NO165598B - Fremgangsmaate for ekspresjon av hepatitt b overflateantigen i cellekultur samt ekspresjonsvektor. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for ekspresjon av hepatitt B overflateantigen i cellekultur. Det anvendes her rekombinant DNA-teknologi. Oppfinnelsen angår også en ekspresjonsvektor som innbefatter en DNA-sekvens som koder for endelig hepatitt B overflateantigen (HBsAg) uten noen forløpersekvens. Ved utførelse av fremgangsmåten så blir HBsAg-et tilført til kulturmediet i partikkelform på ca. 22 nm og inneholder antigendeterminant(er) fra hepatitt B virus (HBV). Det fremstilte hepatitt B overflateantigen egner seg for anvendelse ved fremstillingen av vaksiner mot hepatitt B-virus.

Publikasjonene og annet materiale som i foreliggende sammenheng er brukt for å vise den tekniske bakgrunn for oppfinnelsen, og i spesielle tilfeller for å gi ytterligere detaljer vedrørende dens praktisering, er for hensiktsmessig-hetens skyld referert til ved hjelp av nummer i den etter-følgende tekst, og samlet i bibliografien tilslutt i beskrivelsen.

A. Rekombinant DNA- teknologi

Som en følge av tilkomsten av rekombinant DNA-teknologi, er den kontrollerbare mikrobielle fremstilling av en rekke nyttige polypeptider blitt mulig. Mange virveldyrpoly-peptider, slik som humant veksthormon, humant proinsulin, desacetyltymosinalfa 1, humane og hybride leukocyttinter-feroner, humant fibroblastinterferon, samt et antall andre produkter, er allerede blitt fremstilt av forskjellige mikroorganismer. Teknologiens potensiale gir anledning til mikrobiell fremstilling av en rekke nyttige polypeptider og bringer innen rekkevidde den mikrobielt styrte fremstilling av hormoner, enzymer, antistoffer og vaksiner som er nyttige ved mange legemiddelrettede anvendelser.

Et grunnleggende element i rekombinant DNA-teknologi er plasmidet, en ekstrakromosomal sløyfe av dobbel-kjedet DNA som finnes i bakterier, som oftest i flere kopier pr. celle. Inkludert 1 Informasjonen som er lnnkodet 1 plasmidets DNA, er det som kreves for å reprodusere plasmidet i datterceller (dvs. et "replikon" eller opphav for replikasjon) og vanligvis ett eller flere fenotype-seleksjonskarakteristika, slik som resistens mot antibiotika, hvilket gjør det mulig å gjenkjenne og fortrinnsvis dyrke i selektive medier kloner av vertscellen som inneholder det aktuelle plasmidet. Nytten av bakterieplasmider ligger i det faktum at de kan spaltes på en bestemt måte ved hjelp av en eller annen restriksjonsendonuklease eller "restriksjonsenzym", hvorav hvert enkelt gjenkjenner et forskjellig sted på plasmid-DNA-et. Deretter kan heterologgener eller genfragmenter innføres i plasmidet ved å knytte endene til spaltingsstedet eller rekonstruerte ender i nærheten av spaltingsstedet. Det som således dannes, er såkalte replikerbare ekspresjonsvektorer.

Rekombinasjon av DNA utføres utenfor vertsorganismen og det resulterende rekombinante plasmid, kan innføres i cellene til organismer ved en fremgangsmåte som er kjent som transforma-sjon, og store mengder av plasmidet (ekspresjonsvektor) erholdes ved å dyrke transformanten. Videre kan, når genet er tilbørlig innført under hensyn til deler av plasmidet som styrer transkripsjonen og translasjonen av det innkodede DNA-budskap, det erholdte plasmidet anvendes til å styre fremstillingen av polypeptidet som det innførte genet koder for, en fremgangsmåte som det henvises til som ekspresjon.

Ekspresjonen initieres i en DNA-sekvens kjent som promoteren. I ekspresjonens transkripsjonsfase adskilles DNA-kjedene, og avdekker seg som en mal for initiert syntese av RNA fra DNA-sekvensen. RNA bindes deretter til ribosomer hvor RNA oversettes til en polypeptidkjede med den aminosyresekvensen som det er kodet for av mRNA-en. Det er kodet for hver enkelt aminosyre ved =n nukleotidtriplett eller et "kodon" som tilsammen utgjør det "strukturelle gen", dvs. den del av DNA-sekvensen som koder for aminosyre-sekvensen til det uttrykte polypeptid-produktet. Translasjon initieres ved et "start"-signal (vanligvis ATG, som i den erholdte RNA blir til AUG). Såkalte stopp-kodoner bestemmer slutten på oversettelsen, og følgelig på fremstillingen av ytterligere aminosyreenheter. Det resulterende produkt kan om nødvendig erholdes ved lysering av vertscellen i mikrobielle systemer, og adskil-lelse av produktet fra andre proteiner ved passende rensing.

