CN105793414A - 前肠干细胞的活体外生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使多能细胞(PSC)分化成前肠干细胞(FSC)，所述分化使用包含TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白质(BMP)和PI3K抑制剂的定形内胚层诱导培养基来将所述多能细胞分化成定形内胚层细胞，以及使用包含TGFβ配体的前肠诱导培养基来将所述定形内胚层细胞分化成前肠干细胞(FSC)。提供了分化的方法、前肠干细胞的群体、培养基和试剂盒。

Description

前肠干细胞的活体外生产
技术领域
本发明涉及前肠干细胞的活体外生产，该前肠干细胞用于例如内胚层谱系的细胞的生产。
背景技术
细胞系间存在的固有差异已经使得将任何hPSC细胞系分化成特定细胞类型的同质群体的通用方案的开发很困难。表观遗传记忆、不一致的重编程和遗传背景很可能是这种差异的主要原因，这对开发个性化药物[1、21]和用低外显率表现型进行疾病建模是主要挑战。扩展分化的中间阶段可能是解决这个问题的有吸引力的替代方案，尤其是在这些细胞类型可以由异质群体中分离的情况下。例如，从向神经外胚层谱系分化的hIPSC细胞系扩展，可以容易地得到神经元干细胞，并随后分化成多种神经元，从而绕过连续培育多能细胞[2]的需要。然而，对内胚层分化使用相同方法十分困难，因为控制此胚层的特化和模式化的诱导信号的复杂组合可能难以活体外模拟[3]。
发明内容
本发明人已经开发出一种确定的培养体系以从hPSC获得前肠干细胞(hFSC)。这些干细胞可以活体外自我更新，并且与前原肠管的多能性细胞的相似处在于它们分化成胰腺内胚层细胞、肝内胚层细胞和肺内胚层细胞的能力此外，hFSCs可以来源于抗内胚层分化的hIPSC细胞系，从而允许从大量hPSC细胞系生产内胚层衍生物。这可能对用于研究和治疗应用的内胚层细胞的活体外生产十分有用。
本发明的一方面提供一种用于生产前肠干细胞(FSC)的群体的方法，所述方法包括：
i)提供多能细胞(PSC)的群体，
ii)在定形内胚层诱导培养基中培养PSC以生产细胞的第一群体，所述定形内胚层诱导培养基包含TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)和PI3K抑制剂；
iii)在前肠诱导培养基中培养所述的细胞的第一群体以生产前肠干细胞(FSC)的群体，所述前肠诱导培养基包含TGFβ配体。
本发明的另一方面提供一种用于生产前肠干细胞(FSC)的群体的方法，所述方法包括：
i)提供定形内胚层细胞(DEC)的群体；
ii)在前肠诱导培养基中培养所述的DEC的群体以生产前肠干细胞(FSC)的群体，所述前肠诱导培养基包含TGFβ配体、优选活化素。
定形内胚层细胞(DEC)的群体可以是同质的或异质的。
可以在FSC维持培养基中培养或传代FSC的群体，所述FSC维持培养基包含TGFβ配体(优选活化素)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、HGF、EGF、和肝素。
本发明的另一方面提供一种用于维持前肠干细胞(FSC)的群体的方法，所述方法包括：
i)提供前肠干细胞(FSC)的群体；
ii)在FSC维持培养基中培养所述的FSC的群体，所述FSC维持培养基包含TGFβ配体(优选地为活化素)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、HGF、EGF、和肝素。
本发明的另一方面提供一种用于使前肠干细胞(FSC)的群体分化成肺祖细胞(progenitorcell)的方法，所述方法包括：
i)提供前肠干细胞(FSC)的群体；
ii)在第一肺诱导培养基中培养FSC的群体，所述第一肺诱导培养基包含RA和FGF；
iii)在中培养来自步骤iii)的细胞，所述第二肺诱导培养基包含FGF和HGF；
从而生产肺祖细胞的群体。
本发明的其它方面提供由本文所述方法生产的FSC的分离群体，以及由本文所述方法生产的FSC的分离群体用于活体外分化成更加分化的内胚层细胞的用途。
附图说明
图1示出hPSC衍生的前肠可以活体外自我更新。图1A示出使来源于hPSC的前肠内胚层干细胞分化并且繁殖的方法。图1B和图1C示出Q-PCR和免疫染色分析，所述Q-PCR和免疫染色分析表明来源于hESC(H9)和hIPSC(BBHX8、AlATD-1)的hFSC可以在维持前肠标记物(CERB、HNFlβ、HNF6、CXCR4、GATA4、HHEX、HNF4α、SOX17)的表达的情况下培育至多十代。多能性(POU5F1、NANOG)、胰腺(PDX1)、肝(AFP)和肺(NKX2.1)、肠(CDX2)的表达在繁殖期间未观察到。
图1D示出如FACS分析所示，共表达SOX17/CXCR4的hFSC近同质群体在传3代之后是明显的，并且传代超过6代后在培养下稳定。灰色群体表示仅有次级抗体的对照组。
图2示出hFSC具有分化成前肠的多种衍生物的能力。图2A示出使hFSC分化成肺细胞的方法的实例。图2B示出Q-PCR结果，所述Q-PCR结果表明在这些条件下，hFSC如Q-PCR所示上调早期肺内胚层标记物(NKX2.1、FOXP2、IRX1)以及更成熟的标记物(MUC1)。图2C示出在3D培养物中生长的所得细胞生成表达远端气道标记物(SFTPC、MUC1、CK18)的分支和囊状结构细胞团块。图2D示出使hFSC分化成胰腺细胞的方法的实例。图2E示出在这些培养条件下生长的hFSC逐渐地表达胰芽标记物(PDX1、HLXB9)，并且然后表达内分泌标记物(INS、NGN3)。图2F示出免疫染色结果，所述免疫染色结果证实C-肽和PDX1由分化25天的细胞表达。图2G示出使hFSC分化成肝细胞的方法的实例。图2h示出在分化25天之后，细胞表达肝标记物(ALB、AFP、A1AT)并且展现可诱导的细胞色素P450活性(C＝HESC，US＝未受刺激，S-受刺激)。图2I示出免疫染色结果，所述免疫染色结果证实细胞表达成熟肝细胞标记物(ALB、A1AT、CK18、HNF4α)。
图3示出hFSC的生成克服了hIPSC细胞系间的差异。图3A示出FACS分析表明共表达内胚层/前肠标记物SOX17/CXCR4的细胞在分离之前(彩色绘出)和在由hIPSC细胞系生成的具有高内胚层分化能力(BBHX8)和低内胚层分化能力(CS8、CV3和C14)的hFSC的扩展后(传5代，黑色绘出)的级分。分选门被设置至仅次级抗体对照物，灰色群体。图3B和图3C示出具有低内胚层分化能力的hIPSC不能分化成肝或胰腺细胞(COXS8(B)、COXV3(B)、4(B))，而由相同细胞系生成并且分裂5次的hFSC可以按能与阳性对照物(BBHX8)相当的水平分化成表达肝细胞(AlAT、AFP、ALBHNF4a)和胰腺细胞(GCG、PDX1、INS、NGN3)的标记物的细胞。
图4示出活体外内胚层模式化和分化的示意图。本文所述培养体系表示用于由相同原始hPSC细胞系生成多种内胚层细胞的独特平台。实际上，由hPSC生成的DE可以模式化成后肠内胚层，所述后肠内胚层可以进一步分化成肠上皮细胞或可以由简单传代来容易地分离的自我可再生的前肠内胚层细胞。这些前肠干细胞可以经历延长的传代，同时保留它们分化成肺、肝和胰腺细胞的能力。
具体实施方式
本发明涉及由多能细胞的群体活体外生产前肠干细胞(FSC)。由不同多能性细胞系均可以生产FSC，并且在本文中所示的FSC为自我更新和多能性的。FSC因此可以是用于活体外生产内胚层谱系的细胞(例如肺细胞、肝细胞和胰腺细胞)的多能性细胞的有用来源。
前肠干细胞(FSC)可以如本文所述通过以下方式生产：在包含TGFβ配体的前肠诱导培养基中培养定形内胚层细胞(DEC)的群体，并且允许DEC分化成FSC。
在一些实施方案中，前肠干细胞(FSC)可以如本文所述通过以下方式生产：在定形内胚层诱导培养基中培养多能细胞(PSC)的群体以生产包含DEC的细胞的群体，并且随后在包含TGFβ配体的前肠诱导培养基中培养细胞的群体，并且允许DEC分化成FSC。
多能细胞是这样的细胞，其显示出未分化的表现型并且潜在地能够分化成三个胚层(内胚层、中胚层和内胚层)中的任何一个的任何胎儿或成人细胞类型。多能细胞与全能细胞不同，并且不能生产胚外细胞谱系。多能细胞的群体可以克隆的，即从单个共同祖先细胞传下来的在遗传上相同的细胞。
多能细胞可以表达以下多能性相关标记物中的一种或多种：Oct4、Sox2、碱性磷酸酶、POU5fl、SSEA3、Nanog、SSEA-4、Tra-1-60、KLF-4和c-myc，优选为POU5f1、NANOG和SOX2中的一种或多种。多能细胞可以缺乏与特定的分化命运有关的标记物，诸如Bra、Sox17、FoxA2、αFP、Sox1、NCAM、GATA6、GATA4、Hand1和CDX2。具体而言，多能细胞可以缺乏与内胚层命运有关的标记物。
优选地，多能细胞是人类多能细胞。
多能细胞可以包括胚胎干细胞(ESC)和非胚胎干细胞，例如胎儿和成人干细胞以及诱导多能干细胞(IPSC)。在一些实施方案中，多能细胞不是hESC。
胚胎干细胞可以使用常规技术获得。例如，ESC细胞可以得自培养的ESC细胞系，例如hESC细胞系。众多的培养hESC细胞系可公开得自储存库(例如NIH人类胚胎干细胞登记处)，诸如CHB-1至CHB-12、RUES1至RUES3、HUES1至HUES28、HUES45、HUES48、HUES49、HUES53、HUES62至HUES66、WA01(HI)、WA07(H7)、WA09(H9)、WA13(H13)、WA14(H14)、NYUES1至NYUES7、MFS5、和UCLA1至UCLA3。合适的人类胚胎干细胞系的更多实例的描述在：ThomsonJA等人《科学》(Science)282:1145-1147(1998)；Reubinoff等人，《自然生物科技》(NatBiotechnol)18:399-404(2000)；Cowan,C.A.等人《新英格兰医学期刊》(N.Engl.J.Med.)350,13531356(2004)、Gage,F.H.等人，《神经科学年度综述》Ann.Rev.Neurosci.18159-192(1995)；和Gotlieb(2002)Annu.Rev.Neurosci25381-407)；Carpenter等人，《干细胞》StemCells.5(1):79-88(2003)。潜在临床级hESCs的描述在Klimanskaya,I.等人《柳叶刀》Lancet365,1636-1641(2005)和Ludwig,T.E.等人《自然生物科技》(Nat.Biotechnol.24,185-187(2006)。可以获得合适的hESC以用于本发明，而不会破坏人类胚胎或为了工业或商业目的来使用人类胚胎。例如，可以通过卵裂球活检技术获得hESC(Klimanskaya(2013)《生殖医学论坛》SeminReprodMed.31(l):49-55；Klimanskaya等人《自然》Nature(2006)444(7118)481-5)。
