ES2905882T3 - Uso de la proteína SUSD2 como marcador - Google Patents

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Abstract

Un método para separar in vitro o asistir en la separación de células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas pancreáticas nacientes en una población de células a ensayar, que comprende las etapas de: detectar si las células en la población de células a ensayar expresan un gen SUSD2; si algunas células expresan el gen SUSD2, estas células son, o son candidatas a ser, células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes; si algunas células no expresan el gen SUSD2, estas células no son, o no son candidatas a ser, células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes; y la secuencia de nucleótidos del gen SUSD2 se ilustra como SEC ID nº 2 en el listado de secuencias.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de la proteína SUSD2 como marcador
Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de la biotecnología, y en particular al uso de la proteína SUSD2 como marcador.
Antecedentes de la técnica
Las células beta pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas proporcionan fuentes suficientes de células de los islotes de donantes para su uso en la terapia de reemplazo celular para la diabetes, particularmente para la diabetes tipo I. Además, la diferenciación dirigida de células madre pluripotentes humanas (hPSC, por sus siglas en inglés) en células beta pancreáticas también puede proporcionar un modelo para estudiar el desarrollo pancreático humano in vitro. El proceso de diferenciación dirigida de las hPSC en células beta pancreáticas se puede dividir en varias etapas mediante la imitación de los eventos de desarrollo in vivo: endodermo definitivo, tubo intestinal, intestino anterior posterior, endodermo pancreático y células endocrinas pancreáticas. Entre ellas, las células del endodermo pancreático son poblaciones de células mixtas, que normalmente incluyen células progenitoras pancreáticas, células progenitoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas pancreáticas nacientes y similares. El destino celular se determina mediante la detección de la expresión de genes relacionados con el desarrollo pancreático. Las células progenitoras pancreáticas se indican principalmente por la expresión de genes relevantes como PDX1, HNF1B, SOX9, NKX6.1, HNF6, etc. NGN3 es el gen marcador más importante de las células progenitoras endocrinas pancreáticas y, sin embargo, debido a sus características de expresión transitoria, se requiere que se combine con la expresión de sus genes cadena abajo, como NKX2.2 y NEUROD1, así como con la expresión negativa de genes endocrinos relacionados, tales como CROMOGRANINA A, INSULINA y GLUCAGON para indicar el destino de las células progenitoras endocrinas pancreáticas. Aunque la expresión de estos genes marcadores se puede usar para indicar el destino de células específicas, la expresión de estas proteínas no se puede usar para aislar y purificar poblaciones celulares específicas, ya que todos son factores de transcripción o proteínas secretoras, que generalmente se ubican dentro del citoplasma o el núcleo, en particular, células progenitoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas pancreáticas nacientes humanas, por lo que sus características moleculares no pueden estudiarse con más detalle.
En la actualidad, las células progenitoras pancreáticas se pueden obtener por diferenciación dirigida de hPSC; sin embargo, estas células se diferencian en células beta pancreáticas maduras funcionales con baja eficiencia in vitro. Aunque tras el trasplante de células precursoras pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas a ratones inmunodeficientes, se pueden obtener células de los islotes funcionalmente maduras, debido a la capacidad proliferativa de las células precursoras pancreáticas, su tumorigenicidad limita su promoción a la aplicación clínica. Las células beta maduras funcionales son fuentes de células donantes más deseables que las células progenitoras pancreáticas. Sin embargo, cómo diferenciar las células progenitoras pancreáticas en células beta maduras funcionales in vitro limita en gran medida la implementación de un tratamiento alternativo de las células de la diabetes, mientras que en el proceso de diferenciación de las células precursoras pancreáticas en células beta pancreáticas, la etapa más importante es la realización correcta de una diferenciación inducida eficiente de las células precursoras endocrinas pancreáticas. Los estudios en modelos animales como el ratón han fomentado en gran medida la comprensión del desarrollo de las células beta pancreáticas. Estos estudios han desempeñado un papel decisivo en la dirección de la diferenciación dirigida de las células beta pancreáticas in vitro. A pesar de esto, los estudios sobre la especialización del destino de las células precursoras endocrinas pancreáticas y la selección del destino entre diferentes células endocrinas son aún escasos. Además, existen algunas diferencias específicas entre seres humanos y animales modelo como el ratón. Por lo tanto, encontrar marcadores moleculares relevantes para aislar directamente las células relacionadas con el páncreas en una etapa de desarrollo particular para la investigación puede acelerar significativamente la adquisición de células beta pancreáticas maduras funcionales in vitro.
El documento n° WO 2012/070014 describe métodos para identificar, aislar y calificar células progenitoras pancreáticas y células endodérmicas definitivas sobre la base de determinados patrones de expresión de marcadores.
El documento n° WO 2013/139952 describe anticuerpos que se unen al antígeno SUSD2.
Compendio
Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para clasificar, o asistir en la clasificación, in vitro de células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes en una población de células a ensayar.
El método proporcionado por la presente invención comprende las siguientes etapas: detectar si las células en la población de células a ensayar expresan el gen SUSD2; si algunas células expresan el gen SUSD2, estas células son, o son candidatas a ser, células precursoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes; Si algunas células no expresan el gen SUSD2, estas células no son, o no son candidatas a ser, células precursoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes.
La secuencia de nucleótidos del gen SUSD2 se ilustra en la SEC ID n° 2 en el Listado de secuencias.
En el método anteriormente indicado, la etapa de detectar si las células de la población de células a ensayar expresan un gen SUSD2 se realiza mediante la detección de si las células de la población de células a ensayar contienen una proteína expresada por el gen SUSD2, y el método para detectar si las células en la población de células a ensayar contienen la proteína expresada por el gen SUSD2 es 1) o 2) o 3) a continuación:
1) ensayo de inmunofluorescencia de anticuerpos, usando anticuerpo monoclonal anti-SUSD2,
2) citometría de flujo, usando anticuerpo monoclonal anti-SUSD2,
3) clasificación de células de perlas magnéticas, usando anticuerpo monoclonal anti-SUSD2.
En el método anterior, las células a ensayar son células del endodermo pancreático.
Al analizar los perfiles de expresión génica de las células del endodermo pancreático, los presentes inventores también han encontrado que la expresión del gen SUSD2 está incrementada en las células progenitoras endocrinas pancreáticas y en las células endocrinas neonatales, es decir, la proteína SUSD2 puede usarse como marcador molecular de ambas células.
