CN113755442A - 一种用于药物活性测定的细胞株及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于药物活性测定的细胞株及其制备方法与应用。本发明将含CRE‑Mini promoter‑GFP复合元件的慢病毒载体和含表达药物受体元件的慢病毒载体分别与包装质粒共转染包装细胞进行包装，获得可用于感染的病毒液；将获得的病毒液感染细胞，获得稳转细胞库；对细胞库进行分离、筛选得到用于药物活性测定的细胞株。本发明采用GFP作为报告基因，检测GIP、GCG、GLP‑1及其类似物活性时，无需裂解细胞等繁琐步骤，可直接检测活细胞，从而检测成本低，不需要专门配套检测试剂盒；所得到的细胞株拥有内参RFP矫正数据，检测结果更准确，稳定可信；所构建的细胞株检测药物范围广，通用性好。

Description

一种用于药物活性测定的细胞株及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于重组蛋白药物体外活性测定技术领域，尤其涉及一种用于药物活性测定的细胞株及其制备方法与应用。

背景技术

肥胖症和糖尿病是当今社会中常见的代表性代谢疾病，并且其与多种其他疾病相关，如心血管疾病(CVD)、中风、阻塞性睡眠呼吸暂停、外周动脉疾病等，成为威胁人们健康的重要影响因素。

肠促胰素(incretin)是通过增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌来调控血糖的胃肠激素，是机体重要的血糖调节激素，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和糖依赖性胰岛素释放多肽(GIP)是代表性的肠促胰素。胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1,GLP-1)来源于前高血糖素原的72-108位氨基酸，由前高血糖素原水解而来，具有血糖依赖性降糖效应，并具有抑制胰高血糖素(GCG)分泌，减缓胃排空，抑制食欲，抑制β细胞凋亡，保护β细胞等作用。GIP是由小肠的K细胞分泌到血流中的42个残基的肽，也具有明显的葡萄糖依赖性降糖效应，对血液内葡萄糖浓度稳态发挥着重要的生理作用，并且它可以抑制胃酸分泌，抑制胃蛋白酶原分泌，抑制胃的蠕动和排空，刺激小肠液的分泌达到降低体重的效果。胰高血糖素(GCG)是一种29个氨基酸的肽，可以刺激糖元分解和糖异生来增加血糖水平，是抵消胰岛素作用和维持血糖水平的重要激素。此外，它还具有促进脂肪分解、脂肪酸氧化、产热、产生饱腹感等作用。

基于GLP-1、GCG、GIP三者控制血糖及降低体重的效果，多靶点激动剂的开发已成为重要研发方向之一，而且已有研究表明多靶点激动剂效果甚至明显优于单靶点激动剂。GLP-1、GCG、GIP多靶点激动剂的开发重点在于合理协调GLP-1、GCG、GIP相应受体激动活性比，得到有效控制血糖水平，减少体重并且无或更少副作用如恶心、呕吐的新型药物分子。因此，快速及准确评价药物对GLP-1、GCG、GIP受体激动活性的测定方法显得尤为重要。

目前用于检测GLP-1及其类似物活性的方法报道较多，主要基于以下两方面：(1)检测胞内cAMP含量的变化间接反映GLP-1活性，该方法易受内源性因素干扰，而且cAMP半衰期短，导致准确性和稳定性都不够理想；(2)利用荧光素酶报告基因表达强度来反映GLP-1活性，该方法需要相应的荧光素酶检测试剂盒，操作较为繁琐，成本较高，而且荧光素酶产生的荧光半衰期短，不利于高通量样品活性筛选。并且测定GCG和GIP及其类似物活性方法报道较少，已报道的方法仍然主要是基于胞内cAMP含量的变化来间接反映GCG和GIP及其类似物活性，需要专门的试剂盒。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，基于GIP、GCG、GLP-1重要活性通路的相似性(GIP与GLP-1有着极其相似的信号传导通路，而GCG在与受体结合后信号传导通路虽然与前两者不同，但都引起了第二信使cAMP的变化，而且后续信号传导路径相同)，本发明发明人通过设计并合成CRE反应元件序列，插入到慢病毒表达载体形成CRE-Mini promoter-GFP(绿色荧光蛋白)复合元件，将GIPR(GIP受体)、GCGR(GCG受体)、GLP1R(GLP-1受体)分别共表达于相应的检测细胞中，配体(GIP、GCG、GLP-1及其类似物)结合受体后，受体活化介导的cAMP依赖的转录因子结合CRE反应元件进而促进绿色荧光蛋白(GFP)表达，通过GFP表达强度来反映出GIP、GCG、GLP-1及其类似物的激动活性。该方法通过多功能微孔板检测仪直接读取GFP荧光强度，敏感性高，无需裂解细胞、无需额外试剂或试剂盒，操作简便经济，可为GIP、GCG、GLP-1多靶点激动剂活性筛选及评价提供重要方法。

从而，本发明的首要目的是提供一种用于药物活性测定的细胞株的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法获得的用于药物活性测定的细胞株。

本发明的的再一目的在于提供上述用于药物活性测定的细胞株的应用。

为了实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：

一种用于药物活性测定的细胞株的制备方法，包括如下步骤：

(1)将含CRE-Minipromoter-GFP复合元件的慢病毒载体和含表达药物受体元件的慢病毒载体分别与包装质粒共转染包装细胞，获得可用于感染的病毒液；

(2)将步骤(1)获得的病毒液感染细胞，获得稳转细胞库；

(3)对步骤(2)的细胞库进行分离、筛选得到用于药物活性测定的细胞株。

所述的药物优选为GLP-1、GLP-1类似物、GCG、GCG类似物、GIP和GIP类似物中的至少一种。

所述的CRE-Mini promoter-GFP复合元件是将序列如SEQ ID NO.2所示的CRE-Mini promoter元件设置在编码GFP的基因的上游得到的复合元件，通过CRE-Minipromoter控制GFP的表达。

步骤(1)中所述的含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的慢病毒载体优选通过如下步骤制备得到：以序列如SEQ ID NO.1所示的复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP为骨架，将序列如SEQ ID NO.2所示的CRE-Mini promoter构建到复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP的GFP基因上游，得到含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的慢病毒载体。

步骤(1)中所述的含表达药物受体元件的慢病毒载体是以复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP为骨架，将载体上的启动子6xTetO-min CMV替换为SV40，将载体上的GFP替换为RFP，将载体上的PuroR替换为药物受体元件，其中，RFP为红色荧光蛋白，GFP为绿色荧光蛋白，PuroR为嘌呤霉素抗性基因；优选通过如下步骤制备得到：

(A)将复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP上的6xTetO-mini CMV更换为SV40promoter，得到含SV40-GFP复合元件的复制缺陷型慢病毒载体；

(B)将含SV40-GFP复合元件的复制缺陷型慢病毒载体上GFP片段更换为RFP，得到含SV40-RFP复合元件的复制缺陷型慢病毒载体；

(C)将含SV40-RFP复合元件的复制缺陷型慢病毒载体上嘌呤霉素抗性(PuroR)基因片段更换为药物受体元件，获得含药物受体元件的慢病毒载体。

步骤(C)中所述的药物受体元件优选为GIPR、GCGR和GLP1R中的至少一种。

所述的GIPR的序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的GCGR的序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的GLP1R的序列如SEQ ID NO.5所示。

步骤(1)中所述的包装的方法按本领域采用的慢病毒载体的包装方法即可，优选的步骤如下为：

(a)将含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的慢病毒载体和含表达药物受体元件的慢病毒载体分别与包装质粒混合后，得到DNA混合液1和DNA混合液2，再分别转染包装细胞；

(b)转染18-28小时后，分别加入丁酸钠(Sodium butyrate)以增强病毒包装效率，处理8-14小时后弃上清换新鲜无血清培养基；

(c)转染43-55小时后，得到含CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含表达药物受体元件的病毒液。

步骤(a)中所述的包装质粒包括但不限于PsPAX2、pMD2.G、pMDLg/RRE、pRSV-Rev、pCMV-VSV-G；优选由PsPAX2和pMD2.G按质量比1:1配比得到。

步骤(a)中所述的含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的慢病毒载体与所述的包装质粒优选按质量比1～3：2进行配比；更优选按质量比1：1进行配比。

步骤(a)中所述的含表达药物受体的慢病毒载体与所述的包装质粒优选按质量比1～3：2进行配比；更优选按质量比1：1进行配比。

步骤(a)中所述的转染方法包括但不限于电击转染法、脂质体转染法、PEI转染法和磷酸钙转染法；优选为脂质体转染法；更优选为将慢病毒载体、包装质粒和转染试剂复合物混合。

步骤(a)中所述的包装细胞优选为HEK-293T。

所述的包装细胞的汇合度优选为转染时达85～95％；更优选为转染时接近90％。

步骤(b)中所述的丁酸钠的终浓度优选为8～12mmol/L；更优选为10mmol/L。

步骤(b)中所述的培养基优选为DMEM培养基。

所述的培养基的用量优选为3～5mL；更优选为3.5mL。

步骤(c)中所述的病毒液优选为是将转染后的细胞培养上清过滤得到。

所述的过滤方式优选为通过0.45μm滤膜过滤。

步骤(2)中所述的慢病毒感染的步骤优选如下：

①取步骤(1)获得的含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的病毒液和含表达药物受体元件的病毒液同时感染细胞；

②病毒感染后3～6小时，补加新鲜的完全培养基培养；

③病毒感染后42～52小时，更换新鲜的完全培养基，获得稳转细胞库。

步骤①中所述的含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的病毒液和所述的含表达药物受体元件的病毒液优选按体积比1-3：1配比；更优选按体积比1：1配比。

