

本发明在细胞培养方面采用常规技术，相应的方法参见“动物细胞培养(1994年，第三版)。一般来说，细胞培养环境包括考虑细胞生长的底物，细胞密度和细胞之间的接触、气相、培养基和温度。

细胞通常在37℃饱和湿度的孵育箱培养。CO₂浓度为5％。常用的培养液为DMEM和RPMI1640等。通常用低糖，并加10％热灭活的小牛或胎牛血清。培养液的PH为7.2-7.4。其它可加抗菌素、氨基酸和肝细胞生长因子等。细胞培养72小时后更换培养液。细胞生长的密度可根据不同的细胞类型由经验判断。当细胞密度超过85％后即可传代。

V.治疗糖尿病的方法

本发明纯化的细胞可用于治疗糖尿病。例如，本方法所生产的分化的内分泌细胞可用于胰岛素依赖型的糖尿病(I型)的治疗。

治疗过程中使用细胞的多少主要由临床医师综合判断决定。细胞毒性，移植反应，疾病的程度及进展，以及抗移植细胞抗体的产生等均有影响。如何使用本发明生产的细胞，可根据能否维持血糖水平，不同量的细胞的副作用，以及患者的体重及整体健康状况来决定。

所使用的细胞剂量应使患者较长时间获得治疗效益。也可取决于细胞类型及患者的状况，以及体重或体表面积等情况。剂量的大小也取决于副作用的出现，性质和程度，以及是否伴随着载体或转型细胞类型等。可单剂量也可多剂量使用。

移植细胞的免疫注射是能否成功进行胰岛移植的一个主要障碍。任何供体细胞的移植均会被免疫细胞识别。但近年免疫排斥反应已初步得到控制。使用本发明的永生化的细胞系的优势是基因工程后的移植细胞有可靠的质量，可避免或抑制宿主的免疫反应。

药物可接受的载体部分决定于所采用的特殊成分(如细胞或小分子)以及如何使用这些成分的特殊方法。相应地，本发明可用的药物成分形式可有较广泛的选择。使用形式可以是静脉注射、肌肉注射、皮内、腹腔或经皮注射。

VI.检测Insm2阳性细胞

检测Insm2阳性细胞可采用常用的针对Insm2蛋白质或RNA的方法，如特异性抗Insm2抗体作组织化学染色或与Insm2核苷酸的互补链结合再与化学标记物如荧光标记，同位素标记等连接。

VII.内分泌细胞功能调节实验

本章举例说明如何应用Insm2表达细胞及识别其他调节内分泌细胞功能的因子。

A试验

试验是指采用本发明所用细胞来检测与内分泌细胞功能调节有关(抑制或激活)有关因子的表达。如GK，SUR-1，MafA，胰岛素，granuphilin，chromagranin A等，这些调节因子对治疗与糖代谢有关的疾患，糖尿病或低血糖有重要作用。功能异常的治疗包括对各型糖尿病，胰岛素瘤所致的高胰岛素血症，或因药物或过量使用胰岛素所致的低血糖，或因胰岛素或胰岛素受体的抗体所致的免疫疾病等。

通过测试标记物(Insm2)表达(RNA或蛋白质)可检测出调节的功能。物理或化学变化的检出也可以制定化合物对内分泌细胞功能的影响。用未加化合物处理的样本作对照，可检测出化合物处理的细胞的抑制或激活的调节作用。

举例来说，试验之前可选转染连接了某启动子的报道基因，报道基因的表达表明所实验的化合物是β细胞功能的调节因子。合适的报道基因包括荧光素酶(Luciferase)，荧光蛋白(GFP)等。合适的启动子包括胰岛素启动子，PDX-1启动子，Insm2启动子和NeuroD/bete2启动子等。

B调节物

成为内分泌细胞功能调节物可以是任何小分子化合物，或大分子，如蛋白质，糖，核苷酸或脂类。理论上任何化合物均可在本发明试验系统中检测是否为调节物或底物。当然，大部分化合物使用时为溶液或溶于有机物(特别是DMSO为基础的)溶液。本试验方法是设计用于筛选的化合物库。通常是自动化检测。