En base a los hallazgos anteriores, la presente invención proporciona el uso de una proteína SUSD2 como marcador para la identificación, cribado o clasificación de células progenitoras endocrinas pancreáticas y/o células endocrinas pancreáticas nacientes, donde se muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína SUSD2 como SEC ID n° 1. La secuencia de referencia NCBI de la proteína SUSD2 es NP_062547.1.
Las células endocrinas pancreáticas nacientes se refieren a una población de células positivas para hormona (entre ellas, insulina, glucagón, grelina, polipéptido pancreático, somatostatina, etc.) durante el proceso de diferenciación directa de células madre pluripotentes humanas en células beta pancreáticas. Esta población celular normalmente coexpresa múltiples hormonas y es menos madura funcionalmente que las células endocrinas pancreáticas maduras. Durante el desarrollo in vivo, las células endocrinas pancreáticas nacientes son principalmente células endocrinas pancreáticas que son funcionalmente inmaduras durante el desarrollo embrionario.
La presente invención proporciona además el uso de un anticuerpo capaz de unirse específicamente a una proteína SUSD2 en la preparación de un reactivo para la identificación, cribado o clasificación de células precursoras endocrinas pancreáticas y/o células endocrinas pancreáticas nacientes.
La proteína SUSD2 es una proteína expresada por el gen SUSD2, que no es ni un factor de transcripción ni una proteína secretora, sino una proteína receptora localizada en la membrana celular.
Las células a ensayar se detectan mediante el método de anticuerpos inmunofluorescentes para determinar si expresan proteínas SUSD2 o no, con el fin de determinar si las células a ensayar son células precursoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas pancreáticas nacientes.
El anticuerpo puede seleccionarse de entre una molécula de anticuerpo intacta, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo biespecífico, una cadena pesada de un anticuerpo, una cadena ligera de un anticuerpo, un homodímero o heterodímero de cadenas pesadas y ligeras, un fragmento de unión a antígeno y derivados de los mismos. La molécula de anticuerpo intacta puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal, preferentemente un anticuerpo monoclonal.
Tal como se ha indicado anteriormente, la proteína SUSD2 generalmente puede detectarse mediante un método de anticuerpos inmunofluorescentes, en el que se requiere que el anticuerpo contra la proteína o un anticuerpo secundario contra el anticuerpo lleve el marcaje fluorescente correspondiente.
Las células precursoras endocrinas pancreáticas y las células endocrinas pancreáticas nacientes son una población de células en las células del endodermo pancreático que pueden producir células endocrinas pancreáticas funcionalmente maduras bajo las condiciones adecuadas.
El método de detección o clasificación adopta principalmente la separación inmunomagnética o la clasificación por citometría de flujo.
En el proceso de expresión del gen SUSD2, primero se transcribe en ARNm, luego el ARNm se traduce en proteína precursora SUSD2 y luego la proteína precursora se procesa para producir proteína SUSD2 madura.
Por las razones anteriores, la presente invención proporciona además un uso de un ARNm que codifica una proteína precursora de una proteína SUSD2 como marcador en la identificación de células precursoras endocrinas pancreáticas y/o células endocrinas pancreáticas nacientes. La invención proporciona además el uso de un cebador, una sonda o sus cadenas complementarias capaces de unirse específicamente al ARNm en la preparación de un reactivo para la identificación de células precursoras endocrinas pancreáticas y/o células endocrinas pancreáticas nacientes.
El cebador puede ser un cebador para amplificar el ARNm completo o un cebador para amplificar una región característica del ARNm, y la sonda es un nucleótido que reconoce una región específica del ARNm y generalmente porta un marcaje.
De acuerdo con la descripción de los ejemplos, la presente invención proporciona un par de cebadores que amplifican específicamente el ARNm, de la manera siguiente:
cebador cadena arriba: GGCACCGCCAACACCTCA
cebador cadena abajo: GGCGTGGGCAGCGACTTGA.
El método de identificación puede emplear PCR cuantitativa de fluorescencia.
Mediante el análisis de los perfiles de expresión génica de las células del endodermo, los inventores han encontrado que la expresión del gen SUSD2 está incrementada en las células precursoras endocrinas pancreáticas y en las células endocrinas pancreáticas nacientes, y que la proteína codificada por el mismo es una proteína receptora de membrana celular y la proteína puede utilizarse como marcador para identificar, cribar o clasificar células precursoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas pancreáticas nacientes, lo que es de gran importancia para el estudio de las células relacionadas con el páncreas en diversas etapas del desarrollo.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la diferenciación directa de células madre pluripotentes humanas en células del endodermo pancreático. (a) Representación esquemática de la diferenciación directa de células madre pluripotentes humanas en células beta pancreáticas; (b) tinción inmunofluorescente para detectar la expresión de la proteína fluorescente verde (EGFP, por sus siglas en inglés) de marcaje de los genes NGN3 y de las proteínas relacionadas con el endodermo pancreático al final del estadio 4 de diferenciación.
La figura 2 muestra los resultados de la citometría de flujo para identificar que las células NGN3-EGFP+ en el endodermo pancreático son células precursoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes. (a) La citometría de flujo se usa para detectar la expresión de NGN3-EGFP y proteínas relacionadas con el sistema endocrino pancreático, tales como NGN3, NKX2.2, NEUROD1, CROMOGrAN iNA A (CHGA) en las células del endodermo pancreático; (b) la citometría de flujo se usa para detectar la expresión de NGN3-EGFP y de la proteína marcadora de células precursoras pancreáticas PDX1 en células del endodermo pancreático, lo que indica que la proteína PDX1 relacionada con células precursoras pancreáticas se expresa poco o nada en células NGN3-EGFP+.
La figura 3 muestra la expresión de genes relacionados con el páncreas en células NGN3-EGFP+ y células NGN3-EGFP, obtenida mediante clasificación con análisis de secuenciación de ARNm, que indica que la población de células precursoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas nacientes NGN3-EGFP+ presentan una expresión relativamente incrementada de genes relacionados con el sistema endocrino pancreático.
La figura 4 muestra la tinción inmunofluorescente para detectar el patrón de tinción combinado de SUSD2 y NGN3-EGFP, que indica que SUSD2 se puede utilizar para marcar células NGN3-EGFP+ derivadas de células madre pluripotentes humanas.