I praksis kan anvendelsen av rekombinant DNA-teknologi uttrykke fullstendig heterologe polypeptider - såkalt direkte ekspresjon - eller eventuelt kan den uttrykke et heterologt polypeptid kondensert til en del av aminosyresekvensen til et homologt polypeptid. I det sistnevnte tilfellet gjøres det tilsiktede bioaktive produkt noen ganger bioinaktivt i det kondenserte, homologe/heterologe polypeptidet inntil det spaltes i et ekstracellulært miljø, kfr. GB patent 2007676A og Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).

Dersom forventningene til rekombinant DNA-teknologi fullt ut skal innfries, må det finnes opp systemer som optimaliserer ekspresjon av geninnskudd, slik at de tilsiktede polypeptid-produktene kan gjøres tilgjengelig i kontrollerte omgivelser og i høye utbytter.

B. Cellekulturteknologi

Teknikken med celler eller vevkulturer for å studere genetikk og cellefysiologi er godt etablert. Det er tilgjengelig midler og fremgangsmåter for å opprettholde de permanente cellelinjer, fremstilt ved suksessive serieoverføringer fra isolerte normale celler. For anvendelse i forskning opprett-holdes slike cellelinjer enten på en fast bærer I væskemedium eller ved dyrking i suspensjon som inneholder næringsunder-støttelse. Oppskalering for fremstillinger i stor målestokk synes bare å skape mekaniske problemer. For ytterligere bakgrunnsmateriale henledes oppmerksomheten til Microbiology, 2nd Edition, Harper and Row Publishers, Inc, Hagerstown, Maryland (1973) spesielt pp. 1122 et seq. og Scientific American 245, 66 et seq. (1981).

Foreliggende oppfinnelse er basert på den oppdagelse at rekombinant DNA-teknologi med hell og effektivt kan anvendes til å fremstille polypeptider i vertscellekultursystemer fra virveldyr. Dette kan by på de fordelene slike systemer kan gi, f.eks. glykosylering, fosforylering, metylering og sukker- og lipidtilknytning som er nærmere beslektet med naturlig fremstilte animalske proteiner, i motsetning til fremstillingen av den i bakterier- eller til og med gjær-verter som ikke rekker opp til slike nivåer av raffinerte fremstillinger. Egnede cellekulturer fra virveldyr vil uten tvil tolerere polypeptidprodukter godt og kan i enkelte tilfelle til og med utskille produkter i cellekulturmediet, noe som er til umåtelig hjelp i utvinnings- og rensingsfrem-gangsmåtene.

Ifølge oppfinnelsen er det tilveiebragt en fremgangsmåte for ekspresjon av hepatitt B overflateantigen i cellekultur, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at cellen omdannes med en vektor innbefattende en DNA-sekvens som koder for endelig hepatitt B overflateantigen uten noen forløper-sekvens, ved at ATG-startkodonet plasseres ved siden av den fullt utviklede N-terminus til hepatitt B overflateantigenet.

Videre er det tilveiebragt en vektor som er kjennetegnet ved at den innbefatter en DNA-sekvens som koder for endelig hepatitt B overflateantigen uten noen forløpersekvens, ved at ATG-startkodonet er plassert ved siden av den fullt utviklede N-terminus til hepatitt B overflateantigenet.

Det fremstilte HBsAg utskilles i cellekulturmediet i adskilt partikkelform, fri for enhver ytterligere, påkondensert polypeptidartefakt, enten denne måtte være kodet for av en annen del av HBV-genomet eller av DNA som er homologt med den anvendte vektoren. Det ti 1veiebragte HBsAg kan anvendes for fremstilling av vaksiner som er nyttige til å gi immunitet mot HBV hos mottagelige mennesker.

Hepatitt B- virus

Hepatitt B (serumhepatitis) virus overføres mellom mennesker og manifesterer seg som kronisk svekkende infeksjoner som gradvis kan gi alvorlig leverskade, primær karsinom og død. I de fleste tilfeller kan det forventes fullstendig restitu-ering fra hepatitt B Infeksjoner, imidlertid er store deler av befolkningen, særlig i mange afrikanske og asiatiske land, kroniske bærere med den alvorlige mulighet for å overføre sykdommen epidemisk.