一个理想的实例是结合化合物和多肽来进行高通量筛选，以找到有上述活性的化合物。这些化合物可作进一步传统的试验及实际治疗。

VIII.评估insm2系统的进一步说明

Ngn3是表达在内分泌受体细胞中的一种重要的转录因子。采用来源于内分泌胰腺的细胞系(cell line)，已发现Ngn3下游的几个重要的转录因子(Murtaugh，et al.，Development 2007；134：427-38)。Insm1就是其中之一，其对胚胎胰岛的发育起关键作用(Gierl，et al.，Genes Dev 2006；20：2465-78)。从理论上来说，β细胞的产生可因新生细胞而出现(即从干细胞分化而来)，也可由已有的β细胞复制而来。人胰腺非内分泌上皮细胞也具有向内分泌细胞分化的能力。

Insm2主要表达在内分泌细胞如胰岛细胞中。Insm2也表达在一些特殊的神经细胞中，如大脑皮层的神经细胞。本发明还有一点重要的发现，即Insm2是BHLH转录因子Ngn3和NeuroD1的下游靶标分子。Ngn3表达的增加或减少也直接导致Insm2表达的增加和减少。

以下实例表明Insm2在胰腺内分泌细胞产生和发育过程起重要作用。Insm2可标示能变成新的胰腺内分泌组织的细胞。以下实例由图所示但不限于这些例子。

实施例1

人Insm2与Insm1的氨基酸序列高度同源，属于Snail/Gfil/Insm1家族含C2H2型锌指蛋白转录因子的新成员。人的Insm2从人胰岛细胞瘤cDNA基因文库中用PCR方法(引物顺序：5′-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；reverse，5′-ACAGCTGAACACCTTGTCGCACTC-3′)分离出(GenBank acc.no.，NM_032594)，编码566个氨基酸残基(Protein Database acc.no.，NP_115983)，该蛋白质的分子量为60kDa、等电点为9.46(图1)。Insm2与Insm1有51％的同一性和56％相似性。从线虫C.elegans到人类都存在直系同源的Insm1/Insm2，提示它是一个在进化中相对保守的基因家族。(A)应用NCBI提供的BLAST程序比较人INSM2与小鼠Insm2的氨基酸序列的高度同源性。(*)表示同一氨基酸，(-)表示缺少最佳对应序列。N-端(氨基酸序列1-260)包含如下几个结构域：snag结构域(氨基酸序列1-7)；两个富含脯氨酸的区域(氨基酸序列35-55和氨基酸序列102-115)；核定位信号(氨基酸序列199-225)。C-端包含5个锌指结构域(氨基酸序列261-566)。INSM1/INSM2家族蛋白特征性序列(氨基酸序列302-316)有下划线。(B)图示比较INSM2和INSM1的蛋白质结构。Snag结构域(绿色圆圈)；2个脯氨酸富含区(空白格子)；NLS核定位信号序列(绿色圆圈)。正方形格子代表每一个锌指结构域。红色表示第一个锌指结构域的最后一个组氨酸被精氨酸代替。两种蛋白质的标记性序列在第二个锌指结构域的末端(箭头表示)。

实施例2

Insm2信使核糖核酸或INSM2蛋白质表达在胚胎及成年胰腺内分泌细胞

采用小鼠全长Insm2 cDNA作探针，Northern印迹试验显示Insm2表达在小鼠胚胎时期，在胰腺发育阶段的E11.5-E13.5天，Insm2的表达明显增强(图2)。采用针对INSM2氨基酸(5-SRQVLLLQMPLRPGC-3)特异性兔抗体，Western印迹实验结果显示，Insm2蛋白质表达在成年胰腺，分子量约为60KDa(图2)。采用Insm2特异性抗体的免疫组织化学染色，显示INSM2蛋白质表达在胰岛内分泌细胞，但在胰腺外分泌组织中未见其表达(图3)。INSM2蛋白质也表达在肾上腺皮质及髓质的内分泌细胞及许多脑神经细胞如脑皮质神经元，海马回和小脑神经细胞。斑马鱼的原位杂交试验也证实Insm2 mRNA表达在发育的胰腺和神经组织(图4)。