iPSC是来源于非多能性的、完全分化的祖先细胞(ancestorcell)或祖代细胞(antecedentcell)的多能细胞。合适的祖先细胞包括体细胞，诸如成人成纤维细胞和外周血液细胞。祖先细胞通常通过在细胞中引入多能基因或蛋白质(诸如Oct4、Sox2和Sox1)被重编程。基因或蛋白质可以通过任何合适技术被引入已分化细胞，所述技术包括质粒转染或更优选的病毒转染或者直接蛋白质递送。其它基因也可以被引入细胞以增加诱导效率，例如Kif基因，诸如Kif-1、Kif-2、Kif-4和Kif-5；Myc基因，诸如C-myc、L-myc和N-myc；nanog；和Lin28。在引入多能基因或蛋白质之后，可以培养祖先细胞。可以分离和/或纯化表达多能性标记物的细胞，以生产iPSC的群体。用于生产iPSC的技术是本领域众所周知的(Yamanaka等人Nature2007；448:313-7；Yamanaka62007年6月7；1(1):39-49；Kim等人Nature.2008年7月31日；454(7204):646-50；TakahashiCell.2007年11月30日；131(5):861-72.Park等人Nature.2008年1月10日；451(7175):141-6；Kimet等人CellStemCell.2009年6月5日；4(6):472-6；Vallier,L.,等人StemCells,2009.9999(999A)：p.N/A)。
优选地，多能细胞是IPSC，更优选地为人类IPSC(hIPSC)。
iPSC可以来源于体细胞，诸如具有正常(即，非疾病相关的)基因型的成纤维细胞，例如得自无遗传病症的个体的细胞。iPSC可以如本文所述使用以生产具有正常(即，非疾病相关的)基因型的FSC。这些FSC可以进一步分化成如图4所示的肺、胰腺、肝或者其它内胚层谱系，所述内胚层谱系可以用于治疗、建模或其它应用。
在一些实施方案中，多能细胞可以是IPSC，所述IPSC例如由于表观遗传效应而难以内胚层分化或抗内胚层分化(Kim等人Nature(2010)467285-290)。在DE诱导培养基中分化时，内胚层抗性hIPSC可以生产具有低DEC百分比的细胞群体(即，异质细胞群体)。甚至具有小数量的DEC的细胞群体也可用于使用本文所述方法来生产同质FSC群体。
IPSC可以得自单个个体。在一些实施方案中，多个IPSC群体可以得自包括多个个体的群体，并且用于生产如本文所述的多个FSC群体系列。
在一些实施方案中，iPSC可以来源于得自具有独特遗传背景的个体的体细胞或者其它祖代细胞。例如，iPSC可以由来自具有疾病病状的个体、具有高风险的疾病病状的个体和/或具有低风险的疾病病状的个体的细胞生产。疾病病状可以包括与内胚层组织有关的病症，例如肺、肝或胰腺病状。如本文所述由具有不同遗传背景的个体生产的FSC或由其活体外分化的细胞可以用于研究疾病病状(诸如糖尿病和肝病)的机理以及用于识别治疗靶标。
iPSC可以来源于体细胞，诸如具有疾病相关基因型的成纤维细胞，例如得自具有遗传病症的个体的细胞。遗传病症可以包括内胚层组织的病症，诸如肺、胰腺和肝病症，并且可以是单基因病症。具有疾病基因型(例如遗传突变或者缺陷)的任何细胞皆可用于生产iPSC，但成纤维细胞(例如真皮成纤维细胞)的样品可以方便地获得。
由得自具有遗传病症的个体的细胞生产的iPSC可以如本文所述使用以生产具有遗传病症的基因型的FSC。这些FSC可以进一步分化成具有疾病基因型的肺、胰腺、肝或者其它内胚层谱系。这些内胚层细胞可能在例如对遗传病症进行建模中是有用的。
在一些实施方案中，多能性细胞的群体可以得自培养的多能细胞系。常规技术可以被用于培养和维持人类多能细胞(Vallier,L.等人Dev.Biol.275,403-421(2004)，Cowan,C.A.等人N.Engl.J.Med.350,1353-1356(2004)，Joannides,A.等人StemCells24,230-235(2006)Klimanskaya,I.等人Lancet365,1636-1641(2005)，Ludwig,T.E.等人Nat.Biotechnol.24,185-187(2006))。本方法中使用的多能细胞可以在确知条件下或者在饲养层细胞上生长。例如，多能细胞可以在培养皿中以合适的密度(例如105至106细胞/60mm皿)在饲养层细胞(诸如辐照后的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF))层上，或在含有饲养条件培养基或确知成分培养基的合适基底上，常规地进行培养。本方法中使用的多能细胞可以通过酶或者机械方式传代。
多能细胞的合适培养基在本领域是众所周知的，并且包括；补充有20％血清替代物、1％非必需氨基酸、1mML-谷氨酰胺、0.1mM对巯基乙醇和4ng/ml至10ng/mlFGF2的敲除杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基(KnockoutDulbecco'sModifiedEagle'sMedium；KO-DMEM)；或者补充有4ng/mlFGF2的敲除(KS)培养基；或者补充有20％血清替代物、1％非必需氨基酸、1mML-谷氨酰胺、0.1mM对巯基乙醇和4ng/ml至10ng/ml人类FGF2的KO-DMEM；或者补充有20％敲除血清替代物(KSR)、6ng/mlFGF2(PeproTech)、1mML-谷氨酰胺、100μm非必需氨基酸、100μM2-巯基乙醇、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素的DMEM/F12。
在优选实施方案中，供本方法中使用的多能细胞的群体可以在化学成分确知培养基(CDM)中培养。
化学成分确知培养基(CDM)是用于培养细胞的营养液，所述营养液仅含有规定组分(优选地为已知化学结构的组分)。CDM不含不确定的成分或包括未确知成分的组分，所述组分诸如为饲养层细胞、间质细胞、血清、基质胶、血清白蛋白和复杂胞外基质。在一些实施方案中，化学成分确知培养基是人源化的。人源化的化学成分确知培养基不含来源于或分离自非人类动物的组分或补充物，所述组分或补充物诸如为胎牛血清(FBS)和牛血清白蛋白(BSA)、小鼠饲养细胞。条件培养基包括来自培养层细胞的未确知组分，并且化学成分上未确知。
合适的化学成分确知基础培养基，诸如高级杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(AdvancedDulbecco'smodifiedeaglemedium；DMEM)(Price等人Focus(2003)253-6)、伊斯考夫氏改良杜尔贝科氏培养基(Iscove'sModifiedDulbecco'smedium；IMDM)和RPMI-1640(Moore,G.E.和WoodsL.K.，(1976)TissueCultureAssociationManual.3,503-508；参见表1)，是本领域已知的，并且可从商业来源(例如Sigma-AldrichMIUSA；LifeTechnologiesUSA)获得。
在一些优选实施方案中，供本方法中使用的多能细胞的群体可以在包含补充有无血清培养基补充物和/或一种或多种额外组分的化学成分确知基础培养基的CDM中培养，所述额外组分例如转铁蛋白、1-硫代甘油和确知的类脂以及任选地聚乙烯醇；聚乙烯醇和胰岛素；血清白蛋白；或者血清白蛋白和胰岛素。
合适的无血清培养基补充物包括B27(Brewer等人BrainRes(1989)49465-74；Brewer等人J.NeurosciRes35567-576(1993)；Brewer等人Focus1616-9；Brewer等人(1995)J.Neurosci.Res.42:674-683；Roth等人JTraceElemMedBiol(2010)24130-137)和NS21(Chen等人J.NeurosciMeths(2008)171239-247)。无血清培养基补充物(诸如B27和N21)是本领域众所周知的，并且广泛地市售可得(例如Invitrogen；SigmaAldrichInc)。
合适的化学成分确知培养基包括CDM-PVA(Johansson和Wiles(1995)MolCellBiol15,141-151)，所述CDM-PVA包含补充有聚乙烯醇、胰岛素、转铁蛋白和确知的类脂的基础培养基，。例如，CDM-PVA培养基可以由以下组成：50％伊斯考夫氏改良杜尔贝科氏培养基(IMDM)加50％具有GlutaMAX-1TM的Ham'sF12或者50％F12NUT-MIX(Gibco，补充有1％化学成分确知的类脂浓缩物、450μM1-硫代甘油、15μg/ml转铁蛋白、1mg/ml聚乙烯醇、7μg/ml胰岛素。其它合适的化学成分确知营养培养基包括：hESC维持培养基(CDMA)，其与如上所述的CDMPVA相同，其中PVA替换为5mg/mlBSA；和补充有B27和活化素(例如至少50ng/ml)的RPMI基础培养基。
CDM-PVA培养基描述在：Vallier等人2009PLoSONE4:e6082.doi:10.1371；Vallier等人2009StemCells27:2655-2666,Touboul201051:1754-1765.Teo等人2011Genes&Dev.(2011)25:238-250和Peterson&LoringHumanStemCellManual:ALaboratoryGuide(2012)AcademicPress。
为了维持多能性，多能细胞在分化之前可以维持在补充有活化素和FGF的CDM中。例如，CDM还可以包含FGF2(例如10至20ng/ml，如12ng/ml)和活化素A(例如10ng/ml)(Vallier等人2005JCellSci118:4495-4509；Brons等人Nature.(2007)7月12日；448(7150):191-5)。
用于细胞培养的合适技术是本领域众所周知的(参见，例如，BasicCellCultureProtocols，C.Helgason，HumanaPressInc.U.S.(2004年10月15日)ISBN:1588295451；HumanCellCultureProtocols(MethodsinMolecularMedicineS.)HumanaPressInc.，U.S.(2004年12月9日)ISBN:1588292223；CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique，R.Freshney，JohnWiley&SonsInc(2005年8月2日)ISBN:0471453293、HoWY等人的JImmunolMethods.(2006)310:40-52，HandbookofStemCells(R.Lanza编辑)ISBN:0124366430)J.Pollard和J.M.Walker的BasicCellCultureProtocols'(1997)、A.Doyle和J.B.Griffiths的'MammalianCellCulture：EssentialTechniques'(1997)、A.Chiu和M.Rao的'HumanEmbryonicStemCells'(2003)、A.Bongso的StemCells:FromBenchtoBedside'(2005)、Peterson&Loring(2012)HumanStemCellManual:ALaboratoryGuideAcademicPress和K.Turksen的HumanEmbryonicStemCellProtocols'(2006)。培养基和其成分可以得自商业来源(例如Gibco、Roche、SigmaEuropabioproducts、R&DSystems)。对以上培养步骤，可以采用标准哺乳动物细胞培养条件，例如37℃、21％氧气、5％二氧化碳。优选地每两天更换培养基并且允许细胞通过重力沉降。