Hepatitt forårsakes av en virusvektor (hepatitis B-virus eller HBV) som i sin hele tilstand, den såkalte Dane-partikkel, utgjør virioner og består av et 27 nm nukleokapsid som omslutter et DNA-molekyl og en kapsel som omgir nukleo-kapsidet. Proteiner som er knyttet til virionet, omfatter kjerneantigenet (HBcAg), en DNA-polymerase og overflateantigenet (HBsAg) som er funnet i serum fra infiserte og sroitte-bærende mennesker. Antistoffer mot HBsAg er også funnet i serum fra HBV infiserte folk. Det antas at HBsAg er HBV-antigenet som kan indusere immunproduksjonen av antistoff (anti-HBs) og følgelig ville det være prinsippet i en HBV-vaksine. Det henvises til: Dane et al., Lancet 1970 (1), 695

(1970); Hollinger et al., J. Immunology 107, 1099 (1971); Ling et al., J. Immunology 109, 834 (1972); Blumberg, Science 197, 17 (1977); Peterson et al., Proe. Nat. Acad. Sei (USA) 74, 1530 (1977) og Viral Hepatitis, A Contemporary Assessment of Etiology, Epidemiology, Pathogenesis and Prevention. (Vyas et al., eds.) Franklin Institute Press, Philadelphia, 1978, som det herved refereres til for ytterligere å illustrere bakgrunnen for denne oppfinnelsen.

HBsAg er tilstede i infisert plasma i overveiende grad i form av kuleformede partikler med diametere som varierer fra 16 til 25 nm, den såkalte "22 nm partikkel". Disse antas å utgjøre en ikke-inflserende virushylse. Ettersom antistoffet mot HBsAg virker beskyttende mot HBV-infeksjon, kan disse ikke-infiserende partiklene effektivt anvendes som en vaksine.

Ettersom hepatitt B-viruset Ikke har virket infiserende i cellekultur og bare kan erholdes fra infiserte mennesker eller høyere primater, har det ikke vært tilgjengelige midler for å erholde og opprettholde tilstrekkelige forsyninger med HBV for anvendelse ved fremstilling av antigen til immuni-ser ing mot HBV.

I GB patentsøknad nr. 2034323A og EP patentsøknader nr. 13828 og 20251 er det beskrevet henholdsvis isoleringen og kloningen av HBV genomet, ekspresjonen av HBV kjerneantigen og fremstillingen av E. Coll av et fusjonert protein som inneholder noe HBsAg. Proe. Nati. Acad. Sei. (HSA) 77, 4549

(1980) rapporterer integreringen av musekromosom ved trans-formasjon av museceller med tandemklonede hepatitt B genomer.

Moriarty et al., i Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 78, 2606

(1981) , beskriver konstruksjonen av en apevirus 40 (SV40) rekombinant som bærer et fragment av HBV-DNA. Kulturer av apenyreceller ble infisert med virusrekombinanten og produ-serte en 22 nm partikkel som synes å ha de samme karakte-ristika som de som finnes i sera fra hepatitt B-infiserte pasienter. Rekombinantvektoren til Moriarty et al. inneholdt et stort segment av HBV-genomet med HBsAg-sekvensen og inkluderte DNA-sekvenser som koder for SV40 tumorproteiner og muligens andre HBV-proteiner. Videre inkorporerte konstruksjonen av DNA for HBsAg sammen med den sekvensen fra SV40 virus som koder for VP-2-proteinet. Det er Ikke klart hvorvidt fullt utviklet HBsAg ble uttrykt.

Noen foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen vil nå bli beskrevet under henvisning til de medfølgende tegninger, hvor:

Fig. 1 viser konstruksjonen av plasmid pSVR som inneholder SV40 DNA med en delesjon av det området som koder for VP-1-proteinet. Fig. 2 viser konstruksjonen av plasmid pHS94 som bærer DNA for HBsAg. Fig. 3 viser konstruksjonen av plasmid pSVHBSA som Inneholder HGsAg DNA og sekvenser av DNA avledet fra SV40 og pBR322. I del B er DNA sekvensen som omgir ATG oppstartingskodonet for VP-1 protein (innrammet I øverste linje), sammenlignet med den for HBsAg som er laget i rekombinanten (innrammet ATG i nederste linje). Setet for Hind III som ble omdannet til et sete for EcoRI, er understreket. Fig. 4 viser replikasjonen av plasmid DNA i apeceller. Monolag av Cos-celler ble dyrket til 50-6056 sammenflytning i 6 cm plastskåler. Cellene ble vasket med Dulbecco's modifiserte medium, og 2 ml av et medium som inneholdt 1 pg plasmid DNA og DEAE-deks tran i en mengde på 200 pg ble tilført i 12 timer ved 37°C. DNA oppløsningen ble fjernet, cellene vasket en gang med medium og 5 ml av medium inneholdende 10 prosent serum fra kalvefoster ble tilsatt og cellene Inkubert ved 37°C i enten en eller tre dager før DNA-ekstraksjon. På disse tidspunktene ble små superoppkveilede plasmid DNA-er isolert etter fremgangsmåten til Hirt (14). DNA-en ble utsatt for elektroforese på agarosegel og overført til nitrocellulose (15). For å visualisere replikerende plasmider, ble nitro-cellulosefilteret testet med P32-merket HBV DNA. Felt (a) - DNA fra Hirt-lysater av celler infisert med pRI-Bgl. Felt (b) - DNA fra Hirt-lysater av celler infisert med pHBs348-L. Felt (M) - 1 jjg pH3s348-L DNA. Piler viser lokaliseringen av lukket sirkulært DNA (I) og det åpne sirkulære DNA (II). Fig. 5 viser kvantifisering av HBsAg syntetisert av rekombinante plasmider 1 Cos-celler. Monolag av Cos-celler ble dyrket til omtrent 50 prosent sammenflytning i 6 cm plastskåler, og preparert for DNA-transfeksjon som beskrevet i forbindelse med fig. 4. 2 ml av Dulbecco's modifiserte medium inneholdende 10 prosent fetalt kalveserum ble tilsatt etter transfeksjonen og etter 24 timers akkumulering ble mediet analysert til forskjellige tider med hensyn til HBsAg ekspresjon. HBsAg-ekspresjonen uttrykkes som antall pr. minutt (cpm) i 0,2 ml ufortynnet medium, analysert ved hjelp av RIA. Fig. 6 viser immun induserende virkning av HBsAg avledet fra apeceller. Medium fra 20 15 cm skåler med Cos-celler transfisert med pHBs348-L ble høstet og HBsAg renset som beskrevet ovenfor for elektronmikroskopundersøkelse. Tre grupper på fem mus ble immunisert med 2:„8 jjg, 0,6 pg eller 0,006 jjg renset HBsAg i nærvær av fullstendig Freund's hjelpemedium. Kontrollmus ble immunisert med lignende mengder autentisk HBsAg avledet fra menneskeserum:.. Det ble tatt blodprøver fra halene på musene til forskjellige tider etter immunisering, mengde anti-HBsAg-antistof f ble målt ved hjelp av RIA, og resul-tatene uttrykt som den gjennomsnittlige titer pr. mus. Mus som var immunisert med HBsAg avledet fra vevkulturer, ga titere som var identiske med de for mus som var immunisert med HBsAg avledet fra menneskeserum. Fig. 7 demonstrerer nærværet av HBV-sekvenser som replikerer som del av SV40. Fig. 8A viser en sukrosegradientsedimentasjon av HGsAg syntetisert via den her beskrevne rekombinantvektoren. Fig. 8B er en tilsvarende CsCl gradient sentrifugering. Fig. 9 viser et elektron-mikrografi av HBsAg syntetisert som en 22 nm partikkel i overensstemmelse med denne oppfinnelse.

Cellekultursystemer/ cellekulturvektorer

Vekst av celler fra virveldyr i kultur (vevskultur) er blitt en rutinefremgangsmåte i de senere år (se Tissue Culture

Academic Press, Kruse and Patterson eds, 1973). Her ble det anvendt CV-l-linjen av apenyrefibroblaster som vert for fremstillingen av HBsAg. De her beskrevne eksperimentene kunne imidlertid vært utført i en hvilken som helst cellelinje som er i stand til replikasjon og ekspresjon av en forenlig vektor, f. eks. WI38, BHK, 3T3, CHO, VERO og HeLa-cellelinjer. Det som i tillegg kreves av ekspresjonsvektoren, er et opphavssted for replikasjon og en promoter lokalisert foran og i avlesningsf ase med genet som skal uttrykkes, sammen med hvilken som helst nødvendig ribosombindings-seter, RNA-sammenbindingsseter, polyadenyleringssete og avslutnings-sekvenser for transkripsjon. For eksempel kunne det brukes replikasjonsopphav for andre virus (f.eks. polyoma, adeno, Retro, VSV, BPV og så videre) vektorer, likesåvel som cellulære opphav for DNA replikasjon som kunne virke i en ikke-integrert tilstand.