图2中，(A)小鼠Insm2的信使核糖核酸(mRNA)在E6.5-E18.5天小鼠胚胎期的表达。Insm2信使核糖核酸的表达在E11.5-E13.5期间有短期增强。以18S和28S信使核糖核酸标示每条电泳泳道的mRNA是等量的。GAPDH作为模板对照。(B)INSM2信使核糖核酸在多种成年人组织的表达水平，其中在胰腺和心脏表达较高。Insm2转录产物的大小标示在每幅图像的右侧。(C)用兔抗INSM2抗体进行蛋白质印迹(Western blot)分析，可见在小鼠胰腺和脑组织Insm2蛋白质的单条带，约为60kDa(千道尔顿)。

图3中，(A)应用INSM2抗体通过免疫荧光染色发现INSM2(绿色)在绝大多数(或者全部)小鼠的胰岛细胞中表达。(B)与此相似，胰岛素抗体显示大多数的胰岛细胞为胰岛素阳性的β细胞(红色)。A和B融合图(C)表明Insm2和胰岛素均表达在β细胞中(黄色)。(D)如箭头所示，在人胰岛β细胞及α细胞中检测到INSM2(红色)。(E)胰高血糖素抗体显示α细胞(绿色)。(F)D和E的融合图表明INSM2与胰高血糖素均表达在α细胞中(黄色)。标尺为100μm。

图4中(A)应用斑马鱼全长Insm2 cDNA作为探针，对胚胎整体切片作原位杂交。检测发现Insm2信使核糖核酸表达在斑马鱼的胚胎胰腺。早在14体节期Insm2就开始表达(受精后14小时)，并且在20体节期(受精后19小时)表现明显(双箭头所示)，右侧方框有5倍的放大图。另外，Insm2在神经系统也有明显表达(E)，且在头端有较强表达(箭头所示)。a，前端；p，后端。

实施例3

Insm2基因是Ngn3和NeuroD1下游的新靶标

Notch信号的失活引起Ngn3的激活是内分泌胰腺发育开始的关键一步。最近的文献表明Insm1基因是Ngn3下游的靶标(Mellitzer，et al.，Embo J 2006；25：1344-52)，同时也是NeuroD1的靶标(Breslin，et al.，J Biol Chem 2003；278：38991-7)。因为Insm2是Insm1的同源基因，故Insm2也可能是Ngn3和NeuroD1下游的新靶标。另外，基因芯片分析Ngn3基因剔除小鼠胰胚(E18.5天)组织表明，Insm1和Insm2基因的表达均显著降低(平均下降6.3倍以上)(Juhl，et al.，Diabetes 2008；57：2755-61)；参见文献附录的数据库资料)。Insm1基因剔除小鼠胰岛细胞发育障碍及胰岛素或胰高血糖素的产生障碍等证据，也提示其同源基因Insm2也可能参与胰岛细胞的发育及内分泌激素生成的信号传导通路。

为了判别Ngn3和NeuroD1是否调控小鼠Insm2基因的表达，Hela细胞被同时转染Insm2启动子和CMV-Ngn3和/或CMV-NeuroD1质粒DNA。结果证明Ngn3和NeuroD1均可以激动Insm2荧光素酶报道基因的活性(图5)。用腺病毒-Ngn3或腺病毒-NeuroD1表达系统，转染胰腺非内分泌细胞而使之转型分化后，通过实时PCR证明小鼠Insm2信使核糖核酸表达的增加(图6)。

