CN109868287A - 一种全基因组高通量克隆载体的构建 - Google Patents

Abstract

一种用于生物医学领域的全基因组高通量克隆载体的构建，其特征在于，构建含hTERT和SV40LT的逆转录病毒载体，转染PT67包装细胞，以G418和PM联合筛选获得质粒包装PT67细胞，提取其培养液，转染sp2/0细胞，再以G418和PM联合筛选获得高度永生化的质粒包装sp2/0细胞，能在植入外源性全基因组后经HAT、G418和PM联合筛选而获得可冻存和扩增全基因组的高度永生化的杂交株，用于罕见病全基因组的产业制备及其永生基因库的构建。

Description

一种全基因组高通量克隆载体的构建

技术领域

本发明涉及生物医学领域的一种全基因组高通量克隆载体的构建，主要用于罕见病全基因组的收藏和产业制备，为临床、科研、制药及诊断提供可再生利用的全基因组资源。

背景技术

为了更好地开展发病机制、临床治疗和实验诊断等研究，已有越来越多的国内外机构专注于各种病例样本的收藏及其样本库的构建。

在美国、英国、日本和中国都已建有各种类型的细胞库，如美国的标准细胞库(ATCC)、人类遗传突变细胞库(HGMR)、细胞衰老细胞库(CAR)；英国的胚胎干细胞库；日本的乳牙干细胞研究库；中国的重要医学生物资源保藏库、中国不同民族永生细胞库、脐血干细胞库、肿瘤细胞库、长寿老人永生细胞库等。

近年来，世界各国开始关注各种基因库的构建，继美国的NCBI基因库、日本的DDBJ基因库和欧盟的EBI基因库之后，中国经国家发改委、卫生部、财政部等部委批复，于2011年开始构建全球第四个国家基因库，并于2016年开始运营，成为目前世界上最大的基因库，该基因库采用基因信息数据库和生物样本资源库相结合的模式，建立样本资源、生物信息数据处理、存储与管理系统网络，主要存储中国特有遗传资源、生物信息和基因数据，包括头发、牙齿、精子卵子、血液、组织、尿液、细胞、干细胞、个人遗传家系、医疗数据、植物资源、动物资源、种子等生命资源，作为国家公益性创新科研及产业基础设施项目，拟为疾病的前瞻性研究提供样本资源，为疾病的诊断、预测、个性化医疗奠定基础，以提高我国生命科学研究水平和国际影响力，促进我国生物产业的发展。

但现有的细胞库或基因库难以进行可再生利用的全基因组扩增，在不断利用样本的同时需要不断收藏样本。虽然从现有基因库中取出的样本可通过聚合酶链反应(PCR)等方法扩增，从而提高相应基因资源的利用率，但PCR扩增对象为有限长度的特定DNA序列，所以取自细胞库的细胞在提取DNA后，除了该次研究所需的基因被利用外，其余的在别的研究中有利用价值的DNA就被浪费了，而各种基因病几乎都为罕见病，发病率通常为几千、几万、几十万甚至几百万、几千万分之一，病例样本很难获取，所以必须研究一种全基因组高通量克隆载体。

据文献报道，1975年Kohler等将具有抗体产生基因的鼠免疫B细胞与具有无限扩增性能的骨髓瘤细胞进行体外融合，得到兼具骨髓瘤细胞无限繁殖和B淋巴细胞分泌抗体的杂交瘤细胞株，其中来源于B淋巴细胞的抗体产生基因随着杂交瘤细胞株的繁殖而扩增，被用于单克隆抗体的制备，称为杂交瘤技术，其中杂交细胞的一方必须选择经抗原免疫的B细胞，另一方则是为了保持杂交细胞的不断增殖。同一体系的肿瘤细胞可增加杂交的成功率，多发性骨髓瘤是B 细胞系的恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞(B细胞)杂交伴侣，所以大多采用鼠免疫B细胞与鼠B细胞系恶变而来的鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)进行杂交。

融合细胞的筛选基于细胞合成DNA的两条途径，其中主要途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌吟磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。细胞融合的选择培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，所以取三者的字头称为HAT培养基。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖。所以可用HAT培养基选择脾细胞和瘤细胞的有效融合，去除脾细胞和脾细胞、瘤细胞和瘤细胞的无效融合以及未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞、细胞的多聚体等形式的无效融合。

