CN104372027A

CN104372027A - 慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P及其构建与应用

Info

Publication number: CN104372027A
Application number: CN201410559278.2A
Authority: CN
Inventors: 齐绪峰; 夏景波; 陈卓莹; 蔡冬青; 吴彩红; 王健欢; 毛承舟; 刘光辉
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2014-10-20
Filing date: 2014-10-20
Publication date: 2015-02-25

Abstract

本发明公开一种慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P及其构建与应用。所述载体在CMV启动子下游插入多克隆位点，能够被SpeI、BclI、EcoRI、PacI、XhoI、SalI及BamHI共7个限制性内切酶所识别。所述载体的应用包括：将目的基因插入到多克隆位点，实现目的基因的稳定表达；利用EF1α启动子驱动的EGFP及Puromycin抗性基因进行荧光示踪及抗药性筛选；利用已在3′LTR区域插入的LoxP位点及慢病毒的转录与反转录特性，在Cre重组酶表达的情况下实现外源基因及报告基因的有效删除。本发明的载体可通过与pCMVR8.74及pMD2.G载体共同转染293T细胞，实现慢病毒颗粒的包装。

Description

慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P及其构建与应用

技术领域

本发明涉及一种慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P，特别涉及一种不仅适用于Cre-LoxP系统，又携带EF1α启动子驱动的EGFP及Puro双报告基因，同时携带CMV启动子驱动的人工合成的多克隆位点的慢病毒表达载体及其构建与应用。

背景技术

慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒(human immune-deficiency virus,HIV)为基础改造而来，具有宿主范围广，能感染分裂细胞及非分裂细胞，转染效率高，能携带多达8～10kb的外源基因等优势，是基因功能研究及基因治疗领域的重要途径之一。近年来，随着分子生物学技术的深入发展，根据慢病毒载体的物理特性将其分装到几个不同的质粒中，进一步提升了慢病毒载体用于基因治疗的安全性。这种技术改进不但使得慢病毒载体所携带的外源基因有效整合到宿主细胞的基因组并稳定表达，同时又具有较低的免疫原性，进而能有效降低慢病毒载体作为基因治疗手段的潜在风险。而且，与逆转录病毒载体相比，慢病毒载体通过随机整合的方式将外源基因插入到宿主细胞的基因组中，因此不容易造成原癌基因及致癌基因位点的插入突变。目前，基于慢病毒载体的基因转染已经在造血干细胞、NK细胞、DC细胞等免疫细胞中取得成功，从而为有关免疫细胞相关疾病的基因治疗提供了一条有效途径。而且，慢病毒载体系统在肿瘤基因治疗领域同样显示出良好的应用前景。2006年，Levine等进行了第一项基于慢病毒载体的人体临床实验，利用表达靶向HIV的反义基因的慢病毒载体转染T细胞，并回输到患者体内，用于治疗5名经过多个疗程的抗病毒治疗仍然无效的HIV患者。结果表明，其中4名患者体内观察到靶向HIV的细胞免疫，在随后的4年随访中，未发现白血病或其他严重的与基因治疗相关的不良反应，进一步表明了慢病毒载体在临床基因治疗中基本安全。虽然通过慢病毒载体能将外源基因有效整合到靶细胞的基因组中实行稳定表达，但外源基因及慢病毒载体骨架序列的整合对靶细胞仍然存在潜在的安全风险，无法根据需要将外源基因及时删除，急需研发出既能有效筛选、鉴定转染的阳性细胞，又能根据需要有效删除外源基因及载体骨架的更加安全有效的慢病系统。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P。该表达载体既能有效表达外源基因，又能进行荧光示踪及抗药性筛选，而且能利用Cre-LoxP系统进行外源基因有效删除。

本发明的另一目的在于上述慢病毒表达载体的构建方法；

本发明的再一目的在于上述慢病毒表达载体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于Cre-LoxP系统的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P，该慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P是以慢病毒载体pLOX-TERT-riesTK为基础，通过插入多克隆位点(MCS)构建pLOX-MCS载体，同时在MCS末端引入由EF1α启动子驱动的EGFP(绿色荧光蛋白)及Puromycin抗性基因(Puro)片段，进而构建慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P；所述载体pLOX-CMV-E/P所携带的多克隆位点由CMV(人巨细胞病毒)启动子驱动，所携带的EGFP(绿色荧光蛋白)及Puromycin抗性基因由EF1α启动子驱动。

