JPS5856685A - 脊椎動物細胞培養におけるポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、脊椎（脊椎）動物組織カルチャーの中でポリ
ペプチドを産生するため０組換えＤＮＡ技術の利用に係
る。−面において、本発明、は、発現を起こすｌロモー
タ系に有効に結合されてお多かつポリ−４ｆチドをコー
ドしているＤＮＡ配列を含有する発現ベヒクルの作成に
係〕、さらにこのように作成され−）系との両者におい
て、複製可能でＴｏシ、かつコードされたポリペデチＩ
ｐＤＮム配列を発現することができる。慟ｍお鱒て、本
発明は、この種の発現ベヒクルで形質転換（ｌｒａｍａ
ｆ・ｒａ＋ａｔｉ・ｎ）され、し九がって上記のＤＮＡ
配列の発現に向けられる背椎動物細胞カルチャーに係る
。

好適具体例において、本発明は、複製、表現型選択、並
びにＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｍＡｇ）遺伝子およびその
ための発現ｆロモータへの結合に用いられるＤＮＡ配列
を利用する特定の発現ベクターを提供する。前記配列は
使用する宿主背椎動物細胞系に対し自然であって何ら悪
影響がない、　ＨＢｓＡｇは約２２１１１１１の粒子の
形態で培養基（培地）中に分泌され、Ｂ製肝炎ウィルス
（ＨＢＶ　）の抗原決定基を含有する。このように産生
され九Ｂ型肝炎表面抗原は、ＢＷｉ肝炎ウィルスに対す
るワクチンの製造に使用するのに適しており、本発明は
さらにこの種の細胞培養発現の最終生産物であるｌｌｓ
ＡｇをＨＩＶに対して有用な、九とえばワクチンのよう
な実体に変換する手段および方法に関するものである・ 本発明の詳細な説明しかつ特にその実施に関しさらに詳
細な説明を記載している刊行物およびその他資料なζζ
に参考のため引用し、便宜上蓼照符号を付し参考文献と
して本明細書末尾に記載する。

組換えＤ）ｉム技術を用いることにより極めて多くの有
用１ｋＩＩｔす（グチドの制御された微生物的産生が可
能となった。たとえば、ヒト成長ホルモン、ヒトグロイ
ンシュリン、デアセチルテモシン（ｄｅｍａａ＠ｔｙｌ
ｔｋｙｍｏａｉｍ）α１１ヒトおよび雑種（ハイブリッ
ド）白血球インターフエ四ン、ヒト絨維芽細胞インター
フェロンならびに多くの他の生産物のような、多くの背
椎動物ポリペプチドが既に各種の微生物によシ産生され
ている。この技術の力は極めて多くの檜類の有用なポリ
ペプチドの微生物的産生を可能にし、広範なｓｉｓの薬
剤が目標とする用途に有用なホルモン、酵素、抗体およ
びワクチンの微生物的製造を可能にする。

組換えＤＮＡ技術の基礎的ｅｍｕプラス擢ド、すなわち
１個の細胞当シ多数のコピーとして、しばしば細菌中に
見出される二本鎖ＤＮＡの染色体外ループである。プラ
スミドＤＮＡにコードされている情報には、娘細胞中に
プラス（ドを再生するのに必要な情報（「レグリ；ン」
すなわち複製のオリジン）が含まれ、さらに通常１種も
しくはそれ以上の表現Ｅ１ｓ択特性、九とえば抗生物質
耐性が、含まれ、これらは目的とするプラスミドを含有
する宿主細胞のクローンを識別し、かつ優先的に選択培
地中で増殖させることを可能にする。細菌性プラスミド
の有用性は、これらデラスンドＤＮム上の異なる部位を
それぞれ識別する種々の制隈工ンドヌタレアーゼすなわ
ち「制限酵素」によ）プラス（ドを特定的に開裂させう
ると−う事実にある。

そＯ後、開裂部位で１または開裂部位に隣接する再構成
末端で端部結合（末端−末端結合）さぜることＫより、
異種遺伝子もしくは遺伝子断片をプラス（１’！に挿入
することができる。いわゆる複製しうる発現ペヒタル社
このようにして生成される。

ＤＮＡ組換えは宿主生物の体外で行なわれ、得られるｒ
組換体」複製可能発現ベヒクルすなわちプラスミドは形
質転換として知られる方法によ）、微生物細胞中に導入
することができ、かつ多量の組換えぺしタルを形質転換
体の増殖により得ることができる。さらに遺伝子がコー
ドしているＤＮＡメツ竜−ゾＯ転写および翻訳を支配す
るプラスミドの部分に関し適切に遺伝子を挿入すれば、
得られる発現ベヒクルを使用して、挿入遺伝子がコード
しているポリペプチドの産生を指令することができる。

この過程を発現という。

発現はプロモータとして知られるＤＮＡ領域において開
始される０発現の転写期において、ＤＮＡはほどけてこ
れを開始したＤＮＡ配列からメツセンシャＲＮＡへの合
成の鋳形として露呈する。次いで、メツセンシャＲＮム
はりＩソームに結合し、ここでメツセンシャＲＮムはこ
のｍＲＮムが；−ドしているアミノ酸配列を有するポリ
−４ｆｆド鎖に翻訳される。

各アミノ酸はヌクレオチドトリプレット、すなわち「コ
ドン」によりコードされてお）、このコドンが集合して
「酵造遺伝子」、すなわち発！ｌｌＩリペゾチＦ産生物
のアミノ酸配列をコードしている゛ＤＮＡ配列部分を構
成する。翻訳は「開始」信号（通常ＡＴＧ、これは得ら
れるメツセンジャＲＮＡ　においてはムＵＧとなる）に
おいて開始される。−わゆる停止コピ／は翻訳の゛終了
を規定し、し丸がつてそれ以上のアイノ酸単位の産生を
規定する。得られる産生物は必要に応じ微生物系中にお
いて宿主細胞を溶菌させ、かつ他の蛋白質からの追歯な
精製によｐ産生物を回収することにょシ得ることができ
る。

実際上、組換えＤＮＡ技術の使用は完全に異種のＩす４
ｆテドの発現、いわゆる直接的発現を可能にし、或いは
同ＩＩ／リペプチドのアミノ酸配列の一部に融合し九異
種−リペプチドの発現を可能にする。後者の場合、目的
とする生物活性量生物は、しばしば融合した同種／異種
４ｖ１１テド内において、この４リペデチドが菌体外環
境で開裂されるまで生物不活性にされている。英国特許
公開公報第２，００７．６７６ム号およびｌ・口・ｌ。

ｍａｒｉｅａｔ＋　Ｓｅｉ＊ｍｔｉｓｔ　ｏ第６８巻、
第６６４頁（１９８０）参照。

組換えＤＮＡ技術がその有望碓を充分に保持しようとす
るならば、目的とするポリペブチＰ産生豐を制御環境に
おいてかつ高収率で入手しうるよう遺伝子挿入物の発現
を歳適化する系を案出せねばならなｉ。

遺伝学および細胞生理学を研究するための細胞培養また
は組織４養の技術拡充分に確立されている。単離正常細
胞の連続的転移（ｔｒａｎｓｆ＠ｒ）によって灸遺され
友永久細胞系（ｐ＠ｒｍａｎ＠ｎｔ・・１１１１ｎ・）
を維持するための手段および方法を使用することができ
る。研究に使用するには、この樵の細胞系は液状媒体中
で同体支持体上に維持されるか、或いは支持栄養物を含
有する懸濁物中で増殖させて維持される。大規模製造に
対するスケールアップは機械的問題を課するだけである
と思われる・その他の技術的背景については！１時塾蝕
ｙｍ第２版、　Ｈａｒｐ＠ｒおよびＲｏｗ出版社、＆ｇ
＠ｒｓｔ＠ｗｍ　ｅＭａｒｙｌａｎｄ　（１９７３）、
特に第１１２２１以降、および５ａｉ＊ｍｔｉｆ１ｃ　
Ａｍ＠ｒｉｍａ＋ａ　、第２４５巻、第６６頁以＃４（
１９８１）を参照することができる。

そのおのおのを参考の九めことに引用する。

本発明は、組換えＤＮＡ技術を背椎動物宿主細胞培養系
において成功９にかつ効率的にポリペプチドを産生させ
るのに使用しう３という知見に基づくものであり、した
がってこの檜の系はたとえばグリコジル化（ｇｌｙｅｏ
ｓ、７１ａ　＄１ｏｎ）、−酸化（ｐｈｏｇｐｈｏｒｙ
／＋ａＨ＊ａ）、メチル化（血ｔｈ７１ａｔｌｏａｌな
らびに天然に産生される動物性蛋白質に一層近縁Ｏ糖質
および脂質結合という利点を有し、これに対し細菌もし
くは酵母宿主においてはそのようなレベルの洗練された
工程による産生は不可能である。さらに１背椎動物紹胞
培養は疑いもなく充分に４す（ブチＰ産生物を許容し得
、特に成る場合には細胞培養培地中にその産生物を分泌
することさえでき、回収および精製法において著しく有
益である。

本発明は、このように産生されたポリペプチド並びにそ
の製造方法および手段に係る。さらに、本発明は、背椎
動物細胞カルチャー中に配置した際Ｉリペｌチドをコー
ドしているＤＮＡ配列を直接発現しうる形態で有する複
製可能な発現ベヒクルに係る。さらに１本発明は、この
種のポリペプチドを発現しうる上記の発現ベヒクルで形
質転換された背椎動物細胞カルチャーに係る。さらに他
の面において、本発明は、このよりなりＮム配列、ＤＮ
Ａ発現発現ペルタルびカルチャーの製造に有用な種々な
方法、ならびＫその゛轡定具体例に係る。