La fig. 5 muestra un gráfico de análisis de una citometría de flujo para detectar la expresión de SUSD2 y proteínas relacionadas con el desarrollo pancreático en células del endodermo pancreático derivadas de células madre pluripotentes humanas, que indica que SUSD2 puede usarse para marcar células precursoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas nacientes obtenidas mediantediferenciación in vitro. (a) La citometría de flujo se usa para detectar la expresión de SUSD2 y proteínas relacionadas con el sistema endocrino pancreático, tales como NGN3, NKX2.2, NEUROD1, CROMOGRANINA A (CHGA) en células del endodermo pancreático; (b) se usa citometría de flujo para detectar la expresión de SUSD2 y proteína PDX1 relacionada con células precursoras pancreáticas en células del endodermo pancreático.
La figura 6 muestra la expresión de genes relacionados con el desarrollo pancreático en células SUSD2+, en células SUSD2 obtenidas mediante separación con citometría de flujo y en células del endodermo pancreático no separadas que se han identificado mediante RT-QPCR, lo que indica que en células SUSD2+ la expresión de genes relacionados con células precursoras endocrinas pancreáticas y de genes relacionados con células endocrinas pancreáticas está relativamente incrementada y la expresión de genes relacionados con células precursoras pancreáticas es relativamente débil, lo que demuestra que las células marcadas con SUSD2 son células precursoras endocrinas pancreáticas y/o células endocrinas nacientes.
La figura 7 muestra que el anticuerpo SUSD2 se usa en la separación celular magnética para enriquecer en células precursoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas pancreáticas nacientes. (a) La expresión de la proteína marcadora NKX2.2 de células precursoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas pancreáticas en células SUSD2+ y en células SUSD2 enriquecidas mediante separación celular magnética aplicada en células del endodermo pancreático obtenidas por diferenciación in vitro con anticuerpo SUSD2 se detecta mediante flujo citometría. Lo anterior indica que el uso del anticuerpo SUSD2 en la separación de células magnéticas puede enriquecer eficazmente en células precursoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas pancreáticas nacientes NKX2.2+. (b) Después de someter a cultivo prolongado las células SUSD2+, las células SUSD2 obtenidas mediante separación celular magnética y las células del endodermo pancreático sin separar, mediante procedimientos inmunohistoquímicos se detecta la expresión de proteínas precursoras pancreáticas y proteínas relacionadas con el sistema endocrino pancreático, lo que indica que las células SUSD2+ pueden producir un gran número de células endocrinas que se ha demostrado que son células precursoras endocrinas o células endocrinas nacientes. (c) Las células SUSD2+ y las células SUSD2 obtenidas mediante separación celular magnética se trasplantan en los ratones inmunodeficientes. Después de 19 semanas, se realiza una tinción inmunofluorescente de los implantes para detectar la expresión de proteínas relacionadas con el sistema endocrino pancreático, lo que indica que las células SUSD2+ pueden producir múltiples tipos de células endocrinas pancreáticas, mientras que las células SUSD2 producen principalmente células similares a conductos. Esto demuestra que las células enriquecidas en SUSD2 son células precursoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas pancreáticas nacientes.
La figura 8 muestra que SUSD2 se puede utilizar para marcar células precursoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas pancreáticas nacientes derivadas de embriones humanos. (a) La coexpresión de SUSD2 con proteínas relacionadas con células progenitoras endocrinas pancreáticas y proteínas relacionadas con células endocrinas pancreáticas en tejidos pancreáticos embrionarios y tejidos pancreáticos adultos se detecta mediante procedimientos inmunohistoquímicos, lo que indica que SUSD2 solo se expresa en precursores endocrinos pancreáticos o en células endocrinas en tejidos pancreáticos embrionarios; (b) La expresión de SUSD2, proteínas relacionadas con el sistema endocrino pancreático y proteínas relacionadas con el conducto pancreático en los tejidos pancreáticos embrionarios se detecta mediante inmunofluorescencia.
La figura 9 muestra que SUSD2 puede usarse para enriquecer en células precursoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas pancreáticas nacientes derivadas de páncreas embrionario humano.
Descripción detallada
Todos los métodos experimentales usados en los siguientes ejemplos son métodos convencionales, a menos que se especifique lo contrario. Todos los materiales, reactivos y similares usados en los siguientes ejemplos están disponibles comercialmente, a menos que se especifique lo contrario. El gen SUSD2 se muestra en SEC ID n° 2 y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada es SEC ID n° 1.
Ejemplo de referencia 1: identificación y aplicación de SUSD2 como gen marcador para células precursoras endocrinas pancreáticas.
1. SUSD2 como gen marcador de células precursoras endocrinas pancreáticas obtenido mediante diferenciación de células madre pluripotentes humanas modificadas
1.1 Adquisición de células del endodermo pancreático
El gen EGFP (NC_013179.1 (3313..4126)) se recombinó homólogamente (Ngn3contig n° NT_030059.13, ubicado en el cromosoma 10; posición del brazo homólogo izquierdo en el genoma: 71325654-71332154; posición del brazo homólogo derecho en el genoma: 71332158-71467568) en la línea de células madre pluripotentes humanas aisladas HI (WiCell Research Institute, NIH n° WA01) para obtener la línea de células madre pluripotentes humanas modificadas NGN3-EGFP. Las células se sembraron en la solución de cultivo celular I al 15%-20% y se cultivaron durante 1 día; luego se transfirió directamente a la solución de cultivo celular II y se cultivó durante 1 a 2 días; posteriormente se transfirió directamente a la solución de cultivo celular III y se cultivó durante 1 día; luego se transfirió directamente a la solución de cultivo celular IV y se cultivó durante 2 días; se transfirió directamente a la solución de cultivo celular V y se cultivó durante 1 día; se transfirió directamente a la solución de cultivo celular VI y se cultivó durante 3 días; se transfirió directamente a la solución de cultivo celular VII y se cultivó durante 4 días; se transfirió directamente a la solución de cultivo celular VIII y se cultivó durante 4 a 6 días; se transfirió directamente a la solución de cultivo celular IX y se cultivó durante 4 a 6 días para obtener células del endodermo pancreático.
La expresión de varios factores de transcripción marcadores relacionados con el endodermo pancreático en poblaciones celulares en esta etapa se detectó mediante tinción inmunofluorescente.