步骤①中所述的细胞优选为HEK-293T。

所述的细胞的汇合度优选为30-50％。

步骤②中所述的补加新鲜的完全培养基的时间优选为病毒感染后4h。

所述的完全培养基优选为含有10％(v/v)胎牛血清、2～4mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM完全培养基；更优选为含有10％胎牛血清、终浓度为4mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM完全培养基。

所述的新鲜的完全培养基的补加体积优选为所述的病毒液的总量的2～4倍；更优选为所述的病毒液的总量的2.3倍。

步骤③中所述的完全培养基为含有10％胎牛血清、终浓度为4mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM完全培养基。

步骤(3)中所述的分离的方法优选为有限稀释法。

所述的有限稀释法中孔板的细胞密度优选为0.3-0.5个细胞/孔；更优选为0.3个细胞/孔。

步骤(3)中所述的筛选的步骤优选为：加入腺甘酸环化酶激活剂Forskolin刺激分离得到的单克隆细胞，进行GFP荧光强度分析；筛选得到GFP荧光响应强度高的单克隆细胞株，即可作为用于药物活性测定的细胞株。

所述的Forskolin的浓度优选为8～12μmol/L；更优选为10μmol/L。

所述的刺激时间优选为20-28h；更优选为24h。

一种用于药物活性测定的细胞株，通过上述制备方法得到。

所述的药物优选为GLP-1、GLP-1类似物、GCG、GCG类似物、GIP和GIP类似物中的至少一种。

所述的用于药物活性测定的细胞株在药物活性测定中的应用。

所述的药物优选为GLP-1、GLP-1类似物、GCG、GCG类似物、GIP和GIP类似物中的至少一种。

一种药物活性测定的方法，包括如下步骤：将所述的用于药物活性测定的细胞株接种入细胞培养板中，针对不同受体细胞分别加入相应的药物刺激后测定GFP表达强度，建立药物剂量与GFP表达强度的量效曲线；优选包括以下步骤：

(I)将所述的用于药物活性测定的细胞株离心、洗涤、重悬，得到细胞悬液，接种入细胞培养板中，静置培养；

(II)制备药物标准品溶液，设置稀释浓度梯度；

(III)细胞培养板中的细胞培养18～24小时后，吸去培养上清，加入配制好的梯度浓度的药物标准品溶液；

(IV)作用20～28h后，测定红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的强度；

(V)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以绿色荧光蛋白强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。

所述的药物优选为GLP-1、GLP-1类似物、GCG、GCG类似物、GIP和GIP类似物中的至少一种。

所述的细胞培养板包括但不限于24孔板、48孔板、96孔板，384孔板；优选为96孔板。

所述的细胞培养板优选为多聚赖氨酸包被的细胞培养板。

所述的多聚赖氨酸包被的细胞培养板优选通过如下方法制备得到：将多聚赖氨酸加入细胞培养板中覆盖全孔，作用，吸干多聚赖氨酸，洗涤，风干，得到多聚赖氨酸包被的细胞培养板。

所述的多聚赖氨酸的浓度优选为0.1mg/mL。

对于96孔板，所述的多聚赖氨酸的加入量优选为30～50μL；更优选为30μL。

所述的作用的时间优选为5～10min；更优选为5min。

所述的洗涤优选采用PBS洗涤。

所述的洗涤的次数优选为2～3次；更优选为2次

步骤(I)中所述的洗涤优选采用PBS洗涤。

所述的洗涤的次数优选为2～3次；更优选为2次。

步骤(I)中所述的重悬优选为采用检测培养基重悬。

所述的检测培养基优选为含10％FBS和2～6mmol/L L-谷氨酰胺的

BrightFluore DMEM；更优选为含10％FBS和4mmol/L L-谷氨酰胺的

BrightFluore DMEM。

步骤(I)中所述的接种量按细胞接种后生长24h达到的汇合度为80～90％来计算；对于96孔板，优选按100～200μl细胞悬液/孔接种，其中细胞悬液的细胞密度为0.5-0.7M/mL。

步骤(I)中所述的培养条件优选为于37℃、5％CO₂及饱和湿度的条件下培养18～24小时。

对于96孔板，步骤(III)中所述的药物标准品溶液优选为100～200μL/孔。

步骤(IV)中所述的作用的时间优选为20～30h；更优选为24h。

步骤(IV)中所述的测定优选为使用多功能微孔板检测仪测定。

步骤(IV)中所述的红色荧光蛋白强度用于复孔之间绿色荧光蛋白强度数据矫正。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明采用自主灭活型慢病毒载体，具有安全、高效等优点。

(2)本发明采用GFP而非荧光素酶作为报告基因，检测GLP-1及其类似物活性时，操作简便，无需裂解细胞等繁琐步骤，直接检测活细胞，从而检测成本低，不需要专门配套检测试剂盒。

(3)本发明所构建的细胞株拥有内参RFP矫正数据，检测结果更准确，稳定可信。RFP和GFP荧光蛋白稳定性较好，不存在或较少存在荧光淬灭的问题，检测更加灵活，利于高通量样品检测。

(4)本发明的研究人员在研究中发现用传统的化学转染方法构建细胞株，抗生素加压筛选后获得的稳定细胞库药物刺激后响应强度不高，不宜用作药物活性测定细胞株，且进一步筛选获得高响应强度的单克隆细胞株也比较困难；而采用慢病毒感染方法构建细胞株，细胞感染率几乎100％，且能将多个拷贝的慢病毒整合序列整合入细胞基因组。获得的稳定细胞库对药物的响应强度高，有限稀释法分离获得的单克隆细胞株对药物响应强度高，药物浓度拟合曲线好，检测稳定性好，对不同药物及其类似物通用性好。

(5)本发明方法制备的细胞株检测药物范围广，通用性好。

附图说明

图1为载体pLenti-GFP的物理图谱图。

图2为载体pLentiCRE-GFP的构建流程图。

图3为载体pLentiSVRFP-GIPR的构建流程图。

图4为载体pLentiSVRFP-GCGR的构建流程图。

图5为载体pLentiSVRFP-GLP1R的构建流程图。

图6为细胞株对GIP标准品的量效曲线关系图。

图7为细胞株对GCG标准品的量效曲线关系图。

图8为细胞株对GLP-1标准品的量效曲线关系图。

图9为载体pcDNA3.0-GLP1R的构建流程图。

图10为载体pTBpCRE-GFP的构建流程图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中，未详尽说明的操作为常规操作。

本实施例中的PBS为0.01M、pH＝7.4的PBS。

实施例1 pLentiCRE-GFP重组载体构建

(1)将质粒pLenti-GFP(实验室留存，其物理图谱见图1，序列如SEQ ID NO.1所示)进行ClaI和PstI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(2)合成ClaI-4xCRE-Mini promote-PstI核酸片段(序列如SEQ ID NO.2所示，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，ClaI和PstI双酶切后胶回收纯化获得带开放性粘性末端的4xCRE-Mini promoter片段。

(3)将pLenti-GFP线性化载体与4xCRE-Mini promoter片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(ClaI-PstI酶切后大小分别为7792bp、209bp片段的为阳性克隆，最后通过测序确定)，最终可获得pLentiCRE-GFP重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株，载体构建流程如图2所示。

实施例2 pLentiSVRFP-GIPR重组载体构建(构建流程如图3所示)

(1)以pcDAN3.0质粒(Invitrogen)为模板，通过PCR反应扩增获取SV40片段，ClaI和PstI双酶切后纯化回收酶切产物。PCR的引物为：

SVClaI：5’-ACCATCGATCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGG-3’；

SVPstI：5’-CAACCTGCAGTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCA-3’。

PCR反应体系为50μL：模板pcDNA3.0质粒1ng(1μL)、浓度为5μM的引物SVClaI 2μL、浓度为5μM的引物SVPstI 2μL、PrimerSTAR Max mix 25μL、灭菌水补足至50μL。

PCR反应条件如下：98℃3min；98℃10s、55℃5s、72℃30s，共34个循环；最后，72℃5min；4℃∞。

(2)将质粒pLenti-GFP进行ClaI和PstI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(3)将pLenti-GFP线性化载体与纯化回收的SV40基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(ClaI-PstI酶切后大小分别为7786bp、348bp片段的为阳性克隆，测序)，最终可获得pLenti-SV40-GFP

重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

(4)以pTRIPZ质粒(Invitrogen)为模板，通过PCR反应扩增获取RFP基因片段，PstI和XhoI双酶切后纯化回收酶切产物。PCR的引物为：

RFPstI：5’-CAACCTGCAGGTCGCCACCATGAGCGA-3’；

RFPXhoI：5’-TGAGCTCGAGATCGATTATCTGTGCCCCAGT-3’。

PCR反应体系为50μL：模板pTRIPZ质粒1ng(1μL)、浓度为5μM的引物RFPstI 2μL、浓度为5μM的引物RFPXhoI 2μL、PrimerSTAR Max mix 25μL、灭菌水补足至50μL。

PCR反应条件如下：98℃3min；98℃10s、55℃5s、72℃1min，共34个循环；最后，72℃5min；4℃∞。

(5)将质粒pLenti-SV40-GFP进行XhoI和PstI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(6)将pLenti-SV40-GFP线性化载体与纯化回收的RFP基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(XhoI-PstI酶切后大小分别为7352bp、712bp片段的为阳性克隆，最终通过测序确定)，最终可获得pLenti-SV40-RFP重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

(7)合成BamHI-GIPR-SalI核酸片段(序列如SEQ ID NO.3所示，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，BamHI和SalI双酶切后胶回收纯化获得带开放性粘性末端的GIPR片段。