さらＫｔた、本発明は、ｖ市乳動物にお叶る種々の病的
状態の処置の際鷹乙投与する九めの、ならびにこの種の
処置に追白な医薬もしくは動物衛生組成物を製造するた
めの（のように産生された４すべ／チドの使用に係る。

一好適具体例において、本発明は、背椎動吻細胞力縛シ
甲でＢ［肝炎表面抗原（ｉ［Ｂ・ム「）を、Ｂ型肝炎ウ
ィルス（ＨＢＶ）の免疫原性決定基を含む分離した粒子
形態として産生ずる手段および方法に係る。このＨＢｓ
Ａぎは個々の粒子形動として細によ如フードされている
かどうかに拘わらず、いかなる付加的な融合ポリイプチ
ド人為構造も含有しない。本発明ｔ’ｌ、ＨＢＶに対す
る免疫原性を感受性のヒトに付与するのに有用なワクチ
ンの製造に対し、かく産生されたＨＢｓＡｇを使用する
ことに関し、さらにこの種のワクチンならびＫ　Ｈ１！
Ｖに対する免疫原性を感受性のヒトに対し接種および付
与するためのその使用方法に向けられる。

蕗型肝炎（血清肝炎）ウィルスは人間の間で伝染し、慢
性弱質感染として現わわ、徐々に重症の肝鯖障害、初期
癌および死亡へと漸次進行する。

大低の場合、Ｂｉｌ肝炎感染からの児食な回復を期待す
ることができるが、特に多くのアフリカおよびアジア諸
国における人口の多数は慢性保菌者であって、この病気
を広い範囲に伝染させるという危険な潜在性を有してい
る。

肝炎はウィルスベクター（Ｂ型肝炎ウィルスすなわちＨ
ＢＶ　）によって引きおこされ、このウィルスベクター
はその完全な状態、すなわちいわゆるｒ−ン粒子におい
てピリオンを示し、かつＤＮＡ分子を包封する２　７　
ａｍのヌクレオカプシドとこのヌクレオカプシドを包囲
するエンペログとから構成されている。Ｖリオンに関連
する蛋白質は、コア抗原（ＨＢｅＡｇ）、ＤＮＡ　／リ
メラーぜ、および感染した保菌者の血清中に見出される
表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を包含するｅ　ＨＢｓＡＨに対
する抗体もＨＢＶ感染者の血清中に見出されている。ｉ
ｆ！Ｉ＠ＡｇはＨＢＶ抗原であって、抗体（抗−ＨＢｓ
）の免疫原性産生を誘発しうると信じられ、シ九がって
ＨＢＶワクチンにおける主要素であろう。これについて
は次の文献を参照することができる：Ｄａｌ＠＠・ｔａ
ｌｅ、Ｌａｍｅｓｔ　（１９）０）（１）−６９５（１
９７０）ＳＨａｌｌ量ｒｒｇｍｒ　　ａｔ　　ａｌｅ、
Ｊ＊Ｉｍｍｇｎｓｌｏｇｙ、１　０７　。

１０９９（１９７１）　、”Ｌｉｔｇ　ａｔ　ａｌａ、
Ｊ＊Ｉ＊ｗｎｃａｏｌｏｇｙ。

１０９．８３４（１９７２）：引４１１ｂ＠ｒｇ、８ｅ
１＠ｎａ＊。

１９７．１７（１９７７）；Ｐ＊ｔ＠ｒｓｏｎ　　ａｔ
　　ａｌ・。

Ｐｒ＠＠、）ｉａｔ、Ｊ＠ａｄ、ｌｉ＠ｔ、（Ｕ８ム）
、に４．１５３０（１Ｇ７７）およびＶｉｒａｌ　Ｈ＠
ｐａｔ口１＠、ＡＣ＠ｎｔ＠ｍｐ＠ｒａｒｙ　Ａｓｓ＊
ｓｓｍ＠ｍｔ　＠ｆ　Ｗｔｌｅｌｅｇｙ。

１ｃｐｌｄ＠ｍ１ｅｌ＊ｇｙ、Ｐａｔｈ＠ｇ＠ｍ＠−亀
−およびＰｒ＊ｗｎｔｉ＊ｍ。

（Ｖｙａｓ　ａｔ　ａｌａ、ａｄｍ）、Ｆｒａｍｋｌｉ
ｎ’ｌｍ５ｔｌｔｉｔ＊Ｐｒｅｍｓ、Ｐｈｉｌａｄｓｌ
ｐｈｌｍ、１９７　Ｌこれらの文献のそれぞれを本発明
の背景をさらに説明するためこむに参考として引用する
。

１ｌｌｓム１は、約１６〜２５　ｍ鴫の範囲の直径を有
する球状粒子、いわゆるｒ　２２　ａｍ粒子」の形態で
、主として感染自装中に存在する。これらは、非感染性
ウィルスエンペａｌであると思われる。

ＨＢｓＡＨに対する抗体はＨＢＶ感染に対して予防効果
を有するので、これらの非感染性粒子をワクチンとして
有効に使用することができる。

Ｂ型肝炎ウィルスは細胞培養物（カルチャー）中では感
染性でなく、感染したヒトまたは高級霊長類からしか得
られなりので、ＨＢＶに対する免疫化用の抗原を産生さ
せるために使用する充分なＨＢＶＯ供ＩｌＩ源を獲得し
かり維持する手段は得られなかった。

英国特許出願公開第２．ＯＢ　４，３２３　Ａ号および
璽−ロツノ４特許出願公開尊１３，８２８号および第２
０，２５１号明細書に社、牛れぞれＨＢＶｒツムの単離
およびクローン化、Ｈ１ｌＶコア抗原の発現、ならびに
ＨＢｓＡｇの一部を含有するとされている融合蛋白質の
工・工土上土における産生が記載されている。

Ｐｒｅａ＠ＮａｔｌｅＡｅａｔｅ８ｃｌｓ（Ｕ８ム）、
第７７巻第４５４９頁（１９８０）Ｈ、タンデムクロー
ン化１ｍ肝炎ｒツムを用いるマウス細胞の形質転換によ
る、マウス染色体の一体化（ｉｍｔ＠ｒｇｒａｔｉ・ｎ
）を報告している。

Ｍｉ＋ｒ１ａｒｔｙ　ａｔ　ａｌｅ、ＰｒｏｅＪｌｍｔ
ｌ、Ａｃａｄ、８ｅｉ。

（Ｕ１１ム）、第７８巻、第２６０６頁（１９８１）は
ＨＢＶ−ＤＮＡの断片を有するサルウィルス４０（８Ｖ
４０）組換体の作成を記載している。サル腎臓細胞の培
養物にウィルス組換体を感染させ、セして］１ｍ肝炎に
感染した患者の血清中に見出されると同じ特性を有する
とされている２　２　ｍｄｌｌ子を産生させえ。Ｍｏｒ
ｉａｒｉｙ・ｔ　ａｌ・によれば、組換体ベクターはＨ
ＢｓＡｇ配列を有するＨＢＶｒツムの大型セグメントを
含有し、かつ８ｖ４０腫瘍蛋白質およびその他ＨＢＶ［
白質をコードしているＤＮＡ配列を包含していえ、さら
に、それらの作成は、５ｖ４ｏウイルスのｖｐ−ｚｚ白
實をコードしている配列と同じ枠で（１ｍ　ｆｒａｍｓ
）ＨＢｍＡｇ　ＤＮＡを組み込んだ、成熟（完全な）　
ＨＢｓＡｇが発現されたかどうかは明確でな−。

第１１１！ｕｔｉ”／Ｐ−１ｆＥ白質をコードしている
領域が欠如し九８　Ｖ　４０　ＤＮＡを含有する！２ス
ミドｐｌｉＶＲの作成を示している。

第２図はＨＢｓＡｇＤＮＡを有するｌラス（ドｐＨ８９
４の作成を示している。

第３図はＨＢａＡｇＤＮＡ並びに８Ｖ４０およびｐＢＲ
３２２から誘導されたＤＮＡＩＣ）配列を含有するグラ
ス（Ｐ　ｐｓＶＨ１１１１ムの作成を示して−る。第３
図Ｂにおいて、ＶＰ−１！［白質のム’ｒＧｌｌｌ始コ
ドン（上部の線内に囲われている）を包囲するＤＮＡｌ
Ｅ列を組換体（下方の線内に囲われたＡＴＧ　）で作ら
れるＨＢｓＡｇのＤＮＡｋ！、列と比較した＠　１ｃｅ
ｅＲＩ部位に変換されたＨ１ｍｄｌｆｌ１位にＴｍを施
ζす・第４図はサル細胞におけるプラス１ｒＤＮムの複
製を示している。単層Ｃｏ−細胞が６１のプラスチツタ
皿において全面（＠＠ｍｆ１ｍｓｍａｙ　）の５０〜ｆ
ｉＯチ壕で成長した。これらの細胞をドルペツコ（Ｄｕ
ｌｂ＠ｅｅｏ　）の改良培地で洗浄し、そして１１１７
０プラスミドＤＮＡと２００μｇのＤＩＡＩＣ−ｆキス
トランとを含有する培地２−を１２時間３７℃にした。

ＤＮＡ溶液を除去し、細胞を培地で１回洗浄し、ｌＯ慢
胎児牛（・ａｌｔ）血清を含有する培地５１１ｊを加え
、そして細胞をＤＮＡ抽出の前に３７℃にて１日間また
は３日間インキエペートした。これらの場合、小さなス
ーΔ−コイルブラスミＰＤＮムをＨｌｒｔ　（後記参考
文献１４参照・以下同じ）の方法に従がって単離した。

