KR101966684B1 - Susd2 단백질의 마커로서의 용도 - Google Patents

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Abstract

마커로 되는 SUSD2단백질의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 마커로 되는 SUSD2단백질의 췌장 내분비 전구세포 및/또는 신생한 췌장 내분비세포의 동정, 스크리닝 혹은 분리 과정에서의 응용; 및 상기 SUSD2단백질의 전구 단백질을 코딩하는 mRNA를 마커로써 췌장 내분비 전구세포 및/또는 신생한 췌장 내분비세포의 동정 과정에서의 응용에 관한 것이다. 인간 다능성 줄기세포를 정향 분화하여 얻은 췌장 내배엽세포의 유전자 발현에 대한 분석을 통해, SUSD2유전자가 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 췌장 내분비세포에서 풍부하게 발현하는 것을 발견하였고, 이가 코딩한 단백질은 세포막에 있는 수용체 단백질이고, 상기 단백질을 마커로 하면 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 췌장 내분비세포를 동정, 스크리닝 혹은 분리해낼 수 있으므로, 각 발육 단계의 췌장 관련 세포를 연구함에 있어서 중요한 의의가 있다.

Description

SUSD2 단백질의 마커로서의 용도{USE OF SUSD2 PROTEIN AS MARKER}
본 발명은 생물 기술분야에 관한 것이고, 구체적으로 SUSD2 단백질의 마커로서의 용도에 관한 것이다.
인간 다능성 줄기세포(Human pluripotent stem cells) 유래의 췌장 beta세포는 당뇨병, 특히는 I형 당뇨병의 세포대체치료를 위해 충족한 공여 섬세포(donor islet cells)를 공급할 수 있다. 또한, 인간 다능성 줄기세포에서 췌장 beta세포로의 정향 유도분화(directed differentiation)는 인간 췌장 발육 과정을 연구하는데 있어서의 일종 생생체외 연구 모델을 제공할 수 있다. 생체내에서의 발육 과정을 모방하면, 인간 다능성 줄기세포에서 췌장 beta세포로의 정향 유도분화는 주로 완전 내배엽(definitive endoderm), 창자관, 앞창자 뒤부분, 췌장 내배엽 및 췌장 내분비세포와 같은 여러 단계를 포함한다. 그중, 췌장 내배엽 단계의 세포는 혼합 세포(mixed cell)이며, 일반적으로 췌장 전구세포, 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 췌장 내분비세포 등을 포함한다. 현재는 주로 췌장 발육에 관련된 유전자의 발현을 통해 세포 운명을 확정한다. 췌장 전구세포는 주로 관련된 유전자, 예를 들면 PDX1、HNF1B、SOX9、NKX6.1、HNF6 등 유전자의 발현을 통해 확정된다. 췌장 내분비 전구세포의 하나의 가장 주요한 표지유전자는 NGN3이지만, 이의 일과성 발현특징으로 인해, 일반적으로 이의 하류 유전자, 예를 들면 NKX2.2, NEUROD1 등 유전자가 발현되고, 또한 크로모그라닌 A (CHROMOGRANIN　A)、인슐린 (INSULIN)、글루카곤 (GLUCAGON) 등 내분비에 관련된 유전자가 발현되지 않는 것을 결합하여 췌장 내분비 전구세포 운명을 확정한다. 비록 이러한 표지유전자의 발현은 특정된 세포의 운명을 확정할 수 있지만, 이들 모두가 전사인자 혹은 분비단백질 등 이므로, 일반적으로 세포질 혹은 세포내핵에 위치하기에, 이러한 단백질의 발현을 통해 특정된 종류의 세포군, 특별히 인간 췌장 내분비 전구세포와 신생한 췌장 내분비세포를 분리정제하여, 분자특정에 대하여 더욱 상세한 연구를 할 수 없다.
현재, 인간 다능성 줄기세포로 정향 유도분화를 통해 췌장 전구세포를 얻을 수 있지만, 상기 종류의 세포들은 생체외에서 기능이 성숙된 췌장 beta세포로의 분화효율은 아주 낮다. 비록, 인간 다능성 줄기세포 유래의 췌장 전구세포를 면역력이 결핍한 마우스의 생체내로 이식하면, 기능이 성숙된 섬세포를 얻을 수 있지만, 췌장 전구세포는 일정한 증식능력을 구비하기에, 발암성으로 하여 임상응용에서 이의 사용을 제한하고 있다. 췌장 전구세포에 비하여, 기능이 성숙된 췌장 beta세포는 더욱 이상적인 공여세포로 될 수 있다. 하지만, 어떻게 생체외에서 췌장 전구세포를 유도분화하여 기능이 성숙된 췌장 beta세포로 되게하는 것은 당뇨병 세포대체치료 방안의 실현을 크게 제한정하고 있다. 또한 췌장 전구세포가 췌장 beta세포로 분화되는 과정에서, 정확한 췌장 내분비 전구세포의 고효율적인 유도분화의 실현은 제일 중요한 단계이다. 마우스 등 모델동물에 대한 연구를 통해, 췌장 beta세포의 발육 과정에 대한 이해를 대폭 추진하였으며, 이러한 연구는 생체외 췌장 beta세포의 정향분화의 연구에 대하여 결정적인 작용을 한다. 그럼에도 불구하고, 췌장 내분비 전구세포 운명의 특정화, 부동한 내분비세포 사이의 운명 선택에 대한 연구는 아직도 적은 편이다. 또한, 사람과 마우스 등 모델동물 사이에는 일정한 종간차이(species differences)가 있으므로, 만약 관련 분자표지를 찾아, 직접 특정된 발육 단계에 있는 췌장과 관련된 세포를 분리하는 것에 대하여 연구하면, 생체외에서 기능이 성숙된 췌장 beta세포를 얻을 수 있는 진도는 더욱 빨라질 것이다.
본 발명의 목적은 측정하려는 세포군에서 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포의 분리 혹은 보조 분리(assisting the sorting of pancreatic endocrine progenitor cells or nascent pancreatic endocrine cells) 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 제공한는 방법은 아래와 같은 단계를 포함한다: 검측하려는 세포군 중의 세포의 SUSD2유전자 발현 여부를 검측하고, 만일 일부 세포가 SUSD2유전자를 발현하였으면, 상기 일부 세포는 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포이거나 후보에 속하고; 만일 일부 세포가 SUSD2유전자를 발현하지 않았으면, 상기 일부 세포는 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포가 아니거나 후보에 속하지 않는다.
상기 SUSD2유전자의 뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence)은 서열표 중 서열번호 2 이다.
상기 방법 중, 상기 검측하려는 세포군 중의 세포의 SUSD2유전자 발현 여부는, 검측하려는 세포군 중의 세포에 SUSD2유전자가 발현된 단백질을 포함하고 있는지를 통해 검측하며, 상기 검측하려는 세포군 중의 세포에 SUSD2유전자가 발현된 단백질을 포함하는지를 검측하는 방법은:
1) 항SUSD2 단일 클론 항체를 항체로 사용한 면역형광항체법으로 검측하고;
2) 항SUSD2 단일 클론 항체를 항체로 사용한 유세포분석으로 검측하며;
3) 항SUSD2 단일 클론 항체를 항체로 사용한 자성비드 분리로 검측한다.
상기 방법 중, 상기 검측하려는 세포는 췌장 내배엽세포이다.
상기 방법 중, 상기 췌장 내배엽세포는 인간 기원인 췌장 내배엽세포이다.
본 발명의 다른 목적은 췌장 내배엽 세포의 유전자 발현에 대한 분석을 통해, SUSD2유전자는 췌장 분비 전구세포 및 신생한 분비세포에서 대량 발현하며, 즉 상기 유전자가 발현한 SUSD2 단백질은 양자의 분자표지(marker)이다.
상기 발견에 기반하여, 본 발명은 SUSD2단백질을 마커로써 췌장 내분비 전구세포 및/또는 신생한 췌장 내분비 세포의 동정, 스크리닝 혹은 분리(sorting)에서의 응용을 제공하며, 상기 SUSD2단백질의 아미노산서열은 서열번호 1이다.
상기 SUSD2단백질이 NCBI에서의 등록번호는 (NCBI　Reference　Sequence): NP_062547.1이다.
상기 신생한 췌장 내분비 세포는: 인간 다능성 줄기세포에서 췌장 beta세포를 향해 정향 유도분화하는 과정중, 생성된 한개 군의 호르몬 (Insulin, Glucagon, Ghrelin, Pancreatic　Polypeptide, Somatostatin 등을 포함하고) 양성 세포이며, 해당 세포는 일반적으로 많은 호르몬이 공동으로 발현되는 것으로, 성숙된 췌장 내분비 세포와 비교하면 기능이 성숙되지 않았다. 체내에서 발육 과정 중, 상기 신생한 췌장 내분비 세포는 주로 배아 발육 시기의 기능이 성숙되지 않은 췌장 내분비 세포를 의미한다.
본 발명은 SUSD2단백질과 특이적 결합하는 항체의, 췌장 내분비 전구세포 및/또는 신생한 췌장 내분비세포의 동정, 스크리닝 혹인 분리 시약(reagents) 제조에서의 응용을 제공하였다.
상기 SUSD2단백질은 유전자SUSD2가 발현한 단백질이고, 이는 전사인자가 아니고, 분비 단백질도 아니며, 세포막에 위치하는 수용체 단백질이다.
면역형광항체법을 통해 검측하려는 세포가 SUSD2단백질 포함 여부를 검측하여, 검측하려는 세포가 췌장 분비 전구세포 혹은 신생한 췌장 내분비 세포인지를 확인한다.
상기 항체는 완전한 항체분자, 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 이중 특이성 항체, 항체중쇄, 항체경쇄, 중쇄와 경쇄의 호모다이머(homodimer)와 헤테로다이머(heterodimer), 및 항원결합조각과 유도체일 수 있다. 완전한 항체분자는 다클론항체 혹은 단일 클론 항체일 수 있으며, 바람직하게는 단일 클론 항체이다.