本方法中适用的多能细胞的群体可以是异质的，或者可以基本上不含一种或多种其它细胞类型(即，同质的)。例如可以使用本领域技术人员已知的任何技术将多能细胞与其它细胞类型分离，所述技术包括基于胞外表位识别的技术，所述识别是通过抗体和磁珠或荧光激活细胞分选(MACS或FACS)来进行，包括使用识别干细胞胞外区域存在的分子的抗体(诸如SSEA4)。
多能性细胞的群体是在定形内胚层(DE)诱导培养基中培养，以生产包含DEC的细胞群体。
DE诱导培养基优选地是化学成分确知培养基(CDM)。
合适的DE诱导培养基包含化学成分确知营养培养基和一种或多种分化因子。
化学成分确知营养培养基可以包含或由补充有一种或多种额外确知组分的基础培养基组成，所述一种或多种额外确知组分诸如聚乙烯醇、1-硫代甘油、胰岛素、转铁蛋白和确知的类脂。
合适的化学成分确知基础培养基如上所述，并且包括伊斯考夫氏改良杜尔贝科氏培养基(IMDM)、Ham'sF12、高级杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(DMEM)(Price等人Focus(2003)，253-6)、和RPMI-1640(Moore,G.E.和WoodsL.K.，(1976)TissueCultureAssociationManual.3，503-508)。
基础培养基可以在DE诱导培养基中通过无血清培养基补充物和/或额外组分进行补充。合适的补充物和额外组分如上所述，并且可以包括L-谷氨酰胺或者替代物，诸如GlutaMAX-1TM、化学成分确知的类脂、白蛋白、1-硫代甘油、聚乙烯醇、胰岛素和转铁蛋白。
供DE诱导培养基中使用的合适化学成分确知营养培养基包括如上所述的CDM-PVA和CDM-BA。
分化因子是调节(例如促进或者抑制)介导哺乳动物细胞中的分化的信号通路的因子。分化因子可以包括：生长因子；细胞因子；和调节活化素/Nodal、FGF、Wnt或BMP信号通路中的一种或多种的抑制剂。分化因子的实例包括FGF、BMP、视黄酸、TGFβ配体(诸如活化素、TGFβ或者Nodal)、GDF、LIF、IL、活化素和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂。
分化因子可以以有效对培养基中培养的细胞中的信号通路进行调节的量来存在于本文所述培养基中。
DE诱导培养基还可以包含TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)和PI3K抑制剂。DE诱导培养基可以不含除了TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)和PI3K抑制剂[4、6、7、9、20]之外的分化因子。
DE诱导培养基可以由补充有有效量的TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)和PI3K抑制剂的化学成分确知营养培养基组成。例如，DE诱导培养基可以由化学成分确知营养培养基组成，诸如CDM-PVA，其补充有活化素、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)和LY294002。
优选的DE诱导培养基可以由补充有活化素-A(10ng/mL至1ug/mL，优选地10ng/mL)、BMP4(1至100ng/mL，优选地l0ng/mL)、bFGF(2至200ng/ml，优选地20ng/mL)和LY294002(1至100μM，优选地10μM)的如上所述的CDM-PVA组成。
在其它实施方案中，DE诱导培养基可以由补充有活化素和Wnt的RPMI组成(KAD'Amour，NatBiotech，2005年12月；23(12):1534-41)。
或者，DEC可以由多能细胞通过三维细胞培养在含有活化素的含血清培养基中生产(Ogawa，S.Development2013年8月；140(15):3285-96))。
TGFβ配体是在哺乳动物细胞中刺激SMAD2和SMAD3介导胞内信号通路的TGFβ超家族的肽。TGFβ超家族的成员具有特征结构并且是本领域众所周知的。
TGFβ配体可以为活化素、TGFβ、Nodal、GDF3、GDF8、GDF10或GDF11，优选地为活化素。
活化素(活化素A：NCBIGeneID：3624核酸参考序列NM_002192.2GI：62953137、氨基酸参考序列NP_002183.1GI:4504699)是二聚多肽，其经由活化素/Nodal通路的刺激发挥各种细胞效应(Vallier等人，CellScience118:4495-4509(2005))。活化素容易从商业来源(例如StemgentInc.MADSA)获得。方便起见，本文所述培养基中的活化素的浓度可以为10至1000ng/ml，优选地为约100ng/ml。
TGFβ(NCBIGeneID：7040核酸参考序列NM_000660.4GI：260655621、氨基酸参考序列NP_000651.3GI:63025222)是调控增殖和分化的同二聚多肽(Watabe,T.等人(2009).CellRes.19:103-115)。重组体人类TGFβ容易从商业来源(例如StemgentInc.MADSA)获得。方便起见，培养基中的TGFβ的浓度可以为10至1000ng/ml，优选地为约100ng/ml。
Nodal(NCBIGeneID4838核酸序列参考号NM_018055.4GI:222352097、氨基酸序列参考号NP_060525.3GI:222352098)是调控分化的TGFβ超家族的成员(Hamada等人Nat.Rev.Genet.3(2)：103-13)。Nodal容易地从商业来源(例如AbeamLtd，UK)获得。方便起见，培养基中的Nodal的浓度可以为10至1000ng/ml，优选地为约100ng/ml。
GDF3(NCBIGeneID9573核酸序列参考号NM_020634.1GI:10190669、氨基酸序列参考号NP_065685.1GI:10190670)是TGFβ超家族的成员，其特征为被切割以生产含有七个保守半胱氨酸残基的成熟GDF3蛋白质的多元蛋白水解加工位点。方便起见，培养基中的GDF3的浓度可以为10至1000ng/ml，优选地为约100ng/ml。
GDF8(也称为MSTN；NCBIGeneID2660核酸序列参考号NM_005259.2GI:149408158、氨基酸序列参考号NP_005250.1GI：4885259)是TGFβ超家族的另一成员，特征为被切割以生产含有七个保守半胱氨酸残基的成熟GDF8蛋白质的多元蛋白水解加工位点。方便起见，培养基中GDF8的浓度可以为10至1000ng/ml，优选地为约100ng/ml(Hannan等人CloningStemCells.2009年9月；11(3):427-35)。
GDF10(也称为BMP3B；NCBIGeneID2662核酸序列参考号NM_005811.3GI:223941867、氨基酸序列参考号NP_004953.1GI：4826740)是TGFβ超家族的另一成员，特征为被切割以生产含有七种保守半胱氨酸残基的成熟GDF8蛋白质的多元蛋白水解加工位点。方便起见，培养基中GDF8的浓度可以为10至1000ng/ml，优选地为约100ng/ml(Hannan等人CloningStemCells.2009年9月；11(3):427-35)。
GDF11(也称为BMP11；NCBIGeneID10220核酸序列参考号NM_004962.3GI:325652088、氨基酸序列参考号NP_005802.1GI：5031613)是TGFβ超家族的另一成员，特征为被切割以生产含有七个保守半胱氨酸残基的成熟GDF8蛋白质的多元蛋白水解加工位点。方便起见，培养基中GDF8的浓度可以为10至1000ng/ml，优选地为约100ng/ml(Hannan等人CloningStemCells.2009年9月；11(3):427-35)。
成纤维细胞生长因子(FGF)是通过结合至成纤维细胞生长因子受体(FGFR)来刺激细胞生长、增殖和细胞分化的蛋白质因子。合适的成纤维细胞生长因子包括FGF家族中的任何成员，例如FGF1至FGF14和FGF15至FGF23中的任何一个。
优选地，FGF为FGF2(又名bFGF、NCBIGeneID：2247、核酸序列NM_002006.3GI：41352694、氨基酸序列NP_001997.4GI：41352695)；FGF7(又名角化细胞生长因子(或者KGF)、NCBIGenelD：2247、核酸序列NM_002006.3GI：41352694、氨基酸序列NP_001997.4GI：41352695)；或者FGF10(NCBIGeneID：2247、核酸序列NM_002006.3GI：41352694、氨基酸序列NP_001997.4：41352695)。最优选地，成纤维细胞生长因子为FGF2。
成纤维细胞生长因子(诸如FGF2、FGF7和FGF10)可以使用常规重组体技术生产或者得自商业供应商(例如R&DSystems，Minneapolis，MN；StemgentIncUSA)。
肝细胞生长因子(HGF)(NCBIGeneID:3082、核酸序列NM_000601.4GI:58533168、氨基酸序列NP_000592.3GI:33859835)是通过结合至c-Met受体来调节细胞生长、细胞运动性和形态发生的细胞因子。方便起见，细胞培养基中的HGF的浓度可以在5至500ng/ml范围内，优选地为约20ng/ml或50ng/ml。
肝细胞生长因子(HGF)可以使用常规重组体技术生产或者得自商业供应商(例如R&DSystems，Minneapolis，MN；StemgentInc,USA)。
骨形态发生蛋白(BMP)骨形态形成蛋白(BoneMorphogenicProteins)结合至骨形态形成蛋白受体(MorphogenicProteinReceptors；BMPR)，并且通过由SMAD1、SMAD5和SMAD9介导的通路来刺激胞内信号。合适的骨形态形成蛋白包括BMP家族中的任何成员，例如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6或者BMP7。优选地，第二TGFβ配体为BMP2(NCBIGeneID:650核酸序列NM_001200.2GI:80861484；氨基酸序列NP_001191.1GI:4557369)或者BMP4(NCBIGeneID:652、核酸序列NM_001202.3GI:157276592；氨基酸序列NP_001193.2GI:157276593)。合适的BMP包括BMP4。方便起见，本文所述培养基中的骨形态形成蛋白(诸如BMP2或者BMP4)的浓度可以在1至500ng/ml范围内，优选地为约10ng/ml。
骨形态形成蛋白可以使用常规重组体技术生产或者得自商业供应商(例如R&DSystems，Minneapolis，USA、StemgentInc,USA)。
视黄酸(2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯酸)为通过结合至视黄酸受体(RAR)来调节转录以及调节各种细胞类型的分化的维生素A代谢产物。优选地，在本文所述培养基中采用全反式视黄酸。
方便起见，培养基中的视黄酸的浓度可以为1至10μM，优选地为约2μM。
视黄酸可来自商业供应商(例如SigmaAldrich，USA；StemgentInc，USA)。
PI3K抑制剂抑制磷脂酰肌醇3-激酶的活性，诸如磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶(EC2.7.1.153)。
