CN104962576A - 一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒及应用，本发明提供了一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒，其序列为SEQ ID NO.1所示。利用该质粒，可以实现对柱状黄杆菌目的DNA片段的定向敲除、对其开展功能研究，进而实现对柱状黄杆菌致病机理的研究，可用于构建柱状黄杆菌基因缺失株或构建弱毒疫苗，本发明构建的定向敲除质粒，能够使sacB基因在黄杆菌中很好地表达，赋予其蔗糖敏感性，获得了无标记基因的突变株，成功克服了柱状黄杆菌基因定向敲除中遇到的最大障碍。

Description

一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒及应用

技术领域

本发明涉及黄杆菌遗传操作系统，具体涉及一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒及应用，特别涉及一种遗传操作系统在功能基因敲除和基因缺失弱毒疫苗构建过程中的具体应用。

背景技术

柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是一种革兰氏阴性细菌。该菌能够感染包括人工养殖或野生鱼类在内的几乎所有不同生长阶段的淡水鱼类。该菌感染鱼体后，在感染部位呈柱状生长，并导致鱼体产生严重的鳃部溃烂、背部溃疡和鳍条坏死等一系列症状，最终引起大量死亡。由该菌所引发的疾病在在我国称为细菌性烂鳃病，在国际上统称为柱形病。每年春末至秋初为该病的流行盛期。我国人工养殖的重要经济鱼类如草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和鳜鱼(Siniperca chuatsi)每年由该病引发的死亡率可高达100％(湖北省水生生物研究所鱼病研究室，1975；陈昌福等，1995)。在美国，每年由该病引起人工养殖斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的死亡率高达90％(Shotts & Starliper,1999；Wagner et al.,2002)。

对于该病病原柱状黄杆菌的早期研究主要集中在诊断(Bernardet et al.,1996；Bader etal.,2003)、病理和流行病学(Foott,2002；Stringer-Roth et al.,2002)和可能的防治(.Dunham et al.,2002；Thomas-Jinu & Goodwin,2004)等方面。近年来，又有学者开展了该菌的遗传多样性的研究，现已证明该菌有三个基因组型(Darwish & Ismaiel,2005；Schneck & Caslake,2006；Wang et al.,2010)。近年来，尽管柱状黄杆菌的基因组序列已经公布，研究人员也尝试开展可能的毒力因子和致病机理的研究，但是尚未取得突破性进展。这主要归因于在该研究领域缺乏一套适合柱状黄杆菌的遗传操作系统。

目前，在许多致病菌如致病性大肠杆菌、沙门氏菌、爱德华氏菌中，均有一套完善的可用于毒力因子和致病机理研究的遗传操作系统。可通过缺失突变的手段对目的基因进行敲除和功能互补，从而深入开展对目的基因的功能研究并阐明其在细菌致病过程中所发挥的作用。而在柱状黄杆菌的研究过程中，由于缺乏合适的遗传操作系统，目前只能实现对目的基因进行同源重组和插入失活(Staroscik et al，2008；Zhang et al.,2012)，对于目的基因进行定向敲除和功能互补一直未能取得成功。因此，也限制和阻碍了对该菌在毒力因子、致病机理和制备毒力基因缺失弱毒疫苗的研究。

本发明的目的在于构建一个能够用于黄杆菌尤其是柱状黄杆菌目的基因的开放阅读框内突变、真正实现目的基因的定向敲除和非极性缺失突变的质粒，并优化一种使用该质粒开展研究的方法。从而为深入开展对该菌功能基因的研究、阐明致病机理和制备毒力基因缺失弱毒疫苗提供一个有利的工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒pMS75(本发明或称自杀质粒)。该质粒共由7715个碱基对组成(SEQ ID NO.1所示)，其中包含了在大肠杆菌中复制所需的复制区域和能够正常表达的抗性基因；在柱状黄杆菌中能够正常表达的抗生素抗性基因和负选择标记基因(SEQ ID NO.2所示序列包含所述的负选择标记基因)。

本发明的另一个目的在于提供一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒的应用。运用本发明所获得的质粒，通过将待缺失基因的上下游序列克隆至载体并导入柱状黄杆菌，可在该菌中发生两次同源重组，最终实现对目的基因的框内缺失突变和功能敲除。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：

一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒，制备方法包括：

(1)穿梭质粒pCP23(Agaral et al，1997)改造为线性载体

可通过两种方法进行：一是将分离纯化的穿梭质粒pCP23用SacI和KpnI进行双酶切，电泳结束后将大小为6103 bp的片段切下，回收后即为pCP23线性载体。二是用引物扩增穿梭质粒pCP23的除黄杆菌复制区域以外的序列。该载体置4℃保存备用。