상기 언급한 바와 같이, 일반적으로 면역형광항체법을 통해 SUSD2단백질을 검측할 수 있으며, 상기 항체 혹은 해당 항체에 대한 2차항체는 상응되는 형광표지를 구비하여야 한다.
상기 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 췌장 내분비 세포는 췌장 내배엽 세포 중 한개 군의 세포를 의미하며, 적당한 조건에서 기능이 성숙된 췌장 내분비 세포를 생성할 수 있다.
상기 인간 췌장 내배엽 세포는 주로 인간 다능성 줄기세포가 췌장 beta세포로 정향 유도분화하는 과정중 췌장 내배엽 단계의 세포, 혹은 새롭게 분리되고 이체 배양한 상응한 발육단계의 인간 배아 췌장조직 세포를 의미하며, 주요하게는 췌장 전구세포, 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 췌장 내분비 세포를 포함한다. 본 발명의 주요한 목적은 췌장 내배엽 세포군 중에서 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 췌장 내분비세포를 스크리닝 혹은 분리하는 것이다.
상기 췌장 내배엽 세포의 출처는: 1. 인간 다능성 줄기세포를 정향 유도분화시켜 얻는 것; 2. 분리된 인간 배아 췌장조직에서 얻는 것; 3.분리된 인간 배아 췌장 내배엽세포를 생체외에서 배양한 후의 세포에서 얻는 것을 포함한다.
상기 스크리닝 혹은 분리하는 방법으로는 주로 면역 자성비드 분리법(immunomagnetic beads separation method) 유세포분리법(flow cytometry sorting method)을 사용한다.
SUSD2유전자의 발현과정에서 우선 mRNA로 전사되고, 다음 SUSD2단백질 전구 단백질로 번역되고, 재차 가공을 거쳐 성숙된 SUSD2단백질을 생성한다.
상기 이유에 기반하여, 본 발명은 SUSD2단백질의 전구 단백질을 코딩하는 mRNA를 마커로 하여, 췌장 내분비 전구세포 및/또는 신생한 췌장 내분비세포 식별(identification)에서의 응용을 제공한다.
또한, 본 발명은 mRNA과 특이적으로 결합을 하는 프라이머, 탐침(probe) 혹은 이들의 상보적 사슬의, 췌장 내분비 전구세포 및/또는 신생한 내분비세포 동정 시약의 제조에서의 응용을 제공한다.
상기 프라이머는 총 mRNA를 증폭하는 프라이머, 혹은 mRNA의 특정구역을 증폭하는 프라이머일 수 있으며, 상기 탐침은 mRNA 특정 구역을 식별하는 뉴클레오티드(nucleotide)이며, 일반적으로 표지를 구비한다.
실시예의 기재에 따르면, 본 발명은 상기 mRNA를 증폭하는 한쌍의 구체적인 프라이머를 제공하였으며, 아래와 같다:
순방향 프라이머(upstream primer): GGCACCGCCAACACCTCA
역방향 프라이머(downstream primer): GCGTGGGCAGCGACTTGA
상기 동정 방법은 형광정량PCR를 사용할 수 있다.
본 발명은 내배엽 세포의 유전자 발현을 분석하여, SUSD2유전자가 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 췌장 내분비세포에서 대량 발현되고, 또한 이가 코딩한 단백질은 세포막에 있는 수용체 단백질이며, 상기 단백질을 마커로 하여 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 췌장 내분비세포를 동정(identification), 스크리닝(screening) 혹은 분리(sorting)할 수 있으며, 각 발육 단계의 췌장관련세포에 대한 연구에 중요한 의미가 있다.
도 1은 인간 다능성 줄기세포가 직접 분화되어 췌장 내배엽 세포를 형성하는 것을 나타낸다. (a)는 인간 다능성 줄기세포가 췌장 beta세포로 정향 유도분화 되는 것을 나타낸 개략도이고; (b)는 면역형광염색법으로 분화의 제4단계의 말단에서 췌장 내배엽 관련 단백질 및 NGN3 유전자를 마크한 녹색형광 단백질(EGFP)의 발현을 검측하는 것을 나타내는 염색도이다.
도 2는 유세포분석법(flow cytometry)으로 췌장 내배엽 중의 NGN3-EGFP+ 세포가 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포인 것을 동정한 결과도이다. (a)는 유세포분석법으로 췌장 내배엽세포 중의 NGN3-EGFP, NGN3, NKX2.2, NEUROD1 및 CHROMOGRANIN　A(CHGA) 등 췌장 내분비 관련 단백질의 발현을 검측한 것을 나타내고; (b)는 유세포분석법으로 췌장 내배엽 세포 중의 NGN3-EGFP와 췌장 전구세포 표지 단백질 PDX1의 발현을 검측한 것이며, 이는 췌장 전구세포 관련 단백질 PDX1는 NGN3-EGFP+ 세포에서 낮게 발현되거나, 또는 발현되지 않는 것을 나타낸다.
도 3은 mRNA 서열 분석으로, 분리하여 얻은 NGN3-EGFP+세포, NGN3-EGFP-세포 중의 췌장 관련 유전자의 발현 상황을 분석한 것이고, NGN3-EGFP+의 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 내분비 세포군은 췌장 내분비 관련 유전자를 대량 발현하는것을 나타낸다.
도 4는 면역형광염색법으로 SUSD2와 NGN3-EGFP가 공동 염색된 상황을 검측하여, SUSD2로 인간 다능성 줄기세포로부터 분화된 NGN3-EGFP+세포를 마크할 수 있음을 의미한다.
도 5는 유세포분석법으로 인간 다능성 줄기세포 유래의 췌장 내배엽 세포 중 SUSD2 및 췌장 발육 관련 단백질의 발현 정황을 검측하는 분석도 이며, 이는 SUSD2가 생체외에서 분화시켜 얻은 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 내분비세포를 마크할 수 있다는 것을 설명한다. (a)는 유세포분석법으로 췌장 내배엽 세포 중의 SUSD2 및 췌장 내분비 관련 단백질 NGN3, NKX2.2, NEUROD1, CHROMOGRANIN　A(CHGA) 등 발현 정황을 검측한 것을 타나내고; (b)는 유세포분석법으로 췌장 내배엽 세포 중 SUSD2와 췌장 전구세포 관련 단백질 PDX1의 발현을 검측한 것을 나타낸다.
도 6은 RT-QPCR으로 유세포 분석법(flow cytometry)을 통해 얻은 SUSD2+ 세포, SUSD2- 세포 및 분리하지 않은 췌장 내배엽 세포 중 췌장 발육 관련 유전자의 발현 정황을 동정한 것이고, SUSD2+ 세포는 췌장 내분비 전구세포 관련 유전자 및 췌장 내분비 세포 관련 유전자를 상대적으로 대량 발현하고, 췌장 전구세포 관련 유전자를 상대적으로 소량 발현하는 것으로 나타내므로, SUSD2는 췌장 내분비 전구세포 및/또는 신생한 내분비 세포를 마크한다는 것을 증명하였다.
도 7은 SUSD2 항체를 자성비드 세포분리에 이용함으로써 췌장 내분비 전구 세포 및 신생한 췌장 내분비 세포를 부유하게 한 것을 나타낸다. (a)유세포 분석으로, SUSD2항체로 생체외에서 분화시켜 얻은 췌장 내배엽세포를 자성비드 세포분리하여 부유한 SUSD2+세포와 SUSD2-세포 중 췌장 내분비 전구세포 및 췌장 내분비 세포의 표지 단백질 NKX2.2의 발현을 검측하였으며, SUSD2항체를 자성비드 세포분리에 이용함으로써 고효율적으로 NKX2.2+ 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 췌장 내분비세포를 부유할 수 있음을 나타낸다. (b) 자성비드 세포분리로 분리된 SUSD2+세포, SUSD2-세포 및 분리하지 않은 췌장 내배엽세포를 연장하여 배양한 후, 면역조직화학법으로 췌장 전구세포 및 췌장 내분비세포 관련 단백질의 발현을 검측한 결과, SUSD2+세포는 내분비 세포를 대량으로 생성할 수 있다는 것을 나타내며, 따라서 이는 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비 세포임 것을 증명하였다. (c)자성비드 세포분리로 분리된 SUSD2+세포, SUSD2-세포를 면역 결핍 마우스(immunodeficient mice) 체내에 이식하고, 19주 이후 이식물에 대하여 면역형광염색하여, 췌장 내분비세포 관련 단백질의 발현을 검측하였으며, SUSD2+세포는 다수 종류의 췌장 내분비세포를 생성할 수 있다는 것을 나타내며, SUSD2-세포는 주로 도관형 세포(duct-like cells)를 생성하므로, SUSD2는 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 췌장 내분비세포를 부유할 수 있음 것을 증명하였다.
도 8은 SUSD2는 인간 배아 유래의 췌장 내분비 전구세포 및 신행한 췌장 내분비 세포를 마크할 수 있음을 나타낸다. (a) 면역조직화학으로 배아 췌장 조직(embryonic pancreas tissues) 및 성체 췌장조직(adult pancreas tissues) 중 SUSD2와 췌장 내분비 전구세포 관련 단백질, 췌장 내분비세포 관련 단백질의 공동 발현을 검측하였으며, SUSD2는 배아 췌장조직 중 췌장 내분비 전구세포 혹은 내분비세포에서만 발현된다는 것을 나타낸다. (b) 면역형광으로 배아 췌장조직 중 SUSD2와 췌장 내분비 관련 단백질 및 췌장 도관 단백질의 발현을 검측하는 것을 나타낸다.
도 9는 SUSD2는 인간 배아 유래의 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 췌장 내분비 세포를 부유하게 할 수 있임을 나타낸다.