Dertil begynner replikasjonen av SV40 DNA på et eneste sted og det fortsetter i to retninger (19). Genetisk bevis-materiale indikerer at bare ett virusgenprodukt kreves for replikasjonen av virus DNA-en. Dette er produktet av A-genet (T-antigen), som kreves for å starte opp hver runde med virus DNA-syntese (12). Eksperimenter som er beskrevet her, har demonstrert at rekombinantplasmider inneholdende opphavet til DNA-replikasjonen av SV40 er istand til å replikere i apeceller i nærvær av SV40 T-antigen (20,21). Det var ønsket å konstruere vektorer som opprettholdt både replikasjon og promoterfunksjoner. At et slikt system kan anvendes for å uttrykke heterologe gener i fravær av et supplerende hjelpe-virus, er også fastslått.

De her beskrevne ekspresjonsvektorene styrer effektivt syntesen av heterologe polypeptider, blant annet i C0S-7-linjen av apeceller. Anvendelsen av både de tidlige og sene promoterene av SV40 har vært utnyttes, selv om andre promotere burde være anvendbare i denne sammenheng. I tillegg til den effektive ekspresjon av potensielt nyttige polypeptider (f.eks. vekstfaktorer, lymfokiner, virusantigener, interferoner), barde systemet være nyttig i andre sammen-henger. F.eks. syntetiseres signifikante mengder av RNA fra disse vektorer, hvilket indikerer at et genominnskudd som inneholder introner skulle gi signifikante nivåer av fremstilt RNA hvorfra cDNA-kloner lett kunne erholdes. Systemet skulle følgelig vise seg nyttig for å omdanne genominnskudd til cDNA-kloner. I det ikke-lytiske ekspresjonssystemet skulle det dertil være mulig å bruke denne innfallsvinkel for å uttrykke gener som det kan påføres et seleksjonstrykk (f.eks. dihydrofolatreduktase, tymidinkinase, legemiddel-resistente gener, onkogener) med det formål å erholde både vektorer som er avhengig av vert, snarere enn virus-, opphav for DNA-replikasjon, såvel som vektorer som replikerer stabilt, kanskje gjennom en ervervelse av vertsekvenser (f.eks. centromerer).

Konstruksjon av en SV40 DNA uten det kodende område for VP- 1 protein

Den fullstendige nukleotidsekvensen for SV40 DNA er kjent (1). Den fysiske lokaliseringen av forskjellige SV40-kodede proteiner kan derfor korrelleres direkte med forskjellige seter for spalting med restriksjonsenzym. Undersøkelse av nukleotidsekvensen som omgir det kodende område for VP-1-protein (1) gir indikasjon på to godt avgrensede seter for spalting med restriksjonsendonuklease (fig. 1). Det første er et spaltingsseté for restriksjonsendonuklease Hind III i nukleotidposisjon 1493, 6 nukleotider 5' fra initieringskodonet for VP-1 protein. Det andre, et spaltingsseté for restriksjonsendonuklease BamHI i nukleotid 2533, er 50 nukleotider 5' fra avslutningskodonet for VP-1 protein. For å oppnå SV40 DNA med utstrykning mellom Hindlll-setet i nukleotid 1493 og BamHI-setet i nukleotid 2533, ble det utført eksperimenter som skissert i fig. 1. I korthet ble først villtype SV40 DNA spaltet med BamHI for å få en lineær DNA I full lengae og deretter spaltet med Hind III under den betingelse at hvert DNA-molekyl i gjennomsnitt bare ble utsatt for en spalting (det er seks Hindlll spaltingsseter fordelt utover i SV40 genomet). Teoretisk skulle en av tolv i den resulterende blanding av nedbrutt DNA være den ene ønskede kombinasjonen. Deretter ble et syntetisk dekanukleotid, dAGCTGAATTC (2), festet til disse BamHI og Hindlll behandlede SV40 DNA ved hjelp av kohesive ender av Hindlll spaltingsseter (-TCGA) og den hos dekanukleotidet. Hele blandingen ble deretter brutt ned med EcoRI (for å frembringe kohesiv ende i EcoRI setet hos det tilsatte dekanukleotid) og klonet til pBR322 gjennom Bam og EcoRI (3) seter. Plasmid DNA-en som inneholder SV40 sekvenser ble påvist ved restrik-sjonsanalyse (4) og fragmentet med den fastsatte utstrykning ble Isolert og betegnet pSVR.