上述的杂交瘤技术或细胞融合技术，通常是基于鼠免疫B细胞与鼠B细胞系恶性肿瘤即多发性骨髓瘤细胞(sp2/0)之间的杂交，这种同一体系的细胞可增加杂交的成功率。但如果将其转用于人基因突变细胞与鼠sp2/0瘤细胞的杂交瘤细胞的制备，我们发现虽能杂交但存在以下3个问题：(1)人基因突变杂交瘤细胞边贴壁生长边漂浮死亡：总有1/2～1/3左右的细胞因死亡而漂浮在培养液中，活细胞贴壁生长的汇合度一般为30～50％，通常不会达到80～90％以上的理想汇合度；(2)罕见病杂交瘤细胞边贴壁生长边贴壁死亡：通常会有1/2～1/3左右的细胞贴壁死亡，通常不会达到80～90％以上的活细胞贴壁生长的理想汇合度；(3)人外周血分离的单个核细胞中主要含有淋巴细胞和单核细胞，前者寿命约为7天，后者寿命为数个月甚至更长，而细胞融合的结果会有以下几种细胞，即有效融合细胞(鼠sp2/0瘤细胞与人基因突变细胞融合而形成的融合细胞)、无效融合细胞(鼠sp2/0瘤细胞之间、人淋巴细胞之间、人单核细胞之间、人淋巴细胞与人单核细胞之间融合所形成的融合细胞)、未融合细胞(鼠sp2/0 瘤细胞、人淋巴细胞、人单核细胞)，在融合实验中，仅希望有效融合细胞生长，而无效融合细胞和未融合细胞死得越早越有利于有效融合细胞的生长，现有技术采用HAT筛选使鼠sp2/0 瘤细胞及其相互融合细胞在7～14天死亡，而淋巴细胞、单核细胞及其融合细胞均靠其自然死亡，没有筛选方法，没有人为的杀灭方法，即未融合的淋巴细胞、淋巴细胞之间形成的融合细胞需7天开始死亡，未融合的单核细胞、单核细胞之间形成的融合细胞及单核细胞与淋巴细胞形成的融合细胞能活数个月甚至更长时间，很不利于有效融合细胞生长。

本发明拟制备一种能用于罕见病杂交瘤永生基因库构建的高度永生化、抵抗G418和PM联合筛选、具有全基因组杂交、贮藏和产业扩增功能的全基因组高通量克隆载体，以解决上述问题。

发明内容

为了解决细胞融合率低下、筛选方法欠佳、融合细胞不易培养、难以进行全基因组产业扩增等问题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供一种全基因组高通量克隆载体的构建方法；另一目的是要提供一种高度永生化、能抵抗G418/PM筛选、能用于全基因组杂交、贮藏和产业制备的全基因组高通量克隆载体。

本发明的目的是这样实现的：构建含hTERT和SV40LT的逆转录病毒载体，转染PT67包装细胞，以G418和PM联合筛选而获得质粒包装PT67细胞，提取含有hTERT和SV40LT基因的质粒包装 PT67细胞的培养液，转染sp2/0细胞，再以G418和HPM联合筛选，以获得高度永生化的质粒包装 sp2/0细胞，即全基因组高通量克隆载体，该载体被植入单基因病细胞全基因组后，经HAT、 G418和PM联合筛选，可获得植入了单基因病全基因组的杂交株，其中单基因病全基因组能随杂交株的无限培养而扩增。

更的进一步说，将具有永生化性能的hTERT从PIRES2-EGFP-hTERT亚克隆到pLPCX的EcoRI 位点，构建pLPCX-hTERT克隆；同时将具有永生化性能的SV40LT从pMFGSV40tsLT亚克隆到pLXN 的EcoRI/BamHI位点，构建pLXN-SV40LT克隆。以磷酸钙沉淀法分别将重组克隆pLPCX-hTERT 和pLXN-SV40LT联合转染PT67包装细胞，以400～700μg/ml新霉素衍生物(G418)和3～5μg/ml 嘌呤霉素(PM)联合筛选转染了hTERT、SV40LT和抗生素抗性基因的质粒包装PT67细胞，培养该包装PT67细胞，使之产生含有hTERT、SV40LT和抗生素抗性基因的质粒，以0.42μm过滤器过滤培养液，将质粒转染sp2/0细胞，再以G418和PM联合筛选因转染了hTERT、SV40LT和抗生素抗性基因而获得能以G418和PM进行防污染筛选的高度永生化的质粒包装sp2/0细胞，即全基因组高通量克隆载体，该载体可冻存、解冻、无限培养，能在植入外源性全基因组后经HAT、G418 和PM联合筛选而获得可冻存和扩增全基因组的高度永生化的杂交株，用于罕见病全基因组的产业制备及其永生基因库的构建。

现有的鼠sp2/0瘤细胞，或称sp2/0细胞，属于鼠B细胞系的恶性肿瘤细胞，适用于同种脾细胞杂交伴侣之间的融合，即适用于与鼠免疫B细胞的融合。本发明人发现并初次以细胞融合的方法将人源细胞全基因组植入sp2/0细胞，使全基因组随sp2/0细胞的传代而扩增，但很难获得预期效果：(1)不易融合：融合成功率约为70％(融合率约为8％)；约有30％的样本无法实现细胞融合(融合率为0％)。(2)融合细胞极易死亡：整个克隆或整瓶细胞死亡者约占37％以上；约有1/2～1/3的融合细胞发生漂浮死亡或贴壁死亡；细胞边长边死，其汇合度始终不超过50％，不能实现融合细胞的产业化扩增。(3)人单个核血细胞的寿命为数天至数个月，此类未发生人-鼠细胞融合的无效细胞因无法被杀灭而长期存活、生长，从而占用人-鼠细胞融合的有效细胞的生长空间，消耗营养，影响有效融合细胞的生长。