El anticuerpo para detectar NKX2.2 era un anticuerpo monoclonal derivado de murino (disponible comercialmente de DSHB, número de catálogo 74.5A5); el anticuerpo para detectar PDX1 era un anticuerpo policlonal derivado de cabra (disponible comercialmente de R&D Systems, número de catálogo AF2419); el anticuerpo para detectar EGFP era un anticuerpo policlonal derivado de pollo (disponible comercialmente de Abcam, número de catálogo AB13970); el anticuerpo para detectar NGN3 era un anticuerpo policlonal derivado de oveja (disponible comercialmente de R&D System, número de catálogo AF3444).
Todos los anticuerpos eran anticuerpos no marcados directamente. En el ensayo, se usaron los siguientes anticuerpos comercialmente disponibles de Jackson ImmunoResearch para la contratinción: anticuerpo policlonal anticabra derivado de asno marcado con Alexa Fluor 488 (n° de catálogo 705-545-147); anticuerpo policlonal anticabra derivado de asno marcado con cianina Cy3 (n° de catálogo 705-165-147); anticuerpo policlonal antioveja derivado de asno marcado con cianina Cy3 (n° de catálogo 715-165-147); anticuerpo policlonal antimurino derivado de asno marcado con Alexa Fluor 488 (n° de catálogo 715-545-151); anticuerpo policlonal antimurino derivado de asno marcado con cianina Cy3 (n° de catálogo 715-145-151); anticuerpos policlonales antipollo derivados de asno marcados con Alexa Fluor 488 (n° de catálogo 703-545-155).
Los resultados se muestran en la fig. 1. En las células obtenidas en esta etapa, algunas de las células expresaron PDX1, una proteína marcadora del precursor pancreático (fig. 1A); las demás células expresaron NGN3-EGFP, y casi no hubo cotinción de los dos (fig. 1B); las células NGN3-EGFP+ expresaron el factor de transcripción del marcador de células progenitoras endocrinas pancreáticas NGN3 o las proteínas relacionadas con las células endocrinas de estadio temprano NKX2.2, CROMOGrAn INA A (CHGA), etc. (fig. 1C y fig. 1D), lo que indica que las células obtenidas son células pancreáticas en estadio endodérmico, en las que existen células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes marcadas con NGN3-EGFP. Las soluciones de cultivo anteriormente mencionadas se formularon de la siguiente manera:
La solución de cultivo celular I se preparó mezclando el medio Essential 8 e Y27632 para obtener la solución de cultivo celular I, en la que la proporción de medio Essential 8 e Y27632 era de 1 ml:10 gmoles.
La solución de cultivo celular II era medio Essential 8.
La solución de cultivo celular III se preparó mezclando medio DMEM/F12, BSA, rmWnt3A y ActivinA para obtener la solución de cultivo celular III, en la que la proporción de medio DMEM/F12, BSA, rmWnt3A y ActivinA era de 1 ml:0,1 g:25 ng:120 ng.
La solución de cultivo celular IV se preparó mezclando medio DMEM/F12, BSA y ActivinA para obtener la solución de cultivo celular IV, en la que la proporción de medio DMEM/F12, BSA y ActivinA era de 1 ml:0,1 g:120 ng.
La solución de cultivo celular V se preparó mezclando medio DMEM/F12, BSA, ActivinA y Wnt-C59 para obtener la solución de cultivo celular V, en la que la proporción de medio DMEM/F12, BSA, ActivinA y Wnt-C59 era de 1 ml:0,1 g:120 ng:50 nmoles.
La solución de cultivo celular VI se preparó mezclando medio DMEM/F12, suplemento B27 sin vitamina A, KGF y SB525334 para obtener la solución de cultivo celular VI, en la que la proporción de medio DMEM/F12, suplemento B27 sin vitamina A, KGF y SB525334 era de 1 ml:10 gl:50 ng:1 gmol.
La solución de cultivo celular VII se preparó mezclando medio DMEM-H, suplemento B27, ácido retinoico todo-trans, NOGGIN y SANT-1 para obtener la solución de cultivo celular VII, en la que la proporción de medio DMEM-H, suplemento B27, ácido retinoico todo-trans, NOGGIN y SANT-1 era de 1 ml:10 pl:2 pmoles:250 ng:0,25 gmoles.
La solución de cultivo celular VIII se preparó mezclando medio DMEM-H, suplemento B27 sin vitamina A, NOGGIN y TPB ((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-trifluorometil)fenil)-2,4-pentadienoilamino-benzolactamo) para obtener la solución de cultivo celular VIII, en la que la proporción de medio DMEM-H, suplemento B27 sin vitamina A, NOGGIN y TPB era de 1 ml:10 gl:250 ng:50 nmoles.
La solución de cultivo celular IX se preparó mezclando medio DMEM-H, suplemento B27 sin vitamina A, NOGGIN, LIF humano e inhibidor de Alk5 II para obtener la solución de cultivo celular VIII, en la que la proporción de medio DMEM-H, suplemento B27 sin vitamina A, NOGGIN y TPB era de 1 ml:10 gl:250 ng:10 ng:1 gmol.
I . 2 Se utilizó el análisis de citometría de flujo para identificar si las células NGN3-EGFP+ eran células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes.
Las células del endodermo pancreático obtenidas tal como se ha indicado anteriormente se sometieron a análisis de citometría de flujo con BD FACS Aria IIu para obtener dos poblaciones celulares: NGN3-EGFP+ (población celular que contiene las células precursoras endocrinas pancreáticas originales) y NGN3-EGFP- (población celular que no contiene las células precursoras endocrinas pancreáticas). EGFP es el canal FL1.
La presencia de múltiples marcadores de factores de transcripción o proteínas secretoras de células progenitoras endocrinas pancreáticas en las poblaciones NGN3-EGFP+ y NGN3-EGFP- se detectó mediante análisis de citometría de flujo intracelular.
El anticuerpo para detectar NKX2.2 era un anticuerpo monoclonal derivado de murino (disponible comercialmente de DSHB, número de catálogo 74.5A5); los anticuerpos para detectar NGN3 incluían un anticuerpo policlonal derivado de oveja (disponible comercialmente de R&D Systems, número de catálogo AF3444) y un anticuerpo monoclonal derivado de ratón (disponible comercialmente de DSHB, número de catálogo F25A1B3); el anticuerpo para detectar NEUROD 1 era un anticuerpo policlonal derivado de cabra (disponible comercialmente de R&D Systems, número de catálogo AF2746); el anticuerpo para detectar PDX1 era un anticuerpo policlonal derivado de cabra (disponible comercialmente de R&D Systems, número de catálogo AF2419) y el anticuerpo para detectar CROMOGRANINA A era un anticuerpo policlonal derivado de conejo (disponible comercialmente, catálogo n° ZA-0507).