Det er to formål for tilføyningen av syntetisk dekanukleotid. For det første inneholder det tilføyde dekanukleotid et spaltingsseté for restriksjonsendonuklease EcoRI som er fraværende i denne del av SV40 DNA. Store mengder av dette SV40 DNA vektorfragmentet kan derfor lett erholdes ved dyrking av pSVR-plasmid i E.Coli (5) og derpå følgende spalting med endonuklease EcoRI og BamHI. For det andre vil det tilføyde dekanukleotid gjenopprette den opprinnelige fysiske avstanden mellom Hindlll spaltningssetet og intieringskodonet for VP-l-protein når et passende konstruert DNA-inneholdende de kodende sekvenser for et fremmed gen bindes til denne SV40 DNA gjennom Eco-RI spaltningssetet (se fig. 3B).

8 pg BamHI-spaltet, lineært SV40 virus DNA i full lengde (dette kan erholdes ved å spalte villtype SV40-virus DNA eller SV40 DNA klonet ved BamHI setet til pBR322 med BamHI) ble brutt ned med 2 enheter Hind III (BRL i en 50 pl reaksjonsblanding inneholdende 20 mM tris-Cl (pH 7,5), 60 mM NaCl og 7 mM MgCl2. Etter inkuberlng ved 37°C i 30 minutter, ble reaksjonen stanset ved tilsetningen av overskudd EDTA og reaksjonsblandingen ble avproteinisert ved fenolekstraksjon etterfulgt av etanolutfelling. Den delvis nedbrutte DNA ble deretter resuspendert i 10 ul TE-buffer (10 mM tris-Cl, ph 7,5, 1 mM EDTA).

For å omdanne den kohesive enden i Hind III setet til en kohesiv ende i EcoRI setet, ble 0,1 nmol syntetisk dekanukleotid dAGCTGAATTC først fosforylert med ATP ved hjelp av T4 polynukleotidinase i 10 pl reaksjonsblanding inneholdende 50 mM glycinbuffer (pH 9,1), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP og 10 enheter kinase. Inkuberlng ble utført ved 37°C 1 1 time. En alikvot (3 ul) av kinasereaksjonsblandingen ble deretter tilsatt til en 1igeringsblanding (20 pl) inneholdende 66 mM tris-HCl (pH 7,5), 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,05 mg/ml BSA, 0,5 mM ATP, 4 pg delvis Hind III nedbrutt SV4 0 DNA (som ovenfor) og 10 enheter T4 DNA ligase. Inkubasjon for ligeringsreaksjonen var ved 20°C i ca. 16 timer.

Etterat ligert DNA var behandlet med restriksjonsendonuklease EcoRI for å frembringe EcoRI kohesiv ende på den ligerte linker, ble den deproteinisert med fenol, utfelt med etanol, bundet til BamHI-EcoRI fragmentet av pBR322 (0,5 pg) i en 15 pl ligeringsblanding (se ovenfor) og brukt til å trans-formere E. Coli 294. Plasmider isolert fra disse trans-formantene ble deretter undersøkt med hensyn til innføringen av passende SV40 DNA-fragmenter ved hjelp av forskjellige restriksjonsenzymnedbrytninger.

Isolering av HBsAg strukturelt gen

Den ovenfor konstruerte SV40 vektoren var utformet for å uttrykke genet som koder for overflateantigenet til hepatitt B virus (HBsAg). HBsAg, et polypeptid med molekylvekt 25.000, foreligger vanligvis som en kompleks partikkelformet struktur (22 nm partikkel) som er delvis glykosylert og utskilles til omgivelsene til den infiserte levercelle (6).

For å uttrykke KBsAg i den ovenfor konstruerte SV40 vektor, måtte et ideelt DNA-fragment som inneholder den kodende sekvens for HBsAg, oppfylle de følgende betingelser. For det første har denne DNA EcoRI restriksjonssete 1 en ende og BamHI sete i den andre. For det andre er EcoRI setet lokalisert umiddelbart 5' i forhold til initieringskodonet for HBsAg slik at den opprinnelige posisjon for ATG i VP-1 proteinet kan gjenopprettes. Endelig bør det resulterende rekombinante SV40 molekylet være av tilsvarende størrelse som vill-type SV40 DNA for effektiv inneslutning i virus-partikler. For å imøtekomme de ovenfor nevnte betingelser ble det utført en serie eksperimenter som er utførlig beskrevet I fig. 2. Ett av de viktige trekk ved denne konstruksjonen er dannelsen av et EcoRI restriksjonssete umiddelbart 5' til det antatte oppstartingskodonet (ATG) for HBsAg. Dette ble gjort ved å anvende en syntetisk 12-mer (dATGGAGAACATC), som er sekvensen som svarer til Initieringskodonet og de tre følgende aminosyrene i HBsAg, som en setespesifikk primer for å få E.coli DNA polymerase til å syntetisere DNA fra enkjedet, klonet HBV DNA. Etter passende enzymatisk behandling, ble så den syntetiske DNA knyttet sammen med den klonede HBV DNA til på nytt å utgjøre et intakt HBsAg gen, og en behandlet vektor DNA som inneholdt et EcoRI sete i enden, til på nytt å utgjøre det fastsatte EcoRI sete. Plasmidet betegnes pHS94.