하기 실시예에서 사용되는 실험방법은 특별한 설명을 하지 않는 한, 모두 통상적인 방법이다. 하기 실시예에서 사용하는 재료, 시약 등은 특별한 설명을 하지 않는 한 모두 상업적으로 얻을 수 있다. SUSD2 유전자는 서열번호 2에서 나타낸 바와 같고, 암호화된 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1 이다.
실시예 1. 췌장 내분비 전구세포의 표지 유전자(marker gene)로 되는 SUSD2의 발견과 응용.
1. 변형된 인간 다능성 줄기세포가 분화하여 얻은 췌장 내분비 전구세포의 표지 유전자인 SUSD2
1.1 췌장 내배엽 세포의 획득
EGFP 유전자(NC_013179.1(3313..4126))를 이체한 인간 다능성 줄기세포계 H1(WiCell　Research　Institute, NIH No.: Wa01)에 상동 재조합함으로써(Ngn3　contig No.: NT_030059.13이며, Chromosome　10에 위치하고, 좌측 상동성 암(homologous arm)이 게놈에서의 위치는: 71325654-71332154이며; 우측 상동성 암이 게놈에서의 위치는: 71332158-71467568), 변형된 세포인 인간 다능성 줄기세포계 NGN3-EGFP를 얻는다. 이를 15％-20％로 세포배양액 I에 접종하여 1일 배양한 후; 직접 세포배양액 II로 교환하여 1~2일 배양한 후; 다시 세포배양액 III으로 교환하여 1일 배양한 후; 계속하여 직접 세포배양액 IV으로 교환하여 2일 배양한 후; 직접 세포배양액 V으로 교환하여 1일 배양한 후; 직접 세포배양액 VI으로 교환하여 3일 배양한 후; 직접 세포배양액 VII으로 교환하여 4일 배양한 후; 직접 세포배양액 VIII으로 교환하여 4~6일 배양한 후; 직접 세포배양액 IX으로 교환하여 4~6일 배양하여 췌장 내배엽 세포를 얻는다.
면역형광항체법으로 해당 단계의 세포군 중 췌장 내배엽 관련 다수 개의 마커전사인자(marker transcription factors)의 발현정황을 검측한다.
NKX2.2를 검측하는 항체는 마우스 유래의 단일 클론 항체(monoclonal antibody)(상기 항체는 DSHB로 부터 구매, Catalog No. 74.5A5)이고; PDX1을 검측하는 항체는 염소 유래의 다클론항체(polyclonal antibody)(상기 항체는 R&D　Systems로 부터 구매, Catalog No. AF2419)이며; EGFP를 검측하는 항체는 닭 유래의 다클론항체(상기 항체는 Abcam로 부터 구매, Catalog No. AB13970)이고; NGN3을 검측하는 항체는 양 유래의 다클론항체(상기 항체는 R&D　System로 부터 구매, Catalog No. AF3444)이다.
모든 항체는 직접표지항체가 아니며(non-directly labeled antibody), 검측 과정에서 각각 Jackson　Immuno Research회사로 부터 구매한 항체로 대조염색(counterstaining)을 진행한다: Alexa　Fluor　488 로 표지된 나귀 유래의 항염소 다클론항체(Catalog No. 705-545-147); Cyanine　Cy3으로 표지된 나귀 유래의 항염소 다클론항체(Catalog No. 705-165-147); Cyanine　Cy3으로 표지된 나귀 유래의 항양 다클론항체(Catalog No. 715-165-147); Alexa　Fluor　488로 표지된 나귀 유래의 항마우스 다클론항체(Catalog No. 715-545-151); Cyanine　Cy3으로 표지된 나귀 유래의 항마우스 다클론항체(Catalog No. 715-165-151); Alexa　Fluor　488로 표지된 나귀 유래의 항닭 다클론항체(Catalog No.703-545-155)이다.
결과는 도 1에서 도시한 바와 같이, 해당 단계에서 얻은 세포 중, 일부 세포는 췌장전구세포의 표지 단백질(도 1에서의 A)인 PDX1을 발현하고; 기타 부분의 세포는 NGN3-EGFP를 발현하며, 이들은 거의 공동 염색되지 않고(도 1에서의 B); NGN3-EGFP+세포는 췌장 내분비 전구세포 마커전사인자 NGN3 혹은 초기 단계의 내분비 세포 관련 단백질NKX2.2, CHROMOGRANIN A (CHGA) 등을 발현하며(도 1에서의 C와 도 1에서의 D), 이는 얻은 세포는 췌장 내배엽 단계의 세포이며 그중에는 NGN3-EGFP로 표기된 췌장 내분비 전구세포 또는 신생한 내분비 세포가 존재함을 의미한다.
상기 사용한 배양액의 배합방법은 하기와 같다:
세포 배양액 I는 아래와 같은 방법으로 배합하여 얻는다: Essential　8 배지와 Y27632를 혼합하여 세포 배양액 I를 얻고, 그중 Essential　8 배지와 Y27632 배합 비율은 1ml:10μmol이다.
세포배양액 II은 Essential　8 배지이다.
세포배양액 III은 아래와 같은 방법으로 배합하여 얻는다: DMEM/F12 배지, BSA, rmWnt3A 및 ActivinA를 혼합하여 세포배양액 III를 얻고, 그중 DMEM/F12 배지, BSA, rmWnt3A 및 ActivinA의 배합 비율은 1ml:0.1g:25ng:120ng 이다.
세포배양액 IV는 아래와 같은 방법으로 배합하여 얻는다: DMEM/F12 배지, BSA 및 ActivinA를 혼합하여 세포배양액 IV을 얻고, 그중 DMEM/F12 배지, BSA 및 ActivinA의 배합 비율은 1ml:0.1g:120ng 이다.
세포배양액 V는 아래와 같은 방법으로 배합하여 얻는다: DMEM/F12 배지, BSA, ActivinA 및 Wnt-C59를 혼합하여 세포배양액 V을 얻고, 그중 DMEM/F12 배지, BSA , ActivinA 및 Wnt-C59의 배합 비율은 1ml:0.1g:120ng:50nmol 이다.
세포배양액 VI는 아래와 같은 방법으로 배합하여 얻는다: DMEM/F12 배지, B27　supplement　without　VitaminA, KGF 및 SB525334를 혼합하여 세포배양액 VI를 얻고, DMEM/F12 배지, B27　supplement　without　VitaminA, KGF 및 Sb525334는 1ml:10μl:50ng:1μmol이다.
세포배양액 VII 아래와 같은 방법으로 배합하여 얻는다: DMEM-H배지, B27　supplement, 올트랜스레티놀산, NOGGIN 및 SANT-1　를 혼합하여 세포배양액 VII를 얻고, 그중 DMEM-H배지, B27 영양소복합체가(B27　supplement), 올트랜스레티놀산, 노긴(NOGGIN) 및 SANT-1의 배합 비율은 1ml:10μl:2μmol:250ng:0.25μmol이다.
세포배양액 VIII는 아래와 같은 방법으로 배합하여 얻는다: DMEM-H 배지, B27　supplement　without　VitaminA, NOGGIN 및 TPB((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-2,4-pentadienoylamino)benzolactam)를 혼합하여 세포배양액 VIII를 얻고, 그중 DMEM-H 배지, B27　supplement　without　VitaminA, NOGGIN 및 TPB의 배합 비율은 1ml:10μl:250ng:50nmol이다.
세포배양액 IX는 아래와 같은 방법으로 배합하여 얻는다: DMEM-H 배지, B27　supplement without　VitaminA, NOGGIN, 인간 LIF(human　LIF) 및 Alk5　저해제　II (Alk5　inhibitor　II)를 혼합하여 세포배양액 IX를 얻고, 그중 DMEM-H 배지, B27　supplement without　VitaminA, NOGGIN, human　LIF 및 Alk5　inhibitor　II의 배합 비율은 1ml:10μl:250ng:10ng:1μmol이다.
1.2 유세포분석법으로 NGN3-EGFP+ 세포가 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포 여부를 동정.
상기 얻은 췌장 내배엽세포를 BD　FACS　Aria　IIu로 유세포 분석하여 2개의 세포군으로 NGN3-EGFP+(췌장 내분비 전구세포 유래의 세포군을 포함)와 NGN3-EGFP-(췌장 내분비 전구세포 유래의 세포군을 포함하지 않음)를 얻으며, EGFP는 FL1 채널이다.
세포내 유세포 분석을 통해 NGN3-EGFP+ 및 NGN3-EGFP-의 집단 중에 췌장 내분비 전구세포의 다수개 마커전사인자 혹은 단백질의 포함 여부를 검측한다.
NKX2.2를 검측하는 항체는 마우스 유래의 단일 클론 항체(상기 항체는 DSHB로 부터 구매, Catalog No. 74.5A5)이고; NGN3을 검측하는 항체는 양 유래의 다클론항체(상기 항체는 R&D　Systems로 부터 구매, Catalog No. AF3444)와 마우스 유래의 단일 클론 항체(상기 항체는 DSHB로 부터 구매, Catalog No. F25A1B3)이며; NEUROD1을 검측하는 항체는 염소 유래의 다클론항체(상기 항체는 R&D　Systems로 부터 구매, Catalog No. AF2746)이고; PDX1을 검측하는 항체는 염소 유래의 다클론항체(상기 항체는 R&D　Systems로 부터 구매, Catalog No. AF2419)이며; CHROMOGRANIN　A를 검측하는 항체는 토끼 유래의 다클론항체(상기 항체는 ZSGB-BIO로 부터 구매, Catalog No. ZA-0507)이다.