图5中(A)上图：携带小鼠Insm2启动子荧光素酶报道基因的E-box及其近端2.5-kb的简图。下图：不同长度的小鼠Insm2启动子荧光素酶构建体的荧光素酶报道基因分析。应用每个质粒DNA(0.5μg)和CMV-Ngn3或CMV-NeuroD1(有或无)进行HeLa细胞瞬时转染(48小时)。(B)上图：0.6-kb的Insm2启动子荧光素酶报道基因两个相邻E-box的简图。下图：Ngn3/E47-或NeuroD1/E47-介导的报道基因活性测定结果，0.5μg质粒DNA转染到HeLa细胞48小时：单纯质粒DNA转染(第一纵行)、与E47、Ngn3、NeuroD1、Ngn3/E47和NeuroD1/E47共转染(第2-6纵行)。(C)左侧图示：野生型或突变型构建体(包含Insm2启动子相邻两个E-box和TATA-荧光素酶报道基因)。右侧图示：CMV-Ngn3/E47或CMV-NeuroD1/E47试剂与0.5μg报道基因质粒DNA共转染结果。(A-C)荧光素酶活性的测定方法参见产品说明(Promega，Madison，WI，USA)。实验结果用运载体或构建体的基本活性的倍数表示(均数±标准差)。细胞转染三份并重复三次。(D)Ngn3和NeuroD1偶联于Insm2启动子。应用MIN6小鼠胰岛瘤细胞分离的染色质与Ngn3抗体，NeuroD1抗体或IgG进行染色质免疫沉淀试验(ChIP)。连续稀释DNA作为PCR分析的阳性对照。引物序列的描述见材料和方法。应用Ngn3抗体或NeuroD1抗体进行Insm2基因启动子的免疫共沉淀分析，但与免疫前IgG无免疫反应。阳性对照Insm1与Ngn3或NeuroD1抗体进行共沉淀，但与阴性对照BRCA1无免疫反应。图像代表三个独立的实验。每一个图像的右侧标有PCR产物的大小。

图6是Ngn3和NeuroD1诱导小鼠胰腺mPANC细胞的内源性Insm2信使核糖核酸的表达。Ngn3或NeuroD1刺激后mPANC细胞的Insm2转录产物增加。RT-PCR结果显示，腺病毒-Ngn3或腺病毒-NeuroD1转导胰腺mPANC细胞Insm2的表达增加(第3行图)，但是，在腺病毒-载体转染细胞或亲本mPANC细胞未检测到。腺病毒-Ngn3转导mPANC细胞中NeuroD1表达上调(第2行图，带1)。GAPDH作为样本对照。图中数据来自三个独立的实验结果。

实施例4

表达Insm2是Ngn3和NeuroD1的直接靶标的基因证据

因为小鼠Insm2启动子顺序含有10个假定的E-盒子，Ngn3和NeuroD1有可能直接调控Insm2的表达(图5)。同时转染Hela细胞不同长度的Insm2启动子区域(0.4-2.5-kb)以及CMV-Ngn3和/或CMV-NeuroD1质粒DNA，过表达的结果显示0.6-kb的近端启动子区域是Insm2与Ngn3或NeuroD1结合的最佳区间。突变试验进一步证明，Insm2近端该区域内的E1和E2盒子均可与Ngn3和NeuroD1结合。另外，采取染色质沉淀试验(ChIP)也证明了Ngn3和/或NeuroD1与Insm2的直接结合(图5)。

总之，Ngn3或NeuroD1与Insm1和Insm2启动子的结合，均是通过与后二者启动子近端区域的E盒子特异性的结合而成。结合以上数据表明，在早期胰腺发育过程中Ngn3的表达，激活了下游Insm2的表达，并通过NeuroD1维持Insm2的表达在成年胰腺内分泌细胞(图7)。

图7是Insm2在小鼠胚胎发育过程和成年胰岛表达调控的模式图。Ngn3的表达启动了定向内胚层内分泌胰腺的发育(Murtaugh，et al.，Development2007；134：427-38)。本图显示Ngn3在胚胎发育第11.5天至13.5天，激活Insm2在胰腺内分泌细胞的显著表达(红色)。同时Ngn3也激活NeuroD1的表达并通过NeuroD1维持了Insm2在成年胰岛细胞的持续表达(绿色)。Insm2的表达受到Ngn3和NeuroD1的双重调控，Insm2表达的高峰以黑体字标示。