(2)含负选择标记的自杀质粒的构建

将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列(含有负选择标记基因片段)与pCP23线性载体定向连接。取连接产物转化大肠杆菌，用氨苄青霉素的LB平板筛选目的菌落。挑取目的菌落在氨苄青霉素的液体培养基中进行扩增培养，即得一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒pMS75，本发明或称为自杀质粒，其序列为SEQ ID NO.1所示。

一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒的应用，包括利用该质粒定向敲除柱状黄杆菌的目的基因构建基因缺失株；或构建柱状黄杆菌基因缺失弱毒疫苗。

具体操作过程包括：

(1)确定待缺失DNA序列

通过生物信息学分析以确定待缺失的基因的功能结构域，并初步确定待缺失的DNA片段长度。

(2)待缺失DNA序列的上游序列选择(本发明或称为A片段)

用于同源重组的待缺失DNA的上游序列需大于或等于1.8kb且小于或等于2.5kb，其中目的基因开放阅读框的第一个碱基至待缺失DNA序列之前的最后一个碱基应为3的倍数。

(3)待缺失DNA序列的下游序列选择(本发明或称为B片段)

用于同源重组的待缺失DNA的下游序列需大于或等于1.8kb且小于或等于2.5kb，其中待缺失DNA序列之后的第一个碱基至目的基因开放阅读框的最后一个碱基应为3的倍数。

(4)将待缺失DNA区域的上下游序列克隆至含负选择标记的自杀质粒

通过酶切连接法将待缺失DNA序列的上下游序列(A、B片段)克隆至自杀质粒。

具体的，将A、B片段克隆至自杀质粒的方法包括：PCR方法扩增A片段时，在A片段的正反向引物上各引入一个酶切位点，这两个酶切位点应不相同；在扩增B片段时，在B片段的正反向引物上也分别引入一个酶切位点，其中B片段的正向引物的酶切位点应与A片段反向引物的酶切位点相同。通过酶切连接的方法将A或B片段通过酶切、连接的方法连入自杀质粒，并转化大肠杆菌。将筛选得到的阳性克隆提取质粒后，同法将B或A片段连入该质粒。将连接产物转化大肠杆菌后，通过氨苄青霉素平板筛选和PCR检测确定含A、B片段的自杀质粒的大肠杆菌阳性菌株。将该大肠杆菌菌株大量培养后，提取质粒即可得到含待缺失DNA上下游同源序列的自杀质粒。

(5)将含待缺失DNA序列上下游同源序列的自杀质粒转入柱状黄杆菌

将上一步提取到的质粒转化到能够进行接合转移的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株如SM10或S17-1λ中。将该含该质粒的大肠杆菌菌株与柱状黄杆菌等体积培养至对数生长早期，离心收集菌体。用Shieh培养基将两种菌体分别洗涤两次后混合重悬，悬液滴至预先铺有灭菌NC膜的Shieh平板上。将该平板在28℃静置培养20-24h。

(6)筛选在柱状黄杆菌中发生第一次同源重组的菌株

将完成接合转移的细菌混合物从NC膜上刮下来，并用不含抗生素的Shieh培养基重悬。悬液涂布含抗生素的Shieh平板，28℃静置培养至有菌落长出。此时长出的菌落即为发生第一次同源重组后的菌株。

(7)筛选在柱状黄杆菌中发生第二次同源重组的菌株

将发生第一次同源重组的菌株在无抗生素的Shieh液体培养基中培养至对数生长期，用该菌液涂布含10％蔗糖的Shieh平板。待菌落长出后，挑选单菌落培养至对数生长期。将该培养物分别在含四环素和不含四环素的平板上划线培养。在两种平板上都能生长的菌株丢弃；将只能在不含四环素的Shieh平板上生长的该菌株保留供进一步筛选。

(8)缺失突变株筛选和确认

用待缺失DNA区域的序列为模板设计引物，菌液PCR方法扩增发生同源重组的菌株，如果扩增到目的条带，表明该菌株回复野生型，应丢弃；如果未能扩增到目的条带，表明该菌株可能已发生缺失突变，保留该菌株供进一步检测和确认。

用待缺失DNA区域的上游片段的序列和下游片段的序列为模板分别设计用于进一步确认突变株的正、反向引物。PCR方法扩增到产物为不含待缺失区域的DNA产物，则表明该菌株为突变株，可用于进一步研究或制备成疫苗；反之，则该菌株为回复野生株。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.首次成功构建了能够在柱状黄杆菌中表达并发挥作用的负选择标记，为建立适于柱状黄杆菌的遗传操作系统奠定了基础。

2.首次成功构建了能够用于柱状黄杆菌目的基因开放阅读框内缺失突变的自杀质粒；运用该质粒，可以实现对目的DNA片段的定向敲除、对其开展功能研究，进而实现对柱状黄杆菌致病机理的研究，可用于构建柱状黄杆菌基因缺失弱毒疫苗。