合适的PI3K抑制剂包括渥曼青霉素(wortmannin)；LY301497(17-b-羟基渥曼青霉素)；LY294002(2-吗啉-4-基-8-苯基苯并吡喃-4-酮：Maclean等人(2007)StemCells2529-38)；CLB1309(KN309：(±)-2-({1—[7-甲基-2-(吗啉-4-基)-4-氧吡啶并[1,2-a]吡啶-9-基]乙基}氨基)安息香酸)；PX-866((1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯-l-基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基环戊烯并[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H-三酮)；IC87114(2-喹诺酮吡咯并吡啶)；GDC-0941(2-(lH-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲磺酰)-1-哌嗪基]甲基]-4-(4-吗啉基)-噻吩并[3,2-d]嘧啶)；TGX-221(7-甲基-2-(4-吗啉基)-9-[1-(苯基氨基)乙基]-4H-吡啶并[1,2-a]吡啶-4-酮)，槲皮素；BEZ235；XL147；X1765；PX-866；ZSTK474(2-(2-二氟代甲基苯并咪唑-1-基)4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪)；和SF1126(2-[2-甲氧基乙胺基]-8-苯基-4H-l-苯并吡喃-4-酮)。其它PI3K抑制剂存在于本领域。
在一些优选实施方案中，PI3K抑制剂为LY294002。
合适的PI3K抑制剂可以得自商业供应商(例如CalbiochemCAUSA)。
例如，培养基可以含有1至100μMPI3K抑制剂，诸如LY294002，优选地为约10μm。
人类多能细胞可以在DE诱导培养基中培养1至6天，优选地约3天，以生产包含定形内胚层细胞(DEC)的细胞的群体。
DE诱导培养基中的多能细胞分化成包含定形内胚层细胞(DEC)或由定形内胚层细胞(DEC)组成的细胞群体。
在一些实施方案中，细胞群体可以是DEC的同质或基本同质群体。例如，细胞群体中的80％或更多、90％或更多、95％或更多、98％或更多、或最优选地所有细胞可以是DEC。
在其它实施方案中，细胞群体可以是包含DEC和一种或多种其它细胞类型的异质群体。例如，细胞群体中的40％或更少、30％或更少、20％或更少、或者10％或更少的细胞可以是DEC。
除DEC之外，该群体可以包括成纤维细胞、中胚层、外胚层、滋养外胚层和/或多能细胞。
DEC是内胚层谱系的早期细胞。与多能性细胞相比，DEC具有降低的分化潜力，并且显示出部分分化的内胚层表现型。DEC被定向至内胚层原胚层中的谱系，并且潜在地能够进一步地分化成内胚层胚层的任何胎儿或成年细胞类型。例如，DEC可以在合适的条件下分化成肝、胰腺、肺、肠和甲状腺中的所有细胞类型。在一些实施方案中，DEC可以称为“专能”。DEC不能生产胚外、中胚层或神经外胚层细胞谱系。
DEC可以表达Sox17、foxA2、GSC、Mixl1、Lhx1、CXCR4、GATA4、脱中胚蛋白(EOMES)、Mixl1、HNF-3β、Cerberus、OTX4、古斯卡德(goosecoid)、C-kit、CD99、和Hex。通常，DEC的特征为CXCR4和Sox17的表达。
DEC可以缺乏与特定内胚层谱系有关的标记物，例如肠、胰腺、肝或肺标记物。例如，DEC可以不表达SOX2(前肠)、CDX2(中后肠)、PDX1、PTF1a(胰腺)、AFP(肝)、Nkx2.1或TBX1(肺)。
DEC还可以缺乏与多能性有关的标记物，诸如Oct4、Sox2、碱性磷酸酶、POU5fl、SSEA-3、Nanog、SSEA-4、Tra-1-60、KLF-4和c-myc，以及与胚外、中胚层或神经外胚层细胞谱系有关的标记物。
包含DEC的细胞群体在前肠诱导培养基中进行培养以使得DEC分化成FSC。
前肠诱导培养基优选地为化学成分确知培养基(CDM)。
合适的前肠诱导培养基可以包含化学成分确知营养培养基和一种或多种分化因子。合适的化学成分确知营养培养基在以上更详细地描述。例如，前肠诱导培养基可以包含基础培养基，诸如RPMI，其补充有诸如B27的无血清培养基补充物。
前肠诱导培养基还可以包含TGFβ配体，优选地为活化素。例如，该培养基可以包含活化素-A。
TGFβ配体可以以有效量存在于培养基中，例如5至500ng/mL，优选地为50ng/mL。
前肠诱导培养基可以不含除TGFβ配体之外的分化因子。例如前肠诱导培养基可以由补充有TGFβ配体的化学成分确知营养培养基组成。优选地，TGFβ配体为活化素。
优选地，前肠诱导培养基含有合适的分化因子以刺激细胞中的TGFβ信号通路，而不刺激其它信号通路，诸如Wnt信号。
在一些实施方案中，前肠诱导培养基可以不含BMP拮抗剂(诸如诺金(noggin))和活化素/TGFβ拮抗剂(诸如SB431542)。
包含DEC的细胞群体可以在前肠诱导培养基中培养2至5天，优选地3-4天，以允许DEC分化成FSC。
FSC可以表达HNF4α、SOX17、CXCR4、EpCAM、HNF1β、GATA4、Cer、HNF6、HNFlbeta、SOX2、HHEX、和HOXA3中的一种或多种，优选地表达其中所有。例如，群体中的细胞的至少50％可以表达SOX2、HHEX、和HOXA3。
FSC可以缺乏对CDX2或者HOXC5的表达。FSC可以还缺乏对多能标记物的表达，所述多能标记物诸如Oct4、Sox2、碱性磷酸酶、SSEA-3、Nanog、SSEA-4、Tra-1-60、KLF-4和POU5fl，以及与外胚层或者中胚层谱系有关的标记物。
FSC可以缺乏对内胚层的组织标记物的表达，例如肺标记物(诸如NKX2.1)、肝标记物(诸如AFP)、或者胰腺标记物(诸如PDX1标记物)。
包含DEC的细胞群体的分化程度可以在细胞培养期间通过监控和/或检测分化细胞的群体中的一种或多种细胞标记物的表达来确定。例如，可以确定FSC的标记物特征的表达增加或者DEC的标记物特征的表达减少。
可以通过任何适用技术确定细胞标记物的表达，所述技术包括免疫细胞化学、免疫荧光、RT-PCR、免疫印迹法、荧光激活细胞分类术(FACS)、和酶法分析。
如上所述的方法还可以包括监控和/或检测细胞群体中的一种或多种FSC标记物的存在和/或一种或多种DEC的不存在。
如上所述的方法还可以包括例如根据一种或多种FSC标记物的表达的存在来将群体中的一种或多种细胞识别为FSC。
在一些实施方案中，例如当细胞群体是DEC的基本同质群体时，如本文所述细胞群体中的DEC的分化可以生产基本无其它细胞类型的FSC群体。例如在前肠诱导培养基中培养后，群体可以含有85％或者更多、90％或者更多、95％或者更多、98％或者更多的FSC。
优选地，FSC的群体充分地不含其它细胞类型，从而不需要纯化。
在其它实施方案中，例如当细胞群体为包括诸如成纤维细胞、外胚层细胞、中胚层细胞、多能细胞和滋养外胚层细胞以及FSC的其它细胞类型的异质群体时，该群体在前肠诱导培养基中培养后可以含有60％或者更少，50％或者更少，40％或者更少，或者30％或者更少的FSC。
如果需要，FSC可以使用本领域技术人士已知的任何技术与群体中的其它细胞类型分离，所述技术包括基于对胞外表位进行识别的那些技术，所述识别是通过抗体和磁珠或荧光激活细胞分选(MACS或FACS)来进行，包括使用针对如上所述的特征标记物的胞外区域的抗体。
在优选实施方案中，FSC可以通过在FSC维持培养基中培养来与群体中的其它细胞类型分离，如本文所述。例如，FSC的基本同质或纯的群体可以通过在FSC维持培养基中的五代或更多的传代来生产。
本发明的另一方面提供分离的FSC群体，优选地为通过如上所述的方法提供的分离的FSC群体。
如上所述，分离的群体中的各FSC能够活体外自我更新。各FSC还是专能的，并且能够分化成肺部细胞谱系、肝细胞谱系和胰腺细胞谱系中的任何一种(即，无谱系限制)。通过本文所述方法生产的FSC不具有前部前肠特性或后部前肠特性，并且可以分化成前部前肠谱系和后部前肠谱系。FSC因此具有比前部前肠祖细胞或后部前肠祖细胞更大的分化能力。
如本文所述FSC是可培养的，并且可以活体外连续扩展，同时保留它们的分化能力(即，FSC保持多能性)。对可以活体外维持的FSC的稳定群体的分离先前尚未报道。
优选地，hFSC的群体是同质或者基本同质的。
分离的FSC可由来源于个体的iPSC生产，并且可具有与个体相同的基因型。例如，FSC可具有疾病相关基因型，例如内胚层病状相关基因型。
不仅是自我更新和多能的，如本文所述生产的FSC群体是同质的，并且由畸胎瘤试验证明是非致癌的，并且可以用于生产内胚层细胞。特别地，FSC可以用于为再生医学或其它应用生产大量的临床相关细胞。
本发明的另一方面提供将如上所述生产的分离的FSC群体用于内胚层细胞的活体外生产的用途。
在前肠诱导培养基中培养之后，可以分离、培养、扩展或维持FSC的群体。
在一些优选实施方案中，FSC的群体可以在FSC维持培养基中培养。这在富集FSC群体并且去除非FSC群体中可能特别有用。
FSC维持培养基是化学成分确知培养基。
合适的FSC维持培养基可以包含化学成分确知营养培养基和一种或多种分化因子。
合适的化学成分确知营养培养基如上所述。
例如，供FSC维持培养基中使用的合适的化学成分确知营养培养基可以包含或由补充有B27的基础培养基(诸如RPMI)组成。
FSC维持培养基还可以包含TGFβ配体(优选地为活化素)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生的蛋白(BMP)、HGF、EGF、和肝素。
本发明的另一方面提供用于维持前肠干细胞(FSC)的群体的方法，所述方法包括：
i)提供前肠干细胞(FSC)的群体；和，
ii)在FSC维持培养基中培养FSC的群体，所述FSC维持培养基包含TGFβ配体(优选地为活化素)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、HGF、EGF、和肝素。
在一些实施方案中，FSC维持培养基可以不含除TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、HGF、EGF、和肝素之外的分化因子。例如，FSC维持培养基可以由补充有TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、HGF、EGF和肝素的化学成分确知营养培养基组成。优选地，TGFβ配体为活化素。
FSC维持培养基可以包含或由补充有B27和分化因子的RPMI基础培养基组成，所述分化因子为：活化素-A(例如1至100ng/mL，优选地为10ng/mL)、bFGF(例如2至200ng/mL优选地为20ng/mL)、BMP(例如1至100ng/mL，优选地为10ng/mL)、HGF(例如2至200ng/mL，优选地20ng/mL)、EGF(例如5至500ng/mL，优选地50ng/mL)和肝素(0.1ug至10ug，优选地为1ng)。
优选地，FSC的群体在FSC维持培养基中传代至少五次。
FSC的群体在FSC维持培养基中的传代富集该群体的FSC内容物并且去除群体的非FSC内容物。例如，在该维持培养基中传代五次之后，群体可以含有至少90％，至少95％，至少98％或者优选地100％的FSC。
如上所述生产并且任选地维持之后，可以存储FSC的群体或者留作随后的使用。