　ＤＮＡをナガロースｒル電気泳動にかけ、セしてニド
四セルロースに移した（Ｉｓ参照）、複製デツスミＶを
可視化する丸め、ニド曹セルロースフィルターｔＰ　で
ｍａｔ、＊ＨＩＶ　ＤＮＡでデローツした。レーン（ａ
）　：　ｐＲＩ　−１１ｇ１でトランスフェクション（
ｔｒａｍｉｆ＠ｅｔ１・ｎ、形質変換）し九細胞のハー
ト（Ｈｌｒｔ）溶菌物からのＤＮＡ６レーｙ（ｂ）　：
　ｐＨ１ｌｓ３４８−Ｌでトランスフェクションした細
胞のハート溶菌物からのＤＮＡｏレーン（財）：　ｐＨ
１膳３４８−Ｌ　ＤＮＡ　１μｇ、矢印は閉１ＩＩＤＮ
ム（１３と開環ＤＮＡ（１）の位置を示している。

第５図はＣａｍ細胞における組換体！ラス之ドにより合
成され九ＨＢｓＡＨの定量化を示している・単層Ｃ６１
細胞を６ｅｓのゲラステック皿において全面の約５ｏｆ
ｉ壕で成長させ、上記第４図の説明に記載したようにＤ
ＮＡでトランスフェクションし九。

トランスフェクションの後ｌＯ憾の胎児牛血清を含有す
るＤｕｌｂ＠＠ｃ・改良培地２ｄを加え、そして培地を
それぞれの時点でＨＢｓＡｇ発現につき２４時間の蓄積
後に分析した・ＨＢｓＡｇ発現は、ＲＩＡ（ムｂｂｏｔ
ｔ　Ｌａｂａ）により分析し、０．２−の未希釈培地中
における１分間ｍｂのカクント数（・ｐｍ　）として表
わされる。

第６図はナル細胞から誘導されたＨＢｍＡｇの免疫原性
を示している。　ｐＨＢｓ３４８−Ｌでトランスフェク
ションしたＣａｍ細胞の２０個の１５３ＨＩＩから培地
をとシ、そして電子顯黴鏡検査用に上記のとお夛ｌＢｓ
Ａｇを精製した。５匹のｌラスからな、４を、それぞれ
完全７０イントアジエパント（Ｃ・ｍｐｌ＠ｔ・Ｆｒ＠
ｔ＋ｎｄｓ　ａｄｊｔｌｖａｎｔ）の存在下で２．８μ
ｇ　、　０．６μｇ。

または０．００６μｇの精製ＨＢ−ムｇで免疫化した。

コントロールマウスについてはヒト血清（ＮｅｒｔｈＡ
ｐｅｒｉｃｍｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ　ｌｎｅ、　
）から得られ九真正ＨＢｓＡＨの同量で免疫化した。免
疫化の後、槁々の時点で、マウス尾から採崩し、抗−ｌ
ＢｍＡｇ抗体をＲＩＡ（Ａｋ＋ｂ＠ｔｔ　Ｌｍｂｓ　）
によシ定量し、そしてそれらの結果をマウス１匹当シの
平均タイターとして表わし友０組織培養から得られた）
ＩＢ−ムｇで免疫化し友！ウス紘、ヒト血清１から得ら
れ九Ｈ１１ｍＡｇで免疫化したマウスと同一のタイター
を示した。

第７図はＳＶ４０の１部として複製するＩＢＭ配列の存
在を示している。

第８Ａ図はとの組換体ベクターにより合成され九ＨＩ１
ｍＡｇの見糖員度勾配沈降のＭ来を示している。第８Ｂ
図は対応するＣｓＣ１濃度勾配遠心分離の結果である。

第９図は本発明に従がって、２２ｎｍ粒子として合成さ
れ九ＨＢｓＡＨの電子顕微鐘与真を示している。

細胞培養系／細胞培養ベクター 培養（組織培養）における背椎動物細胞の増殖は、近年
日常的方法となった（　Ｔｉ５ｓｕ＠Ｃｕ１ｔｕｒ・４
ｃａｄ＠ｍｉｅ　Ｐｒ＠ｍｓ社、　ＫｒｍｍｅおよびＰ
　ａ　ｔ　ｔ　＠　ｒ　ｓ　ｏ　！ｄｌｌ。

１９７３参照）。ここでは、ＨＢｓＡｇを産生するため
の宿主としてＣＶ−１系サル腎臓繊維芽細胞を使用した
。しかしながら、ヒとで詳細に記載した実験は適合性の
ベクターの複製および発現を可能とする任意の細胞系、
たとえばＷＩ　３８　、　ＢＩ（Ｋ。

３　Ｔ　３　、　ＣＨＯ，ＶＥＲＯおよびＨ＠Ｌａ細胞
系で行なうことができた。さらに１発現ベクターに要求
されるものは、複製のオリジンと発現すべき遺伝子の前
方かつそれと一致する解読相にある！ロモータと、さら
に任意の必要なりＩソーム結合部位、ＲＮＡスプライス
（ｍｐＨａ＊）部位、ボリアアニル化（ｐｏｌｙａｄｓ
ｎｙｌａｔｌｏｍ　）部位および転写終止配列とである
。本発明では８Ｖ４０のこれら必須の要素を利用したが
、ここに好適具体例として記載した本発明はこれら配列
のみに限定するものでないと了解される。たとえば、他
のウィルス（たとえばＰ＠ｌｙｍａ　、ムｄ＊ｔｚｅ、
　Ｒ＊ｔｒｅ、　ＶＳＶ、　ＲＰＶなど）ベクターの複
製オリジンを使用することができ、さらに非一体化状態
で機能しうるＤＮＡ複製の細胞オリジンも使用すること
ができる。さらに、８ｖ４０　ＤＮＡの複製は独特の部
位で始まり、二方向性で進行する（１Ｇ参照）、遺伝学
的柾明によれば、ウィルスＤＮＡの複製には１個のみの
ウィルス遺伝子生産物が必要とされる。これはＡ遺伝子
（τ抗原）の生産物であシ、ウィルスＤＮＡ合成のそれ
ぞれの段階を開始させるのに必要である（１２参照）。

ここに記載された実験が示すとζろによれば、８ｖ４０
のＤＮＡ複製のオリシンを含有する組換体シラスミドは
１ｉＶ４Ｇ大型〒抗原の存在下にサル細胞中で複製する
ことができる（２０．２１参照）。

複製およびｆａモータ機能の両者を保持するベクターを
作成することが望ましかった。相補的補助ウィルスの非
存在下でこの種の系を使用して異種遺伝子を発現しうろ
ことも確立されている。

ポリペプチド産生物 本発明は、生理学的目的で生体生物内で天然に産生され
るポリペプチドならびに不用蛋白質の開裂除去、折シ畳
み組み合せなどによシこの種のポリペプチドに変換処理
しうる中間体と同様な生物活性を示す広範な種類のポリ
ペプチドを製造するのに有用である。これらの例はホル
モン、たとえばヒト成長ホルモン、牛（ｂｏｗｉｎ＠）
成長ホルモンなど；リンフ才力イン（１部ｍｐｈｏｋ１
ｎ・）；酵素たとえばスーパーオキシドジスムターゼ（
超過酸化物不均化酵素）など；インターフェロン、たと
えばヒト繊維芽細胞ならびにヒトおよび維種白崩球イン
ターフェロンなど；ウィルス抗原もしくはイムノシン（
免疫原）たとえばフット・アンド・マウス病（口締病）
抗原、インフルエンザ抗原性蛋白質、肝炎コア抗原およ
び表面抗原など；各種のその化ポリペプチド、たとえば
ヒトインシ瓢リン、ムＣＴＨ１各種のグリコ蛋白質、免
役グロブリン、ビタインＫを必要とする血液ファクター
、たとえば因子■および■などである。

これらの発現ペタターは、特にＣ０８−７系ナル細胞に
おいて異種ポリ−４ｆチドの合成を有効に指令する。８
Ｖ４０Ｏ初期および後期プロモータの使用を開発したが
、その他のプロモータもこの点に関し有用である。潜在
的に有用なポリ−４ｆテド（たとえば成長因子、リンフ
才力イン、ウィルス抗原、インターフェロン）の効率的
発現に加えて、この系はその他の面でも有用である。た
とえば、著しいレベルの田植がこれらのベクターから合
成され、このことはイントロンを含有するｒツム挿入物
が着しいレベルの処理ＲＮＡを生成し、そζから・ＤＮ
Ａクローンを容易に得ることができることを示している
。したがって、この系はｒツム挿入物をａ　ＤＮＡクロ
ーンに変換させるのに有用であることが判かる。さらに
、非溶菌発現系において１この方法を使用して遺伝子を
発現させることができ、その目的で選択圧（たとえばジ
ヒドロ葉酸還元酵章、チギノンキナーゼ、薬剤耐性遺伝
子、腫瘍遺伝子）などを作用させることができ、この結
果ウィルス、ＤＮＡ複製オリジンでなく宿主に健在する
ベクター、ならびに宿主配列（たとえば動原体）を獲得
することによ多安定して複製するベクターの両者を得る
ことができる・ （以−ｔ’全余白 ｖｐ−ｉ蛋白質のコード領域を含有しない１ｌＶ４０掛
ｔｉｅ作成 ＩＶ４ＯＤＮ＆０％金なヌクレオチド配列は公知であ）
（１参照）、したがって種々０８Ｖ４０がコードしてい
る蛋白質の物理的位置を種々の制限酵素−裂部位と直棒
に相関させることができる＊ＶＰ−１蛋白質をコードし
ている領域を包含するヌクレオチド配列（１参ｊｌ）の
検査によシ、２つのうまく配置している制限エンドヌタ
レアーザ開裂部位が４１ＩＩｊｌｌシた（第１５ｉＥＩ
）。第１のものはヌクレオチド位１１１４１１３におけ
る制限エンドヌクレアー管引ｈａ　ｌの開裂部位であっ
て、ＶＰ−１＊白質に対する開始コドンに対しヌクレオ
チＰ６備分ｓ　７側である。嬉！Ｏもの、すなわちヌク
レオチド２５３３における制限エンドヌクレアーゼＩｔ
ｅｍ　［Ｉ　Ｋ対する開裂部位は、　ＶＰ−Ｉ　Ｍ白質
に対する終止コドンに対してヌクレオチド５０側分５′
ｌ側である。