本发明将永生化基因hTERT和SV40LT以及抗新霉素基因和抗嘌呤霉素基因通过逆转录病毒载体导入PT67包装细胞，进行培养复制，进而转染sp2/0细胞，制成具有高度永生化、抵抗 G418和PM联合筛选的质粒包装sp2/0介质细胞即全基因组高通量克隆载体，当将外源基因植入该载体后，所得杂交细胞株兼具两亲代细胞的特性，即既具有高度永生化、抵抗G418和PM联合筛选的特性，又带有植入的外源基因。所以在将人类单基因病细胞的全基因组导入本发明制备的全基因组高通量克隆载体后，所制成的杂交株因含有抗生素抗性基因，所以不仅可通过HAT筛选杀灭无效的sp2/0细胞，还可新增G418或PM筛选以杀死人单个核血细胞及敏感的微生物，从而及早清除无效细胞对有效细胞生长的影响以及防止实验中微生物的污染；因具有高度永生化特性，所以杂交株不易死亡，极易传代培养和产业化扩增；更意想不到的是因本发明的克隆载体的高度永生化而能显著增加细胞融合的成功率和融合率。这种具有高度永生化的、抗生素抗性的、能植入、扩增和收藏全基因组的基因克隆载体的构建为罕见病全基因组的产业化制备解决了关键技术。

附图说明

图1是本发明含有hTERT和SV40LT的杂交瘤细胞株的第5代细胞生长状态图。

图2是本发明不含hTERT和SV40LT的杂交瘤细胞株的第5代细胞生长状态图。

图3是本发明经HAT和G418/PM联合筛选至第7天时的无效细胞死亡状态图。

图4是本发明以HAT筛选至第15天时的无效细胞生长状态图。

图5是1例耳聋患者外周血淋巴细胞的全基因组被植入本发明的高通量全基因组克隆载体后所得杂交瘤细胞株的染色体核型图。

在图1中，采用了本发明提出的经pLPCX-hTERT和pLXSN-SV40LT转染的sp2/0细胞即全基因组高通量克隆载体进行细胞融合的全基因组植入，所制备的杂交瘤细胞株因为含有hTERT 和SV40LT基因而呈很好的生长状态，杂交瘤细胞株传代培养2～3天时，贴壁细胞呈密集生长，几乎未见贴壁或漂浮的死亡细胞，其汇合度达到80％以上。

在图2中，采用了传统的sp2/0细胞作为对照，即采用未经pLPCX-hTERT和pLXSN-SV40LT 转染的sp2/0细胞进行细胞融合，细胞传代培养2～3天时，可见有大量的杂交瘤细胞株死亡变黑、失去反光性、漂浮在培养液中，细胞边长边死，传代3天后活细胞的汇合度不超过50％。

在图3中，采用了本发明提出的以G418和HAT联合筛选法，筛选至第7天时，几乎所有的无效细胞(只有sp2/0细胞与人细胞融合形成的杂交瘤细胞株称为有效细胞，其余的融合细胞或未融合细胞均称为无效细胞)均已转变为无反光性的细胞或为无反光性的点状，即无效细胞已经死亡分解，这有利于有效细胞的生长，以免消耗营养和占用生长空间。

在图4中，采用了传统的筛选方法作为对照，即仅用HAT筛选，筛选至第15天时仍有无效细胞生长，如图示中的梭形、圆形及不规则形的无效细胞仍能在HAT的筛选中生长，无效细胞仍未被HAT杀死，具有反光性，这些无效细胞会利用培养基中的营养物质和占用生长空间，不利于有效融合细胞的生长。

在图5中，染色体数目多于任一亲代细胞但少于两亲代细胞的染色体数目之和，大多染色体的结构不同于两亲代细胞，但如图中1-9数字标示的某些染色体的区带仍保留了原亲代人类染色体的结构。

具体实施方式

下面结合图1、图2、图3和图4，对本发明的实施方案作具体的描述。

1、逆转录病毒重组载体pLPCX-hTERT和pLXN-SV40LT的构建

分别将hTERT从PIRES2-EGFP-hTERT亚克隆到pLPCX的EcoRI位点，构建逆转录病毒重组载体pLPCX-hTERT；将SV40LT从pMFGSV40tsLT亚克隆到pLXN的EcoRI/BamHI位点，构建逆转录病毒重组载体pLXN-SV40LT。

试剂：pLPCX、pLXSN逆转录病毒载体为美国Clontech公司产品；PIRES2-EGFP-hTERT或 pCIneo-hTERT或、SV40DNA(strain 776)为美国Invitrogen公司产品；PCR扩增试剂盒和磷酸钙沉淀转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；E.coliDH5-alpha大肠埃希氏杆菌为本单位保存；Endotoxin-free的质粒纯化试剂盒购自德国QIGEN公司；EcoR I、Not I、BamH I、内切酶为立陶宛Fermentas公司产品；T4DNA连接酶为德国Roche公司产品；RetroPT67细胞为美国Clontech公司产品；新霉素衍生物G418购自美国Sigma公司；端粒酶活性测定PCR-ELISA 试剂盒为德国Roche公司产品；Taq酶为美国Promega公司；新霉素衍生物和嘌呤霉素为美国 Clontech公司产品；胎牛血清、polybrene以及DMEM培养基购自美国Gibcol公司。本发明的载体还涉及pCDNA3.1、pCMV、pSV-neo、pEF。