FSC的群体可以进一步分化成更特定的内胚层谱系和/或分化内胚层细胞。例如，FSC可以分化成胰腺谱系细胞(诸如胰腺内胚层细胞(PDX+、HLXB9+)、或者胰腺祖细胞(PDX+、NGN3+、INS+)、肝谱系细胞(诸如肝内胚层细胞(AFP+、HEX+、HNF4a+)或者肝祖细胞(Alb+、A1AT+、HNF4a+)或者肺部谱系细胞(诸如肺部内胚层细胞(NKX2.1+、FOXP2+)和肺部祖细胞(NKX2.1+、GATA6+、SFTP-C+)。
FSC作为分化基底的用途允许内胚层细胞一致地由不考虑来源的多能细胞群体生产。特别地，内胚层细胞可以一致地由难以内胚层分化的iPSC系生产。
可以分离、培养、扩展或者维持通过PSC的分化生产的内胚层细胞的群体。
在一些实施方案中，定形内胚层细胞的群体可以分化成肝谱系细胞，例如肝细胞、肝的祖细胞或者肝内胚层细胞。合适的用于肝分化的方法在本领域中是可得的(参见例如WO2012/025725；Yusa等人Nature.2011年10月12日；478(7369):391-4；Cho等人Diabetologia.2012年12月；55(12):3284-95；Hannan等人NatProtoc.2013年1月31日；8(2):430-7；Touboul等人Hepatology.2010年5月；51(5):1754-65；Si-Tayeb等人Hepatology.2010年1月；51(1):297-305；Song等人CellRes.2009年11月；19(11):1233-42；Zhao等人PLoSOne.2009年7月31日；4(7):e6468；Hay等人ProcNatlAcadSciUSA.2008年8月26日；105(34):12301-6。Baharvand等人Differentiation.2008年5月；76(5):465-77。Agarwal等人StemCells.2008年5月；26(5):1117-27。Cai等人Hepatology.2007年5月；45(5):1229-39；CaiJ，等人JMolCellBiol2(1):50-60；D'Amour,K.A.等人(2006),NatBiotechnol24(11):1392-401；Jiang,W.等人(2007)CellRes17(4):333-44。
简单地说，如上所述的方法中的任何一个还可以包括；
在肝诱导培养基中培养如上所述生产的FSC的群体以生产肝祖细胞的群体，
其中，肝的诱导培养基是包含BMP和FGF的化学成分确知培养基。
合适的肝诱导培养基可以包括补充有一种或多种额外因子(优选地为重组体人类因子)的化学成分确知基础培养基，所述额外因子诱导FSC分化成肝祖细胞。
合适的化学成分确知基础培养基包括如上所述的优选地补充有B27补充物的RPMI-1640。CDM可以补充有BMP(优选地为BMP4(例如1至100ng/mL，优选地10ng/mL))和FGF(优选地为FGF10(例如1至100ng/mL，优选地为10ng/mL))。
FSC的群体可以培养3至5天，优选地约4天，以生产肝祖细胞的群体。
任选地，肝祖细胞可以进一步分化。例如，方法还可以包括在肝成熟培养基中培养肝祖细胞的群体以生产肝细胞的群体。
合适的肝成熟培养基可以由补充有无血清培养基补充物(诸如B27)和任选地额外因子(优选地为重组体人类因子)的化学成分确知基础培养基组成，以诱导肝祖细胞熟化为肝祖细胞。合适的化学成分确知基础培养基包括CMRL、hepatozymeSFM.(GIBCOTM；InvitrogenInc)和肝细胞基础培养基(Lonza)。CMRL基础培养基是无血清基础培养基，并且容易地从商业来源获得(例如CatNo:11530037Invitrogen；产品号C0422Sigma)。HepatozymeSFM是可得自商业来源的无血清基础培养基(例如CatNo17705；Invitrogen)。
化学成分确知基础培养基可以用诱导肝祖细胞分化且熟化成为肝细胞的一种或多种因子补充。例如，基础培养基可以补充有例如5至500ng/mL优选地为50ng/mL)的肝细胞生长因子(HGF)或表皮生长因子(EGF)。
化学成分确知基础培养基还可以补充有诱导肝细胞的分化和熟化的一种或多种因子，诸如制瘤素-M。
合适的熟化培养基可以包含诸如肝细胞基础培养基或HepatozymeSFM的化学成分确知基础培养基，所述化学成分确知培养基补充有无血清培养基补充物，诸如B27，并且还补充有制瘤素M(例如50ng/mL)和HGF(例如50ng/mL)。
肝祖细胞的群体可以培养10至40天，优选地约25天，以生产肝细胞的群体。
用于分化成肝祖细胞和肝细胞的合适的技术、培养基和试剂描述于：W02012/025725；Yusa等人Nature.2011年10月12日；478(7369):391-4和Cho等人Diabetologia.2012年12月；55(12):3284-95。
在一些实施方案中，FSC的群体可以分化成胰腺内胚层或者祖细胞。用于胰腺分化的合适方法在本领域中是可得的(参见例如Cho等人Diabetologia.2012年12月；55(12):3284-95；D'Amour等人,2006)、Jiang等人,2007、Cai等人,2010)。
简单地说，如上所述的方法还可以包括；
在第一胰腺诱导培养基中培养FSC的群体以生产背侧前肠细胞的群体，所述第一胰腺诱导培养基包含活化素拮抗剂；FGF；视黄酸；和BMP抑制剂；
在第二胰腺诱导培养基中培养背侧前肠细胞，所述第二胰腺诱导培养基包含FGF、视黄酸、BMP抑制剂、和刺猬蛋白(hedgehog)信号抑制剂，并且然后；
在包含FGF的分化因子的第三胰腺诱导培养基中培养所述细胞；
从而生产胰腺祖细胞的群体。
合适的第一胰腺诱导培养基可以为包含活化素/TGFβ拮抗剂；FGF；视黄酸；和BMP拮抗剂的化学成分确知培养基(CDM)。在一些实施方案中，这些可以是培养基中的仅有分化因子。例如，第一胰腺诱导培养基可以由诸如高级DMEM的化学成分确知基础培养基组成，所述化学成分确知基础培养基补充有活化素/TGFβ拮抗剂(优选地为SB-431542(例如5至25μM，优选地为约10μM))、FGF(优选地为FGF10(例如5至100ng/ml，优选地为约50ng/ml))、视黄酸(例如0.5至20μM，优选地为约2μM)和BMP拮抗剂(优选地为诺金(例如100至500ng/ml)。
优选地，FSC的群体可以培养2至4天，最优选地3天，以生产背侧前肠细胞的群体。
合适的第二胰腺诱导培养基可以是包含FGF、BMP抑制剂、视黄酸、和刺猬蛋白信号抑制剂的化学成分确知培养基(CDM)。在一些实施方案中，这些可以是培养基中的仅有分化因子。例如，第二胰腺诱导培养基可以由诸如高级DMEM的化学成分确知基础培养基组成，所述化学成分确知基础培养基补充有FGF(优选地为FGF10(例如5至100ng/ml，优选地为约50ng/ml))；视黄酸(例如0.5至20μM，优选地为约2μM)；刺猬蛋白信号抑制剂(优选地为KAAD-环巴胺(例如0.1至1μM，优选地为0.25μM))；和BMP拮抗剂(优选地为诺金(例如5至500ng/ml或者100至500ng/ml，优选地为约50ng/ml))。
背侧前肠细胞可以在第二胰腺诱导培养基中培养2至4天，最优选地3天。
合适的第三胰腺诱导培养基可以是包含FGF的化学成分确知培养基(CDM)。在一些实施方案中，FGF可以是培养基中的唯一分化因子。例如，第三胰腺诱导培养基可以由诸如高级DMEM的化学成分确知基础培养基组成，所述化学成分确知基础培养基补充有FGF，优选地为FGF10(例如5至100ng/ml，优选地约50ng/ml)。
细胞可以在第三胰腺诱导培养基中培养2至4天，最优选地3天，以生产胰腺祖细胞的群体。
任选地，胰腺祖细胞可以进一步分化和/或熟化成为胰腺内分泌细胞。例如，可以通过i)在第一内分泌诱导培养基中培养和ii)在第二内分泌诱导培养基中培养以生产胰腺内分泌的细胞的群体，将胰腺细胞熟化，其中第一内分泌诱导培养基是包含Notch信号抑制剂和视黄酸的化学成分确知培养基；并且第二内分泌诱导培养基是不含除了视黄酸之外的分化因子的化学成分确知培养基。
合适的第一内分泌诱导培养基可以是补充有无血清培养基补充物(诸如B27)的化学成分确知培养基(CDM)；其还包含Notch信号抑制剂和视黄酸。在一些实施方案中，Notch信号抑制剂和视黄酸可以是培养基中的唯一分化因子。第一内分泌诱导培养基可以由诸如高级DMEM的化学成分确知基础培养基组成，所述化学成分确知基础培养基补充有B27和Notch信号抑制剂，优选地为N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-1-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁基酯(DAPT)(例如0.1至10mM，优选地为约1mM)。
胰腺祖细胞可以在第一内分泌诱导培养基中培养2至4天，最优选地3天。
合适的第二内分泌诱导培养基可以是诸如高级DMEM的化学成分确知培养基(CDM)，其补充有B27，而无额外的分化因子，。
胰腺祖细胞可以在第二内分泌诱导培养基中培养2至4天，最优选地3天。
通过本方法生产的胰腺细胞可以表达胰腺标记物，诸如PDX1、INS、NGN2、NGN3和SST。
所述细胞中的至少80％在第一内分泌诱导培养基中可以表达PDX1。所述细胞可以顺序地表达早期胰腺标记物(HLXB9、PDX1)，然后是内分泌祖细胞标记物(Ngn3)和最终β-细胞标记物(胰岛素(Insulin))。
用于胰腺内分泌细胞的分化和熟化的合适的方案、试剂和培养基在本领域中是可得的(参见KroonE等人(2008)NatBiotechnol26:443-452和Cho等人Diabetologia.2012年12月；55(12):3284-95)。
在一些实施方案中，FSC的群体可以分化成肺部谱系的细胞，例如肺部祖细胞或者肺部内胚层细胞。
FSC可以通过在诱导肺部特化的条件下培养，分化成肺部细胞。例如，FSC可以通过包括以下的方法分化成肺部细胞；
iii)在包含RA和FGF的第一肺部诱导培养基中培养FSC的群体；
iv)在包含FGF和HGF的第二肺部诱导培养基中培养来自步骤iii)的细胞；
从而生产肺部祖细胞的群体。
合适的第一肺部诱导培养基可以是包含FGF和RA的化学成分确知培养基(CDM)。在一些实施方案中，FGF和RA可以是培养基中的仅有分化因子。例如，第一肺部诱导培养基可以由诸如高级DMEM的化学成分确知基础培养基组成，所述化学成分确知基础培养基补充有FGF(优选地为FGF10(例如10至1000ng/ml，优选地为约100ng/ml))和视黄酸(例如0.3至30uM，优选地为约3uM)。
肺部祖细胞可以表达早期肺部标记物Nkx2.1、FOXP2和IRX1。
肺部祖细胞可以表达肺II型肺泡细胞标记物NKX2.1、ABCA3、MUC1和远侧气道标记物NKX2.1、CK18、CFTR、SFTPC、GATA6。
在一些优选实施方案中，肺部祖细胞可以是表达表面活性蛋白-C、粘蛋白1和NKX2.1的II型肺细胞。肺部祖细胞可展现出II型肺细胞的一种或多种活性，例如经由囊状纤维化跨膜受体的离子传递以及分化成I型肺细胞的能力。
本发明的其它方面提供II型肺细胞的分离群体，和FSC在生产II型肺细胞的群体的方法(例如上所述的方法)中的用途。
如本文所述生产的分离的FSC群体可以用于筛选。
本发明的另一方面提供筛选化合物的方法，所述方法包括；
用测试化合物接触如上所述的分离FSC，和；
确定测试化合物对所述前肠干细胞的作用和/或所述前肠干细胞对测试化合物的作用。