１４９３におけるＨ１ｍ４厘部位と２５３３におけるｌ
ａｗ　ＨＩ部位との間が欠如したｇＶ４ＯＤＩ値を得る
良め、第１図に示しえような実験を行なった。

要するに１野性型の８Ｖ４０　ＤＮムを先ずシＬｌｌｌ
　ＩＩで開裂させて充分な長さの線状ｍ仇を得、次いで
これを各ｍ勉分子が平均して、１備のみの開裂を受け＆
　（８Ｖ４０　ｒ／ｈ全体には６１１１（ＤＨｉｍｄ　
Ｍｉｌｌｉ！部位が分布してい゛る）を受けるような条
件下で、ＨＩ　ａｄ璽によシ開裂し九、理論上１２種の
得られる消化ＤＮＡ混合物の１種は所属の１種の組合せ
である筈である０次いで、合成デカヌクレオチド、すな
わちｄＡＧｃＴＧＡＡＴＴｃ　（２参照）をこれらのＢ
ａｍ　ＨｌおよびｔｉＩｎｓｌ　Ｎ処理され九８Ｖ４０
　Ｄａに対しＨｌｍｄ　ｌ開裂部位の結合性末端（−Ｔ
ＣＧＡ）とｒカヌクレオチドの結合性末端とを介して結
紮させた６次いで、全混合物を桓ＲＩて消化しく添加ｒ
カヌクレオチｒ上のＩ＊＊　Ｒ１部位における結合性末
端を生ぜしめ）、そしてシ！および治ＲＩ（３参照）部
位を介してｐＢｇ　３２２中ヘクローン化させた。ＳＶ
４０配列を有するグラス＜ＰＤＮ人を制限分析（４参照
）によシスク１リーニンダし、規定した欠如部を有する
そＯ断片を単隨し、　ｐ８ＶＲと名付けた。

合成デカヌクレオチＰＯ添加には２つの目的がある。第
１Ｋ、添加デカヌクレ°オチドは制限エンドヌクレアー
ぜＷｏｏ　ＲＩに対する開裂部位を有し、この部位は８
Ｖ４Ｇ　ＤＮＡのこの部分に存在しない。

し九がって、ｉｅ、＠ａｌｌ　（５参照）中でｐ８ＶＲ
グラス＜ｆを繁殖させ、次いでエンドヌクレアーゼ見本
１１およびシュＨ！により開裂させることにより、多量
のむの１ｉＶ４Ｇ　ＤＮＡベクター断片を容品に得るこ
とかでらる。第２に、この添加デカヌクレオチドは、外
来遺伝子のコード配列を有する適切に作成されたＤＮＡ
をＩ＠＠　ＲＥ關裂部位を介して。

この８Ｖ４ＯＤＮＡに結紮させると、Ｈ１ｎ４厘開裂部
位とＶＰ−１１１白質に対する開始コドンとの間の本来
の物理的間隔を回復する（第３Ｂ図参照）。

８μｇのシラＨ！で開裂し素線状で完全な長さの８Ｖ４
Ｇ　Ｏ’）　イルスＤＮＡ　（ｅれ１１舒性型ＩＶ４０
つ４にスＤＮＡ　またはクローン化された８Ｖ４０　Ｄ
ＮＡをＢａｗｍＨＩを用いてｐＢＲ３２２のＢｉｍＨ１
部位にて開裂させて得ることができる）を２０ｍＭｔｙ
１ｍ−Ｃｊ（ｐＨ７，５）と６０ｍＭＮａＣＡと７　ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ２とを含有する反応混合物５０μＬ中にお
いて、２単位の引−４厘（ＩＩＲＬ）にょシ消化させた
。３７℃にて３０分間イン中エペーションした後、過剰
のｚＤＴムを添加して反応を止め。

反応俤合物をフェノール抽出によシ＃蛋白し、次いで工
・タノール沈澱させ虎０次いで、部分消化したＤＮＡを
１０　ｓＬのＴｇ緩衡液（１０ａＩＭｔｒｌｓ−Ｃｊ（
ｐＨ７，５）、１　ｍＭ　１０７人）中に再懸濁させ良
。

Ｈ１ｎ４１部位結合性末端をＩＣ＠・ＲＩ部位結合性末
端に変換させるため、先ず０．１　ｍ　ｗ＊ｏｊの合成
デカヌクレオチドｄＡＧｃＴＧＡム１ＴＣｔムＴＰを用
いて、５０　ｍＭりＩＪ　シｙ緩衡液（ｐＨ９，１）と
１０ｗｍｙＨｃｔ２と５　ｒｒＭ　ＤＴＴと０．　Ｓ　
ｍＭＡＴＰと１０単位の中ナーゼとを含有する反応混合
物１０声を中においてＴ４／リヌクレオチドヤナーゼに
よシ燐酸化させた。インキユベーシヨンを３７°０にて
１時間行なった。次いで、中ナーゼ反応混合物の１アリ
コート（３ｘＡ）を６６　ｍＭ　ｔｒｌｍ−Ｃｔ（ｐｌ
ｉ　７．５　）と６、６　ｒｎｋｌ　Ｍｇｃｔ２と１０
　ｒｄｉ　ＤＴＴと００５１１９．ｍのＢＡＡとＱ、　
５　ｙＭ　ＡＴＰと４ｓｇの引ｎｄ　ｌで部分消化され
喪８Ｖ４０　ＤＮＡ　（上記）とｉｏ単位ノ’ｒ　Ｊ　
ＤＮＡすＩ−ゼとを含有する結紮混合物（２０μＬ）へ
加えた。結紮反応の九めのイン中ユペーションを２０℃
にて約１６時間行なった。

納置され九ＤＮＡを制限エンＶヌクレアーぜシ１Ｒ１で
処理して、結紮リンカ−上にＥｅｅ　ＲＥ結合性末端を
生ぜしめた後、次いでこれをフェノールによって除蛋白
し、エタノールで沈澱させ、１５μｔの結紮混合物（上
記参照）中にてｐＢＲ３２２（０，５声＆＋）のｌａｗ
　ＨＩ−１＊＊　Ｒ断片に結紮させ、これを使用してＥ
、ｃｅｌｌ　２９４を形質転換させた。

次いで、これら形質転換体から単一されｆＦ−ｆラスミ
ドを種々の制限酵素消化によ〕適正な８Ｖ４ＯＤＮＡ断
片の挿入に関しスクリーニングし友。

ＨＩｌ＠Ａｇ構造遺伝子の単一 上記で作成したａＶ４ＧベクターをＩＩＩ肝炎ウィルス
の表面抗原（ＨＢｍＡｇ）をコードしている遺伝子を発
現するよう設計し喪０分子量２５，０００の４リペデチ
ドであるＨＢｍＡｇは通常複合粒子状構造（２２ｎ−粒
子）として存在し、これは部分的にダリコシル化されて
お〕、感東し大肝臓細胞の外部に分泌される（６参照）
０ 上記で作成した田ｒ４（Ｎフタ−においてＨ３−ムｇを
発現させるため、　ＨＢｉＡＨのコード配列を有する理
想的なりａ断片は次の秦件に一致する。第１に、このＤ
ＮＡは一方の末端部１１ＣＮｅ・ａＸ制限部位を有し、
他方の末端部にｌａｗ　ＨＥ部位を有する。第２に、　
　Ｎｅｏ　ＲＩ部位はＨ３祷ｇの開始コドンに対し直ぐ
５′側に位置し、したがってｖｐ−ｉ蛋白質におけるＡ
ＴＧの本来の位置を回復することができる。最後に、得
られ九組換体８Ｖ４０分子はその寸法において野性ＩＩ
　８Ｖ４０　Ｄａと同様であシ、ウィルス粒子中に効率
的に包封される。上記の条件を満たす良め、第２図に詳
細に示し九−運の実験を行なった。この作成の１つの重
要な特徴は、ＨｌｄＨの推定開始コドン（ムＴＧ）に対
し直ぐ５′儒Ｋ　Ｅｇｏ　ＲＩ制制限位を生成させるこ
とである。これは、合成１２量体（ム〒ＧらＧ■ＣＡＴ
Ｃ）を使用することにより行なわれ、この１２量体はＨ
ＢｓＡＨにおける開始コドンおよびそれに続く３個のア
建ノ酸に対応する配列であｆｉ、　ｆｆｉ、ｅｏｌｌＤ
ＮＡ／リメラーゼが単一鎖クローン化、　ＨＩＶ　ＤＮ
ＡからＤｌｊｌＡを合成するための部位特定的なプライ
マーである。適正に酵素処理し危機１合成りＮＡをクロ
ーン化ＨＢＶ　ＤＮＡと共に切粉−ぎ、完全ＨＢａＡｇ
遺伝子を再編成させ、処理されたベクターＤＢ１ｍは末
端に、規定のＥｇｏ　Ｒ１部位を再編成するためのＥ＠
・ＩＩＩ部位を有している。このグラスミドをｐＨ８９
４と名付ける。