(8)将pLenti-SV40-RFP进行BamHI和SalI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(9)将pLenti-SV40-RFP线性化载体与纯化回收的GIPR基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(BamHI-SalI酶切后大小分别为7444bp、1435bp片段的为阳性克隆，最终通过测序确定)，最终可获得pLentiSVRFP-GIPR重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

实施例3 pLentiSVRFP-GCGR重组载体构建(构建流程如图4所示)

pLentiSVRFP-GCGR重组载体的构建方法与pLentiSVRFP-GIPR重组载体的构建方法一致，区别仅在于步骤(7)、(9)，具体如下：

(7)合成BamHI-GCGR-SalI核酸片段(序列如SEQ ID NO.4所示，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，BamHI和SalI双酶切后胶回收纯化获得带开放性粘性末端的GCGR片段。

(9)将pLenti-SV40-RFP线性化载体与纯化回收的GCGR基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(BamHI-SalI酶切后大小分别为7444bp、1468bp片段的为阳性克隆，最终通过测序确定)，终可获得pLentiSVRFP-GCGR重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

实施例4 pLentiSVRFP-GLP1R重组载体构建(构建流程如图5所示)

pLentiSVRFP-GLP1R重组载体的构建方法与pLentiSVRFP-GIPR重组载体的构建方法一致，区别仅在于步骤(7)、(9)，具体如下：

(7)合成BamHI-GLP1R-SalI核酸片段(序列如SEQ ID NO.5所示，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，BamHI和SalI双酶切后胶回收纯化获得带开放性粘性末端的GLP1R片段

(9)将pLenti-SV40-RFP线性化载体与纯化回收的GLP1R基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(BamHI-SalI酶切后大小分别为7444bp、1422bp片段的为阳性克隆，最终通过测序确定)，最终可获得pLentiSVRFP-GLP1R重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

实施例5 慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GIPR包装和感染

(1)质粒提取：将慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GIPR及包装载体PsPAX2、pMD2.G进行质粒提取，获得高浓度高纯度无内毒素的质粒(参照PureLink^TM HiPurePlasmid Filter Midiprep Kit(Thermo)中方法)。

(2)细胞培养：复苏HEK-293T贴壁细胞(ATCC)，以常规传代培养方法在DMEM完全培养基(含10％(v/v)胎牛血清，4mmol/L L-谷氨酰胺)中进行传代培养3代以上，用于共转染慢病毒包装实验。

(3)慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GIPR的包装

(A)共转染前一天(约24小时)，将铺满的HEK-293T细胞以1：2.5-3的比例进行传代；转染当天，HEK-293T细胞汇合度接近90％。

(B)将1.25μg PsPAX2、1.25μg pMD2.G、2.5μg pLentiCRE-GFP(质量比为1：1：2)和1.25μg PsPAX2、1.25μg pMD2.G、2.5μg pLentiSVRFP-GIPR(质量比为1：1：2)分别混合均匀，得到DNA混合液A和DNA混合液B。

(C)在步骤(B)中混匀的DNA混合液A中加入300μL Opti-MEM和12μL P3000，混合均匀，得到稀释的DNA溶液(1号管)；同时，将300μL Opti-MEM和12μL

3000混合均匀，得到转染试剂混合液(2号管)。对混合液B的处理方式同对混合液A的处理方式。

(D)分别设置阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组以相同的方式共转染pLVX-ZsGreen1-N1(Clontech)质粒和包装质粒PsPAX2和pMD2.G(质量比为2：1：1)，阴性对照组只转染包装质粒PsPAX2和pMD2.G(质量比为1：1)。

(E)将步骤(C)中稀释后的质粒混合液(1号管)分别加入到转染试剂混合液(2号管)中，轻轻混匀(终体积600μl)，室温下静置20分钟使形成DNA-转染试剂复合体。然后，将DNA-转染试剂复合体混合液分别加入待转染HEK-293T细胞中，继续培养。

(F)共转染后第二天(18-20小时后)，在转染HEK-293T细胞中分别加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠。

(G)继续培养10-12小时，小心移除上清，每个T25培养瓶分别加入3.5mL新鲜无血清DMEM培养基后继续培养。

(H)培养15-18小时后，培养上清分别经过0.45μm滤膜过滤后即可获得可用于感染的病毒液(分别为含有CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含有PGK-GIPR元件的病毒液)。

(4)慢病毒感染

(A)病毒感染前一天，对待感染HEK-293T贴壁细胞进行传代，感染当天，HEK-293T细胞汇合度为30-50％。

(B)吸去HEK-293T细胞培养上清，加入步骤(3)获得的经过0.45μm滤膜过滤后的含有CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含有PGK-GIPR元件的慢病毒病毒液各1.5mL，轻轻混匀后，8％CO₂、37℃继续培养。

(C)病毒感染后4小时，补加7mL新鲜的DMEM完全培养基(含10％胎牛血清+4mmol/LL-谷氨酰胺)，8％CO₂、37℃继续培养。

(D)病毒感染2天(约48小时)后，更换新鲜的DMEM完全培养基(含10％胎牛血清+4mmol/L L-谷氨酰胺)，在此步骤中，荧光显微镜下可见离心收集的阳性对照组细胞具有较强的绿色荧光，阴性对照组未见荧光，慢病毒感染实验成功。

实施例6 慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GCGR包装和感染

(1)质粒提取：将慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GCGR及包装载体PsPAX2、pMD2.G进行质粒提取，获得高浓度高纯度无内毒素的质粒(参照PureLink^TM HiPurePlasmid Filter Midiprep Kit(Thermo)中方法)。

(2)细胞培养：复苏HEK-293T贴壁细胞(ATCC)，以常规传代培养方法在DMEM完全培养基(含10％胎牛血清，4mmol/L L-谷氨酰胺)中进行传代培养3代以上，用于共转染慢病毒包装实验。

(3)慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GCGR的包装

(A)共转染前一天(约24小时)，将铺满的HEK-293T细胞以1：2.5-3的比例进行传代；转染当天，HEK-293T细胞汇合度接近90％。

(B)将1.25μg PsPAX2、1.25μg pMD2.G、2.5μg pLentiCRE-GFP(质量比为1：1：2)和1.25μg PsPAX2、1.25μg pMD2.G、2.5μg pLentiSVRFP-GCGR(质量比为1：1：2)分别混合均匀，得到DNA混合液C和DNA混合液D。

(C)在步骤(B)中混匀的DNA混合液C中加入300μL Opti-MEM和12μL P3000，混合均匀，得到稀释的DNA溶液(1号管)；同时，将300μL Opti-MEM和12μL

3000混合均匀，得到转染试剂混合液(2号管)。对混合液D的处理方式同对混合液C的处理方式。

(D)分别设置阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组以相同的方式共转染pLVX-ZsGreen1-N1(Clontech)质粒和包装质粒PsPAX2和pMD2.G(质量比为2：1：1)，阴性对照组只转染包装质粒PsPAX2和pMD2.G(质量比为1：1)。

(E)将步骤(C)中稀释后的质粒混合液(1号管)分别加入到转染试剂混合液(2号管)中，轻轻混匀(终体积600μl)，室温下静置20分钟使形成DNA-转染试剂复合体。然后，将DNA-转染试剂复合体混合液分别加入待转染HEK-293T细胞中，继续培养。

(F)共转染后第二天(18-20小时后)，在转染HEK-293T细胞中分别加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠。

(G)继续培养10-12小时，小心移除上清，每个T25培养瓶分别加入3.5mL新鲜无血清DMEM培养基后继续培养。

(H)培养15-18小时后，培养上清分别经过0.45μm滤膜过滤后即可获得可用于感染的病毒液(分别为含有CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含有PGK-GCGR元件的病毒液)。

(4)慢病毒感染

(A)病毒感染前一天，对待感染HEK-293T贴壁细胞进行传代，感染当天，HEK-293T细胞汇合度为30-50％。

(B)吸去HEK-293T细胞培养上清，加入步骤(3)获得的经过0.45μm滤膜过滤后的含有CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含有PGK-GCGR元件的慢病毒病毒液各1.5mL，轻轻混匀后，8％CO₂、37℃继续培养。

(C)病毒感染后4小时，补加7mL新鲜的DMEM完全培养基(含10％胎牛血清+4mmol/LL-谷氨酰胺)，8％CO₂、37℃继续培养。

(D)病毒感染2天(约48小时)后，更换新鲜的DMEM完全培养基(含10％胎牛血清+4mmol/L L-谷氨酰胺)，在此步骤中，荧光显微镜下可见离心收集的阳性对照组细胞具有较强的绿色荧光，阴性对照组未见荧光，慢病毒感染实验成功。

实施例7 慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GLP1R包装和感染

(1)质粒提取：将慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GLP1R及包装载体PsPAX2、pMD2.G进行质粒提取，获得高浓度高纯度无内毒素的质粒(参照PureLink^TMHiPure Plasmid Filter Midiprep Kit(Thermo)中方法)。

(2)细胞培养：复苏HEK-293T贴壁细胞(ATCC)，以常规传代培养方法在DMEM完全培养基(含10％胎牛血清，4mmol/L L-谷氨酰胺)中进行传代培养3代以上，用于共转染慢病毒包装实验。

(3)慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVRFP-GLP1R的包装

(A)共转染前一天(约24小时)，将铺满的HEK-293T细胞以1：2.5-3的比例进行传代；转染当天，HEK-293T细胞汇合度接近90％。

(B)将1.25μg PsPAX2、1.25μg pMD2.G、2.5μg pLentiCRE-GFP(质量比为1：1：2)和1.25μg PsPAX2、1.25μg pMD2.G、2.5μg pLentiSVRFP-GLP1R(质量比为1：1：2)分别混合均匀，得到DNA混合液E和DNA混合液F。