可以在测试化合物的存在(相对于不存在)下确定FSC的增殖、生长或生存力或者它们的分化或执行一种或多种细胞功能的能力。分化、增殖、生长、生存力或者执行一种或多种细胞功能的能力的降低表明该化合物具有毒性效应，并且生长、生存力或者执行一种或多种细胞功能的能力的增加表明化合物具有改良效应。
由分离FSC生产的细胞群体还可以用于筛选。例如，筛选化合物的方法可以包括；
用测试化合物接触如上所述生产的肝祖细胞、胰腺祖细胞或肺部祖细胞，和；
确定测试化合物对所述祖细胞的作用和/或所述祖细胞对测试化合物的作用。
本发明的另一方面提供用于生产FSC的试剂盒，所述试剂盒包括；
如上所述的前肠诱导培养基，例如由补充有TGFβ配体(优选地为活化素)的化学成分确知营养培养基组成的CDM培养基。
该试剂盒还可以包含如上所述的DE诱导培养基，例如由补充有TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)和PI3K抑制剂的化学成分确知营养培养基组成的培养基。
试剂盒还可以包含如上所述的FSC维持培养基，例如由补充有TGFβ配体(优选地为活化素)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、HGF、EGF、和肝素的化学成分确知营养培养基组成的培养基。
试剂盒还可以包含以下中的一种或多种；肝诱导培养基、肝成熟培养基、第一胰腺诱导培养基、第二胰腺诱导培养基、第三胰腺诱导培养基、第一内分泌诱导培养基、第二内分泌诱导培养基、第一肺部诱导培养基和第二肺部诱导培养基。合适的培养基如上所述。
本发明的另一方面提供用于维持FSC的试剂盒，所述试剂盒包括；
FSC维持培养基，其由补充有有效量的TGFβ配体(优选地为活化素)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、HGF、EGF、和肝素的化学成分确知营养培养基组成。
如本文其它地方描述，培养基可以补充有有效量的以上阐述的分化因子。
试剂盒中的一种或多种培养基可以在去离子的蒸馏水中配制。一种或多种培养基通常在使用前，例如通过紫外光、加热、辐照或者过滤灭菌，以防止污染。一种或多种培养基可以被冷冻(例如-20℃或者-80℃)用于储存或者运输。一种或多种培养基可以含有一种或多种抗生素以防止污染。
一种或多种培养基可以是1x制剂或者更浓缩的制剂，例如2x至250x浓缩培养基制剂。在1x制剂中，培养基中的各成分处于旨在用于细胞培养的浓度，例如以上阐述的浓度。在浓缩制剂中，所述成分中的一种或多种以比旨在用于细胞培养而言更高的浓度存在。浓缩培养基是本领域众所周知的。培养基可以使用已知方法来浓缩，例如盐沉淀或者选择性过滤。浓缩培养基可以用水(优选地被去离子化并且蒸馏)或者任何合适的溶液(例如盐水溶液、缓冲剂水溶液或者培养基)稀释。
试剂盒中的一种或多种培养基可以被容纳在密封容器中。该密封容器可以被优选用于培养基的运输或者储存以防止污染。该容器可以为任何合适的容器，诸如烧瓶、平皿、瓶子、罐子、小瓶或者袋子。
本发明的另一方面提供如本文所述前肠诱导培养基在DEC活体外分化成FSC中的用途。
本发明的另一方面提供如本文所述前肠诱导培养基和DE诱导培养基在多能细胞活体外分化成FSC中的用途。
本发明的另一方面提供如本文所述FSC维持培养基用于FSC的活体外培养的用途。
本发明的其它方面和实施方案提供其中术语“包含”被“由...组成”替代的如上所述的方面和实施方案，以及其中术语“包含”被术语“基本上由...组成”替代的如上所述的方面和实施方案。
应理解，本申请公开如上所述的以上方面和实施方案中的任一者与彼此的所有组合，除非上下文另外要求。类似地，本申请以单独或与其它方面中的任一者一起的方式公开优选和/或任选的特征的所有组合，除非上下文另外要求。
对以上实施方案的修改、其它实施方案和对其的修改对于技术人员而言在读到此公开时将显而易见，并且因而，这些修改和实施方案是处于本发明的范围内。
在此说明书中提及的所有文献和序列数据库条目出于所有目的按其全文以引用方式并入本文。
本文中使用“和/或”之处应理解为对两个特定特征或组分中的每一者与或不与另一者一起进行特定公开。例如“A和/或B”应理解为对(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一者进行特定公开，正如本文中对每一者进行个别阐述一般。
本发明的某些方面和实施方案现在将以例举方式且参照上述附图来说明。
实验
方法
人类ES和IPS细胞培养
如先前描述[5-7、17、18]，使用活化素-A(10ng/mL)和bFGF(12ng/mL)，使hESC(H9)和hIPSC(BBHX8、A1ATD-1、C0XV3、C0XS8、Line4和IPS40)化学成分确知无饲养层培养体系中培养。使用胶原酶IV或胶原酶与分散酶的1:1比率的混合物，使细胞每七天传代。
hPSC分化成内胚层
如先前描述[4、6、7、9]，使用CDM-PVA和活化素-A(100ng/mL)、BMP4(10ng/mL)、bFGF(20ng/mL)、LY294002(10μM)，历时3天使细胞分化成定形内胚层。
定形内胚层的模式化
DE细胞在具有活化素-A(50ng/mL)的RPMI+B27培养基中培养3-4天，以生成前肠细胞。DE细胞在具有CHIR99021(6μM)的RPMI+B27培养基中培养4天以生成后部内胚层。
后部内胚层分化成3D肠类器官
将后部化内胚层细胞嵌入生长因子降低的基质胶(BDBiosciences)，所述基质胶含有B27补充物(RA耗尽)(Invitrogen)、人类R脊椎蛋白(500ng/mL)(R&D)、人类诺金(100ng/mL)(R&D)、人类EGF(100ng/mL)(R&D)、Jagged-1肽(1μM)(AnaSpecInc.)。细胞/基质胶混合物覆盖有高级DMEM/F12(Gibco)，所述高级DMEM/F12(Gibco)补充有2mMGlutaMax(Invitrogen)、10mMHepes(Invitrogen)和100U/ml青霉素/100ug/ml链霉素)，含有B27补充物(RA-耗尽)(Invitrogen)、Y-27632(10uM)(SigmaAldrich)、诺金(100ng/ml)(R&D)、人类EGF(100ng/ml)、人类R-脊椎蛋白(1ug/ml)(R&D)、人类Wnt3a(100ng/mL)(R&D)。
hFSC的传代和维持
hFSC在RPMI培养基中在针对hPSC维持所述那样制备的明胶涂覆板上培养，所述RPMI培养基含有B27补充物、NEAA、Pen/Strep、活化素-A(10ng/mL)、bFGF(20ng/mL)、BMP(10ng/mL)、HGF(20ng/mL)、EGF(50ng/mL)、和肝素。使用细胞解离缓冲剂(CDB)使细胞每4-7天传代。用PBS洗涤细胞l×，然后在37℃下在CDB中培育10-15分钟。将细胞刮为小块，并且转移至15mL试管并且以800rpm离心2分钟。细胞用RPMI培养基洗涤l次，并且然后再悬浮在含有如上所述的生长因子与Rock抑制剂Y-27632(10μM)的混合物的RPMI培养基中。在随后的培养天数期间不使用Rock抑制剂。下一天和随后每天更换培养基，直到细胞80-90％融合。
hFSC分化成肝内胚层
肝分化已经先前描述过[4、7、9]。简而言之，使hFSC's在含有BMP4(10ng/mL)和FGF10(10ng/mL)的RPMI+B27中培养四天。细胞然后在含有OSM(50ng/mL)和HGF(50ng/mL)的肝细胞基础培养基(Lonza)中培养至少额外20天。
hFSC分化成胰腺内胚层
如先前描述[4]使用5步骤方法，使hFSC分化成胰腺内胚层。hFSC(阶段1)在高级DMEM(Invitrogen)中培养3天，所述高级DMEM(Invitrogen)补充有SB-431542(10μM；Tocris)、FGF10(50ng/ml；AutogenBioclear、全反式视黄酸(RA2μM；Sigma)和诺金(50ng/ml；R&DSystems)。对于阶段2，细胞在高级DMEM中培养3天，所述高级DMEM补充有人类FGF10(50ng/ml；AutogenBioclear)、全反式视黄酸(RA，2μM；Sigma)、KAAD-环巴胺(0.25μM；TorontoResearchChemicals)和诺金(50ng/ml；R&DSystems)。对于阶段3，细胞在人类FGF10(50ng/ml；R&DSystems)中培养3天。对于胰腺祖细胞的熟化(阶段4)，细胞在高级DMEM+1％体积/体积B27和DAPT(1mM)中生长3天，并且在高级DMEM+1％体积/体积B27中生长额外的3天(阶段5)。分化的阶段4和最后阶段(阶段5)是使用不含胰岛素的培养基来实现，以便不干涉荧光免疫检验法和ELISA试验。提供存在证明的胰岛素抗体针对C-肽，，以避免可能的假阳性成果。
hFSC分化成肺内胚层
肺祖细胞通过使hFSC在视黄酸(3μM)和FGF10(100ng/mL)中生长6天而生成。细胞在具有FGF10、和HGF的2D培养物或者在使用FGF10和HGF的3D基质胶培养物中生长额外20天。
RNA分离、RT和Q-PCR
使用GenElute(Sigma-Aldrich)哺乳动物总RNA分离试剂盒来分离RNA。粘附物或者细胞小球用PBS洗涤1次，并且然后在350uL的总RNA裂解缓冲剂中裂解。然后按照生产商的说明书纯化RNA。使用无RNA酶的DNA酶(Sigma)按照生产商的介绍执行DNA消化。逆转录500ng的总RNA，每反应使用500ng总RNA、0.5uL随机引物(Promega)和1uL的dNTP's(Promega)。经5分钟将样品加热至65℃，并且然后放在冰上再5分钟。将4uL第一链缓冲剂(Invitrogen)+2uL二硫苏糖醇(DTT)(Invitrogen)+1uLRNaseOUT(Invitrogen)+0.5uLSuperScriptII(Invitrogen)添加至各样品，并且然后在RT下培育10分钟，随后为42℃下50分钟和70℃下15分钟。来自RT-PCR的cDNA被稀释入总体积500uL的无RNA酶水。每个反应将5uL的cDNA与7.5uLCyber-GreenSensi混合物(Bioline)、正向引物和反向引物各0.6uL、和1.3uL的无RNA酶水合并。PCR执行是在95℃下使用Stratagene热循环仪1个10分钟周期，然后40个95℃下30秒，60℃下30秒和72℃下30秒周期，随后为1个95℃下1分钟周期。在各Q-PCR运行结束时生产55℃-95℃范围内的解离曲线，以确认单一扩增产物的存在。所有Q-PCR数据显示三个实验的平均值，并且误差条显示标准平均误差。在所有实验中使用hESC(H9)作为阴性对照，并且误差条代表标准平均误差(SEM)。
免疫染色
将hPSC或者它们的分化祖细胞在4℃下固定在4％多聚甲醛中20分钟，并且然后在PBS中洗涤三次。细胞在室温下在含有10％驴血清(SerotecLtd.)的PBST(0.1％TritonX100；Sigma；在PBS中)培育20分钟，并且随后在4℃下培育过夜，并且将初级抗体(表11)稀释在1％的驴血清的PBST溶液中。细胞然后在PBS中洗涤三次，并且在室温下在1％的驴血清中于PBST内，用次级抗体培育2小时。通过在PBS中三次5分钟的洗涤来除去未结合次级抗体。Hoechst33258被添加至第一次洗涤(Sigma-Aldrich；1:10,000)。
在针对石蜡切片的处理之前，3D类器官从基质胶除去，固定在4％多聚甲醛中并且嵌入4％琼脂糖中。在抗原修复之后，用0.5％TritonX-100渗透化样品，并且封闭在10％FBS中，随后初级抗体中培育过夜。样品用PBS洗涤，并且用次级抗体在室温下培育1小时，随后使用DAPI复染色。使用装备有AxioCamMRm和MRc照相机的ZeissImagerM.2和用于图像捕获的AxioVision软件来使样品成像。