所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的多克隆位点包括SpeI、BclI、EcoRI、PacI、XhoI、SalI及BamHI等7个酶切位点，其DNA序列为：5′-ACT AGTGAT CAG AAT TCT TAA TTA ACT CGA GTC GAC GGA TCC-3′。

所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的构建方法，包含以下步骤：

(1)设计合成包含SpeI、BclI、EcoRI、PacI、XhoI、SalI、BamHI、SbfI、MluI及KpnI等10个酶切位点DNA序列的两条引物，如下所示：MCS-F：5′-CTAGTG ATC AGA ATT CTT AAT TAA CTC GAG TCG ACG GAT CCT GCA GGACGC GTG GTA C-3′及MCS-R：5′-CAC GCG TCC TGC AGG ATC CGT CGA CTCGAG TTA ATT AAG AAT TCT GAT CA-3′；

(2)将上述两条DNA序列等量混合，进行退火反应，以形成DNA双链，进而获得预期的人工合成多克隆位点序列MCS；所述人工合成的MCS两端分别含有SpeI及KpnI酶切位点的粘性末端(图1B)；

(3)将pLOX-TERT-iresTK质粒(美国Addgene)经SpeI和KpnI双酶切(ThermoFisher公司)，电泳后，切胶回收8195bp大小片段，并与步骤(2)所述退火形成的MCS片段进行连接、转化，挑选重组质粒，用CMV-F正向测序引物进行测序，测序正确的重组质粒命名为pLOX-MCS；

所述的CMV-F正向测序引物的DNA序列如下所示：5′-CGC AAA TGG GCGGTA GGC GTG-3′；所述的CMV-F正向测序引物位于MCS上游的CMV启动子内部；

(4)以pB513质粒(System Biosciences公司)为模板，设计正向引物EF1α-GFP/Pur-F：5′-CGG GAT CCG AAG GAT CTG CGA TCG CTC C-3′(下划线为BamHI酶切位点，5′端CG为酶切位点保护碱基)，以及反向引物EF1α-GFP/Pur-R：5′-GGG GTA CCT CAG GCA CCG GGC TTG CGG GT-3′(下划线为KpnI酶切位点，5′端GG为酶切位点保护碱基)；用KOD-Plus-Neo高保真酶PCR扩增试剂盒(Toyobo公司)扩增EF1α-EGFP-Puro片段，大小为1986bp，切胶回收目的大小片段；

(5)将步骤(4)所述切胶回收的PCR产物及步骤(3)所述pLOX-MCS载体均使用BamHI和KpnI双酶切(ThermoFisher公司)，经电泳、切胶纯化后进行连接反应，转化感受态大肠杆菌DH5α(北京天根生化科技有限公司)；

(6)对步骤(5)所述的转化平板进行单菌落挑选，进行菌落PCR及双酶切(BamHI和KpnI)鉴定，结果均为阳性的单克隆分别用CMV-F及Sp6-R(Sp6-R：5′-ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3′)进行正、反双向测序。所述CMV-F正向测序引物位于插入位点上游的CMV启动子内部，Sp6-R反向测序引物位于3′LTR区域。测序正确的重组质粒命名为pLOX-CMV-EF1α-EGFP-Puro，简称pLOX-CMV-E/P，即得到慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P。

所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P在生物技术领域中的应用，包括：(1)将外源目的基因克隆到载体的多克隆位点，获得表达目的基因的重组载体，与慢病毒包装载体pCMVR8.74及pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装，将所包装的慢病毒颗粒作用于靶细胞，以达到有效表达外源基因的目的；(2)利用所述慢病毒表达载体同时表达EGFP及Puromycin抗性基因的特性，进行中靶细胞的荧光示踪及抗药性筛选，以达到有效筛选及纯化中靶细胞的目的；(3)本慢病毒表达载体的3′LTR区域内的U3原件中间插入了LoxP序列，通过慢病毒载体的转录及反转录过程，最终在外源基因及表达原件整合到宿主基因组中的同时，在其两端同时整合了同向的两个LoxP位点，在Cre重组酶表达的情况下，包含外源基因在内的整合片段将能被有效删除。