3.提供了经过优化的、运用该质粒进行目的基因缺失突变的所需的各种参数，建立了应用接合转移、抗生素筛选、蔗糖负选择和PCR检测来构建和筛选缺失突变株的方法，以便从事柱状黄杆菌研究的人员能快速构建目的基因的缺失突变株和开展功能研究。

4.无标记基因敲除技术能够得到稳定遗传的突变株，避免极性突变，并能够在同一菌株中进行多个基因的敲除(Yosuke et al.,2012)。在常用的负选择标记基因中，sacB基因不能在黄杆菌中正常表达，使菌株对蔗糖敏感，用于非极性基因基因敲除技术(Ryan et al.,2011)。本发明构建的自杀质粒pMS75，能够使sacB基因在黄杆菌中很好地表达，赋予其蔗糖敏感性，获得了无标记基因的突变株，成功克服了柱状黄杆菌基因定向敲除中遇到的最大障碍。

附图说明

图1.为负选择标记扩增情况示意图。

泳道1：负选择标记启动子序列的PCR扩增产物P_ompA；泳道2：负选择标记基因sacB完整开放阅读框的PCR扩增产物；泳道3为负选择标记启动子P_ompA和负选择标记基因sacB完整开放阅读框的overlap PCR扩增产物；泳道4：DNA分子量标准DNA Marker。

图2为由穿梭质粒pCP23改造而成的线性载体示意图。

泳道1：穿梭质粒pCP23经过限制性内切酶SacI和KpnI作用后，被切成两部分，其中“→”指示的pCP23线性载体的条带；泳道2：DNA分子量标准Trans15K DNA Marker。

图3为PCR方法确认柱状黄杆菌硫酸软骨素AC裂解酶基因chlAC缺失突变株示意图。

以chlAC基因待缺失DNA区域的序列为模板设计引物chl_del_ch_inF和chl_del_ch_inR，在第二次同源重组的菌株中未扩增到目的条带(泳道1-7)，同时以野生株则扩增到相应的条带(泳道8)；以待缺失DNA区域的上游和下游片段序列为模板分别设计的正向引物chl_del_ch_ouF和反向引物chl_del_ch_ouR1，在第二次同源重组的菌株中扩增到的条带(泳道10-16)明显小于在野生株中得到的条带(泳道17)，差别为被缺失区域的DNA碱基数；泳道9：DNA分子量标准Plus DNA Marker。

图4为柱状黄杆菌硫酸软骨素AC裂解酶基因chlAC缺失后的表型变化情况示意图。

其中：WT：柱状黄杆菌野生型降解硫酸软骨素的情况；ΔchlAC：柱状黄杆菌chlAC基因的功能结构域缺失突变株降解硫酸软骨素的情况。

具体实施方式

下面结合附图及实施例子对本发明作进一步说明，但并不作为对本发明权利范围的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。

实施例1：

一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒，制备方法包括：

(1)穿梭质粒pCP23改造为线性载体

将分离纯化的pCP23用SacI和KpnI两种限制性内切酶进行双酶切，酶切产物在0.8％(W/V)琼脂糖凝胶中电泳。电泳结束后，在紫外透照仪中检测可见～6000bp和～2800bp两种大小的条带(图2)，将大小6103bp的条带切下，用DNA胶凝纯化试剂盒纯化DNA后即为pCP23线性载体。该载体置4℃保存备用。

(2)含负选择标记的自杀质粒的构建

约氏黄杆菌ompA基因的启动子扩增：以pAS43(Andrew et al.,2008)为模板，通过使用引物PompASacF(ACGCGAGCTCGGCAGCGCATACCAAAGAACA)和PompAR(TGCAAACTTTTTGATGTTCATTTTTTAATTACAATTTAGTTAAT)扩增。具体条件为：94℃变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，反应30个循环；72℃延伸10min。

蔗糖果聚糖酶转移酶基因sacB完整开放阅读框的扩增：以pRE112(Edwards et al.,1998)为模板，pr45-sacBF(ATTAACTAAATTGTAATTAAAAAATGAACATCAAAAAGTTTGCA)和SacB1KpnR(CGGGGTACCTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC)为引物扩增。具体扩增条件为：94℃变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，反应30个循环；72℃延伸10min。

第一轮PCR产物各取0.5μl混合后稀释至100μl作为第二轮PCR的模板，分别以PompASacF和SacB1KpnR为引物，通过overlap PCR获得负选择标记基因的扩增产物。具体扩增条件为：72℃延伸2min；94℃变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，反应30个循环；72℃延伸10min。

第二轮PCR产物在1％(W/V)琼脂糖凝胶中电泳后，将目的条带切下(图1)(目的条带包括SEQ ID NO.2所示序列)，回收后连接到pMD18-T载体(Takara公司)，挑选阳性克隆测序。目的条带序列经确认准确无误再后开展下一步工作。