ｐＢＲ３２２のＥｃｏ　Ｒ１部位中にクローン化し九Ｈ
ＢＶの完全ｒツムを含有するグラスミド（ｐＨＢＶ−７
−ＩＡ）から、ｔｌＢ−λｇをコードしている構造遺伝
子を回収した。このクローンはＶａｌ＊ｎｉｕ＠１ａ　
ａｔ　ａｌ（７および８参照）Ｋより最近発表されたと
同様な方法により得られた。

この構造遺伝子を２種の方法で変性し％０）開始人刊メ
チオニンコドンの前部Ｋｌ！ｉ的に独特な制限部位を組
み込み、かつ（２）　ＨＢｓＡｇ遺伝子から離れて位置
するＨＢＶ　Ｈｐａ　１部位をｐＢＲ３２２の充填され
たＥｃｏ　ＲＩ部位に平滑末端結紮させた。ＨＢａＡｇ
構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片に対するこれら２つの
改良は下記のようにして行なつ友： （１）　　先ず５０　ｐｇ　（Ｄ　ｐＨＢＶ−Ｔ−ＩＡ
　ＤＮＡを２００ｘＡの反応混合命中で酵素供給業＠（
ＢＲＬ）の反応条件に従って１（ｐａｌ（８０単位）に
よシ消化させて、１．７　ｋｂのＤＮＡ断片を得、この
ＤＮＡ断片においてはＨＢｓＡＨのコード配列に対する
開始コドンがセンス−ストランド（約４００　ｈｐ　）
の５′末端に近接位置する。この併仏をボリアクリルア
ｉｙｒル電気泳動法（ＰＡＧＩＣ）により精製した。次
いで、精製されたＨｐｍ　ｌ断片を１００μＬの反応混
合物（Ｎ＠ｖｌｃｎｇｌａｎ纏Ｂｉｏ１ｍｂ）中でλ工
午ンヌクレアーゼ（２単位）によ）３７℃で３０分間処
理した。λエキソヌクレアーゼは二重鎖ＤＮＡを消化す
る５′エキソヌクレアーぜである。この反応は１センス
−ストランド″ＤＮＡのＨＢｍＡｇコード配列から５″
側半分を分裂させ、アンチセンスストランドを露出して
添加プライマと対にする。λエキンヌクレアーゼ処理さ
れたｍ仏を除蛋白し、そして４〇−燐酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７，４）と１　ｍＭ　ＤＴＴと５０ＡｇｌＲＩ　
ＢａＡと＠　ｍＭ　ｋＣＬｚと０．５−各ｄＮＴＰと０
、２　ｎ　ｒｎｏＬのｄＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣ（／
リヌクレオテドキナーぜにより５′末端において、５２
標識したもの）とを含有する反応混合物５０μｔに再懸
濁させた。この混合物を先ず９０℃で１分間加熱し、Ｏ
υで３０分間アニールし、次いで２単位のＥ、ｅ・■Ｄ
ＮＡ　＆リメラー七′°ｉクレノー断片（９参照）の存
在下に３７℃で３時間イン中ユペートした。このｍ仏ポ
リメラーゼは添加プライマーによシブライムされたＤＮ
Ａを合成し、かり３’−０１’ｌ末端を有する単一鎖Ｄ
ＮＡを分裂させ、したがって、平滑末端化ＤＮＡ分子を
生成した０次いで、得られたＤＮＡを除蛋白し、　ＨＢ
ｓＡぎ遺伝子内に位置する部位にてＸｂａＩ（４１５単
位）により１００μＬの反応混合物中で消化させ、そし
てＰＡＧＩ　Ｋより分画した。ＰＩ３ムぎ遺伝子の最初
の３０個のコドンを有する９１塩基対のＤＮＡ断片をオ
ートラジオグラフィー検出法によって単離した（断片ム
）。

Ｈ！ｌｍＡｇ遺伝子の直ぐ５′側に独特な制限部位を生
成させるため、プラスイドＰＢＲ３２２の誘導体（いわ
ゆる１）Ｎ（！Ｖ　）を利用した。この誘導体はＥｅｏ
Ｒ１部位に位置する配列： ムムＴＴＣＴＧＣＡＧ ＧＡＣＧＴＣＴＴＡ人 を有する合成りＮ＆上セグメント含有する。この合成諏
ム配列中に％Ｐａｔ　１部位をＬｌみ込んだ・１０５ｇ
のｐＮｃＶ　ＤＮＡを先ず１００　μｔの反応混合物中
で２４単位のＰａｔ　Ｉ酵素によって切断し、次いで上
記と同様な反応混合物５０μを中で２単位のＥ。

Ｃｏ１１ＤＮＡポリメラーぜクレノー断片によって８℃
にて１時間処理した。このＤＮＡ−リメラーゼ処１１は
Ｆ’ｓｔｌ消化によシ生成されｆｃ４個の塩基対３′オ
ー・噌−ハングを除去して、完全なＥ＠ｏ　ＲＩ制限部
位を有する平滑末端ＤＮＡを残し、ＰＢＲ３２２の複製
のオリジンを含有する断片Ｂを与えた。上記のように調
製された平滑末端ＨＢｍＡｇ遺伝子断片色を、断片％０
ＫｃｅＲＩ部位に結紮させた。これは、！ラスミドｐＨ
８９４を生成させるための３ｖＩＴ片結紮において行な
った。第３の断片（Ｍ片Ｃ）は次のように調製した： 口）　デ５　Ｘ　ｉ　Ｗ　ｐｌＢＶ−？−１１からＯＨ
ｌｓＡｇ遺伝子をＨ１ｓＡ１造伝子から離れ九部位にお
いてＨｐａｌによ〕開裂させ良。こ０Ｈｐａ１部位を予
かしめｍ仏４リメラーＶ≠クレノー断片（９参雇）が充
填されている９８ｍ３２２の鳶・・ＲＩ辞位に結紮させ
た。これはｐｌＲ３２２ｔ）誘導体をナックローン化し
てｐｕｓ　４２を生じしめることによ）行なわれえ。

このプラス建ドをＸｂ＠ｌ（これはコドンＢ１ｔＣおい
て開裂を行なう）とＢａｍＨＩ　　（これはｐａｌ　３
２２（）Ｉｉ＠ｓＲ１部位から３７５０塩基対を開裂す
る）によって開裂させ、殆んどのＨＢｍＡｇ遺伝子と、
このＨ１ｍＡｇ遺伝子から離れ友釣１５０（１０塩基対
と、プロモータ／オペレータと、テトラナイタリン耐性
遺伝子の最初の２００１１０塩基対とを含有するＤＮＡ
断片を生成させた。ＸｂａｌおよびＢａ論に！によシ限
定されるＤＮＡ断片ＣをＦＡＧ罵によ）単離し、これを
上記の３断片結紮に使用してグラス＜ｒｐＨ８９４を生
成させ走（第２図）。

ＨＢ・Ａｇを合成しうる組換体８Ｖ４０　ＤＮＡの作成
サル細砲をトランスフェクションするよう適正に結紮さ
れたＤＮＡを多量に得るため、結紮ＤＮＡを次のように
してＬｙｅｌｌ中でクローン化した。第３図に示したよ
うに、　ｐ８Ｖ’Ｒカラ１２）　５Ｖ４Ｇ　ＤＮＡを含
有するｌａｗ　ＨＩ乃ｆｉｌｅｅＲＩ断片を、先ずｐＨ
８９４からの肝炎表面抗原を有するＥｅ・ＲＩ乃至１１
＆ｍＨＩ断片Ｋ、その４１１（ＩＲＩ部位を介して結紮
させ、得られた断片を次いでｐｌＲ３２２のＢａｍＨＩ
部位にクローン化させ良。

次いで、適正に作成され九ＤＮ＆、ｐ８ＹＨ１８Ａを制
限エンドヌタレ７−ゼｆｌａｗ　ＨＩで開裂させて５３
８２傭のヌクレオチド０ＤＮＡ断片を生成させることが
でき、このＤＮＡ断片はそのＶＰ−１蛋白質のコード領
域が肝炎表面抗原をコードしている遺伝子により交換さ
れて−る組換体８Ｖ４０　ｌ”ツムよりなっている。

ｐｓＶＨｌｕ　ＤＩ’ｌｉＡを作成するため、ＢｍｍＨ
１＋Ｅａ。

Ｒｘで消化され＆　９８ＶＢ　ＤＮＡからの讃値断片を
含有するＳＶ４０　ＤＮＡ　Ｏ，３７７ｇと、ＢａｍＨ
Ｉで消化されたｐＨＢＶ−Ｔ−ＩＡ　ＤＮＡ　（詳細な
構造についテハ第２図参照）からのＤＮＡ断片を含有す
るｐｌＲ８２２５０ｎｇと、ＢａｍＨＩ＋ｇｃｏＲ１で
消化されたｐｉ（８９４からのＤＮＡを含有するＨＢｓ
Ａｇ　　コード配列０．２μｇとを１５．ｍｔの結紮混
合物中において、それらの各ＢａｍＨＩおよびＥＣ＠Ｒ
Ｉ部位を介し、’ｒ　４　ＤＮＡリガーゼにより１晩イ
ン午ユベーシヨンして結紮させた。１つの種類の適正に
結紮されたＤＮＡ生産物はｐＢＲ３２２の完全なｔ・−
遺伝子を再編成し、したがってベクターＤＮＡの自己結
紮から生じた多数のｔ＠ｔ“組換体からｔ＠ｌ”によシ
選別することができる０次Ｉｎテ、ｐ８ＶＨＢ８Ａｏ構
造と制限ｌｌｌｌｌ化によって証明した。