具体方法：

(1)、逆转录病毒重组载体pLPCX-hTERT的构建

①EcoR I酶切pLPCX、hTERT：EcoR I酶切PIRES2-EGFP-hTERT质粒，得到hTERTcDNA片段 (去焦磷酸化后亚克隆到pLPCX逆转录病毒载体EcoRI位点)；同法用EcoR I酶切pLPCX逆转录病毒载体。

②碱性磷酸酶防止载体自身环化：在pLPCX逆转录病毒载体的酶切体系中加10u110×磷酸酶缓冲液，10ul碱性磷酸酶，60ul ddH20，37℃水浴30分钟。酶切产物经过纯化、溶解、冻存备用。

③构建pLPCX-hTERT：用T4连接酶经22℃30分钟将hTERT和pLPCX连接为pLPCX-hTERT。

④pLPCX-hTERT的转化、筛选、鉴定：转化至感受态E.coli DH5-alpha大肠埃希菌，37℃培养过夜，经X-gal、IPTG筛选，挑选无色菌落接种于3mlLB液中，37℃培养过夜，用质粒纯化试剂盒纯化重组质粒；经酶切、测序鉴定，序列准确无误后，将含有hTEFT重组质粒的大肠杆菌扩大培养，用Endotoxin-Free的质粒纯化试剂盒纯化hTERT/pLPCX重组逆转录病毒载体，并经无水乙醇灭菌处理后，溶于ddH20；测定重组质粒的浓度后冻存备用。

(2)逆转录病毒重组载体pLXN-SV40LT的构建

①SV40LT高保真PCR的扩增：以SV40DNA(strain 776)为模板，扩增片段长度为2400bp，50μl PCR反应体系。10mM Tris(pH9.2)，50mM Kcl，0.01％gelatin，0.1％TritonX-100，1.5mMMgSO4，0.3mM dNTP mixture，20pmol上游引物SV40LT-1和下游引物SV40LT-2，去离子水补足至50ul，2.5U pfx Taq酶(invitrogen)。循环参数：94℃2min，94℃15s， 55℃30s，68℃3min，35个循环；72℃延伸10min；终止4℃。

②构建pLXSN-SV40LT：分别用EcoR I/BamH I内切酶双酶切SV40LT的PCR片段和逆转录病毒载体pLXSN，并经过纯化，用T4连接酶22℃连接为pLXSN-SV40LT。

③感受态大肠杆菌的制备：转化感受态E.coli DH5-alpha菌，37℃培养过夜，经氨苄抗性筛选，挑选无色菌落接种于3mlLB液中，37℃培养24h，用质粒抽提试剂盒抽提重组质粒。

④含SV40LT重组逆转录病毒载体的PCR鉴定：随机挑取8个克隆进行鉴定，应用SV40LT的 P1(P1：5’ACAAATGTGGTATGGCTGAT-3’)和P2(P2：5’-GTGGTATGGGAACTGGA-3’)为引物，以单个菌落的少许菌体为模板，同时以pLXSN逆转录病毒载体作为阴性对照模板，进行PCR扩增，将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。

⑤含SV40LT重组逆转录病毒载体的酶切鉴定：重组逆转录病毒载体SV40LT-pLXSN进行 EcoRI/BamH I内切酶双酶切分析，酶切产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳。

⑥重组逆转录病毒载体SV40LT-pLXSN的DNA测序：由上海生工生物工程技术有限公司完成，双向测序。正向测序引物pLXSN(nt1398-1420)为：5’-CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC-3’，反向测序引物pLXSN(nt1537-1515)为：5’-GAGCCTGGGGACTTCCACACCC-3’。

⑦pLXSN-SV40LT重组质粒提取：经酶切和测序鉴定无误后，将含有SV40LT重组质粒的大肠埃希氏菌扩大培养，用Endotoxin-Free的质粒抽提试剂盒抽提SV40LT-pLXSN重组质粒。

2、逆转录病毒重组载体pLPCX-hTERT和pLXN-SV40LT转染PT67包装细胞

(1)PT67包装细胞的转染前准备：将包装细胞系PT67传代培养于含10％胎牛血清的高糖 DMEM培养基中，转染前一天将细胞(2×10⁵/孔)接种于六孔板中，培养至60％～70％细胞密度时进行转染。

(2)PT67包装细胞的转染：用标准的磷酸钙沉淀法分别将SV40LT/pLXSN、hTERT/pLPCX 各10ug转染至对数生长期的PT67细胞，转染24h后用PBS洗两遍，再用10％DMSO处理2min，更换新鲜培养液，继续培养，制备产毒PT67包装细胞。

3、产毒PT67包装细胞的筛选及鉴定

(1)筛选：PT67包装细胞转染72h后，经转染hTERT/pLPCX的细胞用4ug/ml的嘌呤霉素筛选，经转染SV40LT/pLXSN的细胞用500ug/ml的G418筛选，药物筛选1～3周，待细胞克隆生长至1.0-2.0cm时，挑取细胞克隆，扩大培养，此时更换为不含药物的培养基，继续培养，可以冻存培养后的产毒PT67包装细胞。