Todos los anticuerpos eran anticuerpos no marcados directamente. En el ensayo, se usaron los siguientes anticuerpos comercialmente disponibles de Jackson ImmunoResearch para la contratinción: anticuerpo policlonal anticabra derivado de asno marcado con Alexa Fluor 488 (n° de catálogo 705-545-147); anticuerpo policlonal antimurino derivado de asno marcado con Alexa Fluor 488 (n° de catálogo 715-545-151), anticuerpo policlonal antimurino derivado de asno marcado con Alexa Fluor 647 (n° de catálogo 715-605-151); anticuerpo policlonal subtipo 1 anti-antígeno de ratón derivado de cabra marcado con Alexa Fluor 488 (n° de catálogo 115-545-205); anticuerpo policlonal antimurino derivado de cabra marcado con Alexa Fluor 647 (n° de catálogo 115-605-205); anticuerpo policlonal de subtipo 2b de antígeno antimurino derivado de cabra marcado con Alexa Fluor 488 (n° de catálogo 115-545-207), anticuerpo policlonal de subtipo 2b de antígeno antimurino derivado de cabra marcado con Alexa Fluor 647 (n° de catálogo 115-605-207); anticuerpo policlonal anticonejo derivado de asno marcado con Alexa Fluor 488 (n° de catálogo 711 -545-152).
Los resultados se muestran en la figura 2. Se expresaron NKX2.2, NGN3 y CROMOGRANINA A (CHGA) en la población NGN3-EGFP+ (que contenía células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes), aunque el gen PDX1 relacionado con el precursor pancreático no se expresó o se expresó bajo allí, lo que indica que esta población de células contiene principalmente células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes.
No se observó expresión de NKX2.2, CROMOGRANINA A (CHGA) y GFP en la población NGN3-EGFP, que principalmente expresaba a nivel elevado el factor de transcripción relacionado con el precursor pancreático PDX1, y un número muy pequeño de células expresan NGN3 o NEUROD1, lo que indica que la población celular contiene predominantemente células progenitoras pancreáticas o tipos celulares no pancreáticos.
1.3 La población de células NGN3-EGFP+ se enriqueció con la expresión de SUSD2
1) La secuenciación de ARN mostró que la expresión de SUSD2 estaba enriquecida en la población celular NGN3-EGFP+
Las células NGN3-EGFP+ y las células NGN3-EGFP obtenidas en las 2 anteriores se extrajeron cada una con RNeayPlus Mini Kit de QIAGEN para obtener 2 gg de ARNm total. El ARNm obtenido se purificó y se sometió a transcripción inversa para obtener ADNc monocatenario. Al extremo 3' del ADNc monocatenario resultante se añadió una cola poliA usando desoxinucleotidiltransferasa terminal. Después de la amplificación del ADNc durante 12 ciclos de PCR, se construyó una biblioteca de ADNc con el kit de preparación de muestras de ADN de extremos emparejados de Illumina y luego se secuenció con Illumina Hiseq2000. Las lecturas sin procesar y el genoma de referencia humano (NCBI versión 37, hg 19) se alinearon mediante el software Tophat, y se reconstruyó un transcriptoma después de hacer corresponder las lecturas de mapeo en sentidos directo e inverso y la base de datos de referencia del NCBI (RefSeq Genes hg19). Después de calcular la abundancia de expresión de todos los genes y normalizarlos con RPKM, se utilizaron los siguientes criterios para determinar la importancia de la expresión diferencial de un gen en las células NGN3-EGFP+ y NGN3-EGFP-: 1) el factor de cambio de expresión era superior a 2 o inferior a 0,5; 2) El valor de p es inferior a 0,05. Se usó un paquete de mapa térmico del software R para analizar los datos obtenidos basados en RPKM usando log 10. El análisis GO se realizó utilizando la expresión génica diferencial (DGE, por sus siglas en inglés).
Los resultados se muestran en la figura 3. En comparación con las células NGN3-EGFP, la expresión de los genes relacionados con el sistema endocrino pancreático NGN3, NEUROD1, NKX2.2, PAX4, ARX y similares se enriqueció en las células NGN3-EGFP+, mientras que la expresión de los genes relacionados con el sistema endocrino pancreático PDX1, HNF1B y HNF6 era baja en las mismas, lo que indica que las células NGN3-EGFP+ obtenidas mediante clasificación eran células progenitoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas nacientes.
La expresión de SUSD2 (NR02212) se enriqueció en células NGN3-EGFP+ y el factor de cambio era de 2,30, lo que indica que el gen SUSD2 (SEC ID n° 2) se puede utilizar como marcador para identificar si la célula que se va a analizar es una célula progenitora endocrina pancreática o una célula endocrina pancreática naciente. La siguiente etapa era identificar si la proteína del gen SUSD2 se expresaba de la misma forma.
(2) Se utilizó el método de anticuerpos de inmunofluorescencia para demostrar que SUSD2 podría marcar la población de células NGN3-EGFP+
La expresión de EGFP y SUSD2 en células NGN3-EGFP+ y células NGN3-EGFP obtenidas en 2, anteriormente, se detectó mediante el método de anticuerpos inmunofluorescentes. El anticuerpo para detectar EGFP es un anticuerpo policlonal derivado de pollo (disponible comercialmente de Abcam, número de catálogo AB13970); el anticuerpo para detectar SUSD2 es un anticuerpo monoclonal derivado de murino (disponible comercialmente de BioLegend, número de catálogo 327401).
Todos los anticuerpos eran anticuerpos no marcados directamente. En el ensayo, se usaron los siguientes anticuerpos comercialmente disponibles de Jackson ImmunoResearch para la contratinción: anticuerpo policlonal antimurino derivado de burro marcado con cianina Cy3 (n° de catálogo 715-165-151); anticuerpo policlonal antipollo derivado de asno marcado con Alexa Fluor 488 (n° de catálogo 703-545-155).
Los resultados se muestran en la fig. 4. Los resultados inmunohistoquímicos mostraron que la expresión de SUSD2 era consistente con la de NGN3-EGFP y SUSD2 no se expresaba en células NGN3-EGFP, es decir, la expresión de SUSD2 estaba enriquecida en las células NGN3-EGFP+; lo que indica que SUSD2 podría usarse para identificar o marcar las células NGN3-EGFP+, es decir, una población celular mixta compuesta por células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas pancreáticas nacientes.