流式细胞术
粘附细胞在PBS中洗涤两次，并且然后在37℃下在细胞解离缓冲剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,http://www.invitrogen.com)中培育20分钟。细胞通过轻柔吹打解离并且以每毫升大致0.1-1×105细胞再悬浮在PBS中。将细胞压成小球，并且通过将细胞在4℃下再悬浮在4％多聚甲醛溶液中20分钟来进行固定。细胞在PBS中洗涤，并且然后封闭在含有0.1％叠氮化物的PBS+10％常规驴血清(NDS)(SerotecLtd.,Oxford,U.K.)中。为渗透化细胞，将压成小球的细胞再悬浮在2mL的SAP缓冲剂(0.1％(w/v)皂角甙的Hanks'平衡盐溶液)中。细胞然后在0.1％SAP1％驴血清+初级抗体的溶液中培育，并且在室温下培育至少2小时或者在4℃过夜。细胞然后在PBS+1％NDS中洗涤三次，并且在SAP缓冲剂中用次级抗体在室温下培育2小时或者4℃下过夜。通过在PBS中三次洗涤来除去未结合次级抗体。然后使用FACSCalibur机器(BDBiosciences,SanJose,California,USA,)来分析细胞。阳性细胞的数量被记录为三个单独实验的平均值。
hIPSC的生成
使用如所述[7]的Yamanaka因子，使用人类皮肤成纤维细胞的逆转录病毒介导重编程，获得hIPSC(BBHX8和A1TATD)。
GFPhPSC的生成和纯系分析
表达H9、BBHX8和A1ATD-1的GFP如先前描述[19]，使用lipofectamine2000(Invitrogen)通过稳定转染生成。使GFP阳性细胞分化成前肠细胞，并且然后解离成单个细胞。单个分离的GFP细胞然后被转移至含有非-GFP阳性hFSC的孔中。在平板接种之后12小时，目测检查孔，并且选择含有单个GFP-阳性hFSC的孔用于无性系扩展。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
在诱导胰腺特化的培养条件下生长了25天的hESC在葡萄糖刺激前在不含胰岛素的分化培养基中培养24h。细胞用PBS洗涤三次，并且在补充有2.2mM葡萄糖(Invitrogen)的DMEM中在37℃预培育60分钟。预培育细胞在含有22mM葡萄糖或者替代地2.2mM葡萄糖的DMEM中生长15或60分钟。收集上清液用于测定C-肽释放。使用Mercodia超灵敏C-肽ELISA试剂盒(Mercodia)执行ELISA分析。关于Abumin和ATT分泌试验，采用针对α1-抗胰蛋白酶(Abeam31657,Cambridge,UK)和白蛋白(Abeam87564,Cambridge,UK)的亲合纯化兔多克隆抗体，以碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂(Na2CO3/NAHCO3,pH9.5)中2μg/ml，将高结合表面COSTAR96-孔板(Corning,NY,USA)涂覆过夜。在洗涤(0.9％w/vNaCl、0.05％v/vTween20)之后，将板在封闭缓冲剂(PBS、0.25％w/vBSA、0.05％v/vTween20)中封闭两个小时。培养基在封闭缓冲剂中稀释，并且将50μl添加至各孔，然后培育两个小时。在洗涤之后，用对应单克隆抗体(1μg/ml，稀释于封闭缓冲剂中)培育所述孔，并且培育两个小时。结合的单克隆抗体用兔抗小鼠IgGHRP-标记抗体(SigmaAldrich,Haverhill,UK,1:20,000)检测一小时。该反应用TMB液体基底(SigmaAldrich,Haverhill,UK)在暗处显影10分钟，并且用1MH2SO4中止反应。在Thermo-max微板读数器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA,U.S.A.)上读出450nm处的吸光度。
细胞色素P450活性
使用P450-Glo试验试剂盒(Promega)根据生产商的说明书，一式三份地测量Cyp3A4活性试验。然后使用P450-GloMax96微板光度计分析细胞色素活性。
高碘酸希夫(PAS)染色
PAS染色一式三份地在细胞上根据生产商的说明书指引使用试剂盒(Sigma395B-1KT)来进行。随后执行淀粉酶消化以确认阳性染色是因为存在糖原。
LDL的吸收
Dil-LDL染色试剂盒购自(CaymanChemicals,MA)，并且试验根据生产商的说明书来执行。
结果
我们先前开发了确知培养体系以引导hPSC分化成具有分化成肝细胞和胰腺祖细胞的能力的定形内胚层(DE)细胞的近同质群体[4-9]。生长在这些培养条件中的细胞连续地表达原条标记物(T,Eomes,Mixll)、下调多能标记物(NANOG,S0X2和POU5F1)并且逐渐地上调定形内胚层标记物(CXCR4、CERB和SOX17)。流式细胞分析示出所得DE群体的80％共表达CXCR4和Sox17。有趣的是，DE细胞的所得群体对于基因标记前肠(SOX2)、中肠/后肠(CDX2)、胰腺(PDX1、PTF1a)、肝脏(AFP)、和肺(Nkx2.1、TBX1)是阴性的。这确认活体外生成细胞DE对应于前后部模式化或者器官发生前的早期内胚层祖细胞。
我们接下来检验DE细胞分化成原肠管的前部和后部域的代表物的能力。我们筛选各种生长因子并且发现活化素-A阻断CDX2表达，同时诱导前肠标记物(诸如SOX2、HHEX、和HOXA3)的表达。另一方面，在GSK3β抑制剂CHIR99021的存在下生长的DE细胞表达中肠/后肠标记物，诸如CDX2、和HOXC5，并且显示无前部标记物的表达。在活化素-A处理和CHIR处理期间，细胞表达高水平的原肠标记物GATA4、HNF4a、EpCAM和HOXA2，证明在这些条件下细胞保留它们的内胚层身份。值得注意的是，流式细胞分析表明90％的细胞在活化素-A处理之后表达SOX2，而85％的细胞在CHIR99021处理之后对CDX2是阳性的。使用两个hIPSC细胞系(BBHX8、A1ATD.1)获得类似结果。总之，这些数据表明活化素-A和GSK3beta信号引导人类DE活体外的前-后模式化。
为进一步证实在活化素-A或者CHIR99021的存在下生成的细胞的身份，我们决定测试它们分化成肠细胞的能力。SOX2+细胞和CDX2+细胞在已知促进后部肠分化的三维类器官培养条件[10]下生长。在这些条件下生长的Sox2+细胞停止增殖，并且不能扩展，而CDX2+细胞形成具有类似肠上皮的高度褶皱结构的球状体，并且表达肠标记物(粘蛋白、绒毛蛋白和嗜铬粒蛋白A)。此外，这些类器官可以扩展至少2个月，同时展现出成年肠上皮的标记物的逐渐增加。最终，CDX2+胞来源的类器官与初级小鼠肠类器官的比较性免疫染色分析证明在两种类型的类器官中具有在顶端表达绒毛蛋白的极化上皮。这些数据确认了在CHIR99021的存在下生成的CDX2+细胞具有形成中肠/后肠祖细胞的分化潜能，而活化素-A诱导的SOX2+已经丧失此能力。这些SOX2+细胞可以因此等同于前肠祖细胞[11]。
我们随后测试前肠SOX2+胞活体外自我更新的能力。来源于hESC的DE细胞在活化素-A的存在下分化4天，并且随后在生长因子的不同组合存在下进行培养。按照此方法，我们认识到活化素-A、bFGF、BMP4、HGF、EGF和肝素按1:4-1:6的比率足以扩展前肠SOX2+细胞超过10代(图1A)。对前肠细胞的扩展最佳的培养条件在前肠细胞自身中生产极少的细胞死亡或分化，然而观察到诸如神经元-样和成纤维细胞-样细胞的污染细胞的显著细胞死亡，这仅起到随时间提高前肠培养物的作用。在这些培养条件中传代5次之后，前肠SOX2+细胞不表达多能性标记物(POU5f1和NANOG)、肺标记物(NKX2.1)、肝(AFP)、或者胰腺标记物(PDX1)，同时维持前肠标记物(HNF4α、SOX17、CXCR4、EpCAM、HNFlβ、GATA4、Cer、SOX2.HNF6、和HNFlbeta；图1B-C)的表达。流式细胞分析表明SOX17和CXCR4近同质地共表达(图1D)。重要的是，用2个hIPSC细胞系(BBHX8、A1ATD.1)获得类似结果[5-7]。这些数据共同证明我们的培养体系捕获了可以活体外自我更新且因此可以代表新型内胚层干细胞(其后称为人类前肠干细胞或者hFSC)的前肠细胞的同质群体。
为确认此假设，我们测试了hFSC分化成肺、肝和胰腺细胞的能力。在诱导肺分化的培养条件下生长的hFSC(图2A)上调早期肺部内胚层标记物(Nkx2.1、FOXP2和IRX1，图2B)。此外，在3D条件中分化的细胞形成类似远侧气道上皮的具有分支囊状结构的团块以及更代表II型肺细胞的单个囊状团块。大约70％的细胞表达早期肺部内胚层标记物NKX2.1，因此，Q-PCR和免疫染色分析确认肺II型肺泡细胞标记物(NKX2.1、ABCA3、MUC1)和远侧气道标记物(NKX2.1、CK18、CFTR、SFTPC、GATA6，图2B-C)的表达。hFSC还在诱导胰腺特化的培养条件[4]下生长(图2D)，从而导致顺序表达早期胰腺标记物(HLXB9、PDX1)，然后是内分泌祖细胞标记物(Ngn3)，并且最终是β-细胞标记物(胰岛素)(图2E)。如先前报道，大约大于80％的细胞在胰腺分化方案[4]的阶段4是PDX1阳性的。在分化18天之后，可以通过免疫染色检测c-肽、PDX1和生长抑素表达细胞，并且在葡萄糖刺激时检测c-肽释放(图2F)。最终，在诱导肝特化的培养条件[7、9]下生长的hFSC(图2G)表达肝标记物(AFP、ALB、AlAT、CYP1A1、CYP1A2、CYP1A4)，展现出可诱导的细胞色素活性(图2H和2I)，分泌AAT和白蛋白并且吸收胆固醇和吲哚菁绿(Cariogreen)。如先前报道[7,9]，由hFSC生成的肝样细胞超过90％对肝标记物白蛋白和α-1-抗胰蛋白酶为双阳性。重要的是，来源于不同hIPSC细胞系的多个hFSC细胞系展现相似的分化效率。总之，这些数据证明hFSC具有分化成前肠衍生物(包括肺细胞、胰腺细胞和肝细胞)的能力，从而确认它们是多能性的。
为进一步地巩固这些结果，我们决定确认单个hFSC是多能性的。hFSC生长为上皮，并且单个细胞分离系统地导致细胞死亡。为绕过此限制，我们生成表达GFP的hFSC，所述hFSC被解离成单个细胞，并且分别放置在含有无GFP表达hFSC的24孔板的孔上。下一天，含有单个GFP阳性hFSC的孔被标记用于扩展，并且在传代5次后，所得的细胞被分化成肺部细胞、肝细胞和胰腺细胞。生长在这些各自培养条件下的hFSCGFP阳性细胞表达肺部标记物(Pro-SFTPC和MUC1)、肝标记物(ALB、A1AT、AFP和HNF4a以及LDL吸收)、和胰腺标记物(PDX1、INS、NGN2和SST)，从而提供由hESC和hIPSC生成的hFSC为多能干细胞的必要证据。
从来源于16位个体的48个hIPSC系的小组中，我们认识到至少3个系不能够分化成DE的同质群体。这些内胚层耐受hIPSC系(COXS8、COXV3和第4系)生产小于30％的SOX17DE细胞(图3A)。然而，此异质群体可以在活化素-A的存在下生长额外的3天以促进前肠特化，并且所得细胞被转移至支持hFSC扩展的培养条件中。有趣的是，非内胚层来源的污染细胞中止增殖，并且在传代时逐渐地消失。流式细胞分析表明生长5代的细胞同质地表达SOX17和CXCR4(99％)，与由精于生产内胚层的hIPSC生成的hFSC类似(图3A)。因此，即使当它们来源于DE细胞的异质群体时，我们的培养体系选择性扩增hFSC。hFSC的所得群体扩展额外的2代，并且然后被转移至诱导胰腺和肝分化的培养条件中。向肝谱系分化的细胞以类似于从对照hFSC生成的肝细胞样细胞的水平，表达肝标记物(AAT、ALB、AFP、HNF4)(图3B)。类似地，向胰腺谱系分化的细胞表达PDX1、INS和NGN3(图3C)。这些结果共同示出，hFSC可以容易由具有降低的用于生产肝细胞和胰腺的细胞的内胚层分化能力的hIPSC生成。因此，hFSC的衍生可以容易实现众多的hIPSC系，并且将允许生产来自各种患者的具有临床有益效果的细胞。