(2)鉴定：SV40和hTERT检测：采用Western blot法，消化细胞，配成1×10⁶/ml细胞悬液，加入细胞裂解液，煮沸10min，13000g离心15min，提取细胞总蛋白，8％SDS-PAGE电泳后转至硝酸纤维膜，脱脂牛奶封闭，加入鼠抗SV40LT/hTERT，37℃保温2h；生物化羊抗鼠抗体， 37℃保温2h；链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物，37℃保温30min，鲁米诺荧光曝光检测。

4、产毒PT67包装细胞逆转录病毒的收获及滴度测定

(1)逆转录病毒的收获与冻存：产毒PT67包装细胞培养24小时后，收集含逆转录病毒的培养上清液，以0.45um的低蛋白吸附滤器过滤，滤液分装后置-70℃保存备用。

(2)病毒滴度测定：①生长状态良好的NIH3T3细胞常规培养至60％汇合度；②将过滤的病毒液分别作10¹、10²、10⁴、10⁶倍稀释，吸取稀释的病毒液2ml，加入NIH3T3细胞瓶内，加入polybrene至终浓度为8μg/ml；③6h后更换为10％牛血清的DMEM培养液，用未感染的NIH3T3 细胞作对照；④72h后用4ug/ml的嘌呤霉素和500ug/ml的G418联合筛选，7d后对照NIH3T3细胞大部分死亡，实验组继续培养，待长出肉眼可见的克落后，倾去培养液，以纯甲醛固定后用 Giemsa染色，计数细胞的克隆数，再乘以稀释倍数得到病毒滴度。

(3)产毒PT67包装细胞的冻存：收获并于-196℃液氮中冻存产毒PT67包装细胞。

5、产毒PT67包装细胞的逆转录病毒转染sp2/0细胞

(1)sp2/0细胞的转染前准备：将细胞传代培养于含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，转染前一天将细胞(2×10⁵/孔)接种于六孔板，培养至40％～50％细胞密度时进行转染。

(2)产毒PT67包装细胞培养液的收获：产毒PT67包装细胞培养24小时后，收获含逆转录病毒的培养上清液，以0.45um的低蛋白吸附滤器过滤，备用于sp2/0细胞的转染。

(3)逆转录病毒转染sp2/0细胞：取待转染的sp2/0细胞培养板，吸弃培养液，加入上述含逆转录病毒的产毒PT67包装细胞培养液，37℃5％C02培养转染24～48h，更换新鲜培养液。

6、逆转录病毒转染sp2/0介质细胞的筛选及鉴定

(1)筛选：sp2/0细胞经逆转录病毒转染72h后，经转染hTERT/pLPCX的细胞用2～4ug/ml 的嘌呤霉素筛选，经转染SV40LT/pLXSN的细胞用200～400ug/ml的G418筛选，药物筛选1～2 周，待细胞克隆生长至1.0cm左右时，挑取细胞克隆，扩大培养，此时更换为不含药物的培养基，继续培养或冻存于-196℃液氮中。

(2)鉴定：采用Western blot法检测SV40和hTERT。消化细胞，配成1×10⁶/ml细胞悬液，加入细胞裂解液，煮沸10min，13000g离心15min，提取细胞总蛋白，8％SDS-PAGE电泳后转至硝酸纤维膜，脱脂牛奶封闭，加鼠抗SV40LT/hTERT，37℃保温2h；生物化羊抗鼠抗体，37℃保温2h；链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物，37℃保温30min，鲁米诺荧光曝光检测。

(3)永生化试验：分别收获均处于对数生长期的逆转录病毒转染sp2/0介质细胞和未作逆转录病毒转染sp2/0细胞，接种于25cm²培养瓶中，每瓶2×10³个细胞，加10％胎牛血清的DMEM 培养基5.0ml，分别置于37℃5％CO₂和37℃无CO₂的培养箱中培养。结果发现，逆转录病毒转染 sp2/0介质细胞在37℃5％CO₂和37℃无CO₂的培养箱中培养48h，细胞生长汇合度均＞90％，几乎无漂浮死亡细胞，培养液清晰；而未作逆转录病毒转染sp2/0细胞在37℃5％CO₂的培养箱中培养48h，细胞生长汇合度为70～80％，有5％的细胞死亡漂浮，培养液有杂质，而且在37℃无CO₂的培养箱中培养48h，接种的细胞全部死亡，无细胞生长(表1)。

表1逆转录病毒转染及未转染sp2/0细胞生长特性的比较

由表1可知，本发明制备的sp2/0细胞易于培养，不易在培养中死亡，细胞生长汇合度大，特别是本发明制备的sp2/0细胞能在无CO₂的条件下生长。鉴于CO₂属于危险品，其使用平台、运输线路等都有特殊要求，另外二氧化碳培养箱为5万元/台，非二氧化碳培养箱为2000～3000 元/台，所以本发明制备的sp2/0细胞能在后期实验中简化实验操作、降低实验条件和成本。