将已取得的负选择标记基因P_ompA+sacB片段和pCP23线性载体在10μl连接体系中16℃孵育12h。具体连接体系如下：

将10μl连接产物转化100μl大肠杆菌感受态细胞，复苏后涂布与含100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12h。将该平板上生长的菌落在含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中进行扩增培养。待细菌生长至对数生长期，用引物PompASacF和SacB1KpnR检测所挑选的细菌是否为含目的质粒的菌株。对于检测呈阳性的细菌，提取质粒即可获得含负选择标记的自杀质粒，命名为pMS75(SEQ ID NO.1所示)。

(3)负选择标记基因sacB基因的功能验证

将获得的pMS75质粒通过结合转移的方法导入柱状黄杆菌中。将含该质粒的柱状黄杆菌接种于含15μg/ml盐酸四环素的Shieh液体培养基中，培养至对数生长期。将该菌液涂布于10％蔗糖的Shieh平板检测含负选择标记的柱状黄杆菌是否能够生长。同时，用不含该基因的柱状黄杆菌涂布蔗糖平板作为对照。如果含负选择标记的柱状黄杆菌不能够生长，则表明该负选择标记能够在蔗糖平板上工作。

实施例2：

一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒的应用，包括以下步骤：

本实施例以编码柱状黄杆菌硫酸软骨素裂解酶的chlAC基因为例，说明利用本发明提供的pMS75定向敲除柱状黄杆菌基因的步骤：

(1)确定待缺失的DNA区域

通过分析chlAC基因完整的开放阅读框，发现该基因所编码的氨基酸为761aa，其中25aa-625aa为该基因的功能结构域，因此初步确定将该区域的DNA片段进行缺失。为保证既能使待缺失DNA序列长度为3的倍数，又能最大程度破坏该基因的功能结构域，确定81aa-711aa待缺失区域。

(2)确定待缺失DNA序列的上游序列(简称A片段)

用于同源重组的上游序列需大于1.8kb，其中目的基因开放阅读框的第一个碱基至待缺失DNA序列之前的最后一个碱基应为3的倍数。上游序列中包含目的基因从起始密码子ATG之前的1973bp和包括ATG之后的(包括ATG在内的)240bp。其中，在正向引物为的5′端引入一个BamHI的酶切位点，序列为5′-CGCGGATCCTCATCATACACCCCTCG-3′；反向引物的5′端引入一个SalI的酶切位点，序列为5′-ACGCGTCGACGATATGCGAAATGTGGAATT-3′。最终用于同源重组的A片段长度为2213bp。

(3)确定待缺失DNA序列的下游序列(B片段)

用于同源重组的下游序列需大于1.8-kb，其中待缺失DNA序列之后的第一个碱基至目的基因开放阅读框的最后一个碱基应为3的倍数。上下游序列的长度应该基本一致。下游序列中包含目的基因终止密码子TAA之前的(包括TAA在内的)153bp和TAA之后的1841bp。其中，在正向引物的5′端引入一个SalI酶切位点，序列为5′-ACGCGTCGACCGCTTGGGCTAAACGAGA-3′；反向引物的5′端引入一个SphI酶切位点，序列为5′-ACATGCATGCTTGCCCAAATAAAATCG-3′。最终用于同源重组的B片段长度为1994bp。

(4)将待缺失DNA序列的上下游序列克隆至负选择标记的自杀质粒pMS75

可通过酶切连接方法将待缺失DNA区域的上下游序列(A、B片段)克隆至自杀质粒pMS75。具体操作过程如下：PCR方法扩增A片段通过凝胶回收试剂盒回收后，用BamHI和SalI进行双酶切；质粒pMS75也用这两种酶同步进行双酶切。酶切完成后用凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。将6μl A片段的回收产物、2μl质粒片段、1μl连接酶buffer和1μl T4连接酶混合后，16℃孵育12h。连接产物转化大肠杆菌TOP10，用含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。阳性克隆经PCR检测确认后，接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基。待生长至对数期，将该菌株所含质粒提取出来用SalI和SphI进行双酶切。同时，也将B片段的扩增产物用相同的酶进行双酶切。酶切结束后回收目的片段，将6μl B片段、2μl质粒片段、1μl连接酶buffer和1μl T4连接酶混合后，16℃孵育12h。连接产物转化大肠杆菌S17-1λ。用含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。PCR检测确认阳性克隆后，4℃保存备用。