我们的结果描述了使hPSC分化成前肠干细胞的多能群体的分步方法(图4)。
重要的是，前肠细胞的生产已经先前报道过[12]，然而，我们的研究首次提供允许多能自我更新前肠干细胞的分离、扩展和分化的培养体系。类似地，最近研究已经示出多能DE细胞可以活体外扩展[3、13]，但这些细胞表达各种标记物，使得它们的胚胎身份难以建立。此外，它们仅可使用饲养层、基质胶、3维培养条件和血清来生成，以上所有与大规模或者临床应用不相容。我们的培养体系解决了这些限制中的若干限制，而hFSC与它们的活体内对应物共用基本特性。然而，此处描述的前肠细胞的确切类型尚未完全确知，因为谱系示踪试验已经表明前肠可以仅含有能够向肝谱系和胰腺的谱系分化的双潜能祖细胞[14]。然而，活体内祖细胞的性质很可能由它们在前肠内的局部分布以及它们的周围环境所支配。
此外，肠管最初具有高度可塑性。实际上，后肠域(如果在早期时间点取得)在与前肠心脏中胚层并置或者置于具有BMP和FGF的培养条件下时，能够生产肝和胰腺的芽结构[15、16]。这表明在肠成型的早期期间，整个肠上皮片可以是专能的。因此，此处描述的培养体系可能局限更少，从而允许hFSC展现出它们的发育可塑性的整个范围。
最终，多能前肠祖细胞群体的扩展具有关于临床应用的显著有益效果。实际上，我们的培养体系与内胚层细胞的近同质群体的大规模生产不矛盾，这可以对基于细胞的疗法来说极大地简化了细胞的生产。此外，hFSCs的衍生允许分化所有测试hIPSC细胞系，而不需要建立个别方案。因此，hFSC不仅提供人类发育的独特活体外模型，而且代表了在个性化医疗领域中实现hIPSC临床前景的重要工具。
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21.Kim等人Nature2010467285-290
表1(RPMI-1640培养基)

Claims (39)

1.一种用于生产前肠干细胞(FSC)的群体的方法，所述方法包括：
i)提供定形内胚层细胞(DEC)的群体，
ii)在前肠诱导培养基中培养所述DEC以生产前肠干细胞(FSC)的群体，所述前肠诱导培养基包含TGFβ配体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DEC的群体通过包括以下的方法生产：在定形内胚层(DE)诱导培养基中培养多能细胞(PSC)的群体，所述定形内胚层(DE)诱导培养基包含TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)和PI3K抑制剂；以及允许所述PSC分化成DEC。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述多能细胞是人类多能细胞。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述多能细胞是IPSC。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述iPSC来源于得自个体的祖代细胞。
6.根据权利要求2至权利要求5中任一项所述的方法，其中所述多能细胞表达以下多能性相关标记物中的一种或多种：Oct4、Sox2、碱性磷酸酶、POU5fl、SSEA3、Nanog、SSEA-4、Tra-1-60、KLF-4和c-myc。
7.根据权利要求2至权利要求6中任一项所述的方法，其中所述DE诱导培养基包含TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)和PI3K抑制剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述DE诱导培养基由补充有TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)和PI3K抑制剂的化学成分确知营养培养基组成。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述TGFβ配体是活化素和/或所述PI3K抑制剂是LY294002。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DEC的群体是同质群体或异质群体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DEC表达以下内胚层相关标记物中的一种或多种：Sox17、foxA2、GSC、Mixl1、Lhx1、CXCR4、GATA4、脱中胚蛋白(EOMES)、Mixl1、HNF-3beta、斯贝卢斯(Cerberus)、OTX4、古斯卡德(goosecoid)、C-kit、CD99、和Hex。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述前肠诱导培养基由补充有TGFβ配体的化学成分确知营养培养基组成。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TGFβ配体是活化素。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述FSC表达以下标记物中的一种或多种：SOX2、HHEX、HOXA3、HNF4α、SOX17、CXCR4、EpCAM、HNF1β、GATA4、Cer、HNF6、和HNFlbet。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括在FSC维持培养基中培养FSC的群体，所述FSC维持培养基包含有效量的TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白质(BMP)、HGF、EGF、和肝素。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述FSC维持培养基由补充有TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、HGF、EGF、和肝素的化学成分确知营养培养基组成。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述TGFβ配体是活化素。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述FSC在活体外是专能和自我更新的。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述FSC分化成内胚层细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其包括使所述FSC分化成肝内胚层细胞或肝祖细胞。
21.根据权利要求19所述的方法，其包括使所述FSC分化成胰腺祖细胞或胰腺内胚层细胞。
22.根据权利要求19所述的方法，其包括使所述FSC分化成肺祖细胞或肺内胚层细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，所述方法包括；
i)在第一肺诱导培养基中培养所述FSC的群体，所述第一肺诱导培养基包含RA和FGF；
ii)在第二肺诱导培养基中培养来自步骤i)的所述细胞，所述第二肺诱导培养基包含FGF和HGF；
从而生产肺祖细胞的群体。
24.一种生产肺祖细胞的方法，所述方法包括；
i)提供FSC的群体；
ii)在第一肺诱导培养基中培养所述FSC的群体，所述第一肺诱导培养基包含RA和FGF；
iii)在第二肺诱导培养基中培养来自步骤i)的所述细胞，所述第二肺诱导培养基包含FGF和HGF；
从而生产肺祖细胞的群体。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述第一肺诱导培养基由补充有视黄酸和成纤维细胞生长因子(FGF)的化学成分确知营养培养基组成。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述第二肺诱导培养基由补充有肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)的化学成分确知营养培养基组成。
27.一种由根据权利要求1至18中任一项所述的方法生产的分离FSC的群体。
28.根据权利要求27所述的群体，其中所述分离FSC具有疾病相关基因型。
29.一种用于维持前肠干细胞(FSC)的群体的方法，所述方法包括：
i)提供前肠干细胞(FSC)的群体；
ii)在FSC维持培养基中培养所述FSC的群体，所述FSC维持培养基包含TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、HGF、EGF、和肝素。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述FSC由根据权利要求1至18中任一项所述的方法生产。
31.根据权利要求27或28的分离FSC群体用于内胚层细胞的活体外生产的用途。
32.根据权利要求27所述的群体，其用于人体或动物体的治疗的方法。
33.根据权利要求27所述的群体，其用于肺病、肝病或胰腺病症的治疗。
34.一种筛选化合物的方法，所述方法包括；
用测试化合物接触根据权利要求27或权利要求28所述的分离FSC的群体，和；
确定所述测试化合物对所述前肠干细胞的作用和/或所述前肠干细胞对所述测试化合物的作用。
35.一种用于生产FSC的试剂盒，所述试剂盒包括；由补充有TGFβ配体的化学成分确知营养培养基组成的前肠诱导培养基。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其还包括由补充有TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白质(BMP)和PI3K抑制剂的化学成分确知营养培养基组成的DE诱导培养基。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的试剂盒，还包括由补充有TGFβ配体、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、HGF、EGF、和肝素的化学成分确知营养培养基组成的FSC维持培养基。
38.前肠诱导培养基用于生产FSC群体的用途，所述前肠诱导培养基由补充有TGFβ配体的化学成分确知营养培养基组成。
39.第一和第二肺诱导培养基用于生产肺祖细胞的群体的用途，所述第一肺诱导培养基由补充有视黄酸和成纤维细胞生长因子(FGF)的化学成分确知营养培养基组成，并且所述第二肺诱导培养基由补充有肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)的化学成分确知营养培养基组成。
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