Det strukturelle gen som koder for HBsAg, ble utvunnet fra et plasmid (pHBV-T-lA) som inneholdt hele genomet for HBV klonet inn i EcoRI se .et til pBR322. Denne klon ble erholdt ved hjelp av lignende fremgangsmåter som de som nylig er publi-sert av Valenzuela et al. (7) og (8).

Det strukturelle gen ble modifisert på to måter: 1) til å omfatte et unikt restriksjonssete like foran det oppstartende ATG metioninkodon og 2) til å sammenbinde over butte ender HBV Hpa 1 setet som er lokalisert langt unna HBsAg genet, til det igjenfylte EcoRI setet til pBR322. Disse to modifika-sjonene av DNA fragmentet som inneholder det strukturelle genet for HBsAg, ble utført som beskrevet nedenfor: 1.) 50 ug pHBV-T-IA DNA ble først brutt ned med Hpa II (80 enheter) i 200 pl reaksjonsblanding i henhold til enzymleverandørens reaksjonsbetingelser hvorved man fikk et 1,7 kb DNA fragment, hvori initieringskodonet for kodende sekvenser til HBsAg var lokalisert nær 5' enden av "sense"-kjeden (ca. 400 bp). DNA-en ble renset ved elektroforese på polyakrylamidgeler (PAGE). Det rensede Hpall fragmentet ble deretter behandlet med X eksonuklease (2 enheter) i 100 ul reaksjonsblanding i 30 minutter ved 37°C. X eksonuklease er en 5' eksonuklease som bryter ned dobbelkjedet DNA. Denne reaksjonen adskilte 5' halvdelen av "Sense"kjede DNA fra sekvenser som koder for HBsAg og blottstilte "antisense"-kjeden for sammenkobling med tilsatt primer. Den X eksonuklease behandlede DNA ble avproteinisert og resuspendert i 50 pl av reaksjonsblandingen som inneholdt 40 mM kalium-fosfatbuffer (pH 7,4), 1 mM DTT, 50 pg/ml BSA, 6 mM MgCl2, 0,5 mM hver av ciNTPs, og 0,2 n mol dATGGAGAACATC (<32>p-merket ved 5' enden ved hjelp av polynukleotidkinase). Blandingen ble først oppvarmet ved 90°C i 1 minutt, herdet ved 0°C i 30 minutter og deretter inkubert ved 37°C i 3 timer i nærvær av 2 enheter E.coli DNA polymerase I Klenow fragment (9). DNA polymerasen syntetiserte DNA etter initiering ved hjelp av den tilsatte primer og nedbrutt enkjedet DNA med 3'-0H ender, og dannet derfor DNA molekyler med butte ender. Den resulterende DNA ble deretter avproteinisert, brutt ned med Xbal (45 enheter) i et sete som er lokalisert I HBsAg genet, i en 100 pl reaksjonsblanding og fraksjonert ved hjelp av PAGE. Et 91 basepar DNA fragment som Inneholdt de første 30 kodonene til HBsAg genet, ble isolert etter autoradiografisk påvisning (fragment A).

For å danne et unikt restriksjonssete like ved 5' enden til HBsAg genet, trakk man fordel av et derivat av plasmidet pBR322 (kalt pNCV) som Inneholder et syntetisk DNA segment med sekvensen: AATTCTGCAG