(5)将含待缺失DNA序列的上下游序列的自杀质粒pMS75转入黄杆菌

将获得的含目的质粒的大肠杆菌S17-1λ与柱状黄杆菌各20ml培养至对数生长早期，室温3,000g×10min离心收集菌体。用不含抗生素的Shieh液体培养基分别将两种菌体洗涤两次后，用100μl Shieh液体培养基将两菌混合重悬，悬液滴至预先铺有灭菌NC膜的Shieh平板上，28℃静置培养20-24h。

(6)筛选发生第一次同源重组的阳性菌株

在静置培养20-24h后，将两种细菌的混合物从NC膜上刮下来，并用不含抗生素的Shieh培养基重悬。悬液涂布在含15μg/ml盐酸四环素和1μg/ml托普霉素的Shieh平板上，28℃静置培养36-72h后，将平板生长的菌落接种至含15μg/ml盐酸四环素和1μg/ml托普霉素的Shieh液体培养基中。待生长至对数期，通过菌液PCR检测缺失片段的方法确认发生第一次同源重组的菌株。

(7)筛选在柱状黄杆菌中发生第二次同源重组的菌株

挑取发生第一次同源重组的菌落至1ml无抗生素的Shieh液体培养基中，28℃振荡培养至对数生长期。取该菌液涂布含10％蔗糖的Shieh平板，28℃静置培养48-96 h后即有菌落长出。挑选单菌落至无抗生素的Shieh液体培养基中28℃振荡培养至对数生长期。将这些菌株分别在含四环素的Shieh平板和不含四环素的Shieh平板上划线培养。如果菌株既能在含四环素的Shieh平板和不含四环素的Shieh平板上生长，则该菌株丢弃。如果菌株不能在含四环素的Shieh平板上生长，但能在不含四环素的Shieh平板上生长，则该菌株保留供进一步筛选。

(8)筛选缺失突变株

以chlAC基因待缺失DNA区域的序列为模板设计引物chl_del_ch_inF和chl_del_ch_inR，序列分别为：5′-AGCGGTTATGCCTTGTTTA-3′和5′-AGATGCCCATGATAGAATGTC-3′。用菌液PCR方法检测发生同源重组的菌株。具体条件为：94℃变性5min；94℃30s，52℃30s，72℃40s，反应30个循环；72℃延伸10min。如果扩增到目的条带，表明该菌株回复野生型，应丢弃；如果未能扩增到目的条带，表明该菌株发生缺失突变，应予以保留。

用待缺失DNA区域的上游片段A的序列和下游片段B的序列为模板分别设计用于进一步确认突变株的正向引物chl_del_ch_ouF和反向引物chl_del_ch_ouR1。序列分别为：5′-AAACCCGTGAGCAAATCCT-3′和5′-CTGGCTTCAGGAGGATTAG-3′。PCR方法扩增到产物如为不含待缺失区域的DNA产物，则表明该菌株为突变株；反之，则该菌株为回复野生株。

图3为chlAC基因缺失突变株PCR检测结果。以chlAC基因待缺失DNA区域的序列为模板设计的引物chl_del_ch_inF和chl_del_ch_inR，在第二次同源重组的菌株中未扩增到目的条带，而野生株则扩增到相应的条带(409bp)；以待缺失DNA区域的上游和下游片段序列为模板分别设计的正向引物chl_del_ch_ouF和反向引物chl_del_ch_ouR1，在第二次同源重组的菌株中扩增到的条带明显小于在野生株中得到的条带，差值刚好为被缺失区域的DNA碱基数。通过两次PCR检测，说明该菌株为正确的chlAC基因缺失突变株。

硫酸软骨素AC裂解酶能够降解硫酸软骨素。比较柱状黄杆菌野生株和突变株降解硫酸软骨素的能力发现，在含有硫酸软骨素的琼脂平板上，野生株和突变株均能够降解硫酸软骨素，并在菌落周围形成透亮的降解圈，但是突变株周围的降解圈明显变小(图4)，说明突变株降解圈硫酸软骨素的能力下降。

在定向敲除黄杆菌基因过程中，发生了两次同源重组。第一次同源重组时，若能在盐酸四环素和托普霉素的Shieh平板上生长，则表明发生了第一次同源重组。第二次同源重组时，在蔗糖平板上生长的单菌落，大部分都能在四环素抗性的平板上生长，说明发生双交换的几率很低。将发生双交换的菌株进行PCR检测，发现部分菌株回复突变。

利用上述方法，将柱状黄杆菌中的胶原酶基因或溶血素酶基因或几丁质酶基因或其他已知相关基因进行定向敲除，可制备柱状黄杆菌弱毒疫苗。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国科学院水生生物研究所

 

<120>  一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒及应用

 

<130>  一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒及应用

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  7715

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cggcagcgca taccaaagaa cacttagaca aggcaataga agcttttaaa ttaacaggta     60