2. SUSD2 como gen marcador de células progenitoras endocrinas pancreáticas obtenido mediante diferenciación de células madre pluripotentes humanas.
2.1 Adquisición de células del endodermo pancreático
La línea de células madre pluripotentes humanas aisladas NGN3-EGFP se diferenció en células del endodermo pancreático de acuerdo con el método de 1.1.
2.2 La expresión del gen SUSD2 y la expresión del gen marcador de células progenitoras endocrinas pancreáticas NKX2.2 y NEUROD1 se detectaron mediante citometría de flujo.
Las células del endodermo pancreático obtenidas en 2.1, anteriormente, se sometieron a citometría de flujo para detectar la expresión de la proteína codificada por el gen SUSD2 de acuerdo con un kit de inmovilización/permeabilización celular disponible comercialmente de BD Biosciences (n° de catálogo 554714). Después de inmovilizar las células del endodermo pancreático obtenidas en 2.1, anteriormente, se utilizó el anticuerpo correspondiente y el anticuerpo SUSD2 marcado directamente (anticuerpo monoclonal anti-SUSD2 marcado con PE derivado de ratón, disponible comercialmente de BioLegend, número de catálogo 327406) y anticuerpo monoclonal derivado de ratón marcado con APC (disponible comercialmente de BioLegend, número de catálogo 327408). Se usó anticuerpo monoclonal no marcado derivado de ratón (disponible comercialmente de BioLegend, número de catálogo 327401) para la tinción, y después se usó anticuerpo secundario fluorescente para la contratinción.
Posteriormente, se realizó un análisis mediante un separador de flujo.
El anticuerpo para detectar NKX2.2 era un anticuerpo monoclonal derivado de murino (disponible comercialmente de DSHB, número de catálogo 74.5A5); los anticuerpos para detectar NGN3 incluían anticuerpo policlonal derivado de oveja (disponible comercialmente de R&D Systems, número de catálogo AF3444) y anticuerpo monoclonal derivado de ratón (disponible comercialmente de DSHB, número de catálogo F25A1B3); el anticuerpo para detectar NEUROD 1 era un anticuerpo policlonal derivado de cabra (disponible comercialmente de R&D Systems, número de catálogo AF2746); el anticuerpo para detectar PDX1 era un anticuerpo policlonal derivado de cabra (disponible comercialmente de R&D Systems, número de catálogo AF2419) y el anticuerpo para detectar CROMOGRANlNA era un anticuerpo policlonal derivado de conejo (disponible comercialmente de Zhong Shan Jinqiao, número de catálogo ZA-0507).
Los anticuerpos secundarios estaban disponibles comercialmente de Jackson ImmunoResearch: anticuerpo policlonal anticabra derivado de asno marcado con Alexa Fluor 488 (n° de catálogo 705-545-147); anticuerpo policlonal de subtipo 2b de antígeno antimurino derivado de cabra marcado con Alexa Fluor 488 (n° de catálogo 115-545-207), anticuerpo policlonal de subtipo 2b de antígeno antimurino derivado de cabra marcado con Alexa Fluor 647 (n° de catálogo 115-605­ 207); anticuerpo policlonal anticonejo derivado de asno marcado con Alexa Fluor 488 (n° de catálogo 711-545-152); anticuerpo policlonal antipollo derivado de asno marcado con Alexa Fluor 488 (n° de catálogo 703-545-155).
Tal como se muestra en la Fig. 5, las células NGN3 positivas o débilmente positivas no expresaban SUSD2 o NEUROD1 y expresaban débilmente NKX2.2 el día 0 del cuarto estadio. El día 1 del cuarto estadio, el 80%, 93% y 88% de las células SUSD2+ expresaban NGN3, NKX2.2 y NEUROD1, respectivamente. Esto indica que la mayoría de las células SUSD2+ expresaban NGN3, NKX2.2 y NEUROD1 simultáneamente, es decir, esta población de células SUSD2+ tenía las características de las células progenitoras endocrinas. En el día 4 del cuarto estadio, la mayoría de las células SUSD2+ expresaban NKX2.2 o CROMOGRANlNA A (CHGA) pero no expresaban NGN3, lo que indica que esta población de células SUSD2+/NGN3- tenía las características de las células endocrinas durante este período. Además, las células SUSD2+ expresaban débilmente o no expresaban PDX1, el marcador de precursoras pancreáticas, de manera sostenida, lo que indica que SUSD2 podría usarse para marcar células progenitoras endocrinas pancreáticas y sus células endocrinas descendientes.
En todo el proceso de diferenciación, aunque parte de las células SUSD2 expresaban proteínas relacionadas con el sistema endocrino pancreático: NGN3, NKX2.2 y similares, la mayoría de las células SUSD2 no expresaban estas proteínas relacionadas con el sistema endocrino pancreático, sin embargo expresaban la proteína relacionada con el precursor pancreático PDX1, lo que indica que las células SUSD2 contienen principalmente células progenitoras pancreáticas o células de tipo no pancreático (figura 5).
Estos resultados indican que las células SUSD2+ son células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas pancreáticas nacientes, lo que demuestra adicionalmente que la expresión de la proteína codificada por el gen SUSD2 puede usarse para identificar si las células son células diana.
2.3 La detección de células SUSD2+ a nivel de ARNm mostró que las células SUSD2- y las células SUSD2+ se obtuvieron mediante separación mediante flujo, y los perfiles de expresión génica de estas dos poblaciones de células y de las células del endodermo pancreático no separadas se analizaron mediante PCR cuantitativa. Se utilizó el kit Power SYBR® Master Mix para la PCR cuantitativa (disponible comercialmente de Life Technologies, número de catálogo 4367659). Los cebadores utilizados en la amplificación se muestran en la Tabla 1 y el cebador de referencia interno era GAPDH. Consulte las instrucciones para operaciones específicas.
La Tabla 1 muestra los cebadores de amplificación
Figure imgf000009_0001
Los resultados se muestran en la fig. 6. La expresión de los genes NGN3, NEUROD1, NKX2.2, PAX4, ARX y similares relacionada con células progenitoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas se encontraba incrementada en células SUSD2+, lo que indica que eran células progenitoras endocrinas pancreáticas. o células endocrinas nacientes, mientras que la expresión de PDX1, HNF6, SOX9, PTF1A y similares relacionada con precursores pancreáticos se encontraba incrementada en células SUSD2, lo que indica que no eran células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nuevas.