この種のベクター系中における肝炎表面抗原の合成の効
率を試験するなめ、　　ＢａｒｍＨｌで膚裂され虎）！
ＩＶＩ（ｆｌｕ　ＤＮｋをＤｔＡＩＦ？２）ラン法（１
１参照）Ｋよシ単層ｃｖ−１細胞（１０参照）中に導入
し、細胞をｔ−ム２８もしくＦｉｔｓλ５８ウィルス（
１２参照）のいずれかにより感染させた０次いで、この
単層ＣＶ−１細砲を適正な培養条件下で４１℃にてイン
ｄＰエペートし九（１１参照）。を−人２８とｔ−Ａ３
８との両者ｌ１ｉ１１Ｖ４０　　丁抗原におりて温度感
受性Ｏ央然変異株を示し、したがって４１℃にて増殖す
ることができない（１参照）。同様Ｋ、組換体８’Ｖ４
０　ｒ　／　Ａ　（ｐｆｆＨｌｌｓＡ）Ｏ−）を含有す
＆ＣＶ−１細胞は、？１１引１がｖｐ−を遺伝子を欠如
するため、感−性ウイルスを生成しない、予想した通り
、ｔｖ８Ｖ４０ウイ羨ヌと組換体８Ｖ４０１”ツムとの
両者を含有するＣＶ−１細施においては、４日後に細胞
変性効果が観察された。インキエペーシ冒ンの２週間後
に完全な溶菌が観察され喪、！ｌ換ｍ５ｖ４ｏｒツム１
走ｄｔｓ８Ｖ４Ｇウィルスのいずれか一方のみを有する
ＣＶ−１細亀においては細胞変性効果は綱察されなかっ
たｅ　ｔｔＢａＡｇ　Ｋ対する一般的なラジオイムノア
ツセイ（１３参照）を用いて、培地中の表面抗原産生を
ＤＮＡの導入４日後できるだけ早く検出し九〇定量分析
が示したところではＩ　Ｘ　１０個の単層ｃｖ−１細胞
ｔ；ｊ　３．８　μｇ　ＯＨ８８１ｇを各感染サイクる
ＳＶ４０　ＶＰ−１蛋白質分子の推定個数に殆ど同一で
ある。

［Ｉ　ＳＶ４０　ｃツムがＳＶ４０ウィルスと同様にｃ
ｖ−ｘ＃ａ！胞中に封入されているかま九は繁殖してｈ
るかどうかを決定するため、　　ｃｖ−ｉ細胞のプレー
トに元来の共感染され念細胞からの溶菌物のアリコート
とｔｓ８Ｖ４０ウィルスとを４１℃にて感染させ九。感
染し念細胞からの低分子量のＤＮＡを感染の７２時間後
に・・−トの方法（１４参１１１）Ｋより単離した。単
離したＤＮＡを処理しないか、或いは制限エンドヌクレ
アーゼで開裂させ、セしてアガロース上でのｒルミ気泳
動によシ分画し友０次いで、分画され′ｆｉｃＤＮＡを
変性させ、サウデーンの方法（１ｓ参照）Ｋよりニトロ
セルロース紙に移シ、シ５！−標１１１ｋ　Ｐｌｌｌｌ
　１１４１）ＮＡテｆ　ｏ　−ｆ　Ｌ＆　＊　ＨＩＥ　
７　ｍから判かるように％肝炎遺伝子配列を有する組換
Ｄａ分子は、殆ど８Ｖ４ＧウィルスＤＮ人（レーン人）
から区別できない寸法の閉１１ＤＮＡとして存在する。

大部分の組換Ｄａは生体内（１ｎマ１マ・）結紮により
そのｌａｍｌｉ１部位を再生する（レージＢ）、予想通
り、ＩＩＩ肝炎表面抗原のコード領域を含有するｌａｍ
−）３ｅ＠ＲＩ断片（１１３図参照）ｔｌｊ、未変化の
形態で単離することができる。

全面の９０−１で繁殖したＣＶ−１細胞＋２）Ｉｓ（Ｃ
＋ｓグレートに、元来のトランスフエクシ爾ン実験から
調製されえ溶菌物（組換体とｔａＡ　２８ウイルスとを
含有する）を感染させ、過剰のロム２８ウイルスを補充
しえ後４１υにてイン中ユペートした。

感染後７０時間で培地を収猥して合成されたＨＢｓ＆ｇ
を特性化した。さらに、細砲内低分子量ＤＮＡをハート
の方法（１４参照）Ｋ従がって単離し食、この単離され
＊ＤＮＡをｔｒ　ｉ　５−ＣＡ（ｐＨ７，４）、ｌｔＩ
ＩＭＥＤＴムを含有する緩衝液１１ｊ中に再ｍ濁させた
０次いで％５ｓＬＯ未切断ＤＮＡと５　ａｔＯＢａｎ　
Ｈｌで消化されたＤＮＡとをＴＢＥ緩衡液中のａ、ＳＳ
Ｓアロースダルにより電気泳動で分画し、さらＫ　８Ｖ
４０　ＤＮＡもコントロールとして同様に処理し喪。ｒ
ル上のＤＮＡ／◆ターンをニトロセルロース紙のシート
ニ移しａ　ＨＢｍＡｇ遺伝子！ローツノースとしてｐ　
−標１１ｐＨ８９４ＤＮＡ（１５参照）Ｋハイゾリダイ
ズした。第７図は、ハイツリダイぜ−シ璽ン後のｐｌ−
標１１１　ＰＨ８９４ＤＮＡのオートラジオグラフィー
像を示している。レーン人および１ｔｌｊ、それぞれ未
処理のハート上澄液およびＢａｎ　ＩＩＩで消化され大
ハート上澄液のＤＮＡである。１．１および厘は、コン
）　ｏ　−ｓ−８Ｖ４０　ＤＮＡ　Ｏｌ型、厘厘および
ｌｌｌ０位置を示し、それらの位置ｒｆＤＮ人をニトロ
セルロース紙に移す前にエチジウムブロマイド染色によ
シ決定した。

肝炎表面抗原は合成されて、感染肝臓細胞から粒子とし
て分泌される（６参照）、各種のクローン化肝炎ＤＮＡ
の配列分析は、成熟表面抗原が大型先駆体蛋白質から開
裂されうる可能性を示唆している（８参照）、成熟Ｈ１
ｌｅ五ｇ分子グラス１つかの３′末鴻未■訳配列をコー
ドしているＤＮＡのみが上記の作成において８Ｖ４０ｒ
ツム中に組み込まれるので、問題とする先駆体ペプチド
が’ｌ　２　＊ｖｍ粒子を組み立てる際に、および細胞
からのその分泌の際に機能的役割を演するかどうか疑問
である。この目的で、合成し危肝炎表面抗原をその性質
につき沈降速度、沈降平衡、および電子顕微鏡検査によ
シ標準蛋白質と比較して特性化した。第８図に示される
ように、このベクター系で合成された肝炎表面抗原は感
染肝臓細胞系の培地から単離された肝炎表面抗原（１７
参照）とは区別しえない沈降速度を有し、１．２２９／
Ｃｄ　　の浮遊密度を有し、これも標準表面抗原２２　
ｎｍ粒子と同様であった（６参照）。精製された表面抗
原の電子顕微鏡による検査も平均直径２２０ス（２２ａ
ｍ　）の主として粒状の構造を示し、形態学的に標準２
２　ｎｍ粒子と同一であり光（第８および９図）、シた
がって、成熟肝炎表面抗原蛋白質モノマーｔ’２２２　
ｎｍ粒子の組み立てに必要とされる肝炎ウィルスにニジ
コードされている唯一の必須構造成分である。

Ａ、　　ＣＶ−１細胞で合成され７ｊＨ１ｓＡｇの沈降
速度とへ・タトーマ細胞系ＰＬＣによシ合成かつ分泌さ
れ九ＨＢｍＡｇ（１７および１８参照）の沈降速度とを
比較した（第８人図）、第７図に記載した実験から収穫
された培地を、ＨＢｍＡｇの原料としてこの実験に使用
した。　ＰＬＣＪｌｌｊｉｌ系によシ産生されたＨＢ−
λｇ（１７および１８参照）を培地から収穫した０両カ
ルチャーからのＨＢｍＡｇを先ず４５−飽和硫酸アンモ
ニウムで沈澱させ、かり２０ｏｉＭｔｒ１ｇ−ｃｔＣｐ
ｎ　７．４）とＯ，Ｓ　ｍＭ　ＩＤＴＡと０．５　ｍＢ
Ｊ　ＮａＣＡとを含有する緩衝液中に再懸濁させ良（Ｈ
ＢｍＡｇの最終層＊Ｑ、Ｓｓｇ／１１４＞　＄　２００
ｓＬの各試料を同じ緩衝液中０２つの／中うレルの５ｊ
１１ｊＪＩＩＩＩＩ濃度勾配（５〜２０−蔗糖）Ｋ装填
した。ペックマン（１＠＠ｋａ＋ａｍ）Ｉｆ　５ａｌ　
ｌｌａ　　Ｉ　　Ｋテ４５．ＧＯＯｒｐｍ　”ｔ’遠心
分離を４℃にて８０分間行なった。市販のＨＢｍＡｇ分
析中ツト（ム１１１ｒ１ａ厘−１２５、Ａｂｉｒｏ、Ｉ
ｔ　Ｌａｂ　）を用いてＨＢｍＡｇを検出し良、　Ｈ１
ｅｓムｇの回収率は常に８Ｇ−以上であつ友。