모든 항체는 직접표지항체가 아니며, 검측 과정에서 각각 Jackson　ImmunoResearch회사로 부터 구매한 항체로 대조염색을 진행한다. Alexa　Fluor　488 로 표지된 나귀 유래의 항염소 다클론항체(Catalog No. 705-545-147); Alexa　Fluor　488로 표지된 나귀 유래의 항마우스 다클론항체(Catalog No. 715-545-151); Alexa　Fluor　647로 표지된 나귀 유래의 항마우스 다클론항체(Catalog No. 715-605-151); Alexa　Fluor　488로 표지된 염소 유래의 항마우스 항원 아형1(antigen subtype 1)의 다클론항체 (Catalog No. 115-545-205); Alexa　Fluor　647로 표지된 염소 유래의 항마우스 다클론항체(Catalog No. 115-605-205); Alexa　Fluor　488로 표지된 염소 유래의 항마우스 항원 아형 2b의 다클론항체 (Catalog No. 115-545-207); Alexa　Fluor　647로 표지된 염소 유래의 항마우스 항원 아형 2b의 다클론항체 (Catalog No. 115-605-207); Alexa　Fluor　488 로 표지된 나귀 유래의 항토끼 다클론항체(Catalog No. 711-545-152).
결과는 도 2에서 도시한 바와 같이, NGN3-EGFP+(췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포를 함유)집단에는 NKX2.2, NGN3 및 CHROMOGRANIN　A(CHGA)이 발현하고, 췌장 전구세포 관련 유전자 PDX1는 발현하지 않거나 소량 발현되므로, 상기 세포군은 주로 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포임을 의미한다.
NGN3-EGFP-집단 중에는 NKX2.2, CHROMOGRANIN　A(CHGA) 및 GFP의 발현이 없고, 주로 췌장 전구 관련 전사인자 PDX1을 대량 발현하며, 극소수 부분의 세포가 NGN3 혹은 NEUROD1을 발현하므로, 상기 세포군은 주로 췌장 전구세포 혹은 췌장세포 유형의 세포임을 알 수 있다.
1.3 NGN3-EGFP+세포군의 SUSD2 대량 발현
1) RNA 서열분석은 NGN3-EGFP+세포군에서 SUSD2의 대량 발현을 나타냄
QIAGEN의 RNeay　Plus　Mini　Kit로 상기 2에서 획득한 NGN3-EGFP+세포 및 NGN3-EGFP-세포를 추출하여, 각각 총 mRNA(total mRNA) 2μg을 얻는다. 얻은 mRNA를 정화한 후 역전사(reverse transcription)를 진행하여 단일쇄(single stranded) cDNA를 얻는다. 말단 데옥시뉴클레오티드 전이효소(terminal　deoxynucleotidyl　transferase)를 사용하여 얻은 단일 가닥의 cDNA의 3'말단에 poly　A 테일을 부가하였다. cDNA를 12 PCR주기 증폭시킨 후, Illumina　Paired-End　DNA　Sample　Prep　Kit로 cDNA 라이브러리(cDNA library)를 만들었다. 다음, Illumina　Hiseq2000로 이에 대하여 서열분석한다. Tophat 소프트웨어를 사용하여 서열분석 결과(raw　reads)와 인간 표준게놈(the　human　reference　genome, NCBI　Build　37, hg19)을 비교하고, 매핑 서열(Mapping　reads)과 NCBI의 참조데이터베이스(RefSeq　Genes　hg19)를 통해 정방향 혹은 역방향으로 매칭한 후 전사체(transcriptome)를 재구성 한다. 모든 유전자의 발현 정도(expression abundance)를 계산하고, RPKM로 이를 정규화한 후, 하기 표준에 근거하여 어느 하나의 유전자가 NGN3-EGFP+와 NGN3-EGFP-세포 사이에서의 차등 발현의 유의성을 판단한다: 1) 발현 배수 관계(fold　change of expression)는 2보다 크거나 혹은 0.5보다 작고; 2) P의 값은 0.05보다 작다. R소프트웨어의 히트맵 패키지(heatmap　package)로 획득한 데이터를 RPKM에 기반하여 log10으로 히트맵 분석을 진행한다. 차등 유전자 발현(Differential　Gene　Expression, DGE)을 이용하여 GO분석을 진행한다.
결과는 도 3에서 도시한 바와 같이, NGN3-EGFP-세포에 대비하여, NGN3-EGFP+세포는 췌장 내분비 관련 유전자 NGN3, NEUROD1, NKX2.2, PAX4, ARX 등을 대량 발현하였고, 췌장 전구세포 관련 유전자 PDX1, HNF1B, HNF6 등을 소량 발현하였으며, 이는 분리하여 얻은 NGN3-EGFP+세포는 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 내분비 세포임을 설명한다.
또한 NGN3-EGFP+세포는 SUSD2(NR02212)를 대량 발현하였고, 발현 배수 관계는 2.30이다. 즉 mRNA 수준으로부터 SUSD2 유전자(서열번호 2)는 측정할 세포가 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비 세포가 맞는지를 식별하는 마커로 될 수 있음을 의미한다. 다음 단계에서는 SUSD2 유전자가 발현한 단백질도 동일한 경우 인지를 확인한다.
2) 면역형광항체법으로 SUSD2가 NGN3-EGFP+세포군을 표지할 수 있음에 대한 검증.
상기 2에서 획득한 NGN3-EGFP+세포 및 NGN3-EGFP-세포에 대하여 면역형광항체법으로 EGFP 및 SUSD2의 발현을 검측한다.
EGFP을 검측하는 항체는 닭 유래의 다클론항체(상기 항체는 Abcam로 부터 구매, Catalog No. AB13970); SUSD2를 검측하는 항체는 마우스 유래의 단일 클론 항체(상기 항체는 BioLegend로 부터 구매, Catalog No. 327401)이다.
모든 항체는 직접표지항체가 아니며 검측 과정에서 각각 Jackson　ImmunoResearch회사로 부터 구매한 항체로 대조염색한다. Cyanine　Cy3으로 표지된 나귀 유래의 항마우스 다클론항체(Catalog No. 715-165-151); Alexa　Fluor　488로 표지된 나귀 유래의 항닭 다클론항체(Catalog No. 703-545-155)이다.
결과는 도 4에서 도시한 바와 같이, 면역조직화학 결과에 의하면, SUSD2의 발현은 NGN3-EGFP과 완전히 일치하고, NGN3-EGFP-세포 중에서는 발현되지 않으며, 즉 NGN3-EGFP+세포 중에서는 대량 발현하였다. 이는 SUSD2로 NGN3-EGFP+세포, 즉 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 췌장 내분비세포로 조성된 혼합 세포군을 식별 혹은 표지할 수 있음을 설명한다.
2. 인간 다능성 줄기세포를 분화시켜 얻은 췌장 내분비 전구세포의 표지 유전자인 SUSD2.
2.1 췌장 내배엽 세포의 획득
이체한 인간 다능성 줄기세포계 NGN3-EGFP 를 방법 1.1에 따라 분화시켜 췌장 내배엽 세포를 얻는다.
2.2 유세포분석법으로 SUSD2 유전자의 발현 및 췌장 내분비 전구세포 표지 유전자 NKX2.2와 NEUROD1의 발현을 검측
상기 2.1에서 얻은 췌장 내배엽 세포를 유세포분석법을 통해 SUSD2 유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현을 검측하되, BD　Biosciences로 부터 구매한 세포 고정/투과성 키트(cell immobilization/permeabilization kit)(Catalog No. 554714)에 따라 진행하며, 상기 2.1에서 얻은 췌장 내배엽 세포를 고정(immobilizing)한 후, 상응하는 항체와 SUSD2 직접표지항체(마우스 유래의 PE로 표지된 항SUSD2의 단일 클론 항체(BioLegend로 부터 구매, Catalog No. 327406) 및 마우스 유래의 APC로 표지된 단일 클론 항체(BioLegend로 부터 구매, Catalog No. 327408))를 사용한다. 마우스 유래의 표지되지 않은 단일 클론 항체(BioLegend로 부터 구매, Catalog No. 327401)로 염색을 하고, 이 후 형광 2차항체(fluorescent secondary antibody)로 대조염색을 진행한다. 다음 유세포 분류기(flow sorter)로 분석을 진행한다.
NKX2.2를 검측하는 항체는 마우스 유래의 단일 클론 항체(상기 항체는 DSHB로 부터 구매, Catalog No. 74.5A5)이고; NGN3을 검측하는 항체는 양 유래의 다클론항체(상기 항체는 R&D　Systems로 부터 구매, Catalog No. AF3444)와 마우스 유래의 단일 클론 항체(상기 항체는 DSHB로 부터 구매, Catalog No. F25A1B3)이며; NEUROD1을 검측하는 항체는 염소 유래의 다클론항체(상기 항체는 R&D　Systems로 부터 구매, Catalog No. AF2746)이고; PDX1을 검측하는 항체는 염소 유래의 다클론항체(상기 항체는 R&D　Systems로 부터 구매, Catalog No. AF2419)이며; CHROMOGRANIN　A를 검측하는 항체는 토끼 유래의 다클론항체(상기 항체는 ZSGB-BIO로 부터 구매, Catalog No. ZA-0507)이다.
2차항체는 Jackson　ImmunoResearch회사로 부터 구매한 것이며: Alexa　Fluor　488로 표지된 나귀 유래의 항염소 다클론항체(Catalog No. 705-545-147); Alexa　Fluor　488로 표지된 염소 유래의 항마우스 항원 아형2b의 다클론항체 (Catalog No. 115-545-207); Alexa　Fluor　647로 표지된 염소 유래의 항마우스 항원 아형2b의 다클론항체 (Catalog No. 115-605-207); Alexa　Fluor　488 로 표지된 나귀 유래의 항토끼 다클론항체(Catalog No. 711-545-152); Alexa　Fluor　488 로 표지된 나귀 유래의 항닭 다클론항체(Catalog No. 703-545-155)이다.