实施例5

本实施例的纯化胰腺内分泌细胞的方法，包括以下步骤：

(a)选择待纯化分类的候选细胞群；

(b)用检测试剂检测上述细胞群中Insm₂表达阳性的细胞；所述的检测试剂包括有抗Insm₂抗体或Insm₂的mRNA的互补核苷酸；

(c)分离出Insm₂表达阳性的细胞，纯化，得到胰腺内分泌干细胞。

检测Insm2阳性细胞可采用本领域技术人员常用的针对Insm2蛋白质或RNA的方法，如特异性抗Insm2抗体作组织化学染色或与Insm2核苷酸的互补链结合再与化学标记物如荧光标记，同位素标记等连接。

本实施例所述识别内分泌干细胞或前体细胞的方法，包括以下步骤：

(a)用Insm₂特异检测试剂接触待识别的细胞；所述检测试剂含有抗Insm₂抗体或一种与Insm₂的mRNA互补的核苷酸；

(b)检测Insm₂的表达

(c)发现Insm₂的出现即为识别出所检出的细胞为内分泌干细胞或前体细胞。

上述纯化胰腺内分泌细胞的方法和识别内分泌干细胞或前体细胞的方法中的检测试剂和检测手段可用本领域的技术人员根据目前现有的技术而实现，也可以参考前述实施例的方法。

本实施例所述识别小分子化合物(例如高通量筛查库中的某些小分子化合物)的方法，该小分子化合物可调节内分泌细胞功能或启动内分泌细胞增殖，该方法包括常规高通量筛查中的各个步骤如与Insm₂阳性细胞接触的化合物，以及测量该化合物对内分泌细胞功能影响。这些化合物的也可通过候选的小分子化合物等检测试验来实现。

本实施例所述识别Insm₂活性调节因子的方法，该方法包括与纯化的Insm₂接触的一组试验的化合物，选择与Insm₂特异结合的小分子化合物，和测验所选的化合物对内分泌细胞功能的影响。

本实施例所述在个体中产生内分泌细胞的方法，该方法包括对该个体使用有效剂量的化合物或调控Insm₂的表达。该化合物可选择性地调控Insm₂的表达。

以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

Claims (8)

1.一种纯化胰腺内分泌细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(a)选择待纯化分类的候选细胞群；

(b)用检测试剂检测上述细胞群中Insm₂表达阳性的细胞；

(c)分离出Insm₂表达阳性的细胞，纯化，得到胰腺内分泌干细胞。

2.根据权利要求1所述纯化胰腺内分泌细胞的方法，步骤(b)所述的检测试剂包括有抗Insm₂抗体或Insm₂的mRNA的互补核苷酸。

3.一种识别内分泌干细胞或前体细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)用Insm₂特异检测试剂接触待识别的细胞；

(b)检测Insm₂的表达；

(c)发现Insm₂的出现即为识别出所检出的细胞为内分泌干细胞或前体细胞。

4.根据权利要求3所述识别内分泌干细胞或前体细胞的方法，其特征在于，所述检测试剂含有抗Insm₂抗体或一种与Insm₂的mRNA互补的核苷酸。

5.一种识别小分子化合物的方法，该小分子化合物可调节内分泌细胞功能或启动内分泌细胞增殖，其特征在于，该方法包括：小分子化合物与Insm₂阳性细胞接触，以及测量该化合物对Insm₂阳性细胞功能影响。

6.一种识别Ins m₂活性调节因子的方法，其特征在于，该方法包括与纯化的Insm₂接触的一组试验的化合物，选择与Insm₂特异结合的小分子化合物，和检测所选的化合物对内分泌细胞功能的影响。

7.一种在个体中产生内分泌细胞的方法，其特征在于，该方法包括对该个体使用有效剂量的化合物或调控Insm₂的表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，该化合物可选择性地调控nsm2的表达。

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