Ｂ、ｅＶ−１細鞠で合成されたＨＢｍＡｇの浮遊密度を
槻定し光（第８３図）。ｌ−ルし九感東カルチャー培地
からＯ■酪１ムｇ　２　ａｇを４５−飽和硫酸アン４ニ
クムで沈澱させ、アｆロースｒル侵透カラム（人＆ＯＭ
、Ｂ量・−１１ａｄ）上で分画し、次いでム項で記載し
大通シ５〜２０１１糖１１度勾配によシ沈降させた。！
［糖１１度勾配遠心分離の後、ブールし光ＨＢｓＡｇｔ
−虐糖を含まない濃度勾配緩衝液に対して透析し、次い
で固体のＣ５ＣＬを加えて最終密度１．２ｊｌ／＊＊Ｏ
溶液（ｆｌｕ）１４え＊ａｈ　で、これをツル７４−ｈ
　（８＠ｒｖａｌｌ）　Ｔ　８６［１型ローターにおい
て５０，０００ｒｐｔｍで６８時間遠心分離し九。

次いで、Ａ項に記載したと同様に分析を行なった。

ＣｍＣＬ濃度勾配におけるＨＢｍＡｇＯ［ｌ収率は約７
０−であった０次いで、ピークフラクシ璽ン（１１分）
ｆ：ｆ−ルし、　　１０　ＥＩＩＭ　Ｔｒｉｓ　ＣＬと
１００　ｗａＭ　ＮａＣｊとＯ１ｓ□ＩＣＤＴム緩衡液
に対して透析し、員縮し、そして電子顕微鏡検査のため
の試料を調製し喪。

電子顕微鏡写真用の抗原を調製するため、炭素被覆した
鋼グリッドを作成した。　ＨＢｌムｔｉｔ白質（１ｐｚ
Ａｄ　）を含有する緩衝液１滴をグリッド上に室温で３
０分間載置した。＊白質溶液をグリッドから＃Ｓ径方向
に吸い取り％４滴のＨ，Ｏで１回洗争した０次いで、こ
のグリッドを１．０ｓホスホタンダステン酸ナトリウム
（ｐＨ７，６）で１分間染色し、そして−紙によシ乾燥
させた０次いで、Ｐｈ１ｌｌｌｐｓ　ＬＭ、　４０　Ｇ
型によシ倍率７７７００ＭＫて電子顕微鏡写真を撮つ喪
、これは陰画を与え、これから第９図に示すように拡大
して（約１０倍）陽画を作威しえ。

組換プラスミドを作成したが、このプラスミドはｌラス
建ドｐＭＬ　（２１参照）から生じ九ｐＢＲ３２２配列
と％ＤＮＡ複製のオリジン領域と初期および後期の両方
の転写単位に対するプロモータ配列とからなる８Ｖ４０
　ＤＮＡの３１４８塩基対と、ＨＢｓＡｇ用の遺伝子を
コードしているＨＢＶ配列とを含有するｅｌｌＶ４０ｏ
ｒリジンは、ＳＶ４０　ＤＮＡをＢｉｎｄ璽により消化
させ、かりＨ１ｎｄ１ｓ端をコンバータ（人ＧＣＴＧＡ
ＡＴＴＣ）の添加によりＥｃｏ　ＲＩ末端に変換させる
ことによシ単離した。このＤＮＡ　ｔｐｖｕ　ｌで切断
し、かつ翼！リンカ−を加えｆｅ＊Ｅｏ・ＲＩ　でＯ消
化の後、オリジンにわ虎る３４８塩基対断片を４リアク
リルアきトグル電気泳動および電気溶出によって単離し
、　　ｐＢＲ３２２にクローン化させた・ＨＢＶのＥａ
ｏＲｌおよびＢｇｔ璽での消化から生ずる１９８６塩基
対断片（２２参照）（これはＨＢｍムぎをコードしてい
る遺伝子にわたる）をＥ・・ＩＩおよびＢａｔｓ　Ｈ１
部位にてプラスミド１１１１．　（２１参照）中でクロ
ーン化させるととＫよシ、発現プラスミドｐＨＢｓ　３
４８−鳶およびｐＨＢａ　３４８−Ｌを作成した。

（ｐ凪ａサル細施におけるグラス建ド複製に対し抑制的
である配列を除去する欠如部を有するｐｌｉＲ３２２の
銹導体である（２１参照）、）次いで、得られｆＦ−プ
ラスミド（ｐｉｌｌ−１１ｔＡ）をＩｃ＠＠ＲＩＫより
て線状化させ、そして８Ｖ４０オリジン領域を示す３４
８塩基対断片をｐＲＩ−Ｂｇｊ　（Ｄ　ｌ＠ｅ　ＲＩ部
位に導入し九。

オリジン断片は、いずれの配向性でも挿入することがで
きる。この断片は複製のオリシンに加えて初期および後
期の５Ｖ４０７”Ｅｌモータの両者をコードしているの
で、■ｌｖ遺伝子はこの配向性に応じていずれかのプロ
モータの制御下に発現させることができる（　ＨＢｍを
代表するｐＢＲ８３４８−Ｅは初期プロモータの制御下
で発現され、かりＨＢｓを代表するｐＨＢｍ　３４８−
Ｌは後期プロモータの制御下で発現される）。

Ｃ０８−７系ｆル細胞におけルＨＢＶ−８Ｖ４０組換プ
ラスミドの複製を次のように行なった： ＤｉＡＥ−デ午ストラン技術によるＤＮＡ　）ランスフ
エクションの後の椎々の時点で、低分子量のＤＮＡを・
・−トの方法（１４参照）Ｋより単離し、アブロースグ
ルでの電気泳動により分画し、そしてサウデーンのプロ
ントノ１イ！す〆イゼーション（１５参照）によって分
析し喪。第４図Ｉｔ、　　）ランスフエクション直後に
殆んどｔ＆は全くスー・臂−コイルプラスミドがＣＯ８
細胞中に存在しないことを示している。しかしながら、
トランスフェクション０３日後、投入し九ＤＭの著しい
複製がｐＨ８−３４８−Ｌ　ＤＮＡ　（レーンｂ）を九
はｐＨＢａ　３４８−ｍ　Ｄ隘のいずれかの導入の後に
生じた。予想通り、プラスミドｐＲＩ−Ｂｇｊ　（これ
は８Ｖ４０オリジン配列を欠如しているが、その他の点
では上記の発現プラスミドと同一である）のトランスフ
ェクションの後プラスきド複製は全く観察されなかった
（レーンａ）。

ＤＩＡＩ−デキストランおよびＤＮＡに対する細胞の処
理および露出時間を１２時間に増大させることによｊｌ
）ＤＩｕＫ−デキストラン法（１１参照）を改変シテ、
ｆ　９　ス（Ｐ　ｐＭＬｈ　ｐＲｘ−Ｂｇｊ　ｓ　ｐＨ
１ｓ　３４８−鵞およびｐＨＢｓ　３４８−ＬをＣｏ　
８−７系ナル細胞（２３参照）中に導入し九、とのＣ０
８−７細施系は８ｖ４０の初期領域の一律化コピーを有
し％８Ｖ４０ム遺伝子産生物（Ｔ抗原）を構成的に発現
する＠　ＢＶ４ＯＤＮＡ複製の機能的オリジンを含有す
るｌラスミドは、８Ｖ４Ｇ？抗原の存在下にサル細胞中
で複製することが示され九（２０，２１参照）。第５図
は、ｌラスミドｐＨＢｓ　３４ｇ−ＩＣ゛およびｐＨ８
８３４８−ＬでトランスフェクトしたＣ０８細胞が２日
目までに著量のＨＢｓＡｇを発現し始め、２週間以上に
わ光シ発現し続ける仁とを示している。ｐＨＢ１３４８
−Ｌによシ指令される発現のレベルはｐＨＢｓ　３４８
−１ｅによ〉指令されるレベルよシ若干高い。１これら
の結果の１つの解釈Ｆｉ、後期Ｏ８Ｖ４０ゾロ篭−夕が
この系においては初期プロモータよシ有効になりうろこ
とである。

組織培養で誘導されたＨＢｓＡｇは動物において免疫原
性である。

組織培養から得られｆ５　ＨＢｓＡＨの粒子は抗原活性
であることを示したが、これら粒子が動物において免疫
原性であるかどうかを決定することが望ましい。したが
って、　Ｃｏ５−７細胞により産生された抗原を硫酸ア
ンモニウム沈澱を蔗糖＃Ｉ度勾配遠心分離とＣ＊ＣＬ密
度勾配遠心分離との組合せにより精製した。組織培養で
得られｆｔ−ＨＢｓＡｇを各！ウスニ注射する一方、コ
ントロールマウスをヒト血清から得られた市販のＨＢｓ
Ａｇ　（Ｎｏｒｔｈ　Ａｔｎ＠ｒｌ＊ａｎＢｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌｓ　Ｉｍ＠、）の同量で免疫化し虎０次いで、
免疫化の後の種々の時点で、抗−Ｈ１参Ａｇのタイター
を決定した。！６図は、抗−Ｈｌｌ５ムｇの着量のタイ
ターが標準ＨＢｍＡｇで免疫化したマウスならびに組織
培養で得られ九■ＢｓＡｇで免疫化しえマウスにおいて
現われたことを示している。さらに、組織培養から得ら
れたＨＢ−五ｇで免疫化したマウスでの抗−ＦｒＢｇＡ
ｇ抗体現出の動力学およびタイターは標準ＨＢｓＡｇで
免疫化し大マウスでの観察とは区別できなかった。した
がって、結論として、組換ＤＮ人技術によりサル細胞中
で合成されｆｃＨｌｍＡｇは、同一と言わないまでも、
免疫原性においてヒト血清から得られたＨＢｓＡｇと類
似であり、そのワクチンとしての効果が充分に示された
。