(C)在步骤(B)中混匀的DNA混合液E中加入300μL Opti-MEM和12μL P3000，混合均匀，得到稀释的DNA溶液(1号管)；同时，将300μL Opti-MEM和12μL

3000混合均匀，得到转染试剂混合液(2号管)。对混合液F的处理方式同对混合液E的处理方式。

(D)分别设置阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组以相同的方式共转染pLVX-ZsGreen1-N1(Clontech)质粒和包装质粒PsPAX2和pMD2.G(质量比为2：1：1)，阴性对照组只转染包装质粒PsPAX2和pMD2.G(质量比为1：1)。

(E)将步骤(C)中稀释后的质粒混合液(1号管)分别加入到转染试剂混合液(2号管)中，轻轻混匀(终体积600μl)，室温下静置20分钟使形成DNA-转染试剂复合体。然后，将DNA-转染试剂复合体混合液分别加入待转染HEK-293T细胞中，继续培养。

(F)共转染后第二天(18-20小时后)，在转染HEK-293T细胞中分别加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠。

(G)继续培养10-12小时，小心移除上清，每个T25培养瓶分别加入3.5mL新鲜无血清DMEM培养基后继续培养。

(H)培养15-18小时后，培养上清分别经过0.45μm滤膜过滤后即可获得可用于感染的病毒液(分别为含有CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含有PGK-GLP1R元件的病毒液)。

(4)慢病毒感染

(A)病毒感染前一天，对待感染HEK-293T贴壁细胞进行传代，感染当天，HEK-293T细胞汇合度为30-50％。

(B)吸去HEK-293T细胞培养上清，加入步骤(3)获得的经过0.45μm滤膜过滤后的含有CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含有PGK-GLP1R元件的慢病毒病毒液各1.5mL，轻轻混匀后，8％CO₂、37℃继续培养。

(C)病毒感染后4小时，补加7mL新鲜的DMEM完全培养基(含10％胎牛血清+4mmol/LL-谷氨酰胺)，8％CO₂、37℃继续培养。

(D)病毒感染2天(约48小时)后，更换新鲜的DMEM完全培养基(含10％胎牛血清+4mmol/L L-谷氨酰胺)，在此步骤中，荧光显微镜下可见离心收集的阳性对照组细胞具有较强的绿色荧光，阴性对照组未见荧光，慢病毒感染实验成功。

实施例8 有限稀释法分离单克隆细胞及单克隆细胞荧光响应分析

(1)取样检测HEK-293T/CRE-GFP活细胞(分别取实施例5、6、7制备的慢病毒感染后筛选得到的稳定细胞库)密度，细胞活率并观察生长状态；将生长状态良好的细胞用新鲜的DMEM完全培养基(含10％胎牛血清+4mmol/L L-谷氨酰胺)逐步稀释至0.3个细胞/40μl，用排枪将稀释后的细胞接种至96孔板，40μl/孔，即0.3个细胞/孔。

(2)接种的96孔板放置于CO₂培养箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下绝对静置培养4小时后，显微镜下逐孔观察，确认并标记只含有一个细胞的孔并将培养基补加至200μl；将细胞重新置于CO₂培养箱继续静置培养。

(3)绝对静置培养7-9天，镜下观察单克隆细胞生长状况，找到有明显细胞增殖的孔并作标记，明显细胞增殖的孔进行100μl/孔新鲜DMEM完全培养基(含10％胎牛血清+4mmol/L L-谷氨酰胺)半量换液。

(4)继续静置培养并每2-3天进行半量换液，镜下观察单克隆细胞增殖情况。

(5)培养8-12天后将生长较好的单克隆细胞放大至24孔板培养。

(6)放大培养的单克隆细胞加入10μmol/L腺甘酸环化酶激活剂Forskolin，刺激24h后，荧光显微镜镜下挑选GFP荧光明显的单克隆细胞扩大培养，并进行细胞株冷冻保藏。

(7)实验结果：有限稀释分离得到多株单克隆细胞，加入Forsklin刺激24h后，大部分加药组细胞GFP表达强度明显增强，未加药组细胞无绿色荧光或荧光很弱。

实施例9 建立GIP标准品量效曲线关系

(1)多聚赖氨酸包被96孔板：配置0.1mg/mL多聚赖氨酸Poly-D-lysine(sigma，P6407)，取30μL加入到96孔板中使其覆盖全孔，作用5min，吸干并用100μL PBS洗涤2次，风干。

(2)取实施例8筛选得到的用于GIP活性检测的单克隆细胞株离心、PBS洗涤2遍，检测培养基(含10％FBS和4mmol/L L-谷氨酰胺的

BrightFluore DMEM(TransGenBiotech)重悬后，以0.05M/100μL/孔的密度种入96孔板，置于CO₂培养箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养过夜。

(3)以检测培养基制备GIP(金斯瑞生物科技Cas No 100040-31-1)溶液：设置稀释浓度梯度：起始浓度为30nmol/L，4倍倍比稀释10个浓度梯度。

(4)96孔板细胞培养18-24小时后，吸去培养上清，并加入稀释好的GIP溶液，100μl/孔。

(5)作用24h后，使用多功能微孔板检测仪测定红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的强度。

(6)复孔偏差较大的绿色荧光强度数据使用红色荧光蛋白强度矫准。

(7)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。

(8)实验结果：筛选得到的单克隆细胞在GIP药物刺激下所得到的剂量效应曲线呈典型的反S型曲线，曲线拟合程度高(结果见图6)，说明药物浓度与GFP荧光强度存在明显的剂量相关性。

实施例10 建立GCG标准品量效曲线关系

(1)多聚赖氨酸包被96孔板：配置0.1mg/mL多聚赖氨酸Poly-D-lysine(sigma，P6407)，取30μL加入到96孔板中使其覆盖全孔，作用5min，吸干并用100μL PBS洗涤2次，风干。

(2)取实施例8筛选得到的用于GCG活性检测的单克隆细胞株离心、PBS洗涤2遍，检测培养基(含10％FBS和4mmol/L L-谷氨酰胺的

BrightFluore DMEM(TransGenBiotech))重悬后，以0.05M/100μL/孔的密度种入96孔板，置于CO₂培养箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养过夜。

(3)以检测培养基制备GCG(金斯瑞生物科技Cas No 64790-15-4)：设置稀释浓度梯度：起始浓度为30nmol/L，4倍倍比稀释10个浓度梯度。

(4)96孔板细胞培养18-24小时后，吸去培养上清，并加入稀释好的GCG溶液，100μl/孔。

(5)作用24h后，使用多功能微孔板检测仪测定红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的强度。

(6)复孔偏差较大的绿色荧光强度数据使用红色荧光蛋白强度矫准。

(7)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。

(8)实验结果：筛选得到的单克隆细胞在GCG药物刺激下所得到的剂量效应曲线呈典型的反S型曲线，曲线拟合程度高(结果见图7)，说明药物浓度与GFP荧光强度存在明显的剂量相关性。

实施例11 建立GLP-1标准品量效曲线关系

(1)多聚赖氨酸包被96孔板：配置0.1mg/mL多聚赖氨酸Poly-D-lysine(sigma，P6407)，取30uL加入到96孔板中使其覆盖全孔，作用5min，吸干并用100μL PBS洗涤2次，风干。

(2)取实施例8筛选得到的用于GLP-1活性检测的单克隆细胞株离心、PBS洗涤2遍，检测培养基(含10％FBS和4mmol/L L-谷氨酰胺的

BrightFluore DMEM(TransGen Biotech))重悬后，以0.05M/100μL/孔的密度种入96孔板，置于CO₂培养箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养过夜。

(3)以检测培养基制备GLP-1(金斯瑞生物科技Cas No 107444-51-9)：设置稀释浓度梯度：起始浓度为30nmol/L，4倍倍比稀释10个浓度梯度。

(4)96孔板细胞培养18-24小时后，吸去培养上清，并加入稀释好的GLP-1溶液，100μl/孔。

(5)作用24h后，使用多功能微孔板检测仪测定红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的强度。

(6)复孔偏差较大的绿色荧光强度数据使用红色荧光蛋白强度矫准。

(7)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。

(8)实验结果：筛选得到的单克隆细胞在GLP-1药物刺激下所得到的剂量效应曲线呈典型的反S型曲线，曲线拟合程度高(结果见图8)，说明药物浓度与GFP荧光强度存在明显的剂量相关性。

对比例1化学转染活性细胞株制备与应用

为了比较传统化学转染方法和病毒载体感染法制备细胞株的差异，我们分别将4xCRE-Mini promoter-GFP复合元件和GLP1R受体片段亚克隆入pcDNA3.0载体中构建得到pcDNA3.0-GLP1R和pTBpCRE-GFP表达载体(构建流程如图9和图10所示)，再以pTBpCRE-GFP和pcDNA3.0-GLP1R同时转染HEK-293T细胞，加压筛选获得GLP-1活性测定细胞。具体过程如下所示：

(1)将质粒pcDNA3.0(Invitrogen)进行SmaI和BstBI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(2)合成NruI-GLP1R-ClaI核酸片段(序列如SEQ ID NO.6所示，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，ClaI和NruI双酶切后胶回收纯化获得带开放性粘性末端的GLP1R片段。

(3)将pcDNA3.0线性化载体与GLP1R片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，通过测序可获得pcDNA3.0-GLP1R重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