7、逆转录病毒转染sp2/0细胞与罕见病细胞杂交试验

(1)细胞融合试验

①罕见病细胞的准备：包括单基因病、多基因病、染色体病、线粒体病或体细胞病的基因缺失、重复等突变的淋巴细胞、单核细胞、羊水细胞或绒毛组织细胞；基因突变包含病因未明突变或目标致病性突变。临用前以DMEM培养液(基础培养基)调整总细胞数到1×10⁸～2 ×10⁸，以台盼兰染色、相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。

②逆转录病毒转染sp2/0介质细胞的准备：融合前一周从液氮罐内取出冻存的逆转录病毒转染sp2/0介质细胞，立即放入热水解冻，融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加DMEM培养液，置CO2培养箱培养，3-4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合时将SP2/0介质细胞从培养瓶上吹下，转入离心管中，1000r/m离心5-10min，重复洗涤细胞2 次，轻轻敲打混匀，取少量悬液计数，调整好密度，使融合时的密度为80％左右。

③细胞融合方法：在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出以后在无菌的条件下将预热的i000μL的30％PEG3000在60s内沿管壁滴加到融合管中，同时轻轻旋转离心管，之后将预热的 25mL基础培养基在3-5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，转置56℃水浴放散抗体5分钟(除去结合的抗体)，立即以1500r/m 离心5min，弃去上清，加入50mL HAT培养基，适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃、 5％CO2培养箱中培养。

④融合细胞的接种：每例融合细胞以10％胎牛血清悬浮，接种于96孔板，共8排，每排12 孔，每孔200μl，37℃培养12～24h。

⑤融合细胞的筛选：筛选试剂的配制：(a)G418贮存液：称取300mgG418加入3mlPBS溶液，完全溶解后，以0.22μm过滤器过滤，-20℃保存；(b)HAT贮存液：以DMEM将HAT原液配成浓度为50×的贮存液；(c)以10％胎牛血清配制同含HAT、G418和PM的联合筛选应用液，包括甲液：G418浓度为200μg/ml、PM浓度为2μg/ml、HAT浓度为1×；乙液：G418浓度为300μg/ml、PM浓度为3μg/ml、HAT浓度为1×；丙液：G418浓度为400μg/ml、PM浓度为4μg/ml、HAT浓度为1×；丁液：G418浓度为500μg/ml、PM浓度为5μg/ml、HAT浓度为1×。筛选方法：(a)在96 孔板的第1和2排、第3和4排、第5和6排、第7和8排中分别以200μl/孔的甲液、乙液、丙液和丁液进行筛选，每5天更换筛选液1次。

⑥融合细胞的扩大培养：待杂交瘤细胞生长至96孔板底面积的1/3～2/3时，转种到24孔板或12孔板，生长到一定程度后，转种至25cm培养瓶，然后冻存或做进一步的鉴定试验。

(2)逆转录病毒转染及未转染sp2/0细胞对比细胞融合的结果

本发明采用重组逆转录病毒转染sp2/0细胞(试验组)与未作重组逆转录病毒转染sp2/0 细胞(对照组)，分别在相同条件下做细胞融合。具体方法为：以5例标本，每例均分为2份，分别编入试验组和对照组，进行细胞融合、96孔板接种、联合筛选、传代扩增及致病基因鉴定。结果发现，试验组在5块96孔板中初筛到由3～5个细胞形成的初筛克隆孔数为71个，在连续筛选2周后细胞持续生长的续筛克隆孔数有66个，将66孔内的细胞克隆分别转至12孔板中培养、最后转至25cm²培养瓶中培养，细胞呈持续生长并能扩增到预期汇合度的预期细胞瓶数为 61瓶；而对照组在5块96孔板中初筛到由3～5个细胞形成的初筛克隆孔数为34个，在连续筛选 2周后细胞仍持续生长的续筛克隆孔数为23个，将23孔内的细胞克隆分别转至12孔板培养、最后转至25cm²培养瓶培养，细胞呈持续生长并扩增到预期结果的预期细胞瓶数为15瓶(表2)。

表2以重组逆转录病毒转染及未转染sp2/0细胞制备融合细胞的实验结果比较

在表2的基础上，结合细胞融合、培养过程的观察，结果发现试验组在5份标本中全部筛选到阳性克隆，转至25cm2培养瓶后细胞呈持续生长，每份标本均获得融合细胞，所以细胞融合成功率达100％；在5块96孔板中，总共筛选到71个克隆孔，融合率为14.8％(71/5×96)；初筛克隆孔数为71个，在连续筛选2周后细胞仍呈持续生长的续筛克隆孔数有66个，细胞成活克隆数占比93％(66/71)，相对细胞死亡克隆数为7％；将细胞生长至孔底1/3以上的续筛克隆转至12孔板培养、最后转至25cm2培养瓶培养，细胞呈持续生长并能扩增到预期结果的预期细胞瓶数占比92.4％(61/66)；在细胞传代培养中，活细胞贴壁汇合度达90％以上。而对照组细胞融合成功率为80％(4/5)；融合率为7.1％(34/5×96)；细胞成活克隆数占比62.7％(52/83)，细胞死亡克隆数占比37.3％；预期细胞瓶数占比67.6％(23/34)，在传代中细胞全部死亡的相应瓶数占比34.8％；细胞传代培养的活细胞贴壁生长汇合度通常不到50％(表2)。