薬剤組成物 本発明のへ上物を公知方法によシー合して薬剤的に有用
な組成物を製造することができ、それによシこの４リペ
ｌ？ドを薬剤上許容しうる担体ベヒクルと混合する。適
するぺしクルおよびその配合はＥ、Ｗ、Ｍａｒｔｉｍに
よｌ）　Ｒ＠ｍｌ’ｍｇｔｏｎのＰｈａｒｍａ−＠・ｗ
ｔｉ＠ａｌ　８ｓｔ＊ｍ・・に記載されており、これを
参考のためここに引用する。この種の組成物は有効量の
ボ＋）−４ｆチド産生物を、宿主に対し有効投与するの
に適する薬剤上許容しうる組成物を製造するための適当
量Ｏ担体ベヒクルと混合して含有する。１つの好適な投
与方式は非経口ルートである。

適する動物衛生製剤は、必要に応じ変更を加えて、ｌＩ
＠組成物の場合と同様に調製される。

ワクチｙ製造 本明細書中に記載したように製造した適するＩリペデチ
ドを混入し九本発明のワクチンは、公知方法に従がって
調製することができ、ここでこの４リペグチドを適する
ベヒクルと混合する。適するベヒクルは、たとえば食塩
溶液、各種の公知アジユバント、を虎はウィルス感染を
予防する九め使用される組成物に使用するための当業界
で認められ良その他添加物を包含する。この種のワクチ
ンは有効量のＩリペｌチドと、宿主に対し有効投与する
のに有用なワクチンを製造するための適当量のベヒクル
とを含有する。これについては、文献「ワクチンにおけ
る新友な傾向および一発」編集者人、Ｖ＠ｌｌ＠ｙおよ
びＨ，Ｆｒｌ＠ｄｍａｍ、ＵｍｉｖｓｒｓｌｔｙＰａｒ
ｋ　Ｐｒ＠ｓｓ、Ｂａｌｔｉｍ＠ｒｅｅ１９γ８を参照
することができ、これをワクチンの製造に関するさらに
詳細な背景を示すため参考としてここに引用する。

これらワクチンの活性成分を製造する方法が独特である
九め、このワクチンは実質的に外来蛋白質ならびにその
他のウィルス性および細胞成分を含有しないと思われる
。し九がって、これらワクテンは完全に死滅し＋、ｔた
は不活化されたウィルスワクチン製剤の副作用を殆ど生
じないと思われる。

上記の説明から木兄Ｆｇｉは、たとえば目的とするポリ
ペｆｆＰ産生物の選択にとけるように、ことに記載した
好適具体例のみに限定されないことが当業者には明らか
であろう。

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２＝２．ムｍ１ｍａｌ　　Ｖｉｒｕｓ　　Ｇ＠ｍ＊ｔｌ
ｃｓ　　（Ｉｄ、Ｆｉ＠１ｄｓ。

ハｅｍｉｓｓｈおよびＦｏｘ）、Ｃｈａｐｔ＠ｒ　Ｌｊ
ｌ　ｓ’ｙ。

人ｅａｄ＠ｍｉ＊　　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、（１９８０
）。

２ＬＧ１ｕｉｍａｎ、Ｃ＠ｌｌ　２３，１７５　（１９
８１）。

【図面の簡単な説明】

第１図はｖｐ−１蛋白質をコードしている領域が欠如し
たＳＶ４０　ＤＮＡを含有するプラスミドｐｓｖａの作
成を示す図、第２図はＨＢｓＡｇ　ＤＮＡを有するプラ
スミドｐＨ８９４の作成を示す図、第３図は８Ｖ４０お
よびｐＢＲ３２２から霞導されたＤＮＡ配列並びにＨＢ
ａＡｇ　ＤＮＡを含有するプラスミドｐ８ＶＨＢｓＡ　
の作成を示す図、第４図はサル細胞におけるｌラス建ド
ＤＮＡの複製を示す図、第５図はＣ０ＩＩ細胞におけ図
はこの組換体ベクターを介して合成したＨＢａＡＨの蔗
糖濃度勾紀沈降の結果を示す図、第８Ｂ図はその対応す
るＣｓＣ１ｍ１ｆｔ勾配遠心分離の結果を示す図、＃！
９図は本発明に従がって２２１誼子として合成されたＨ
ＢｍＡＨの電子顕微鏡写真である。 代理人弁璽±４　　本↑　　　　′ ｂ 日 メツλ９．５ ２ａフロ、６ ｏ発　明　者　チュンーチェン・リューアメリカ合衆国
カリフォルニア ９４０６６サン・ブルーノ・ラスン ・ドライヴ２２１ ＠発明者　　ダニエル・ジー・ヤンスーラアメリカ合衆
国カリフォルニア ９４１３４サン・フランシスコ・ビ オチェ１２５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　−リベプチドをコードしている複製可能な発
   現ベクターを内包しておシかつこのベクターの発現によ
   〕前記ポリペプチドを産生しうる脊椎動物形質転換細胞
   カルチャーの製造方法であって、（ａ）　　宿主細胞カ
   ルチャー中で複製しうるＤＮＡ　）ランスファーベクタ
   ー断片を調製し、 ｃｂ）宿主細胞カルチャーに対し適合性の！ロモータを
   含むＤＮＡｌｌｙ片を調製し、 （＠）工程伽）の断片と結合するのに適しておシ、かつ
   前記４リ−ｅｆｆＰをコードしている聾は断片を調製し
   、 （−工程ら）、伽）および（＠）の各断片を、追歯に配
   置され九転写終止部位、／！ｊＡ付加配列並びに翻訳開
   始および停止信号と組合せて、複製可能な発現ベクター
   を形成し、工程（−）の前記配列は前記！ロモータの制
   御下にあ〕、 （・）工程（ｄ）のベクターによｊｌＦ椎動物細胞カル
   チャーを形質転換することからなる零椎動物形質転換細
   胞カルチャーの製造方法。 （２）（ｆ）　　ＩＦ椎動物形質転換細胞カルチャーを
   通常の条件下培地中で前記ポリペプチドが産生される壕
   で成育させ、 ω　前記Ｉ９ベグチドを回収する付加１椙を含むことを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （３）工程（１）の断片が微生物宿主において表現型１
   択し得ることを特徴とする特許請求の範囲第１１Ｍに記
   載の方法。 （４）工程（ａ）のＤＮＡベクターが複製のオリジンを
   含有する８ｖ４０ベクターからなることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の方法
   ・ （５）工程（、）の零椎動物細胞カルチャーが（Ｖ−１
   系ナル腎臓繊−芽細胞であることを特徴とする特許請求
   の範ｉ！Ｉ第１項に記載の方法・ （６）　　工１！（＠）の脣椎動物細胞カルチャーがＣ
   Ｏ３−７系ナル腎臓繊維芽細胞であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （７）／９−Ｃ７”チドが前記培地中に分離粒子形態で
   分泌される１型肝炎表面抗原であることを特徴とする特
   許請求の範囲第２項乃至Ｃ６項のいずれかに記載の方法
   。 （８）　　−り（デチドをコードしているＤＮＡ配列お
   よび形質転換細胞に対し適合性の発現ゾロモータからな
   る複製可能なりＮＡ発現ベクターと、細胞カルチャーを
   栄養的に支持する友めの通常の培地と からなｐ前記配列は翻訳開始および停止信号と共に前記
   ベクター中で前記７”ａモータの制御下に配置されてお
   シ、前記Ｉリペプデドをブードしている複製可能な発現
   ベクターを内包しておにかつこのベクターの発現によシ
   前記ぼりペプチドを産生しうる脊椎動物形質転換細胞カ
   ルチャー・（９）ＣＶ−１系サル腎臓繊維芽細胞を形質
   転換して得られることを特徴とする特許請求の範囲第８
   項に記載の細胞カルチャー。 （ト）　Ｃ０８−７系サル腎臓繊維芽細胞を形質転換し
   て得られることを特徴とする特許請求の範囲第８項に記
   載の細胞カルチャー。 （１１Ｂ型肝炎ウィルスに対する免疫原性を感受性のと
   ）Ｋ付与し、まえはそのためのワクチンを製造するため
   の特許請求の範囲第２項に記載の方法により製造される
   Ｂ型肝炎表面抗原の使用。 （２）特許請求の範囲Ｃ１項または第２項に記載の方法
   の生産物。 ｏ３　　簿椎動物形質転換細胞カルテ←中ｍて、発現、
   担当ゾロモータの適正な解読枠制御下にポリ−（デチド
   を発現しうるＤＮム発現ペタター。 ６４　　ｐ８ＶＨ＊ｍＡ、１８８ｍ３４Ｂ−ＥｋＸＵｐ
   ｋｉＢｍ７３４Ｂ−Ｌヨｐなる群から選択されることを
   特徴とする特許請求の範囲第１３項に記載のベクター・ （２）　ｍｍ肝炎表面抗原を発現しうろことを特徴とす
   る特許請求の範囲第１３項または餉１４項に記載のベク
   ター。 ０４　−リペプテＰをコードしている複製可能な発現ベ
   クターを内包している奏椎動物細胞カルチャー中で前記
   ベクターの発現によｌＩ産生されるｍｍ肝炎表面抗原か
   ら１！にゐ約２２　ａｍの粒子。 的　前記カルチャーからその培地中へ分泌されることを
   特徴とする特許請求の範囲柄１６項に記載の粒子。