(4)以pLPCX质粒(Clontech)为模板，PCR扩增Puro基因片段，扩增产物大小为640bp，NruI和ClaI双酶切后纯化回收酶切产物。PCR的引物为：

PuroP1：5’-ACATCGCGACCCCTCACAAGGAGACGA-3’；

PuroP2：5’-TGGATCGATTCAGGCACCGGGCTTGC-3’。

PCR反应体系为50μl：模板pLPCX质粒1ng(1μl)、浓度为5μM的引物PuroP1 2μl、浓度为5μM的引物PuroP2 2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl、灭菌水补足至50μl。

PCR反应条件如下：98℃3min；98℃10s、55℃5s、72℃45s，共34个循环；最后，72℃5min；4℃∞。

(5)将pcDNA3.0线性化载体与Puro基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，通过测序可获得pPuro重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

(6)再将质粒pPuro载体进行XhoI和NruI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。

(7)合成NruI-Transcription Blocker-4xCRE-Mini promote-GFP-XhoI核酸片段(序列如SEQ ID NO.7所示，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，并使用NruI和XhoI酶切胶回收获得带开放性粘性末端的NruI-Transcription Blocker-4xCRE-Mini promote-GFP-XhoI基因片段。

(8)将pPuro线性化载体与纯化回收的NruI-Transcription Blocker-4xCRE-Minipromote-GFP-XhoI基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(通过测序确定NruI-XhoI酶切后大小分别为4443bp、1243bp片段的为阳性克隆)，最终可获得pTBpCRE-GFP重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。

(9)质粒提取：将重组pTBpCRE-GFP和pcDNA3.0-GLP1R进行质粒提取，获得高浓度高纯度无内毒素的质粒(参照PureLink^TMHiPure Plasmid Filter Midiprep Kit(Thermo)中方法)，质量比为1：1共转染HEK-293T细胞，具体操作方法同实施例5转染步骤(参考Invitrogen^TMLipofectamine^TM3000Transfection Reagent L3000008)。

(10)共转染后第三天(44-48小时后)，加入终浓度为2μg/mL嘌呤霉素(puromycin)进行加压筛选。

(11)嘌呤霉素进行加压筛选5-7天，待阴性对照组细胞(未转染质粒)全部死亡，此时可认为完成细胞筛选，得到稳定表达的细胞库。

(12)步骤(11)获得的稳定细胞库，加入10μM/L腺甘酸环化酶激活剂Forskolin，刺激24h后测定GFP荧光强度。

(13)步骤(12)获得的稳定细胞库进行GLP-1(金斯瑞生物科技Cas No 107444-51-9)量效曲线分析，操作方法同实施例11。

(14)实验结果：化学转染方法加压获得的稳定细胞库加入Forskolin刺激后GFP表达强度增加不明显，远远小于病毒感染法获得的稳定细胞库(GFP表达强度约为病毒感染法的十分之一)，由于化学转染法获得的稳定细胞库Forskolin刺激后GFP表达强度较低，而未进行有限稀释分离单克隆细胞株，此稳定细胞库进行GLP-1(金斯瑞生物科技Cas No107444-51-9)量效曲线分析，药物浓度与GFP荧光强度也存在明显的剂量相关性，但GFP表达强度不高。

pLenti-GFP序列：

acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatgcaggtccgaggttctagacgagtttactccctatcagtgatagagaacgatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttatccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcaccggtcagctagcactgcagcgtctcaagcttcagaattctcagatccgctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtccggactctgatctcgagggggttggggttgcgccttttccaaggcagccctgggtttgcgcagggacgcggctgctctgggcgtggttccgggaaacgcagcggcgccgaccctgggtctcgcacattcttcacgtccgttcgcagcgtcacccggatcttcgccgctacccttgtgggccccccggcgacgcttcctgctccgcccctaagtcgggaaggttccttgcggttcgcggcgtgccggacgtgacaaacggaagccgcacgtctcactagtaccctcgcagacggacagcgccagggagcaatggcagcgcgccgaccgcgatgggctgtggccaatagcggctgctcagcagggcgcgccgagagcagcggccgggaaggggcggtgcgggaggcggggtgtggggcggtagtgtgggccctgttcctgcccgcgcggtgttccgcattctgcaagcctccggagcgcacgtcggcagtcggctccctcgttgaccgaatcaccgacctctctccccagggggatccaccggagcttaccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgagtcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggaattaattcgagctcggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcgggcccaaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagctg。

ClaI-4xCRE-Mini promote-PstI序列：

Atcgataaccggattaccgggatccatgctagcgcaccagacagtgacgtcagctgccagatcccatggccgtcatactgtgacgtctttcagacaccccattgacgtcaatgggagaacagatctggcctcggcggccaagcttcgaagacactagagggtatataatggaagctcgacttccagcttggcaatccggtactgttggtacactgcag。

BamHI-GIPR-SalI序列：

ggatccacgaaccagacccttcgccgccctcaccatgactacctctccgatcctccagctgctgctgcggctctcactgtgcgggctgctgctccagagggcggagacaggctctaaggggcagacggcgggggagctgtaccagcgctgggaacggtaccgcagggagtgccaggagaccttggcagccgcggaaccgccttcaggcctcgcctgtaacgggtccttcgatatgtacgtctgctgggactatgctgcacccaatgccactgcccgtgcgtcctgcccctggtacctgccctggcaccaccatgtggctgccggtttcgtcctccgccagtgtggcagtgatggccaatggggactttggagagaccatacacaatgtgagaacccagagaagaatgaggcctttctggaccaaaggctcatcttggagcggttgcaggtcatgtacactgtcggctactccctgtctctcgccacactgctgctagccctgctcatcttgagtttgttcaggcggctacattgcactagaaactatatccacatcaacctgttcacgtctttcatgctgcgagctgcggccattctcagccgagaccgtctgctacctcgacctggcccctaccttggggaccaggcccttgcgctgtggaaccaggccctcgctgcctgccgcacggcccagatcgtgacccagtactgcgtgggtgccaactacacgtggctgctggtggagggcgtctacctgcacagtctcctggtgctcgtgggaggctccgaggagggccacttccgctactacctgctcctcggctggggggcccccgcgcttttcgtcattccctgggtgatcgtcaggtacctgtacgagaacacgcagtgctgggagcgcaacgaagtcaaggccatttggtggattatacggacccccatcctcatgaccatcttgattaatttcctcatttttatccgcattcttggcattctcctgtccaagctgaggacacggcaaatgcgctgccgggattaccggctgaggctggctcgctccacgctgacgctggtgcccctgctgggtgtccacgaggtggtgtttgctcccgtgacagaggaacaggcccggggcgccctgcgcttcgccaagctcggctttgagatcttcctcagctccttccagggcttcctggtcagcgtcctctactgcttcatcaacaaggaggtgcagtcggagatccgccgtggctggcaccactgccgcctgcgccgcagcctgggcgaggagcaacgccagctcccggagcgcgccttccgggccctgccctccggctccggcccgggcgaggtccccaccagccgcggcttgtcctcggggaccctcccagggcctgggaatgaggccagccgggagttggaaagttactgctaggtcgac。

BamHI-GCGR-SalI序列：

ggatcctgtgggaggcagctagctgcccagaggcatgcccccctgccagccacagcgacccctgctgctgttgctgctgctgctggcctgccagccacaggtcccctccgctcaggtgatggacttcctgtttgagaagtggaagctctacggtgaccagtgtcaccacaacctgagcctgctgccccctcccacggagctggtgtgcaacagaaccttcgacaagtattcctgctggccggacacccccgccaataccacggccaacatctcctgcccctggtacctgccttggcaccacaaagtgcaacaccgcttcgtgttcaagagatgcgggcccgacggtcagtgggtgcgtggaccccgggggcagccttggcgtgatgcctcccagtgccagatggatggcgaggagattgaggtccagaaggaggtggccaagatgtacagcagcttccaggtgatgtacacagtgggctacagcctgtccctgggggccctgctcctcgccttggccatcctggggggcctcagcaagctgcactgcacccgcaatgccatccacgcgaatctgtttgcgtccttcgtgctgaaagccagctccgtgctggtcattgatgggctgctcaggacccgctacagccagaaaattggcgacgacctcagtgtcagcacctggctcagtgatggagcggtggctggctgccgtgtggccgcggtgttcatgcaatatggcatcgtggccaactactgctggctgctggtggagggcctgtacctgcacaacctgctgggcctggccaccctccccgagaggagcttcttcagcctctacctgggcatcggctggggtgcccccatgctgttcgtcgtcccctgggcagtggtcaagtgtctgttcgagaacgtccagtgctggaccagcaatgacaacatgggcttctggtggattctgcggttccccgtcttcctggccatcctgatcaacttcttcatcttcgtccgcatcgttcagctgctcgtggccaagctgcgggcacggcagatgcaccacacagactacaagttccggctggccaagtccacgctgaccctcatccctctgctgggcgtccacgaagtggtcttcgccttcgtgacggacgagcacgcccagggcaccctgcgctccgccaagctcttcttcgacctcttcctcagctccttccagggcctgctggtggctgtcctctactgcttcctcaacaaggaggtgcagtcggagctgcggcggcgttggcaccgctggcgcctgggcaaagtgctatgggaggagcggaacaccagcaaccacagggcctcatcttcgcccggccacggccctcccagcaaggagctccagtttgggaggggtggtggcagccaggattcatctgcggagacccccttggctggtggcctccctagattggctgagagccccttctga gtcgac。