所述的慢病毒表达载体的图谱如图3C所示。

将重组慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P与包装载体pCMVR8.74(美国Addgene)及包膜载体pMD2.G(美国Addgene)共同转染293T细胞，收集培养上清，获得慢病毒颗粒，实现慢病毒颗粒的包装，可用于转染目的细胞。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)位点特异性基因重组技术是通过对特定的DNA序列进行精确切割及连接，实现在基因水平上对生物体进行遗传改造的一种基因操作技术，其中Cre-LoxP系统已经发展成为一种成熟且广泛应用的删除目的基因片段的方法。本研究首先利用已经在3′端LTR区域的U3原件中插入了LoxP位点的慢病毒载体pLOX-TERT-riesTK为基础，通过设计、合成并插入多克隆位点(MCS)构建pLOX-MCS载体，同时在人工合成的MCS末端引入由EF1α启动子驱动的EGFP绿色荧光蛋白基因及Puromycin抗性基因(Puro)片段，进而构建既能进行荧光示踪及抗药性筛选，又能根据需要适时外源基因的慢病毒表达载体pLOX-CMV-EF1α-EGFP-Puro(简称pLOX-CMV-E/P)，为基因治疗及基因功能研究提供一种安全有效的慢病毒载体系统。

(2)将外源目的基因的编码区构建于所述慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的多克隆位点上，不仅可实现外源基因的稳定表达，同时可利用其所携带的EGFP及Puromycin抗性基因进行荧光示踪及抗药性筛选。所述插入外源基因的慢病毒表达载体不仅可有效作用于分裂及非分裂状态的细胞，也适用于体内及体外研究，对于基因治疗及基因功能研究均具有重要的科学意义及应用前景。

附图说明

图1是本发明所述pLOX-MCS载体的构建流程及载体图谱；其中，A为pLOX-TERT-riesTK载体图谱；B为人工合成的多克隆位点图谱；C为pLOX-MCS载体图谱。

图2是本发明所述pLOX-MCS载体的多克隆位点的测序结果。

图3是本发明所述慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的构建流程及载体图谱；其中，A为pLOX-MCS载体图谱；B为pB513载体图谱；C为pLOX-CMV-E/P载体图谱。

图4是利用本发明所述EF1α-EGFP-Puro片段的PCR扩增及菌落PCR鉴定结果；其中，A为利用本发明所设计的引物对EF1α-GFP/Pur-F及EF1α-GFP/Pur-R，以pB513质粒为模板扩增出的EF1α-EGFP-Puro片段的电泳结果；B为所扩增的PCR片段(EF1α-EGFP-Puro)与pLOX-MCS质粒进行酶切、连接及转化后所挑选的5个单克隆的菌落PCR结果。

图5是重组慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的酶切鉴定及序列分析结果；其中，A为1号与5号克隆的双酶切(BamHI及KpnI)鉴定结果；B为利用CMV-F测序引物对1号克隆进行正向测序的结果；C为利用Sp6-R测序引物对1号克隆进行反向测序的结果。

图6是利用免疫荧光显微镜检测重组慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P中绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况；其中，对照组为利用pLOX-MCS载体与包装质粒共转染293T细胞1天后的白光及荧光照片；实验组为利用pLOX-CMV-E/P载体与包装质粒共转染293T细胞1天后的白光及荧光照片。

图7是利用Puromycin药物处理及荧光显微镜技术检测重组慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P中抗药性基因的功能；其中，对空白对照(Con)为未做任何处理的293T细胞；对照组(pLOX-CMV-E/P)为pLOX-CMV-E/P载体所包装的慢病毒颗粒感染293T细胞3天后，再继续培养4天的白光及荧光照片；实验组为利用pLOX-CMV-E/P载体所包装的慢病毒颗粒感染293T细胞3天后，再分别用Puromycin(3μg/mL)连续处理4天及7天后的白光及荧光照片。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1 人工多克隆位点MCS的设计与合成

(1)以pLOX-TERT-iresTK质粒(美国Addgene)DNA为模板，利用NEBcutterV2.0在线分析软件(http://tools.neb.com/NEBcutter2/)进行限制性酶切位点分析，在CMV启动子与TERT编码区之间选择SpeI单酶切位点，在TK基因编码区与3′LTR之间选择酶切位点KpnI进行双酶切，去除TRET-iresTK片段(如图1A所示)。