결과는 도 5에서 도시한 바와 같이, 제4단계에서 0번째 날일 경우, NGN3 양성 혹은 저양성 세포는 SUSD2 혹은 NEUROD1를 발현하지 않으며, NKX2.2은 저발현 된다. 제4단계에서 첫번째 날일 경우, 각각 80％, 93％ 및 88％의 SUSD2+세포가 NGN3, NKX2.2 및 NEUROD1를 발현한다. 이는 대부분의 SUSD2+세포가 동시에 NGN3, NKX2.2 및 NEUROD1를 발현한다는 것을 의미하며, 상기 SUSD2+세포군은 내분비 전구세포의 특징을 구비한다는 것을 설명한다. 제4단계의 네번째 날일 경우, 대부분 SUSD2+세포는 NKX2.2 혹은 CHROMOGRANIN　A(CHGA)를 발현하지만, NGN3은 발현하지 않는다. 이는 이시기 내에 상기 SUSD2+/NGN3-세포군은 내분비세포의 특징을 구비한다는 것을 설명한다. 이외 SUSD2+세포는 지속적으로 췌장 전구의 표지 PDX1을 저발현 혹은 발현하지 않는다. 이는 SUSD2는 췌장 내분비 전구세포 및 후대 내분비세포를 표지하는데 사용할 수 있다는 것을 설명한다.
전체 분화 과정에서, 일부 SUSD2-세포는 췌장 내분비 관련 단백질 NGN3,　NKX2.2 등을 발현할 수 있지만, 대부분의 SUSD2-세포는 이러한 췌장 내분비 관련 단백질을 발현하지 않으며, 췌장 전구세포 관련 단백질 PDX1을 발현한다. 이는 SUSD2-세포는 주로 췌장 전구세포 혹은 비췌장 세포유형의 세포를 포함하고 있음을 설명한다(도면 5).
상기 결과는 SUSD2+세포는 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 췌장 내분비 세포인 것을 의미하며, 나아가 SUSD2 유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현은 세포가 표적 세포(target cells)가 맞는지를 식별할 수 있다.
2.3 SUSD2+세포의 mRNA 수준에서 유세포분석법을 통해 얻은 SUSD2-세포 및 SUSD2+세포를 검측하되, 정량 PCR 기술로 상기 2개 군의 세포 및 분리하지 않은 췌장 내배엽 세포의 유전자 발현 정황을 분석한다. PowerMaster　Mix 키트를 사용하여 정량 PCR(Life　Technologies로 부터 구매, Catalog No. 4367659)를 진행하고, 증폭에 사용된 프라이머는 표 1을 참조하고, 내부 표준 물질 프라이머(Internal control primers)는 GAPDH이고, 구체적인 조작절차는 명세서를 참조하면 된다.
표 1은 증폭 프라이머이다.
Gene 5'-프라이머 3'-프라이머
HHEX ACCTCTACTCTGGAGCCCCTTCT ATCTCACCTGGCCGCCTTT
WNT3 ACAAGCACAACAACGAGGCG GAGGTGCATGTGGTCCAGGATAG
MIXL1 CCGAGTCCAGGATCCAGGTA CTCTGACGCCGAGACTTGG
MEOX1 GCGATGACTACGGGGTGCTT TTCTCCGCCTGGATGATTTC
GAPDH TGCACCACCAACTGCTTAGC GGCATGGACTGTGGTCATGAG
OCT4 CCGAAAGAGAAAGCGAACCAG ATGTGGCTGATCTGCTGCAGT
SOX17 GCATGACTCCGGTGTGAATCT TCACACGTCAGGATAGTTGCAGT
T GATGATCGTGACCAAGAACGG CCACGAAGTCCAGCAGGAA
FOXA2 CTGAGCGAGATCTACCAGTGGA CAGTCGTTGAAGGAGAGCGAGT
CXCR4 CCATCGTCCACGCCACCAAC ACGCCAACATAGACCACCTT
CER1 TGAAGTACATTGGGAGACCTGC CACAGCCTTCGTGGGTTATAGT
BRAX1 CACGCCGGACAGAATAGATC GGTACCACGTCTTCACCTGCAAC
CDX2 CTGGAGCTGGAGAAGGAGTTTC ATTTTAACCTGCCTCTCAGAGAGC
AFP CCCGAACTTTCCAAGCCATA TACATGGGCCACATCCAGG
SOX2 CCATGACCAGCTCGCAGAC GGACTTGACCACCGAACCC
HNF1B GCACCTCTCCCAGCATCTCA GTCGGAGGATCTCTCGTTGC
HNF4A ACTACATCAACGACCGCCAGT ATCTGCTCGATCATCTGCCAG
HNF6 TGTGGAAGTGGCTGCAGGA TGTGAAGACCAACCTGGGCT
HB9 GCTCATGCTCACCGAGACCC TTTGCTGCGTTTCCATTTCATC
NKX61 GGGCTCGTTTGGCCTATTCGTT CCACTTGGTCCGGCGGTTCT
PDX1 CGGAACTTTCTATTTAGGATGTGG AAGATGTGAAGGTCATACTGGCTC
CAP1 CTCGGAAGATTTGGCACTGACTAT CGTGGTGGGCATTGTGGAGATA
PTF1A GAAGGTCATCATCTGCCATCG GGCCATAATCAGGGTCGCT
SOX9 CTGAGCTCGGCGTTGTG AAAGGCTACGACTGGACG
NOD1 ATTGCACCAGCCCTTCCTTTGAT ACTCGGCGGACGGTTCGTGTTT
NGN3 GGCTGTGGGTGCTAAGGGTAAG CAGGGAGAAGCAGAAGGAACAA
NKX22 TTCCAGAACCACCGCTACAAG GGGCGTCACCTCCATACCT
PAX6 CGAATTCTGCAGGTGTCCAA ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT
ARX GGAGGCAGAAAGGCACAAAGA GGTGGGGTTAGATAGCGGGTT
PAX4 AGTGTCTCCTCCATCAACCG TGGTGACCTGAGCCGTGT
AMY AGGAGGTAATTGATCTGGGTGG AAGTGCTCTGTCAGAAGGCATG
GCG GAGATTTCCCAGAAGAGGTCG TGGCGGCAAGATTATCAAGAA
GCK CTTCCCTCAGTTTTTCGGTGG TTGATTCCAGCGAGAAAGGTG
INS GCAGCCTTTGTGAACCAACAC CCCCGCACACTAGGTAGAGA
ISL1 ATTTCCCTATGTGTTGGTTGCG CGTTCTTGCTGAAGCCGATG
MAFB CCCGACCGAACAGAAGACA ACTGGGTGCGAGCCGATGAG
SST CGCTGTCCATCGTCCTG GGGCATCATTCTCCGTCTG
GRELIN GAGGCCCCAGCCGACAAGTG AAGCAAGCGAAAAGCCAGAT
PPY AGTGTACCCAGGGGACAATGC CAGCATGTTGATGTATCTACGGA
MAFA CAGAGCCAGGTGGAGCAGC CGTATTTCTCCTTGTACAGGTCCC
CELA2A CATCGTCAGCTTCGGGTCTCGC GAAGACGGAGGGCTTGTGGTAG
CTRB1 CGCCATCCACCCTGTGCTCA GACGGCGTCCTCCCCATTCA
CPA1V2 CCTGGGCTGGGTGGCTATGG GCGGCATCATTCATTTCTTTCA
CHROMOGRANIN A（CHGA） CGCAAACCGCAGACCAGAGGA AGCTCTGCTTCAATGGCCGACA
SUSD2 GGCACCGCCAACACCTCA GCGTGGGCAGCGACTTGA
결과는 도 6에서 도시한 바와같이, SUSD2+세포는 췌장 내분비 전구세포 및 내분비세포관련 유전자를 대량 발현하였고, 즉 NGN3, NEUROD1, NKX2.2, PAX4, ARX 등을 대량 발현하였는데, 이는 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포임을 의미하며, SUSD2-세포는 췌장 전구세포 관련 유전자 PDX1, HNF6, SOX9, PTF1A 등을 대량 발현하고, 이는 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포가 아니라는 것을 의미한다.
3. 자성비드를 이요한 SUSD2 양성세포와 SUSD2 음성세포의 분리(sorting).
3.1 췌장 내배엽 세포의 획득
이체 인간 다능성 줄기세포계 H1을 방법 1.1에 따라 분화시켜 췌장 내배엽세포를 얻는다.
3.2 자성비드를 이용한 분리
자성비드(magnetic beads)를 이용하여 췌장 내배엽세포를 분리하며, 필요한 항체는 SUSD2 직접표지항체(마우스 유래의 PE로 표지된 항SUSD2의 단일 클론 항체이며, BioLegend로 부터 구매하였고, Catalog No. 327406)이고, 자성비드를 이용한 분리에 관련된 시약은 Miltenyi　Biotec로부터 구매하였고, 사용 설명에 따라 SUSD2 양성세포 및 SUSD2 음성세포를 얻는다.
3.3 검측
A. 유세포분석
SUSD2+세포, SUSD2-세포 및 분리하지 않은 세포에 대하여 유세포분석을 진행하며, 검측 방법은 상술한 바와 같다.
결과는 도 7(a)에서 도시한 바와같이, SUSD2+세포는 높은 순도로 NKX2.2+세포가 부유되게 할 수 있고, 상기 세포는 NGN3+의 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포이다(도 7(a)).
B) SUSD2 양성세포로 배양한 후대세포에 대한 면역형광법 동정을 진행한다.
분리하여 얻은 SUSD2+세포, SUSD2-세포 및 분리하지 않은 췌장 내배엽세포에 대하여 생체외에서 연장하여 배양한다. 표적세포를 세포 배양액X에서 재현탁하고, Matrigel 코팅한 세포배양판에 분산하고 하루동안 배양하여 부착되도록 한다. 다음 날, 배지를 제거한 후 PBS로 한번 세척하고, 세포 배양액 XI로 교체하여 계속하여 5일 동안 배양한다. 배양 조건은 37→의 온도 및 5%의 이산화탄소 조건이다.