3. Las células positivas para SUSD2 y las células negativas para SUSD2 se separaron con perlas magnéticas
3.1 Adquisición de células del endodermo pancreático
La línea de células madre pluripotentes humanas aisladas HI se diferenció en células del endodermo pancreático de acuerdo con el método de 1.1.
3.2. Separación celular con perlas magnéticas
Las células del endodermo pancreático se sometieron a separación celular con perlas magnéticas, en la que el anticuerpo requerido es el anticuerpo SUSD2 marcado directamente (el anticuerpo monoclonal anti-SUSD2 marcado con PE derivado de ratón estaba disponible comercialmente de BioLegend, número de catálogo 327406), los reactivos relacionados con la separación celular magnética se encontraban disponibles comercialmente de MiltenyiBiotec, y las células positivas para SUSD2 y las células negativas para SUSD2 se obtuvieron de acuerdo con las instrucciones de uso.
3.3. Detección
A. Análisis de citometría de flujo
Las células SUSD2+, las células SUSD2 y las células no separadas se analizaron mediante citometría de flujo tal como se ha indicado anteriormente. Los resultados se muestran en la fig. 7 (a). Las células SUSD2+ pudieron enriquecer las células NKX2.2+ con alta pureza, que eran células progenitoras endocrinas NGN3+ o células endocrinas nacientes (fig. 7 (a)).
B. Las células descendientes obtenidas mediante el cultivo de células positivas para SUSD2 se identificaron mediante inmunofluorescencia. Las células SUSD2+ y las células SUSD2- obtenidas mediante separación y las células del endodermo pancreático no separadas se sometieron a un cultivo prolongado in vitro. Las células diana se resuspendieron en solución de cultivo celular X y se sembraron en placas de cultivo celular recubiertas con Matrigel durante un día para que se adhirieran. Al día siguiente se retiró el medio y se lavaron las células con PBS. Las células se cultivaron durante 5 días adicionales en la solución de cultivo celular XI. Las condiciones de cultivo eran 37°C y 5% de CO2.
La solución de cultivo celular X se obtuvo por el siguiente método: DMEM-H: B27 sin vitamina A: Y27632=1 ml:10 pl:10 pM.
La solución de cultivo celular XI se obtuvo por el siguiente método: DMEM-H: B27 sin vitamina A: nogina: LIF humano: inhibidor de Alk5 II=1 ml:10 pl:250 ng:10 ng:100 nM.
Se llevó a cabo una tinción inmunohistoquímica.
Los resultados se muestran en la fig. 7 (b). Las células obtenidas mediante el cultivo de células SUSD2+ eran capaces de producir una gran cantidad de células INSULINA+, es decir, se obtuvo una gran cantidad de células endocrinas. Las células obtenidas mediante el cultivo de células SUSD2- eran principalmente células progenitoras pancreáticas PDX1+ y eran capaces de producir solo una pequeña cantidad de células INSULINA+, lo que indica que las células enriquecidas en SUSD2 eran células precursoras endocrinas pancreáticas.
Se indica que las células enriquecidas en SUSD2 son células precursoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes.
C) Trasplante en quistes renales de ratón inmunodeficiente
El trasplante de quistes renales en ratones inmunodeficientes (6 a 8 semanas) se llevó a cabo mediante la implantación de células positivas para SUSD2 y células negativas para SUSD2 obtenidas mediante separación, así como células del endodermo pancreático no separadas. Después de 19 semanas del trasplante, se recogieron los implantes y se prepararon secciones congeladas para la tinción inmunohistoquímica.
Los resultados se muestran en la fig. 7 (c). Las células SUSD2+ y SUSD2- obtenidas mediante MACS se trasplantaron en ratones y, como resultado, las células SUSD2+ pudieron producir todo tipo de células endocrinas (células beta INSULINA+, células alfa Glucagón+, células delta SST+, células épsilon Ghrelin+ y células PPY PPY), mientras que no se produjo ninguna estructura similar a un conducto, lo que indica que las células SUSD2+ son células precursoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes.
4. SUSD2 utilizado para la separación in vitro de células precursoras endocrinas pancreáticas derivadas de embriones humanos y células endocrinas nacientes.
4.1 Tinción de inmunofluorescencia de sección congelada de tejido pancreático embrionario humano
Corte de tejido: se fijó tejido pancreático fetal humano aislado con PFA al 4% a 4°C durante 2 horas y se lavó tres veces con PBS a 4°C durante un instante, 10 minutos y 2 horas, respectivamente, seguido de la introducción de las masas de tejido en solución de sacarosa al 30% a 4°C durante la noche hasta que el tejido se había asentado. Las masas de tejido resultantes se incluyeron en compuesto de temperatura de corte óptimo (O.C.T., por sus siglas en inglés) (Tissue-Tek), se congelaron en nitrógeno líquido, se cortaron en secciones de 10 pm mediante microtomo criostático Cryostat (Leica).
Las secciones resultantes se detectaron mediante el ensayo de anticuerpos inmunofluorescentes de acuerdo con 1.1, que mostró que las secciones eran células en el estadio de endodermo pancreático y que las células marcadas con SUSD2 eran células precursoras endocrinas pancreáticas y/o células endocrinas pancreáticas nacientes (fig. 8).
4.2 Enriquecimiento de células progenitoras endocrinas derivadas de páncreas de embriones humanos y células endocrinas nacientes mediante separación celular magnética
El tejido pancreático fetal se lavó dos veces con PBS frío y se cortó en pequeños trozos de 1 mm cúbico con unas tijeras oftálmicas. A continuación, los trozos fueron digeridos con solución de digestión (PRMI 1640, colagenasa IV 100 a 400 U/ml (Life Technologies), dispasa II 1,2 U/ml (Roche), ADNasa I (al 0,02%, (p/v)) y suero bovino fetal (FBS, Hyclone) al 0,5% a 37°C durante 30 minutos, y las células se dispersaron mediante pipeteado suave con una pipeta cada 5 minutos. Las células individuales digeridas se transfirieron a PRMI 1640 con FBS al 0,5% y se lavaron dos veces con PBS que contenía BSA al 0,5% y EDTA 2 mM. Las masas de tejido restantes se recogieron y se digirieron de nuevo tal como se ha indicado anteriormente. La suspensión celular resultante se filtró a través de un tamiz celular de 40 pm (BD Biosciences) y la suspensión de células individuales resultante se almacenó en PBS que contenía BSA al 0,5% y EDTA 2 mM y se dejó sobre hielo para el análisis posterior. La suspensión de células individuales resultante se sometió a separación celular magnética, y el anticuerpo deseado era el anticuerpo SUSD2 marcado directamente (anticuerpo monoclonal anti-SUSD2 marcado con PE derivado de ratón, disponible comercialmente de BioLegend, catálogo n° 327406) a fin de obtener células positivas para SUSD2 y células negativas para SUSD2.