(2)选择剩余质粒片段中没有的常用限制性酶切位点BclI、EcoRI、PacI、XhoI、SalI、BamHI、SbfI及MluI，共同组成多克隆位点序列，并在其5′端加入SpeI酶切位点的粘性末端，在其3′端加入KpnI酶切位点的粘性末端，用于将多克隆位点连接到载体中。

(3)设计合成包含上述酶切位点DNA序列的互补引物对：MCS-F：5′-CTAGTG ATC AGA ATT CTT AAT TAA CTC GAG TCG ACG GAT CCT GCA GGACGC GTG GTA C-3′及MCS-R：5′-CAC GCG TCC TGC AGG ATC CGT CGA CTCGAG TTA ATT AAG AAT TCT GAT CA-3′，经退火形成双链，构成多克隆位点序列(MCS)。其中，所设计的人工多克隆位点序列图谱如图1B所示；多克隆位点的退火反应体系如表1所示。

表1 多克隆位点的退火反应体系

MCS-F(100μM)	1μL
		MCS-R(100μM)	1μL
T4PNK	0.5μL
		10×T4Ligase Buffer	1μL
DDW(超纯水)	6.5μL
		Total Volume	10μL

将上述反应体系混匀，按照如下条件进行退火反应：37℃反应30min，95℃反应5min，程序性降温到25℃(0.08℃/s降温)。

实施例2 pLOX-MCS载体的构建

(1)将pLOX-TERT-iresTK质粒经Spe I和Kpn I双酶切，将酶切产物进行电泳分离，并用凝胶回收试剂盒(Qiagen公司)进行切胶回收8195bp大小片段，与实施例1步骤(3)中所述退火形成的MCS片段进行连接，用T4DNA连接酶(ThermoFisher公司)于16℃连接过夜。其中，连接反应体系如表2所示。

表2多克隆位与pLOX-TERT-riesTK酶切片段点的连接反应体系

切胶回收的pLOX-TERT-iresTK载体片段	50ng
		MCS片段	0.1μL
T4DNA连接酶	1μL
		10×T4Ligase Buffer	2μL
DDW(超纯水)	至20μL
		Total Volume	20μL

(2)取上述连接产物2μL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)，涂布于含有氨苄青霉素(浓度100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜，挑选单克隆进行测序验证(图2)，使用重组质粒中MCS上游的CMV启动子中的测序引物(CMV-F：5′-CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG-3′)进行测序，测序正确的重组质粒命名为pLOX-MCS。

其中，重组质粒pLOX-MCS的图谱及构建流程如图1所示。

实施例3 pLOX-CMV-E/P载体的构建

(1)以pB513质粒(System Biosciences公司)为模板，设计正向引物EF1α-GFP/Pur-F：5′-CGG GAT CCG AAG GAT CTG CGA TCG CTC C-3′(下划线为BamHI酶切位点，5′端CG为酶切位点保护碱基)，以及反向引物EF1α-GFP/Pur-R：5′-GGG GTA CCT CAG GCA CCG GGC TTG CGG GT-3′(下划线为KpnI酶切位点，5′端GG为酶切位点保护碱基)，用KOD-Plus-Neo高保真酶PCR试剂盒(Toyobo公司)扩增EF1α-EGFP-Puro片段(大小为1986bp)，经电泳分离(见图4A)后，利用凝胶回收试剂盒(Qiagen公司)回收目的大小片段。其中，PCR反应体系如表3所示。

表3用于扩增EF1α-EGFP-Puro片段的PCR反应体系

pB513质粒(170ng/μL)	0.3μL
		EF1α-GFP/Pur-F(10μM)	1.5μL
EF1α-GFP/Pur-R(10μM)	1.5μL
		KOD-Plus-Neo(1.0U/μL)	1μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo	5μL
		dNTPs(2mM)	5μL
MgSO₄(25mM)	3μL
		DDW(超纯水)	32.7μL
Total Volume	50μL

将上述反应体系混匀，按照如下条件进行退火反应：94℃预变性2min；98℃10s，58℃退火30s，68℃延伸1min10s，共35个循环；最后于68℃延伸7min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检查。

(2)将pLOX-MCS载体及上述PCR产物均用BamHI和KpnI(ThermoFisher公司)进行双酶切，经电泳分离后，利用凝胶回收试剂盒(Qiagen公司)回收目的大小片段，最后将二者的回收产物用T4DNA连接酶(ThermoFisher公司)于16℃连接过夜。其中，连接反应体系如表4所示。