세포 배양액X는 아래의 방법으로 얻는다: DMEM-H:B27　without　VitaminA:Y27632＝1ml:10μl:10μM.
세포 배양액XI는 아래의 방법으로 얻는다: DMEM-H:B27　without　vitamin　A:Noggin:human　LIF:Alk5　inhibitor　II＝1ml:10μl:250ng:10ng:100nM.
면역조직화학 염색의 진행:
결과는 도 7(b)에서 나타낸 바와같이, SUSD2+로 부터 배양하여 얻은 세포는 대량의 INSULIN+을 생성할 수 있고, 즉 대량의 내분비세포를 얻을 수 있고; SUSD2-로 부터 배양하여 얻은 세포는 주요하게 PDX1+ 췌장 전구세포가 부요되게 하며, 단지 소량의 INSULIN+을 생성한다. 따라서 SUSD2로 부유된 세포는 췌장 내분비 전구세포인 것을 설명한다.
SUSD2로 부유된 세포는 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포임을 설명한다.
C) 면역 결핍 마우스의 신장 낭종(renal cysts) 이식
분리하여 얻은 SUSD2 양성세포, SUSD2 음성세포 및 분리하지 않은 췌장 내배엽세포로 면역 결핍 마우스(6~8주) 신장 낭종 이식을 진행한다. 이식 19주 이후, 이식물을 취하여 동결절편 면역조직 화학염색을 진행한다.
결과는 도 7(c)에서 도시한 바와같이, MACS로 얻은 SUSD2+ 및 SUSD2-를 마우스 생체내에 이식하면, SUSD2+세포는 모든 종류의 내분비세포(INSULIN+의 beta세포, Glucagon+의 alpha세포, SST+의 delta세포, , Ghrelin+의 epsilon세포 및 PPY+의 PPY세포)를 생성할 수 있고, 도관형 구조(duct-like structure)는 생성되지 않으므로, SUSD2+세포는 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포임을 설명한다.
4. SUSD2로 생체내에서 인간배아 유래의 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 내분비세포의 분리.
4.1 인간배아 조직 동결 절편의 면역형광염색
조직절편: 이체 인간배아 췌장 조직을 4％의 PFA로 4℃에서 2시간동안 고정하고, 4℃에서 PBS로 세번 세척하되, 세척 시간은 각각 신속, 10분 및 2시간이다. 다음 조직 덩어리를 30％의 자당용액에 넣고, 4℃조건에서 조직이 침전될때 까지 밤새 지난다. 조직 덩어리를 Optimal　Cutting　Temperature　Compound(O.C.T)(Tissue-Tek)에 포매한 후, 액체 질소로 동결시키고, 동결절편기Cryostat (Leica)를 사용하여 10μm로 절편한다.
상기 절편을 1.1에서의 면역형광항체법으로 검측하면, 그 결과 절편은 췌장 내배엽 단계의 세포이고, SUSD2가 표지한 것은 췌장 내분비 전구세포 및/또는 신생한 췌장 내배엽세포이다(도 8).
4.2 자성비드를 이용한 인간배아 유래의 췌장 내분비 전구세포 및 신생한 내분비세포의 부유.
배아 췌장 조직(fetal pancreatic tissue)을 냉각된 PBS로 두번 세척한 후, 안과용 가위로 1mm3의 조각으로 자른다. 다음 소화액 (PRMI　1640, 100-400　U/ml　Collagenase　IV(Life　Technologies), 1.2　U/ml　Dispase　II(Roche), DNase　I(0.02％, (wt/vol))and　0.5％fetal　bovine　serum(FBS, Hyclone))으로 37℃에서 30분 동안 소화시키고, 5분 간격으로 피펫을 사용하여 부드럽게 세포를 분산되도록 한다. 소화하여 생성된 단세포를 0.5％ FBS를 함유하는 PRMI　1640　으로 옮기고, 0.5％의 BSA 및 2mM의　EDTA를 포함하는 PBS를 사용하여 두번 세척한다. 잔여한 조직 덩어리를 수집하여 상기 단계에 따라 재차 소화를 진행한다. 생성된 세포 현탁액을 40μm의 메쉬(BD　Biosciences)를 통해 여과하여 얻게된 단세포 현탁액은 0.5％의 BSA 및 2mM의　EDTA을 포함하는 PBS에 저장하고, 얼음위에 놓아 다음 분석에 사용한다.
자성비드를 이용하여 상기 단세포 현탁액에 대하여 분리를 진행하며, 필요한 항체는 SUSD2 직접표지항체(마우스 유래의 PE로 표지된 항SUSD2의 단일 클론 항체, BioLegend로 부터 구매, Catalog No. 327406)이며, 이로써 SUSD2 양성세포 및 SUSD2 음성세포를 얻는다.
4.3 형광정량 PCR를 통해 음성세포는 췌장 내분비 전구세포 또는 신생한 내분비세포임을 입증
자성비드를 이용하여 얻은 SUSD2 양성세포, SUSD2 음성세포 및 분리하지 않은 배아 췌장세포에 대하여 정량 PCR를 진행하여 췌장 내배엽세포 관련 유전자의 발현 정황을 검측한다. 구체적인 조작절차는 2.3을 참조.
결과는 도 9에서 도시한 바와같이, SUSD2 양성세포에서는 SUSD2유전자의 발현이 대량 발생하고, 동시에 췌장 내분비 전구세포 및 초기 단계의 내분비세포 관련 유전자 NGN3, NEUROD1, NKX2.2, PAX4, ARX 등의 발현이 대량 발생하며, 췌장 전구세포 관련 유전자 PDX1, HNF6, SOX9, PTF1A, 후기 단계 내분비세포 관련 유전자 INSULIN, GLUCAGON, PAX6, MAFB, MAFA, CHROMOGRANIN　A(CHGA) 및 외분비 관련 유전자 CPA1 등은 소량 발현된다. 이는 SUSD2 양성세포는 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포인 것을 설명한다.
이로부터 알다시피, SUSD2유전자는 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포의 표지유전자로써, 이의 발현 여부를 통해 검측하려는 세포군 중의 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 췌장 내분비세포를 분리 혹은 보조 분리를 진행할 수 있다. 구체적으로는 하기와 같다:
검측하려는 세포군 중의 세포가 SUSD2유전자를 발현하는 지를 검측하고, 만일 일부 세포가 SUSD2유전자를 발현한다면, 상기 일부 세포는 인간 췌장 내분비 전구세포 혹은 호르몬을 분비하지 않는 이의 후대세포이거나, 이의 후보세포(candidates)이며; 만일 일부 세포가 SUSD2유전자를 발현하지 않으면, 상기 일부 세포는 인간 췌장 내분비 전구세포 혹은 호르몬을 분비하지 않는 이의 후대세포가 아니고, 이들의 후보세포에 속하지 않는다.
검측방법은 검측하려는 세포군 중의 세포가 SUSD2유전자가 발현한 단백질을 포함하고 있는지, 구체적으로 SUSD2유전자의 mRNA 수준(mRNA level)의 발현을 정량검측하거나, 혹은 면역형광항체법으로 SUSD2유전자가 발현한 단백질을 검측하거나, 혹은 유세포분석으로 SUSD2유전자가 발현한 단백질을 검측하거나, 혹은 자성비드를 이용하여 SUSD2유전자가 발현한 단백질을 분리하는 것을 통해 검측을 실현한다.
실시예 2. SUSD2유전자의 발현에 기반하여 인간 췌장 내분비 전구세포 혹은 호르몬을 분비하지 않는 이의 후대세포를 분리.
1. 췌장 내배엽 세포의 획득
이체 인간 다능성 줄기세포계를 방법 1.1에 따라 분화시켜 췌장 내배엽세포를 얻는다.
2. 유세포분석으로 SUSD2유전자의 발현을 검측한 인간 췌장 내분비 전구세포 혹은 호르몬을 분비하지 않는 이의 후대세포의 분리.
췌장 내배엽 세포는 유세포분석을 통해 검측되고, 사용한 항체는 SUSD2 직접표지항체(마우스 유래의 PE로 표지된 항SUSD2의 단일 클론 항체, BioLegend로 부터 구매하였고, Catalog No. 327406)이며, 염색한 후, 형광 2차항체를 사용하여 대조염색(counterstaining)한다.
만일 일부 세포가 SUSD2유전자를 발현한다면, 상기 일부 세포는 인간 췌장 내분비 전구세포 혹은 호르몬을 분비하지 않는 이의 후대세포이거나 이의 후보세포이며; 만일 일부 세포가 SUSD2유전자를 발현하지 않으면, 상기 일부 세포는 인간 췌장 내분비 전구세포 혹은 호르몬을 분비하지 않는 이의 후대세포가 아니고, 이들의 후보세포에 속하지 않는다.
분리된 SUSD2+세포는 인간 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 췌장 내분비세포이다.
동시에 SUSD2+세포에 대하여 유세포분석을 진행하여 췌장 내분비 전구세포 표지유전자 NGN3, NKX2.2, NEUROD1의 발현을 검측한다. NKX2.2를 검측하는 항체는 마우스 유래의 단일 클론 항체(상기 항체는 DSHB로 부터 구매하고, Catalog No. 74.5A5)이고; NGN3을 검측하는 항체는 양 유래의 다클론항체(상기 항체는 R&D　System로 부터 구매, Catalog No. Af3444)와 마우스 유래의 단일 클론 항체(상기 항체는 DSHB로 부터 구매하고, Catalog No. F25A1B3)이고; NEUROD1을 검측하는 항체는 염소 유래의 다클론항체(상기 항체는 R&D　Systems로 부터 구매하고, Catalog No. AF2746)이다.