 

aaatgttaaa agttatataa ttgccacatt tggtgttttt ttgtaggttt tttttaacat    120

 

ttgattttgt atttaaaaaa tttggtgtta cttttgcttg taattaacta aattgtaatt    180

 

aaaaaatgaa catcaaaaag tttgcaaaac aagcaacagt attaaccttt actaccgcac    240

 

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aaacatacgg catttcccat attacacgcc atgatatgct gcaaatccct gaacagcaaa    360

 

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caaaaggcct ggacgtttgg gacagctggc cattacaaaa cgctgacggc actgtcgcaa    480

 

actatcacgg ctaccacatc gtctttgcat tagccggaga tcctaaaaat gcggatgaca    540

 

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ctggccgcgt ctttaaagac agcgacaaat tcgatgcaaa tgattctatc ctaaaagacc    660

 

aaacacaaga atggtcaggt tcagccacat ttacatctga cggaaaaatc cgtttattct    720

 

acactgattt ctccggtaaa cattacggca aacaaacact gacaactgca caagttaacg    780

 

tatcagcatc agacagctct ttgaacatca acggtgtaga ggattataaa tcaatctttg    840

 

acggtgacgg aaaaacgtat caaaatgtac agcagttcat cgatgaaggc aactacagct    900

 

caggcgacaa ccatacgctg agagatcctc actacgtaga agataaaggc cacaaatact    960

 

tagtatttga agcaaacact ggaactgaag atggctacca aggcgaagaa tctttattta   1020

 

acaaagcata ctatggcaaa agcacatcat tcttccgtca agaaagtcaa aaacttctgc   1080

 

aaagcgataa aaaacgcacg gctgagttag caaacggcgc tctcggtatg attgagctaa   1140

 

acgatgatta cacactgaaa aaagtgatga aaccgctgat tgcatctaac acagtaacag   1200

 

atgaaattga acgcgcgaac gtctttaaaa tgaacggcaa atggtatctg ttcactgact   1260

 

cccgcggatc aaaaatgacg attgacggca ttacgtctaa cgatatttac atgcttggtt   1320

 

atgtttctaa ttctttaact ggcccataca agccgctgaa caaaactggc cttgtgttaa   1380

 

aaatggatct tgatcctaac gatgtaacct ttacttactc acacttcgct gtacctcaag   1440

 

cgaaaggaaa caatgtcgtg attacaagct atatgacaaa cagaggattc tacgcagaca   1500

 

aacaatcaac gtttgcgccc agcttcctgc tgaacatcaa aggcaagaaa acatctgttg   1560

 

tcaaagacag catccttgaa caaggacaat taacagttaa caaataaggt acccggggat   1620

 

cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct   1680

 

gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt   1740

 

aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc   1800

 

gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg   1860

 

agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcggtc ttgccttgct cgtcggtgat gtacttcacc   1920

 

agctccgcga agtcgctctt cttgatggag cgcatgggga cgtgcttggc aatcacgcgc   1980

 

accccccggc cgttttagcg gctaaaaaag tcatggctct gccctcgggc ggaccacgcc   2040

 

catcatgacc ttgccaagct cgtcctgctt ctcttcgatc ttcgccagca gggcgaggat   2100

 

cgtggcatca ccgaaccgcg ccgtgcgcgg gtcgtcggtg agccagagtt tcagcaggcc   2160

 

gcccaggcgg cccaggtcgc cattgatgcg ggccagctcg cggacgtgct catagtccac   2220

 

gacgcccgtg attttgtagc cctggccgac ggccagcagg taggccgaca ggctcatgcc   2280

 

ggccgccgcc gccttttcct caatcgctct tcgttcgtct ggaaggcagt acaccttgat   2340

 

aggtgggctg cccttcctgg ttggcttggt ttcatcagcc atccgcttgc cctcatctgt   2400

 

tacgccggcg gtagccggcc agcctcgcag agcaggattc ccgttgagca ccgccaggtg   2460

 

cgaataaggg acagtgaaga aggaacaccc gctcgcgggt gggcctactt cacctatcct   2520

 

gcccggctga cgccgttgga tacaccaagg aaagtctaca cgaacccttt ggcaaaatcc   2580

 

tgtatatcgt gcgaaaaagg atggatatac cgaaaaaatc gctataatga ccccgaagca   2640

 

gggttatgca gcggaaaagc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt   2700

 

cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga   2760

 

atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg   2820

 

taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa   2880

 

aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt   2940

 

tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct   3000

 

gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct   3060

 

cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc   3120

 

cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt   3180

 

atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc   3240

 

tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat   3300

 

ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa   3360

 

acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa   3420

 

aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga   3480

 

aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct   3540

 

tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga   3600

 

cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc   3660

 

catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg   3720

 

ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat   3780

 

aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat   3840

 

ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg   3900

 

caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc   3960

 

attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa   4020

 

agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc   4080

 

actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt   4140

 

ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag   4200

 

ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt   4260

 

gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag   4320

 

atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac   4380

 

cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc   4440

 

gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca   4500

 

gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg   4560

 

ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgctaag aaaccattat tatcatgaca   4620

 

ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac   4680

 

ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat   4740

 

gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg   4800

 

cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatacgtc tattttttta   4860

 

ttgccaagtt ctaatgcttc tatctcctgc cattcataga ggctattata tgccatacat   4920

 

ccgataagaa tggagataag tatatatccc aactgtattg ccttatagaa atttcctgac   4980

 

cgctccatta ttttgatgac attgattttt ggaacatgaa taaaagttta tctttttcgt   5040

 

tcatgcggat attatcagaa taaccgcctt ttgttatttg atacccgcat ggcttaacca   5100

 

taaaaatgcc taagccctta gtgtatgaac ttacttctga tgcatagtct ttacttgtat   5160

 

ttaatggaac tttcccttta atatgacacc actcattatt gcaactgatg tcttcaatct   5220

 

cagacatcat tttttgcaaa tctgtaatag ctttggaact tgccgcttgg ggtatctgca   5280

 

actcaaaata gagcatcggt tcgagaatgt ccacacctga ctgttgcaag gccagcctga   5340

 

agacataagg ggtcagctgt ctgaaatcag caggtgtact taccgggcta taatactcgg   5400

 

cttgagtaaa agttactttc agatcagtca cttcccatcc atgtaacccg gattggcaag   5460

 

acatacgaat cccttcaaaa acggcatttt gaaaagaatg gttcagataa ccataggaga   5520

 

tgtcactttc gatttgcaac cctgtcccta acggtaaggg ttcaagagtc agccctattg   5580

 

tggcccaata agggttgggc ggcacttcga tctgaataat cttattgacc ttttttacag   5640

 

gtcgttcttt gtatatagtc ttgatctcat caaaatggac ctttacggaa aatcgttctt   5700

 

ccagcaatgt ctgtatgatt tccttttggg ttaaaccata taacgagatt tccaattcat   5760

 

cactatatga gtttatggaa aaggacaaag acgggtcttc aatccacaat gtattcagag   5820

 

cggatatcac cttgcttctc tcttcgggcc tgtctggccg gacggaggat ttgagagcgg   5880

 

gatgctgatg cgataatcct tgaatcaaac aaggttcagc acctaaataa tttccgattc   5940

 

gaaaatcatc catatcctct acaatcgcga tatcattggc gcccacttca tcaacattta   6000

 

tctctctgcc ctgattgata gtttttagat ttttaatctt gatgaatttt tccgaatcgt   6060

 

tgattcttac aacgtctcga agtctcagac ttccgtcaat tatttttaga aaacttcttt   6120

 

tatgtccttt ggggtcatgc tctatcttat aaagataaga tgaaagtctg tttgagaccg   6180

 

atgccggagg aagtataaaa gaagtgatgg cgtccaacaa ctcattgata ccgatattga   6240

 

acattgctga tccatgtagc accggataga ctttggcttt tgccacaaga gcgattatcg   6300

 

tattccaata atcagccggt gaaatttcgc tatccgccaa atatcgttct aatatattgt   6360

 

cgtcatggtt gcatacaaat tctttgtatt cttcctttat atatgtttgg gagcaaaccg   6420

 

gataaaccga tccatcgaca acattttgca taaacaggac atcttgagac agatttgctt   6480

 

ttatatccag atacaaacgc tccaaattca caccggctcg gtcaatctta ttgataaata   6540

 

taattgtcgg gatttgcagc ttctgtaaag tattgaacag caactttgtc tgcgcttgta   6600

 

tgccttcctt tgcggataag atgaggactg ctccatcaag cattttgaat gtccgctcca   6660

 

cttccgcaat aaaatccatg tgtcccggag tgtcaatgat attgcatttc acaccattcc   6720

 

agataataga tgtcgtagaa gcccgaacag taattcctct acgtttctct atatccatag   6780

 

agtccgttat ggtgtcacca ttatccacac agccgcactt ttccgttgct ccactggcaa   6840

 

acagcagatt ctcggttacg gaagtttttc ctgcatcaat gtgagcaaga attcctaaat   6900

 

ttataatatt catttggatt aagcaataat atactacaat agatgcattg tcgaaacgca   6960

 

ccttttaata cctcctcgta gcatatgaga actacaggat tcctaactcg tattaatatg   7020

 

tatattatta ctgccgcata acgattacaa aattacacaa aaaaatatat ctaacaaaag   7080

 

taggaggatt ttttaacttt ttaccataga cattttatta gggaaacgta ggttcaactg   7140

 

gtaagtacaa ataagtagaa atgtttgaac aacactgttt taggaagttg aaaaatcaag   7200

 

tttctctctc ggtatagcgt ttattttggc caatatcttc tttagtttgg catttgagta   7260

 

tttcccattc gtgttctatt tagctcctta ttatgagtat gtagcaagtt gcttatcaaa   7320

 

ttcagcctct ttgagggtca aatatggttt tgcaaatggt gactgacaag acataaacaa   7380

 

ggtcagcagg attttttaca taaatggaca tgaatgtata taacggggtt tgagggccaa   7440

 

tggaacgaaa acgtacgtta aggagataat tcgttgttta tatttaaatt tagtatgcgg   7500

 

tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc   7560

 