表4 双酶切的pLOX-MCS载体片段与双酶切的PCR产物的连接反应体系

双酶切的pLOX-MCS载体片段	50ng
		双酶切的PCR产物	与载体的摩尔比为10：1
T4DNA连接酶	1μL
		10×T4Ligase Buffer	2μL
DDW(超纯水)	至20μL
		Total Volume	20μL

(3)取上述连接产物2μL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)，涂布于含有氨苄青霉素(浓度100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜，重组质粒经过菌落PCR(结果见图4B)挑选阳性克隆，并进行双酶切鉴定(结果见图5A)后，分别利用CMV-F及Sp6-R(Sp6-R：5′-ATT TAG GTG ACACTA TAG-3′)进行正、反双向测序(结果分别见图5B、C)，CMV-F正向测序引物位于插入位点上游的CMV启动子内部，Sp6-R反向测序引物位于3′LTR区域(测序由北京六合华大基因科技有限公司完成)。测序正确的重组质粒命名为pLOX-CMV-EF1α-EGFP-Puro(pLOX-CMV-E/P)。

其中，pLOX-CMV-E/P载体的图谱及其构建流程如图3所示。

实施例4 重组载体pLOX-CMV-E/P表达绿色荧光蛋白的功能验证

(1)实验分组：实验分为对照组(pLOX-MCS)与实验组(pLOX-CMV-E/P)共2组，所有组别的细胞数量及培养条件一致。

(2)具体转染方法：将1×10⁵个293T细胞(ATCC，美国)接种于24孔板，用DMEM(10％的血清、无抗生素)培养基培养24小时，待细胞长到80％融合，去除原有培养基，将1.2μg质粒混合物((pLOX-MCS或pLOX-CMV-E/P)：pCMVR8.74：pMD2.G的摩尔比＝1.5:1:1；三种质粒的总量为1.2μg/孔)与3.6μL的LipoFiter^TM脂质体转染试剂(汉恒生物科技(上海)有限公司)混合于100μL的Medium(Gibco公司)中，共同添加到含有400μL新鲜DMEM完全培养基的24孔板中，放入37℃的培养箱中继续培养。

(3)荧光显微镜检测：细胞转染24小时后进行荧光显微镜观察并进行拍照。结果表明，用pLOX-CMV-E/P表达载体与包装质粒共转染靶细胞后，能够产生稳定的绿色荧光，表明绿色荧光蛋白能够稳定表达；然而，用pLOX-MCS载体与包装质粒共转染靶细胞后，未观察到绿色荧光(图6)。

实施例5 重组载体pLOX-CMV-E/P表达抗药性基因的功能验证

(1)慢病毒包装：

将本发明所构建的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P分别与包装载体pCMVR8.74及包膜载体pMD2.G共转染293T细胞，进行病毒颗粒的包装。将293T细胞提前一天接种到10cm的培养皿中，待第二天达到70％～80％融合时进行上述表达载体与包装载体的共转染。转染体系：pLOX-CMV-E/P质粒：pCMVR8.74质粒：pMD2.G质粒的摩尔比为1.5:1:1，三者的总DNA量为24μg，将质粒混合物溶解到500μL的Medium(Gibco公司)中，并与已经溶解到500μL的Medium(Gibco公司)中的LipoFiter^TM脂质体转染试剂(48μL)混匀，共转染293T细胞，转染48h后收集上清液，同时加入10mL新鲜培养基并于转染后72h后收集上清，将两次收集的病毒上清液混合，3000rpm水平离心去除细胞碎片，上清液通过Milipore 0.45μm滤膜过滤，进一步去除细胞碎片。将过滤后的病毒上清液与慢病毒浓缩试剂盒(BIOMIGA，美国)中的LP buffer按照4：1(V/V)的比例混合，并于4℃过夜。然后将病毒混合液于4℃条件下，以3000rpm的转速离心30min，移除上清，用慢病毒浓缩试剂盒中的LS buffer(100μL)溶解病毒颗粒沉淀，并于4℃条件下，以8000rpm的转速离心2min，收集上清液，分装后于-80℃冻存备用。

(2)实验分组：实验分为空白对照组(Con)，pLOX-CMV-E/P感染组，pLOX-CMV-E/P感染+Puromycin处理(4天)组，pLOX-CMV-E/P感染+Puromycin处理(7天)组等共4组，所有组别的细胞数量及培养条件一致。