결과적으로 SUSD2+세포는 췌장 내분비 전구세포 표지유전자 NGN3, NKX2.2, NEUROD1를 발현하므로, 확실히 인간 췌장 내분비 전구세포 혹은 호르몬을 분비하지 않는 후대세포인 것을 입증한다. 따라서 본 발명의 방법이 정확하다는 것을 증명한다.
SEQUENCE LISTING <110> PEKING UNIVERSITY; PEKING UNIVERSITY SHENZHEN GRADUATE SCHOOL; BEIJING RUIPU CHENCHUANG TECHNOLOGY CO., LTD <120> Use of SUSD2 Protein as Marker <130> <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 822 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Pro Ala Leu Leu Pro Trp Ala Leu Leu Leu Leu Ala Thr Ala 1 5 10 15 Leu Gly Pro Gly Pro Gly Pro Thr Ala Asp Ala Gln Glu Ser Cys Ser 20 25 30 Met Arg Cys Gly Ala Leu Asp Gly Pro Cys Ser Cys His Pro Thr Cys 35 40 45 Ser Gly Leu Gly Thr Cys Cys Leu Asp Phe Arg Asp Phe Cys Leu Glu 50 55 60 Ile Leu Pro Tyr Ser Gly Ser Met Met Gly Gly Lys Asp Phe Val Val 65 70 75 80 Arg His Phe Lys Met Ser Ser Pro Thr Asp Ala Ser Val Ile Cys Arg 85 90 95 Phe Lys Asp Ser Ile Gln Thr Leu Gly His Val Asp Ser Ser Gly Gln 100 105 110 Val His Cys Val Ser Pro Leu Leu Tyr Glu Ser Gly Arg Ile Pro Phe 115 120 125 Thr Val Ser Leu Asp Asn Gly His Ser Phe Pro Arg Ala Gly Thr Trp 130 135 140 Leu Ala Val His Pro Asn Lys Val Ser Met Met Glu Lys Ser Glu Leu 145 150 155 160 Val Asn Glu Thr Arg Trp Gln Tyr Tyr Gly Thr Ala Asn Thr Ser Gly 165 170 175 Asn Leu Ser Leu Thr Trp His Val Lys Ser Leu Pro Thr Gln Thr Ile 180 185 190 Thr Ile Glu Leu Trp Gly Tyr Glu Glu Thr Gly Met Pro Tyr Ser Gln 195 200 205 Glu Trp Thr Ala Lys Trp Ser Tyr Leu Tyr Pro Leu Ala Thr His Ile 210 215 220 Pro Asn Ser Gly Ser Phe Thr Phe Thr Pro Lys Pro Ala Pro Pro Ser 225 230 235 240 Tyr Gln Arg Trp Arg Val Gly Ala Leu Arg Ile Ile Asp Ser Lys Asn 245 250 255 Tyr Ala Gly Gln Lys Asp Val Gln Ala Leu Trp Thr Asn Asp His Ala 260 265 270 Leu Ala Trp His Leu Ser Asp Asp Phe Arg Glu Asp Pro Val Ala Trp 275 280 285 Ala Arg Thr Gln Cys Gln Ala Trp Glu Glu Leu Glu Asp Gln Leu Pro 290 295 300 Asn Phe Leu Glu Glu Leu Pro Asp Cys Pro Cys Thr Leu Thr Gln Ala 305 310 315 320 Arg Ala Asp Ser Gly Arg Phe Phe Thr Asp Tyr Gly Cys Asp Met Glu 325 330 335 Gln Gly Ser Val Cys Thr Tyr His Pro Gly Ala Val His Cys Val Arg 340 345 350 Ser Val Gln Ala Ser Leu Arg Tyr Gly Ser Gly Gln Gln Cys Cys Tyr 355 360 365 Thr Ala Asp Gly Thr Gln Leu Leu Thr Ala Asp Ser Ser Gly Gly Ser 370 375 380 Thr Pro Asp Arg Gly His Asp Trp Gly Ala Pro Pro Phe Arg Thr Pro 385 390 395 400 Pro Arg Val Pro Ser Met Ser His Trp Leu Tyr Asp Val Leu Ser Phe 405 410 415 Tyr Tyr Cys Cys Leu Trp Ala Pro Asp Cys Pro Arg Tyr Met Gln Arg 420 425 430 Arg Pro Ser Asn Asp Cys Arg Asn Tyr Arg Pro Pro Arg Leu Ala Ser 435 440 445 Ala Phe Gly Asp Pro His Phe Val Thr Phe Asp Gly Thr Asn Phe Thr 450 455 460 Phe Asn Gly Arg Gly Glu Tyr Val Leu Leu Glu Ala Ala Leu Thr Asp 465 470 475 480 Leu Arg Val Gln Ala Arg Ala Gln Pro Gly Thr Met Ser Asn Gly Thr 485 490 495 Glu Thr Arg Gly Thr Gly Leu Thr Ala Val Ala Val Gln Glu Gly Asn 500 505 510 Ser Asp Val Val Glu Val Arg Leu Ala Asn Arg Thr Gly Gly Leu Glu 515 520 525 Val Leu Leu Asn Gln Glu Val Leu Ser Phe Thr Glu Gln Ser Trp Met 530 535 540 Asp Leu Lys Gly Met Phe Leu Ser Val Ala Ala Gly Asp Arg Val Ser 545 550 555 560 Ile Met Leu Ala Ser Gly Ala Gly Leu Glu Val Ser Val Gln Gly Pro 565 570 575 Phe Leu Ser Val Ser Val Leu Leu Pro Glu Lys Phe Leu Thr His Thr 580 585 590 His Gly Leu Leu Gly Thr Leu Asn Asn Asp Pro Thr Asp Asp Phe Thr 595 600 605 Leu His Ser Gly Arg Val Leu Pro Pro Gly Thr Ser Pro Gln Glu Leu 610 615 620 Phe Leu Phe Gly Ala Asn Trp Thr Val His Asn Ala Ser Ser Leu Leu 625 630 635 640 Thr Tyr Asp Ser Trp Phe Leu Val His Asn Phe Leu Tyr Gln Pro Lys 645 650 655 His Asp Pro Thr Phe Glu Pro Leu Phe Pro Ser Glu Thr Thr Leu Asn 660 665 670 Pro Ser Leu Ala Gln Glu Ala Ala Lys Leu Cys Gly Asp Asp His Phe 675 680 685 Cys Asn Phe Asp Val Ala Ala Thr Gly Ser Leu Ser Thr Gly Thr Ala 690 695 700 Thr Arg Val Ala His Gln Leu His Gln Arg Arg Met Gln Ser Leu Gln 705 710 715 720 Pro Val Val Ser Cys Gly Trp Leu Ala Pro Pro Pro Asn Gly Gln Lys 725 730 735 Glu Gly Asn Arg Tyr Leu Ala Gly Ser Thr Ile Tyr Phe His Cys Asp 740 745 750 Asn Gly Tyr Ser Leu Ala Gly Ala Glu Thr Ser Thr Cys Gln Ala Asp 755 760 765 Gly Thr Trp Ser Ser Pro Thr Pro Lys Cys Gln Pro Gly Arg Ser Tyr 770 775 780 Ala Val Leu Leu Gly Ile Ile Phe Gly Gly Leu Ala Val Val Ala Ala 785 790 795 800 Val Ala Leu Val Tyr Val Leu Leu Arg Arg Arg Lys Gly Asn Thr His 805 810 815 Val Trp Gly Ala Gln Pro 820 <210> 2 <211> 3201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gcctcggagc cactgcactg ctggctgcag acacaggctg caccatgaag ccagccctcc 60 tgccctgggc cctgctgctg ctggcgacag ccctcggccc gggccccgga cccacagcag 120 atgcccaaga gagctgctcc atgcgctgtg gcgccctgga cgggccatgt tcctgccacc 180 cgacgtgctc tggccttggc acctgctgct tggatttccg ggacttctgc ctggagatat 240 tgccctactc aggatccatg atgggcggca aggactttgt ggtgcggcac ttcaagatgt 300 ccagccccac agacgccagt gtgatctgca ggtttaagga cagcatccag accctcggcc 360 atgtggactc ctccgggcaa gtgcactgtg tgtcacctct gctctatgag agcggccgca 420 tccccttcac tgtgtcactg gacaacggcc actccttccc tcgtgcgggc acctggctgg 480 ctgtgcaccc caacaaagtg tcaatgatgg agaagagcga gttggtgaac gagacgcgtt 540 ggcaatacta cggcaccgcc aacacctcag gcaacctcag cctgacctgg catgtcaagt 600 cgctgcccac gcagaccatc accatcgaac tgtggggcta cgaggagaca ggaatgccct 660 actcacagga gtggactgca aagtggtcgt acctgtaccc cctggccaca cacatcccca 720 actccggctc tttcactttc accccaaaac ctgctcctcc cagctaccag agatggcgag 780 tgggtgcact tcggatcatc gacagcaaaa attacgcagg gcagaaggac gtgcaggcgc 840 tctggaccaa cgaccacgca ctggcctggc acctgagcga tgacttccga gaggaccctg 900 tggcctgggc acgaactcag tgccaggcct gggaggagct ggaggatcag ctgcccaact 960 tcctggagga gctgccggac tgcccctgca ccctgaccca ggcccgggct gactccggcc 1020 gcttcttcac ggactacggc tgtgacatgg agcagggcag cgtgtgcacc taccaccccg 1080 gggccgtgca ctgtgtgcgt tctgtgcagg ccagcctccg gtacggctca ggtcagcagt 1140 gctgctacac agcggacggg acgcagctcc tgacagctga ctccagcggc ggcagcactc 1200 ccgaccgcgg ccatgactgg ggcgcacccc cgttccgcac gccaccccga gtgcccagca 1260 tgtcccactg gctctacgat gtcctcagct tctattactg ctgcctctgg gcacccgact 1320 gcccccgcta catgcaacgg cggccctcca atgactgccg caactaccgg cccccaagac 1380 tggcctccgc cttcggagac ccacactttg tgaccttcga cggcaccaac ttcacattca 1440 atgggcgcgg agagtacgtg ctgctggagg cagcgctgac cgacctgagg gtgcaggcgc 1500 gggcccagcc cgggacgatg tccaacggca cggagacccg tggcactggg ctgaccgcag 1560 tggccgtcca ggagggcaac tcagatgtgg tggaagtcag gctggccaac aggaccggag 1620 gtctggaggt gctgctgaac caggaggtgc tgagcttcac cgagcagagc tggatggacc 1680 tgaaaggaat gttcctgtcg gtggctgccg gggacagggt ctccatcatg ctggcatcag 1740 gggccggcct ggaggtcagc gtgcagggcc cgttcctgag tgtgtccgtc ctgctgcctg 1800 agaagttcct cacccacacc