BamHI-GLP1R-SalI序列：

ggatcctggcccagtcctgaactccccgccatggccggcgcccccggcccgctgcgccttgcgctgctgctgctcgggatggtgggcagggccggcccccgcccccagggtgccactgtgtccctctgggagacggtgcagaaatggcgagaataccgacgccagtgccagcgctccctgactgaagatccacctcctgccacagacttgttctgcaaccggaccttcgatgaatacgcctgctggccagatggggagccaggctcgttcgtgaatgtcagctgcccctggtacctgccctgggccagcagtgtgccgcagggccacgtgtaccggttctgcacagctgaaggcctctggctccagaaggacaactccagcctgccctggagggacttgtcggagtgcgaggagtccaagcgaggggaaagaagctccccggaggagcagctcctgttcctctacatcatctacacggtgggctacgcactctccttctctgctctggttatcgcctctgcgatcctcctcggcttcagacacctgcactgcaccaggaactacatccacctgaacctgtttgcatccttcatcctgcgagcattgtccgtcttcatcaaggacgcagccctgaagtggatgtatagcacagccgcccagcagcaccagtgggatgggctcctctcctaccaggactctctgagctgccgcctggtgtttctgctcatgcagtactgtgtggcggccaattactactggctcttggtggagggcgtgtacctgtacacactgctggccttctcggtcttatctgagcaatggatcttcaggctctacgtgagcataggctggggtgttcccctgctgtttgttgtcccctggggcattgtcaagtacctctatgaggacgagggctgctggaccaggaactccaacatgaactactggctcattatccggctgcccattctctttgccattggggtgaacttcctcatctttgttcgggtcatctgcatcgtggtatccaaactgaaggccaatctcatgtgcaagacagacatcaaatgcagacttgccaagtccacgctgacactcatccccctgctggggactcatgaggtcatctttgcctttgtgatggacgagcacgcccgggggaccctgcgcttcatcaagctgtttacagagctctccttcacctccttccaggggctgatggtggccatattatactgctttgtcaacaatgaggtccagctggaatttcggaagagctgggagcgctggcggcttgagcacttgcacatccagagggacagcagcatgaagcccctcaagtgtcccaccagcagcctgagcagtggagccacggcgggcagcagcatgtacacagccacttgccaggcctcttgcagctga gtcgac。

NruI-GLP1R-ClaI序列：

acatcgcgaatggccggcgcccccggcccgctgcgccttgcgctgctgctgctcgggatggtgggcagggccggcccccgcccccagggtgccactgtgtccctctgggagacggtgcagaaatggcgagaataccgacgccagtgccagcgctccctgactgaagatccacctcctgccacagacttgttctgcaaccggaccttcgatgaatacgcctgctggccagatggggagccaggctcgttcgtgaatgtcagctgcccctggtacctgccctgggccagcagtgtgccgcagggccacgtgtaccggttctgcacagctgaaggcctctggctccagaaggacaactccagcctgccctggagggacttgtcggagtgcgaggagtccaagcgaggggaaagaagctccccggaggagcagctcctgttcctctacatcatctacacggtgggctacgcactctccttctctgctctggttatcgcctctgcgatcctcctcggcttcagacacctgcactgcaccaggaactacatccacctgaacctgtttgcatccttcatcctgcgagcattgtccgtcttcatcaaggacgcagccctgaagtggatgtatagcacagccgcccagcagcaccagtgggatgggctcctctcctaccaggactctctgagctgccgcctggtgtttctgctcatgcagtactgtgtggcggccaattactactggctcttggtggagggcgtgtacctgtacacactgctggccttctcggtcttatctgagcaatggatcttcaggctctacgtgagcataggctggggtgttcccctgctgtttgttgtcccctggggcattgtcaagtacctctatgaggacgagggctgctggaccaggaactccaacatgaactactggctcattatccggctgcccattctctttgccattggggtgaacttcctcatctttgttcgggtcatctgcatcgtggtatccaaactgaaggccaatctcatgtgcaagacagacatcaaatgcagacttgccaagtccacgctgacactcatccccctgctggggactcatgaggtcatctttgcctttgtgatggacgagcacgcccgggggaccctgcgcttcatcaagctgtttacagagctctccttcacctccttccaggggctgatggtggccatattatactgctttgtcaacaatgaggtccagctggaatttcggaagagctgggagcgctggcggcttgagcacttgcacatccagagggacagcagcatgaagcccctcaagtgtcccaccagcagcctgagcagtggagccacggcgggcagcagcatgtacacagccacttgccaggcctcttgcagctgaatcgatcca。

NruI-Transcription Blocker-4xCRE-Mini promote–GFP–XhoI序列：

tcgcgaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgtaataaaatatctttattttcattacatctgtgtgttggttttttgtgtgaatccatagtactaacatacgctctccatcaaaacaaaacgaaacaaaacaaactagcaaaataggctgtccccagtgcaagtgcaggtgccagaacatttctctggcctaactggccggtacctgagctcatcgataaccggattaccgggatccatgctagcgcaccagacagtgacgtcagctgccagatcccatggccgtcatactgtgacgtctttcagacaccccattgacgtcaatgggagaacagatctggcctcggcggccaagcttcgaagacactagagggtatataatggaagctcgacttccagcttggcaatccggtactgttggtacactgcagcgtctcaagcttcagaattctcagatccgctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtccggactctgatctcgag。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 珠海联邦制药股份有限公司

<120> 一种用于药物活性测定的细胞株及其制备方法与应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<223> pLenti-GFP载体序列

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 240

ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 300

gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 360

tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc 420

ccgaacaggg acttgaaagc gaaagggaaa ccagagctct ctcgacgcag gactcggctt 480

gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540

actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600

attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660

aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720

gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780

tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840

atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900

aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960

caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020

acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080

tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140

gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200

ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca 1260

ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1320

ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1380

atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440

ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500

acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560

ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620

agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680

tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740

tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1800

aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860

aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1920

atcgatgcag gtccgaggtt ctagacgagt ttactcccta tcagtgatag agaacgatgt 1980

cgagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgtcgag tttactccct atcagtgata 2040

gagaacgtat gtcgagttta ctccctatca gtgatagaga acgtatgtcg agtttatccc 2100

tatcagtgat agagaacgta tgtcgagttt actccctatc agtgatagag aacgtatgtc 2160

gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga 2220

tcgcaccggt cagctagcac tgcagcgtct caagcttcag aattctcaga tccgctagcg 2280

ctaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 2340

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 2400

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 2460

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 2520

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 2580

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 2640

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 2700

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 2760

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 2820

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 2880

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 2940

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 3000

gagctgtaca agtccggact ctgatctcga gggggttggg gttgcgcctt ttccaaggca 3060

gccctgggtt tgcgcaggga cgcggctgct ctgggcgtgg ttccgggaaa cgcagcggcg 3120

ccgaccctgg gtctcgcaca ttcttcacgt ccgttcgcag cgtcacccgg atcttcgccg 3180

ctacccttgt gggccccccg gcgacgcttc ctgctccgcc cctaagtcgg gaaggttcct 3240

tgcggttcgc ggcgtgccgg acgtgacaaa cggaagccgc acgtctcact agtaccctcg 3300

cagacggaca gcgccaggga gcaatggcag cgcgccgacc gcgatgggct gtggccaata 3360

gcggctgctc agcagggcgc gccgagagca gcggccggga aggggcggtg cgggaggcgg 3420

ggtgtggggc ggtagtgtgg gccctgttcc tgcccgcgcg gtgttccgca ttctgcaagc 3480

ctccggagcg cacgtcggca gtcggctccc tcgttgaccg aatcaccgac ctctctcccc 3540

agggggatcc accggagctt accatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc 3600

gcgacgacgt ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca 3660

cgcgccacac cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct 3720

tcctcacgcg cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg 3780

tggcggtctg gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc 3840

cgcgcatggc cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc 3900

tggcgccgca ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg 3960

accaccaggg caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc 4020

gcgccggggt gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc 4080

ggctcggctt caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca 4140

tgacccgcaa gcccggtgcc tgagtcgaca atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa 4200

gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa 4260

tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat 4320

cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt 4380

gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc 4440

tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc 4500

ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg 4560

ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga 4620

cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc 4680

tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc 4740

tttgggccgc ctccccgcct ggaattaatt cgagctcggt acctttaaga ccaatgactt 4800

acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa 4860

ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc 4920

agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa 4980

gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga 5040

gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc 5100

ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt 5160

ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 5220

catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 5280

tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 5340

cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 5400

ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 5460

cgggcccaaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 5520

caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 5580

tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 5640

cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 5700

gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 5760

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 5820

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 5880

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 5940

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 6000

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 6060

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 6120

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 6180

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 6240

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 6300

ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 6360

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 6420

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 6480

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 6540

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 6600

ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 6660

gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 6720

tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 6780

cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 6840

ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 6900

gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 6960

caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 7020

gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 7080

ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 7140

tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 7200

caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 7260

tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 7320

cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 7380

ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 7440

aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 7500

tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 7560

gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 7620

gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 7680

ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac 7740

acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag 7800

cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat 7860

cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 7920

ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc 7980

gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc 8040

gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg 8100

ccaagctg 8108

<210> 2

<223> ClaI-4xCRE-Mini promote-PstI序列

atcgataacc ggattaccgg gatccatgct agcgcaccag acagtgacgt cagctgccag 60

atcccatggc cgtcatactg tgacgtcttt cagacacccc attgacgtca atgggagaac 120

agatctggcc tcggcggcca agcttcgaag acactagagg gtatataatg gaagctcgac 180

ttccagcttg gcaatccggt actgttggta cactgcag 218

<210> 3

<223> BamHI-GIPR-SalI序列

ggatccacga accagaccct tcgccgccct caccatgact acctctccga tcctccagct 60

gctgctgcgg ctctcactgt gcgggctgct gctccagagg gcggagacag gctctaaggg 120

gcagacggcg ggggagctgt accagcgctg ggaacggtac cgcagggagt gccaggagac 180

cttggcagcc gcggaaccgc cttcaggcct cgcctgtaac gggtccttcg atatgtacgt 240

ctgctgggac tatgctgcac ccaatgccac tgcccgtgcg tcctgcccct ggtacctgcc 300

ctggcaccac catgtggctg ccggtttcgt cctccgccag tgtggcagtg atggccaatg 360

gggactttgg agagaccata cacaatgtga gaacccagag aagaatgagg cctttctgga 420

ccaaaggctc atcttggagc ggttgcaggt catgtacact gtcggctact ccctgtctct 480

cgccacactg ctgctagccc tgctcatctt gagtttgttc aggcggctac attgcactag 540

aaactatatc cacatcaacc tgttcacgtc tttcatgctg cgagctgcgg ccattctcag 600

ccgagaccgt ctgctacctc gacctggccc ctaccttggg gaccaggccc ttgcgctgtg 660

gaaccaggcc ctcgctgcct gccgcacggc ccagatcgtg acccagtact gcgtgggtgc 720

caactacacg tggctgctgg tggagggcgt ctacctgcac agtctcctgg tgctcgtggg 780

aggctccgag gagggccact tccgctacta cctgctcctc ggctgggggg cccccgcgct 840

tttcgtcatt ccctgggtga tcgtcaggta cctgtacgag aacacgcagt gctgggagcg 900

caacgaagtc aaggccattt ggtggattat acggaccccc atcctcatga ccatcttgat 960

taatttcctc atttttatcc gcattcttgg cattctcctg tccaagctga ggacacggca 1020

aatgcgctgc cgggattacc ggctgaggct ggctcgctcc acgctgacgc tggtgcccct 1080

gctgggtgtc cacgaggtgg tgtttgctcc cgtgacagag gaacaggccc ggggcgccct 1140

gcgcttcgcc aagctcggct ttgagatctt cctcagctcc ttccagggct tcctggtcag 1200

cgtcctctac tgcttcatca acaaggaggt gcagtcggag atccgccgtg gctggcacca 1260

ctgccgcctg cgccgcagcc tgggcgagga gcaacgccag ctcccggagc gcgccttccg 1320

ggccctgccc tccggctccg gcccgggcga ggtccccacc agccgcggct tgtcctcggg 1380

gaccctccca gggcctggga atgaggccag ccgggagttg gaaagttact gctaggtcga 1440

c 1441

<210> 4

<223> BamHI-GCGR-SalI序列

ggatcctgtg ggaggcagct agctgcccag aggcatgccc ccctgccagc cacagcgacc 60

cctgctgctg ttgctgctgc tgctggcctg ccagccacag gtcccctccg ctcaggtgat 120

ggacttcctg tttgagaagt ggaagctcta cggtgaccag tgtcaccaca acctgagcct 180

gctgccccct cccacggagc tggtgtgcaa cagaaccttc gacaagtatt cctgctggcc 240

ggacaccccc gccaatacca cggccaacat ctcctgcccc tggtacctgc cttggcacca 300

caaagtgcaa caccgcttcg tgttcaagag atgcgggccc gacggtcagt gggtgcgtgg 360

accccggggg cagccttggc gtgatgcctc ccagtgccag atggatggcg aggagattga 420

ggtccagaag gaggtggcca agatgtacag cagcttccag gtgatgtaca cagtgggcta 480

cagcctgtcc ctgggggccc tgctcctcgc cttggccatc ctggggggcc tcagcaagct 540

gcactgcacc cgcaatgcca tccacgcgaa tctgtttgcg tccttcgtgc tgaaagccag 600

ctccgtgctg gtcattgatg ggctgctcag gacccgctac agccagaaaa ttggcgacga 660

cctcagtgtc agcacctggc tcagtgatgg agcggtggct ggctgccgtg tggccgcggt 720

gttcatgcaa tatggcatcg tggccaacta ctgctggctg ctggtggagg gcctgtacct 780

gcacaacctg ctgggcctgg ccaccctccc cgagaggagc ttcttcagcc tctacctggg 840

catcggctgg ggtgccccca tgctgttcgt cgtcccctgg gcagtggtca agtgtctgtt 900

cgagaacgtc cagtgctgga ccagcaatga caacatgggc ttctggtgga ttctgcggtt 960

ccccgtcttc ctggccatcc tgatcaactt cttcatcttc gtccgcatcg ttcagctgct 1020

cgtggccaag ctgcgggcac ggcagatgca ccacacagac tacaagttcc ggctggccaa 1080

gtccacgctg accctcatcc ctctgctggg cgtccacgaa gtggtcttcg ccttcgtgac 1140

ggacgagcac gcccagggca ccctgcgctc cgccaagctc ttcttcgacc tcttcctcag 1200

ctccttccag ggcctgctgg tggctgtcct ctactgcttc ctcaacaagg aggtgcagtc 1260

ggagctgcgg cggcgttggc accgctggcg cctgggcaaa gtgctatggg aggagcggaa 1320

caccagcaac cacagggcct catcttcgcc cggccacggc cctcccagca aggagctcca 1380

gtttgggagg ggtggtggca gccaggattc atctgcggag acccccttgg ctggtggcct 1440

ccctagattg gctgagagcc ccttctgagt cgac 1474

<210> 5

<223> BamHI-GLP1R-SalI序列

ggatcctggc ccagtcctga actccccgcc atggccggcg cccccggccc gctgcgcctt 60

gcgctgctgc tgctcgggat ggtgggcagg gccggccccc gcccccaggg tgccactgtg 120

tccctctggg agacggtgca gaaatggcga gaataccgac gccagtgcca gcgctccctg 180

actgaagatc cacctcctgc cacagacttg ttctgcaacc ggaccttcga tgaatacgcc 240

tgctggccag atggggagcc aggctcgttc gtgaatgtca gctgcccctg gtacctgccc 300

tgggccagca gtgtgccgca gggccacgtg taccggttct gcacagctga aggcctctgg 360

ctccagaagg acaactccag cctgccctgg agggacttgt cggagtgcga ggagtccaag 420

cgaggggaaa gaagctcccc ggaggagcag ctcctgttcc tctacatcat ctacacggtg 480

ggctacgcac tctccttctc tgctctggtt atcgcctctg cgatcctcct cggcttcaga 540

cacctgcact gcaccaggaa ctacatccac ctgaacctgt ttgcatcctt catcctgcga 600

gcattgtccg tcttcatcaa ggacgcagcc ctgaagtgga tgtatagcac agccgcccag 660

cagcaccagt gggatgggct cctctcctac caggactctc tgagctgccg cctggtgttt 720

ctgctcatgc agtactgtgt ggcggccaat tactactggc tcttggtgga gggcgtgtac 780

ctgtacacac tgctggcctt ctcggtctta tctgagcaat ggatcttcag gctctacgtg 840

agcataggct ggggtgttcc cctgctgttt gttgtcccct ggggcattgt caagtacctc 900

tatgaggacg agggctgctg gaccaggaac tccaacatga actactggct cattatccgg 960

ctgcccattc tctttgccat tggggtgaac ttcctcatct ttgttcgggt catctgcatc 1020

gtggtatcca aactgaaggc caatctcatg tgcaagacag acatcaaatg cagacttgcc 1080

aagtccacgc tgacactcat ccccctgctg gggactcatg aggtcatctt tgcctttgtg 1140

atggacgagc acgcccgggg gaccctgcgc ttcatcaagc tgtttacaga gctctccttc 1200

acctccttcc aggggctgat ggtggccata ttatactgct ttgtcaacaa tgaggtccag 1260

ctggaatttc ggaagagctg ggagcgctgg cggcttgagc acttgcacat ccagagggac 1320

agcagcatga agcccctcaa gtgtcccacc agcagcctga gcagtggagc cacggcgggc 1380

agcagcatgt acacagccac ttgccaggcc tcttgcagct gagtcgac 1428

<210> 6

<223> NruI-GLP1R-ClaI序列

acatcgcgaa tggccggcgc ccccggcccg ctgcgccttg cgctgctgct gctcgggatg 60

gtgggcaggg ccggcccccg cccccagggt gccactgtgt ccctctggga gacggtgcag 120

aaatggcgag aataccgacg ccagtgccag cgctccctga ctgaagatcc acctcctgcc 180

acagacttgt tctgcaaccg gaccttcgat gaatacgcct gctggccaga tggggagcca 240

ggctcgttcg tgaatgtcag ctgcccctgg tacctgccct gggccagcag tgtgccgcag 300

ggccacgtgt accggttctg cacagctgaa ggcctctggc tccagaagga caactccagc 360

ctgccctgga gggacttgtc ggagtgcgag gagtccaagc gaggggaaag aagctccccg 420

gaggagcagc tcctgttcct ctacatcatc tacacggtgg gctacgcact ctccttctct 480

gctctggtta tcgcctctgc gatcctcctc ggcttcagac acctgcactg caccaggaac 540

tacatccacc tgaacctgtt tgcatccttc atcctgcgag cattgtccgt cttcatcaag 600

gacgcagccc tgaagtggat gtatagcaca gccgcccagc agcaccagtg ggatgggctc 660

ctctcctacc aggactctct gagctgccgc ctggtgtttc tgctcatgca gtactgtgtg 720

gcggccaatt actactggct cttggtggag ggcgtgtacc tgtacacact gctggccttc 780

tcggtcttat ctgagcaatg gatcttcagg ctctacgtga gcataggctg gggtgttccc 840

ctgctgtttg ttgtcccctg gggcattgtc aagtacctct atgaggacga gggctgctgg 900

accaggaact ccaacatgaa ctactggctc attatccggc tgcccattct ctttgccatt 960

ggggtgaact tcctcatctt tgttcgggtc atctgcatcg tggtatccaa actgaaggcc 1020

aatctcatgt gcaagacaga catcaaatgc agacttgcca agtccacgct gacactcatc 1080

cccctgctgg ggactcatga ggtcatcttt gcctttgtga tggacgagca cgcccggggg 1140

accctgcgct tcatcaagct gtttacagag ctctccttca cctccttcca ggggctgatg 1200

gtggccatat tatactgctt tgtcaacaat gaggtccagc tggaatttcg gaagagctgg 1260

gagcgctggc ggcttgagca cttgcacatc cagagggaca gcagcatgaa gcccctcaag 1320

tgtcccacca gcagcctgag cagtggagcc acggcgggca gcagcatgta cacagccact 1380

tgccaggcct cttgcagctg aatcgatcca 1410

<210> 8

<223> NruI-Transcription Blocker-4xCRE-Mini promote –GFP–XhoI序列

tcgcgaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 60

cacatgtaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt gttggttttt tgtgtgaatc 120