(3)具体转染方法：将1×10⁵个293T细胞(ATCC，美国)接种于24孔板，用DMEM(10％的血清、无抗生素)培养基培养24小时，待细胞长到80％融合，每孔加入上述包装并浓缩的慢病毒悬液5μL(空白对照组每孔加入5μL的培养基)，放入37℃的培养箱中继续培养，24h后换液培养，以后每2～3天换液一次。其中，慢病毒感染3天后，加入Puromycin(3μg/mL)处理4到7天。

(4)荧光显微镜检测：结果表明：未处理的正常细胞能够有效存活，但无绿色荧光蛋白表达；经慢病毒感染而未经Puromycin处理的细胞仍然观察到大量存活的细胞，并且可观察到相当比例的细胞中表达绿色荧光蛋白；然而，用Puromycin处理慢病毒感染的细胞4天后，仅有少量细胞存活，且存活的细胞均能表达绿色荧光蛋白；而且，继续用Puromycin筛选到7天后，仍然有存活并能表达绿色荧光蛋白的细胞(图7)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于Cre-LoxP系统的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P，其特征在于：该慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P是以慢病毒载体pLOX-TERT-riesTK为基础，通过插入多克隆位点构建pLOX-MCS载体，同时在入多克隆位点末端引入由EF1α启动子驱动的EGFP及Puromycin抗性基因片段，进而构建慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P；所述载体pLOX-CMV-E/P所携带的多克隆位点由CMV启动子驱动，所携带的EGFP及Puromycin抗性基因由EF1α启动子驱动。

2.根据权利要求1所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P，其特征在于：

所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的多克隆位点包括SpeI、BclI、EcoRI、PacI、XhoI、SalI及BamHI酶切位点。

3.根据权利要求1或2所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P，其特征在于：所述的多克隆位点的DNA序列为SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1～3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的构建方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)设计合成两条引物，分别见SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；

(2)将上述两条引物等量混合，进行退火反应，以形成DNA双链，进而获得人工合成多克隆位点序列MCS；所述人工合成的MCS两端分别含有SpeI及KpnI酶切位点的粘性末端；

(3)将经过SpeI和KpnI双酶切的pLOX-TERT-iresTK质粒DNA片段，与步骤(2)所述退火形成的MCS片段进行连接，构建pLOX-MCS载体；

(4)设计正向引物EF1α-GFP/Pur-F以及反向引物EF1α-GFP/Pur-R，以pB513质粒为模板，PCR扩增EF1α-EGFP-Puro片段；

(5)将步骤(4)所述的PCR扩增产物及步骤(3)所述的pLOX-MCS载体均使用BamHI和KpnI双酶切，然后进行连接反应，将EF1α-EGFP-Puro片段插入到pLOX-MCS载体多克隆位点中的BamHI与KpnI酶切位点之间，构建成慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)中所述的多克隆位点包括SpeI、BclI、EcoRI、PacI、XhoI、SalI、BamHI、SbfI、MluI及KpnI酶切位点。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：步骤(3)中所述的EF1α-GFP/Pur-F的DNA序列为：5′-CGG GAT CCG AAG GAT CTG CGA TCGCTC C-3′，下划线为BamHI酶切位点，5′端CG为酶切位点保护碱基；所述的EF1α-GFP/Pur-R的DNA序列为：5′-GGG GTA CCT CAG GCA CCG GGC TTGCGG GT-3′，下划线为KpnI酶切位点，5′端GG为酶切位点保护碱基。

7.权利要求1～3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P在生物技术领域中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将外源目的基因克隆到权利要求1～3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的多克隆位点中，实现外源基因的稳定表达。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：利用权利要求1～3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的3′LTR区域已插入的LoxP位点，通过慢病毒载体的转录及反转录过程，最终在外源基因及表达原件整合到宿主基因组中的同时，在其两端同时整合了同向的两个LoxP位点，在Cre重组酶表达的情况下，包含外源基因在内的整合片段将能被有效删除。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：利用权利要求1～3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P同时表达EGFP及Puromycin抗性基因的特性，不仅能利用EGFP基因进行荧光示踪，同时能利用Puromycin抗性基因进行抗药性筛选；

权利要求1～3任一项所述的慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P与包装载体pCMVR8.74及包膜载体pMD2.G共同转染293T细胞，实现慢病毒颗粒的包装。