cacggcctcc tcgggacact caacaacgac cccaccgacg 1860 acttcaccct gcacagcggg cgcgtcctgc ccccaggcac cagtccccag gagctgttcc 1920 tgtttggggc caactggacc gtgcacaatg cgtcctccct gctcacctac gattcctggt 1980 tcctggtcca caacttcctg taccaaccca agcacgaccc caccttcgag cccctcttcc 2040 ccagtgagac caccctcaac cccagcctgg cacaagaggc agccaaacta tgtggggacg 2100 atcatttctg caactttgat gtggcagcca ctgggagcct gagcacgggc actgccactc 2160 gggtggccca ccagctgcac cagcgtcgca tgcagagcct gcagccagtg gtgtcctgtg 2220 gctggctggc cccacctccc aacggacaaa aggagggcaa caggtacctg gcgggttcca 2280 ccatctactt ccactgtgac aacggctaca gcctggccgg ggcagagacc agcacctgcc 2340 aggctgacgg cacctggtcc tcacccaccc cgaagtgcca gccaggacgc agctacgcgg 2400 tgctgttggg catcatcttt gggggcctcg cggtggtggc ggcggttgcg ctcgtctatg 2460 tgctgctgcg ccgcaggaag ggcaacacgc acgtctgggg tgcacagccc tgatgggagc 2520 agcttggctg tgagcaccag gccaagactc ctgagaacag gcagcccagt cctgcgactc 2580 ccgcatcccc aggaccagac acctgggacc tggatacttg atacctgggc atttaacccc 2640 ctactctgtc atctcagacc ccaggcagga ggcccagtgt tccaacaccc aagccccgtg 2700 ctagcagcgc tccgtgctct tccccaaata ctcacggctc taattcccca aacctgaaac 2760 ttcataccct gggattctaa tacctatgtc ctgagccctg acactcccac acctgagcct 2820 cagattccaa tagctcactc cctagagcct gacgccgggg cccctgaccc ctgagcctca 2880 gattccaata cctcactccc cagagcctga tgccggggcc cctgacccct gatctacgga 2940 ggcctgctcc cggaccgtgc gggcaccagt gcagtgctgc cttggttcct ggacccctgg 3000 gcccatcctg ggaccccaga tggggtaagg agaggcccca gaaccccaaa gcagacagcg 3060 agacccccag cggcagaggc ctccctcggc actccaggct tataatttcg aactcttctg 3120 gaaggtcact caggaacacc ctccctgcct gtgcaaagag aaaacaagcg ccttgtttcc 3180 ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3201 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 ggcaccgcca acacctca 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gcgtgggcag cgacttga 18

Claims (10)

  1. 검측하려는 세포군 중의 췌장내분비 전구세포 혹은 신생한 췌장 내분비세포의 분리 또는 보조 분리 방법에 있어서,
    검측하려는 세포군 중의 세포의 SUSD2유전자 발현 여부를 검측하되, 만일 일부 세포가 SUSD2유전자를 발현하였으면, 상기 일부 세포는 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포이거나 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포의 후보세포에 속하고; 만일 일부 세포가 SUSD2유전자를 발현하지 않았으면, 상기 일부 세포는 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포가 아니거나 췌장 내분비 전구세포 혹은 신생한 내분비세포의 후보세포에 속하지 않는 단계를 포함하고,
    상기 SUSD2유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중 서열번호 2인 검측하려는 세포군 중의 췌장내분비 전구세포 혹은 신생한 췌장 내분비세포를 분리 혹은 분리를 보조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 검측하려는 세포군 중의 세포의 SUSD2유전자 발현 여부는, 검측하려는 세포군 중의 세포에 SUSD2유전자가 발현된 단백질을 포함하고 있는지를 통해 검측하며, 상기 검측하려는 세포군 중의 세포가 SUSD2유전자가 발현된 단백질을 포함하는지를 검측하는 방법으로는:
    1) 항SUSD2 단일 클론 항체를 항체로 사용한 면역형광항체법으로 검측;
    2) 항SUSD2 단일 클론 항체를 항체로 사용한 유세포분석으로 검측하며;
    3) 항SUSD2 단일 클론 항체를 항체로 사용한 자성비드 분리인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 검측하려는 세포는 췌장 내배엽세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 췌장 내배엽세포는 인간 유래의 췌장 내배엽세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 췌장 내분비 전구세포 및/또는 신생한 췌장 내분비세포의 동정, 스크리닝 혹은 분리하는 방법에 있어서,
    SUSD2단백질 혹은 이의 코딩 유전자 혹은 상기 SUSD2단백질의 전구 단백질을 코딩하는 mRNA는, 췌장 내분비 전구세포 및/또는 신생한 췌장 내분비세포의 상기 동정, 스크리닝 혹은 분리에 있어 마커이고,
    상기 SUSD2단백질의 아미노산서열은 서열표 중 서열번호 1이고;
    상기 SUSD2단백질의 코딩 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중 서열번호 2인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 시약의 제조 방법으로서,
    상기 제조 방법은 SUSD2단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 제공하여 시약을 제조하되,
    상기 시약은 췌장 내분비 전구세포 및/또는 신생한 췌장 내분비세포의 동정, 스크리닝 혹은 분리하기 위한 것인, 시약의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항체는 형광표지를 구비하고;
    상기 항체는 단일 클론 항체인 것을 특징으로 하는, 시약의 제조 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 시약은 췌장 내배엽세포 중에서 췌장 내분비 전구세포 및/또는 신생한 췌장 내분비세포를 스크리닝 혹은 분리하기 위한 것이고;
    상기 스크리닝 혹은 분리하는 방법은 면역 자성비드 분리법 및 유세포분리법 이며;
    상기 동정하는 방법은 면역형광항체법 및 유세포분석법인 것을 특징으로 하는, 시약의 제조 방법.
  9. SUSD2단백질의 전구 단백질을 코딩하는 mRNA와 특이적 결합을 하는 프라이머 쌍(primer pair), 탐침 혹은 이들의 상보적 사슬을 제공하고, 췌장 내분비 전구세포 및/또는 신생한 내분비세포를 동정하는 시약을 제조하는 것을 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 프라이머 쌍은 서열표 중 서열번호 3의 단일쇄 DNA분자와 서열표 중 서열번호 4의 단일쇄 DNA분자로 조성된 것을 특징으로 하는 방법.

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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104215768B (zh) 2014-08-07 2016-01-13 北京大学 Susd2蛋白作为标记物的用途
CN106706915A (zh) * 2016-12-30 2017-05-24 山东大学齐鲁医院 Susd2在制备高级别浆液性卵巢癌诊断和/或预后判断的试剂盒中的应用
IL311054A (en) * 2021-09-07 2024-04-01 Wisconsin Alumni Res Found Extracellular matrix derived from cardiac fibroblast
US20230251262A1 (en) * 2022-02-09 2023-08-10 Universitaesklinikum Hamburg-Eppendorf Enrichment, detection and characterization of circulating tumor cells with susd2 and enpp1
CN116536251B (zh) * 2023-07-06 2023-09-19 北京北启生物医药有限公司 一种无饲养层的化学诱导多能干细胞单克隆建株方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102321572A (zh) 2011-01-29 2012-01-18 余跃红 一种纯化、识别胰腺内分泌细胞的方法
WO2013139952A2 (de) 2012-03-23 2013-09-26 Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum Neue msc-oberflächenmarker
WO2014030166A1 (en) 2012-08-22 2014-02-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of isolating distinct pancreatic cell types

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8030003B2 (en) * 2004-12-07 2011-10-04 Children's Hospital Medical Center Diagnosis of eosinophilic esophagitis based on presence of an elevated level of eotaxin-3
CN101188942B (zh) * 2005-03-04 2011-11-30 生命扫描有限公司 成年胰衍生的基质细胞
US7842467B1 (en) * 2005-05-12 2010-11-30 Celera Corporation Breast disease targets and uses thereof
US20070099251A1 (en) * 2005-10-17 2007-05-03 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
WO2010065940A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 The Regents Of The University Of California Materials and methods for determining diagnosis and prognosis of prostate cancer
WO2012070014A2 (en) * 2010-11-26 2012-05-31 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Identification of novel cell surface markers for pancreatic progenitor cells and definite endodermal cells
EP2668264B1 (en) * 2011-01-25 2017-05-31 Elixirgen, LLC Zscan4 as a marker for pancreatic stem cells and progenitor cells and use thereof
CN104215768B (zh) 2014-08-07 2016-01-13 北京大学 Susd2蛋白作为标记物的用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102321572A (zh) 2011-01-29 2012-01-18 余跃红 一种纯化、识别胰腺内分泌细胞的方法
WO2013139952A2 (de) 2012-03-23 2013-09-26 Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum Neue msc-oberflächenmarker
WO2014030166A1 (en) 2012-08-22 2014-02-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of isolating distinct pancreatic cell types

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