4.3 Las células positivas se identificaron como células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes mediante PCR cuantitativa fluorescente y se cuantificaron mediante PCR cuantitativa las células positivas para SUSD2 y las células negativas para SUSD2 obtenidas mediante separación celular magnética y las células pancreáticas embrionarias no separadas a fin de detectar la expresión de genes relacionado con las células del endodermo pancreático. Para más información, consulte la sección 2.3.
Los resultados se muestran en la fig. 9. Las células positivas para SUSD2 se enriquecieron con la expresión del gen SUSD2 y también con la expresión de los genes NGN3, NEUROD1, NKX2.2, PAX4, ARX, etc.relacionados con las células progenitoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas de estadio temprano; expresaban débilmente además genes relacionados con las células progenitoras pancreáticas: PDX1, HNF6, SOX9, PTF1A, genes relacionados con células endocrinas de fase tardía: INSULINA, Gl UCAGON, PAX6, MAFB, MAFA, CROMOGRANINA A (CHGA) y el gen relacionado con células exocrinas CPA1, y similares, lo que indica que las células positivas para SUSD2 son células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes.
Por lo tanto, puede observarse que las células progenitoras endocrinas pancreáticas o las células endocrinas pancreáticas nacientes en una población de células a ensayar pueden separarse, o asistirse la separación, mediante la detección de si el gen SUSD2 como gen marcador de células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes se expresa o no; los detalles de ello son los siguientes:
Se sometió a ensayo la expresión del gen SUSD2 en las células de la población de células a ensayar, y si algunas células expresaban el gen SUSD2, estas células eran, o eran candidatas a ser, células progenitoras endocrinas pancreáticas humanas o sus células descendientes que no secretan hormonas; si algunas células no expresaban SUSD2, estas células no eran, o no eran candidatas a ser, células progenitoras endocrinas pancreáticas humanas o sus células endocrinas pancreáticas nacientes.
El método de detección se llevó a cabo mediante la detección de si las células de la población de células a ensayar contenía una proteína expresada por el gen SUSD2, en concreto mediante la detección de la expresión del gen SUSD2 a nivel de ARNm o mediante la detección de la proteína expresada por el gen SUSD2 mediante un método de anticuerpos inmunofluorescentes o mediante la detección de la proteína expresada por el gen SUSD2 mediante citometría de flujo o mediante separación de la proteína expresada por el gen SUSD2 con perlas magnéticas.
Ejemplo de referencia 2. Las células progenitoras endocrinas pancreáticas humanas o sus células progenitoras que no secretan hormonas se separaron mediante detección de la expresión del gen SUSD2

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un método para separar in vitro o asistir en la separación de células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas pancreáticas nacientes en una población de células a ensayar, que comprende las etapas de: detectar si las células en la población de células a ensayar expresan un gen SUSD2; si algunas células expresan el gen SUSD2, estas células son, o son candidatas a ser, células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes; si algunas células no expresan el gen SUSD2, estas células no son, o no son candidatas a ser, células progenitoras endocrinas pancreáticas o células endocrinas nacientes; y la secuencia de nucleótidos del gen SUSD2 se ilustra como SEC ID n° 2 en el listado de secuencias.
2. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de detectar si las células de la población de células a ensayar expresan un gen SUSD2 se lleva a cabo mediante la detección de si las células de la población de células a ensayar contienen una proteína expresada por el gen SUSD2; el método para detectar si las células en la población de células a ensayar contiene una proteína expresada por el gen SUSD2 es como sigue, 1) o 2) o 3): 1) ensayo de anticuerpos de inmunofluorescencia, usando anticuerpo monoclonal anti-SUSD2 como anticuerpo; 2) citometría de flujo, usando anticuerpos monoclonales anti-SUSD2 como losl anticuerpos; 3) separación celular con perlas magnéticas, usando anticuerpo monoclonal anti-SUSD2 como anticuerpo.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque las células a ensayar son células del endodermo pancreático.
4. Uso de la proteína SUSD2 o su gen codificante o un ARNm que codifica una proteína precursora de la proteína SUSD2 como marcador en la identificación, cribado o separación in vitro de células progenitoras endocrinas pancreáticas y/o células endocrinas pancreáticas nacientes; la secuencia de aminoácidos de la proteína SUSD2 se muestra en SEC ID n° 1 en el listado de secuencias; y la secuencia de nucleótidos del gen codificante de las proteínas SUSD2 que se muestra en SEC ID n° 2 en el listado de Secuencias.
5. Uso de un anticuerpo capaz de unirse específicamente a la proteína SUSD2 para la identificación, cribado o separación in vitro de células progenitoras endocrinas pancreáticas y/o células endocrinas pancreáticas nacientes.
6. El uso según la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo porta un marcador fluorescente y el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
7. El uso según la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque el uso es cribado o separación de células progenitoras endocrinas pancreáticas y/o células endocrinas pancreáticas nacientes a partir de células del endodérmico pancreático;
el método para cribar o separar es el método de separación de perlas inmunomagnéticas y el método de separación de la citometría de flujo;
el método de identificación es el método de inmunofluorescencia de anticuerpos y la citometría de flujo.
8. Uso de un par de cebadores, sonda o su cadena complementaria capaz de unirse específicamente a ARNm que codifica una proteína precursora de la proteína SUSD2 para la identificación in vitro de células progenitoras endocrinas pancreáticas y/o células endocrinas pancreáticas nacientes.
9. El uso según la reivindicación 8, caracterizado porque el par de cebadores consiste en la molécula de ADN monocatenario que se muestra en SEC ID n° 3 en el listado de secuencias y la molécula de ADN monocatenario que se muestra en SEC ID n° 4 en el listado de secuencias.
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