表3重组逆转录病毒转染及未转染sp2/0细胞的细胞融合实验结果比较

表2和3的结果表明，本发明以hTERT和SV40LT转染的sp2/0细胞制备融合细胞，因融合细胞也获得了hTERT和SV40LT永生化基因，所以能提高细胞融合的成功率和融合率，增加克隆筛选过程的细胞成活率，降低阳性克隆细胞传代培养的细胞死亡率，提高融合细胞贴壁生长的汇合度，从而为产业化扩增融合细胞、进而扩增融合细胞内的致病基因奠定了基础。

(3)融合细胞培养特性试验：分别取以逆转录病毒转染及未转染sp2/0细胞制备的融合细胞，接种于25cm²培养瓶中，每瓶2×10³个细胞，加10％胎牛血清的DMEM培养基5.0ml，分别置于37℃5％CO₂和37℃无CO₂的培养箱中培养。结果发现，本发明以逆转录病毒转染sp2/0细胞制备的融合细胞，在37℃5％CO₂和37℃无CO₂的培养箱中培养48h，细胞生长的汇合度均＞90％，几乎无漂浮死亡细胞，培养液清晰；而以未作逆转录病毒转染sp2/0细胞制备的融合细胞，在37℃5％CO₂的培养箱中培养48h，细胞生长汇合度<50％，有30％的细胞死亡漂浮，培养液有杂质，而且在37℃无C0₂的培养箱中培养48h，接种的细胞全部死亡，无细胞生长(表4)。

由表4可知，本发明制备的融合细胞易于培养，不易在培养中死亡，细胞生长汇合度大，特别是本发明制备的融合细胞能在无CO₂的条件下生长。鉴于CO₂属于危险品，其使用平台、运输线路等都有特殊要求，以及二氧化碳培养箱为5万元/台，非二氧化碳培养箱为2000～3000 元/台，所以本发明制备的融合细胞能在后期实验中简化实验操作、降低实验条件和成本。

表4分别以逆转录病毒转染及未转染sp2/0细胞制备的融合细胞的生长特性比较

(4)融合细胞的验证

①染色体核型的验证：对比分析SP2/0细胞和杂交瘤细胞的染色体核型，计数50个分裂象，观察杂交瘤细胞中染色体数目的变化。SP2/0细胞的染色体数目大多为62条，杂交瘤细胞的染色体数目大多少于人染色体数目与SP2/0细胞染色体数目之和(有部分人染色体在细胞融合后没有独立存在，已与SP2/0细胞的染色体发生融合)，杂交瘤细胞的染色体结构保留了人类染色体的区带(图5)。

②致病基因的验证：采用荧光原位杂交(FISH)技术和/或PCR技术(QF-PCR/RT-PCR/荧光定量PCR/实时PCR)扩增后DNA电泳和/或测序技术(一代测序/Hiseq测序/目标区域测序/ 深度测序/GC校正及信息对比判定CNV/滑动窗口分析测序数据/二元分割一双向节段调节阈值分析测序数据)验证致病基因并进行分类。

③杂交瘤细胞的稳定性：每隔3个月取1支冻存的杂交瘤细胞，进行复苏培养，观察细胞的存活率及传代培养情况，传5-10代后进行致病基因的PCR或测序验证，以发现致病基因的稳定性，稳定者继续冻存。

8、罕见病杂交瘤永生基因库的构建

(1)按本发明的上述方法制备罕见病杂交瘤细胞。

(2)冻存杂交瘤细胞：按细胞株的常规冻存方法，将杂交瘤细胞冻存于-196℃液氮中。

(3)配置信息化平台：用于记录杂交瘤细胞株来源、基因组序列、定期验证结果等信息。

(4)突变基因移植并贮存于杂交瘤细胞内，而杂交瘤细胞冻存于-196℃液氮中，当需要使用突变基因时可通过提取杂交瘤细胞进行体外培养以复制细胞，进而经DNA提取或PCR扩增而可再生利用罕见病基因。

9、罕见病杂交瘤永生基因库的应用

(1)制备质控参考株：按DNA提取试剂盒说明书，提取罕见病杂交瘤细胞株DNA，测定目标罕见病基因DNA的浓度，按基因检测试剂盒规定的DNA用量，换算为相当的细胞数量，据目标罕见病基因DNA浓度和细胞含量的关系以及目标罕见病基因的类型分别配制、分装杂交瘤细胞株，作为罕见病基因检测的校准参考株。

(2)用于基因检测的室内质控：①判断检测结果的准确性：选择2株校准参考株，与疑含相同目标致病基因的被测标本在相同条件下检测，如果质控参考株所含有的已知目标致病基因被全部检出，而不含有的目标致病基因不被检出，说明检测系统处于质控在控状态，同批次的同类目标致病基因检测结果可靠，可发出报告；②绘制基因检测的室内质控图：将质控参考株的目标致病基因作为阳性对照，非目标致病基因的突变作为阴性对照，将每批次的阳性和阴性对照检测结果记录在室内质控图上，以监测室内检测方法的稳定性及是否在控。