catagtacta acatacgctc tccatcaaaa caaaacgaaa caaaacaaac tagcaaaata 180

ggctgtcccc agtgcaagtg caggtgccag aacatttctc tggcctaact ggccggtacc 240

tgagctcatc gataaccgga ttaccgggat ccatgctagc gcaccagaca gtgacgtcag 300

ctgccagatc ccatggccgt catactgtga cgtctttcag acaccccatt gacgtcaatg 360

ggagaacaga tctggcctcg gcggccaagc ttcgaagaca ctagagggta tataatggaa 420

gctcgacttc cagcttggca atccggtact gttggtacac tgcagcgtct caagcttcag 480

aattctcaga tccgctagcg ctaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt 540

tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca 600

gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct 660

gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg 720

tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca 780

tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga 840

cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca 900

tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc 960

acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc 1020

gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca 1080

tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga 1140

gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg 1200

ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtccggact ctgatctcga g 1251

<210> 8

<223> 引物SVClaI

accatcgatc tgtggaatgt gtgtcagtta gg 32

<210> 9

<223> 引物SVPstI

caacctgcag ttgcaaaagc ctaggcctcc a 31

<210> 10

<223> 引物RFPstI

caacctgcag gtcgccacca tgagcga 27

<210> 11

<223> 引物RFPXhoI

tgagctcgag atcgattatc tgtgccccag t 31

<210> 12

<223> 引物PuroP1

acatcgcgac ccctcacaag gagacga 27

<210> 13

<223> 引物PuroP2

tggatcgatt caggcaccgg gcttgc 26

Claims (12)

1.一种用于药物活性测定的细胞株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将含CRE-Minipromoter-GFP复合元件的慢病毒载体和含表达药物受体元件的慢病毒载体分别与包装质粒共转染包装细胞，获得可用于感染的病毒液；

(2)将步骤(1)获得的病毒液感染细胞，获得稳转细胞库；

(3)对步骤(2)的细胞库进行分离、筛选得到用于药物活性测定的细胞株。

2.根据权利要求1所述的用于药物活性测定的细胞株的制备方法，其特征在于：

所述的CRE-Mini promoter-GFP复合元件是将序列如SEQ ID NO.2所示的CRE-Minipromoter元件设置在编码GFP的基因的上游得到的复合元件；

所述的药物受体元件为GIPR、GCGR和GLP1R中的至少一种；

所述的药物为GLP-1、GLP-1类似物、GCG、GCG类似物、GIP和GIP类似物中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的用于药物活性测定的细胞株的制备方法，其特征在于：

所述的含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的慢病毒载体通过如下步骤制备得到：以序列如SEQ ID NO.1所示的复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP为骨架，将序列如SEQ IDNO.2所示的CRE-Mini promoter构建到复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP的GFP基因上游，得到含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的慢病毒载体；

所述的含表达药物受体元件的慢病毒载体是以复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP为骨架，将载体上的启动子6xTetO-min CMV替换为SV40，将载体上的GFP替换为RFP，将载体上的PuroR替换为药物受体元件，其中，RFP为红色荧光蛋白，GFP为绿色荧光蛋白，PuroR为嘌呤霉素抗性基因；

所述的GIPR的序列如SEQ ID NO.3所示；

所述的GCGR的序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的GLP1R的序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1所述的用于药物活性测定的细胞株的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的包装的步骤如下：

(a)将含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的慢病毒载体和含表达药物受体元件的慢病毒载体分别与包装质粒混合后，得到DNA混合液1和DNA混合液2，再分别转染包装细胞；

(b)转染18-28小时后，分别加入丁酸钠以增强病毒包装效率，处理8-14小时后弃上清换新鲜无血清培养基；

(c)转染43-55小时后，得到含CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含表达药物受体元件的病毒液；

步骤(2)中所述的慢病毒感染的步骤如下：

①取步骤(1)获得的含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的病毒液和含表达药物受体元件的病毒液同时感染细胞；

②病毒感染后3～6小时，补加新鲜的完全培养基培养；

③病毒感染后42～52小时，更换新鲜的完全培养基，获得稳转细胞库；

步骤(3)中所述的分离的方法为有限稀释法；

步骤(3)中所述的筛选的步骤为：加入腺甘酸环化酶激活剂Forskolin刺激分离得到的单克隆细胞，进行GFP荧光强度分析；筛选得到GFP荧光响应强度高的单克隆细胞株，即可作为用于药物活性测定的细胞株。

5.根据权利要求4所述的用于药物活性测定的细胞株的制备方法，其特征在于：

步骤(a)中所述的包装质粒包括但不限于PsPAX2、pMD2.G、pMDLg/RRE、pRSV-Rev、pCMV-VSV-G；

步骤(a)中所述的转染方法包括但不限于电击转染法、脂质体转染法、PEI转染法和磷酸钙转染法；

步骤(a)中所述的包装细胞为HEK-293T；

步骤(b)中所述的丁酸钠的终浓度为8～12mmol/L；

步骤(c)中所述的病毒液是将转染后的细胞培养上清过滤得到；

步骤①中所述的含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的病毒液和所述的含表达药物受体元件的病毒液按体积比1-3：1配比；

步骤①中所述的细胞为HEK-293T；

步骤②中所述的完全培养基为含有10％(v/v)胎牛血清、2～4mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM完全培养基；

步骤③中所述的完全培养基为含有10％胎牛血清、终浓度为2～4mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM完全培养基。

6.根据权利要求5所述的用于药物活性测定的细胞株的制备方法，其特征在于：

所述的包装质粒由PsPAX2和pMD2.G按质量比1:1配比得到；

步骤(b)中所述的丁酸钠的终浓度为10mmol/L；

步骤①中所述的含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的病毒液和所述的含表达药物受体元件的病毒液按体积比1：1配比；

所述的新鲜的完全培养基的补加体积为所述的病毒液的总量的2-4倍；

所述的有限稀释法中孔板的细胞密度为0.3-0.5个细胞/孔；

所述的Forskolin的浓度为8～12mmol/L；

所述的刺激时间为20～28h。

7.根据权利要求4～6任一项所述的用于药物活性测定的细胞株的制备方法，其特征在于：

步骤(a)中所述的含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的慢病毒载体与所述的包装质粒按质量比1-3：2进行配比；

步骤(a)中所述的含表达药物受体的慢病毒载体与所述的包装质粒按质量比1-3：2进行配比；

步骤②中所述的补加新鲜的完全培养基的时间为病毒感染后4h。

8.一种用于药物活性测定的细胞株，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。

9.权利要求8所述的用于药物活性测定的细胞株在药物活性测定中的应用。

10.一种药物活性测定的方法，其特征在于包括如下步骤：将权利要求8所述的用于药物活性测定的细胞株接种入细胞培养板中，针对不同受体细胞分别加入相应的药物刺激后测定GFP表达强度，建立药物剂量与GFP表达强度的量效曲线。

11.根据权利要求10所述的药物活性测定的方法，其特征在于包括以下步骤：

(I)将权利要求8所述的用于药物活性测定的细胞株离心、洗涤、重悬，得到细胞悬液，接种入细胞培养板中，静置培养；

(II)制备药物标准品溶液，设置稀释浓度梯度；

(III)细胞培养板中的细胞培养18～24小时后，吸去培养上清，加入配制好的梯度浓度的药物标准品溶液；

(IV)作用20～28h后，测定红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的强度；

(V)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以绿色荧光蛋白强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。

12.根据权利要求11所述的药物活性测定的方法，其特征在于：

所述的药物为GLP-1、GLP-1类似物、GCG、GCG类似物、GIP和GIP类似物中的至少一种；

所述的细胞培养板为多聚赖氨酸包被的细胞培养板；

步骤(I)中所述的重悬为采用检测培养基重悬；

所述的检测培养基为含10％FBS和2～6mmol/L L-谷氨酰胺的

BrightFluore DMEM；

步骤(I)中所述的培养条件为于37℃、5％CO₂及饱和湿度的条件下培养18-24小时；

步骤(IV)中所述的作用的时间为20～30h；

步骤(IV)中所述的红色荧光蛋白强度用于复孔之间绿色荧光蛋白强度数据矫正。

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