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg   7620

 

gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca   7680

 

cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc gagct                              7715

 

 

<210>  2

<211>  1606

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ggcagcgcat accaaagaac acttagacaa ggcaatagaa gcttttaaat taacaggtaa     60

 

aatgttaaaa gttatataat tgccacattt ggtgtttttt tgtaggtttt ttttaacatt    120

 

tgattttgta tttaaaaaat ttggtgttac ttttgcttgt aattaactaa attgtaatta    180

 

aaaaatgaac atcaaaaagt ttgcaaaaca agcaacagta ttaaccttta ctaccgcact    240

 

gctggcagga ggcgcaactc aagcgtttgc gaaagaaacg aaccaaaagc catataagga    300

 

aacatacggc atttcccata ttacacgcca tgatatgctg caaatccctg aacagcaaaa    360

 

aaatgaaaaa tatcaagttc ctgagttcga ttcgtccaca attaaaaata tctcttctgc    420

 

aaaaggcctg gacgtttggg acagctggcc attacaaaac gctgacggca ctgtcgcaaa    480

 

ctatcacggc taccacatcg tctttgcatt agccggagat cctaaaaatg cggatgacac    540

 

atcgatttac atgttctatc aaaaagtcgg cgaaacttct attgacagct ggaaaaacgc    600

 

tggccgcgtc tttaaagaca gcgacaaatt cgatgcaaat gattctatcc taaaagacca    660

 

aacacaagaa tggtcaggtt cagccacatt tacatctgac ggaaaaatcc gtttattcta    720

 

cactgatttc tccggtaaac attacggcaa acaaacactg acaactgcac aagttaacgt    780

 

atcagcatca gacagctctt tgaacatcaa cggtgtagag gattataaat caatctttga    840

 

cggtgacgga aaaacgtatc aaaatgtaca gcagttcatc gatgaaggca actacagctc    900

 

aggcgacaac catacgctga gagatcctca ctacgtagaa gataaaggcc acaaatactt    960

 

agtatttgaa gcaaacactg gaactgaaga tggctaccaa ggcgaagaat ctttatttaa   1020

 

caaagcatac tatggcaaaa gcacatcatt cttccgtcaa gaaagtcaaa aacttctgca   1080

 

aagcgataaa aaacgcacgg ctgagttagc aaacggcgct ctcggtatga ttgagctaaa   1140

 

cgatgattac acactgaaaa aagtgatgaa accgctgatt gcatctaaca cagtaacaga   1200

 

tgaaattgaa cgcgcgaacg tctttaaaat gaacggcaaa tggtatctgt tcactgactc   1260

 

ccgcggatca aaaatgacga ttgacggcat tacgtctaac gatatttaca tgcttggtta   1320

 

tgtttctaat tctttaactg gcccatacaa gccgctgaac aaaactggcc ttgtgttaaa   1380

 

aatggatctt gatcctaacg atgtaacctt tacttactca cacttcgctg tacctcaagc   1440

 

gaaaggaaac aatgtcgtga ttacaagcta tatgacaaac agaggattct acgcagacaa   1500

 

acaatcaacg tttgcgccca gcttcctgct gaacatcaaa ggcaagaaaa catctgttgt   1560

 

caaagacagc atccttgaac aaggacaatt aacagttaac aaataa                  1606

 

 

Claims (5)

1.一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒，所述质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述质粒的制备方法，包括：

（1）穿梭质粒pCP23改造为线性载体

将分离纯化的穿梭质粒pCP23用SacI和KpnI进行双酶切，电泳结束后将大小为6103 bp的片段切下，回收后即为pCP23线性载体；或用引物扩增穿梭质粒pCP23的除复制区域以外的序列；

（2）含负选择标记的自杀质粒的构建

将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列与pCP23线性载体定向连接；取连接产物转化大肠杆菌，经筛选后，即得一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒。

3.权利要求1所述的质粒在定向敲除柱状黄杆菌目的基因中的应用。

4.权利要求1所述的质粒在构建柱状黄杆菌基因缺失弱毒疫苗中的应用。

5.权利要求1所述的质粒在构建柱状黄杆菌基因缺失株中的应用。