(3)校准基因检测平台：根据质控参考株的室内质控结果，如果发现检测系统并非处于质控在控状态，则应查找失控原因，包括校准或更换检测仪器和检测试剂、改用数据分析软件和突变基因比对数据库及其比对方法。

(4)验证数据分析软件：在检测仪和检测试剂都处于质控在控的前提下，可用参考株的检测数据验证数据分析软件是否准确可靠，分析其在数据的筛选和拼接等处理中的准确性。

(5)验证基因数据库：在检测仪、检测试剂和分析软件及其分析方法都处于质控在控的前提下，可用质控参考株的检测数据验证基因突变比对数据库的可靠性，分析其在参考株目标突变基因的比对和筛选中是否与所含有的已知突变基因相符。

(6)佐证突变基因的检测结果：将质控参考株与被测标本在相同条件下检测所得到的检测数据同时与比对数据库进行比对，如果参考株被检出的突变基因与所含有的已知突变基因相符，则被测标本所检出的与参考株相同的突变基因应判断为可靠的结果。

(7)用于基因检测的室间质评：质量管理机构可定期将质控参考株发放到各参评单位，进行基因检测的质量评价，根据回报的结果评价各参评实验室基因检测的准确性及各室检测结果的差异，以便及时发现质量问题并及时整改。

(8)互认室间检测结果：根据室间质评结果，如果发现相同质控参考株因检测单位的不同而给出不同的结果，则说明室间质量有问题，应查找原因，统一改用可靠的基因检测系统，确保各单位检测结果的准确性和一致性，促使各室检测结果的互认，以免就诊者每到一家医疗单位就诊各需取样复检。

(9)创建以质控参考株为比对的基因检测方法：传统的基因检测方法是通过基因芯片和测序数据与基因数据库的比对得到基因诊断或筛查结果，例如将基因检测数据与正常突变数据库比对，除去正常突变基因，再与致病突变数据库比对，得到同类致病突变基因。这种比对因被测人种和检测条件等不同，缺乏可比性，创建质控参考株替代现有基因数据库进行比对，基于被测标本与参考株具有相同检测条件的相同检测数据而推断两者具有相同的突变基因，依此作出基因诊断或筛查报告。

Claims (10)

1.一种全基因组高通量克隆载体的构建，其特征在于，构建含SV40LT、hTERT和抗生素抗性基因的逆转录病毒重组载体，将该重组载体转染PT67包装细胞以制备转染质粒，继之将该质粒转染sp2/0细胞，使sp2/0细胞获得高度永生化和抗生素抗性的性能，从而更适合于在体外无限传代并带动被植入的外源基因的扩增，以作为全基因组高通量克隆载体用于罕见病全基因组的植入、产业制备和收藏。

2.根据权利要求1所述的一种全基因组高通量克隆载体的构建，其特征在于，逆转录病毒载体包括pLPCX、pLXN、pCDNA3.1、pCMV、pSV-neo及pEF。

3.根据权利要求1所述的一种全基因组高通量克隆载体的构建，其特征在于，所述逆转录病毒重组载体包括pLPCX-hTERT和pLXSN-SV40LT。

4.根据权利要求1、3所述的一种全基因组高通量克隆载体的构建，其特征在于，所述逆转录病毒重组载体包含携带PM抗性基因的hTERT和携带G418抗性基因的SV40LT。

5.根据权利要求1所述的一种全基因组高通量克隆载体的构建，其特征在于，以含4ug/ml PM和500ug/ml G418的混合液联合筛选经逆转录病毒重组载体转染的PT67包装细胞。

6.根据权利要求1所述的一种全基因组高通量克隆载体的构建，其特征在于，以含2～4ug/ml PM和200～400ug/ml G418的混合液联合筛选经转染质粒转染的sp2/0细胞。

7.根据权利要求1所述的一种全基因组高通量克隆载体的构建，其特征在于，所述全基因组高通量克隆载体指因转染了hTERT/pLPCX和SV40LT/pLXSN而含有G418抗性基因、SV40LT基因、PM抗性基因和hTERT基因的高度永生化sp2/0细胞。

8.根据权利要求5、6所述的一种全基因组高通量克隆载体的构建，其特征在于，所述HAT、G418和PM联合筛选，应用液包括甲液：G418浓度为200µg/ml、PM浓度为2µg/ml、HAT浓度为1×；乙液：G418浓度为300µg/ml、PM浓度为3µg/ml、HAT浓度为1×；丙液：G418浓度为400µg/ml、PM浓度为4µg/ml、HAT浓度为1×；丁液：G418浓度为500µg/ml、PM浓度为5µg/ml、HAT浓度为1×。

9.根据权利要求6所述的一种全基因组高通量克隆载体的构建，其特征在于，所述HAT、G418和PM联合筛选指在96孔板的第1和2排、第3和4排、第5和6排、第7和8排中加入200µl/孔的分别以甲液、乙液、丙液、丁液配制的融合细胞悬液，过5天更换筛选液。

10.根据权利要求1所述的一种全基因组高通量克隆载体的构建，其特征在于，所述罕见病全基因组的收藏指将罕见病基因贮存在sp2/0细胞内，并长期冻存于-196℃液氮，临用时提取细胞进行培养扩增，以可再生利用罕见病基因。