GACGTCTTAA

lokalisert ved EcoRI setet. Et Pstl sete er inkorporert i denne syntetiske DNA sekvensen. 10 ug pNCV DNA ble først kuttet med 24 enheter Pstl enzym i en 100 ul reaksjonsblanding og deretter behandlet med 2 enheter E.coli DNA polymerase Klenow fragment i 50 ul reaksjonsblanding som beskrevet ovenfor ved 8°C i en time. DNA polymerasebehand-lingen fjernet det 4 base-par store 3<*> overhenget fremstilt ved Pstl nedbryting, hvorved man fikk en DNA med butte ender med et intakt EcoRI restriksjonssete, dvs. fragmentet B som inneholder opphavet for replikasjon av pBR322. HBsAg gen framentet A med butte ender fremstilt ovenfor ble bundet til EcoRI setet til fragmentet B. Dette ble utført i en tre-fragments ligering for å danne et plasmid pHS94. Det tredje fragmentet (fragment C) ble fremstilt på følgende måte: 2.) HBsAG genet fra plasmidet pHBV-T-lA ble spaltet med Hpal på et punkt fjernet fra HBsAg genet. Hpal setet ble bundet til et EcoRI sete fra pBR322 tidligere utfylt med DNA polymerase I Klenow fragment (9). Dette ble utført ved å klone derivatet av pBR322 hvorved man fikk pHS42. Dette plasmidet ble spaltet med Xbal (som spalter ved kodon 31) og med Barn HI (sem spalter 375 basepar fra EcoRI setet til pBR322) hvorved man fikk et DNA fragment som inneholder det meste av HBsAg genet, ca. 150 basepar som er perifere i forhold til HBsAg genet og promoteren/operatoren og de første 200 baseparene av genet for tetracyklinresistens. DNA fragmentet C, som er avgrenset ved hjelp av Xbal og BamHI, ble isolert med PAGE og anvendt i tre-fragments ligeringen beskrevet ovenfor hvorved man fikk plasmidet pHS94. (fig. 2). ;Konstruksjon av rekombinant SV40 DNA som er istand til å syntetisere HBsAg ;For å sikre store mengder passende ligert DNA til transfeksjon av apeceller, ble den ligerte DNA klonet i E. coli på følgende måte. Som vist i fig. 3, ble BamHI til EcoRI fragmentet inneholdende SV40 DNA fra pSVR først bundet til EcoRI til BamHI fragmentet som inneholder HBsAg genet fra pHS94 over dets EcoRI sete og det resulterende fragment ble deretter klonet i BamHI setet til pBR322. ;Den korrekt konstruerte DNA, pSVHBSA, kan deretter spaltes med restriksjons endonuklease BamHI for å frembringe et DNA fragment med 5382 nukleotider som består av et rekombinant SV 40 genom med området som koder for dets VPI protein erstattet av det området fra genet som koder for en hepatitt overflateantigen. ;For konstruksjonen av pSVHBSA DNA ble 0,3 pg av det SV40 DNA inneholdende DNA-fragment fra BamHI+EcoRI nedbrutt pSVR DNA, 50 ng av pBR322-inneholdende DNA-fragment fra BamHI nedbrøt pHBV-T-IA DNA (se fig. 2 for detaljert struktur) og 0,2 ug DNA som inneholder HBsAg kodende sekvens fra BamHI+EcoRI nedbrutt pHS94, ble bundet sammen ved hjelp av T4 DNA ligase over deres respektive BamHI og EcoRI seter i en 15 pl ligeringsblandlng inkubert over natten. En type passende sammenbundne DNA produkter har gjenopprettet et intakt tet<R >gen fra pBR322 og kan derfor selekteres for ved hjelp av tet<R >blant det store antallet tet<s> rekombinanter som skyldes innbyrdes ligering mellom vektor DNA. Strukturen til pSVHBSA ble deretter bekreftet ved hjelp av nedbryting med restrik-sj onsenzym. ;Vekst av rekombinant SV40 virus og ekspresjon av HBsAg i apeceller ;For å utprøve effektiviteten av hepatitt overflateantigen-syntese i et slikt vektorsystem, ble pSVHBSA DNA spaltet med BamHI innført i et monolag av CV-1 celler (10) ved hjelp av DEAE dekstranmetoden (11) og celler som samtidig var infisert enten med tsA28 eller tsA58 virus (12). Monolaget av CV-1 celler ble deretter inkubert ved 41°C under passende kultur-betingelser (11). Både tsA28 og tsA58 utgjør temperatur-sensitive mutanter i SV40 T antigenet og kan derfor Ikke formere seg ved 41°C (1). På samme måte produserer Ikke CV-1 celler som inneholdt bare rekombinant SV40 genom (pSVHBSA), smittsomt virus fordi pSVHBSA mangler VP-1 genet. Som antatt, ble det observert cytopatisk virkning etter 4 dager i CV-1 cellene som inneholdt både ts SV40 virus og det rekombinante SV40 genom. Fullstendig cellelyse ble observert etter 2 uker med inkubasjon. Det ble ikke observert noen cytopatisk effekt i CV-1 cellene som bare mottok rekombinant SV40 genom eller ts SV40 virus. Ved å anvende en vanlig brukt radioaktiv Immunanalyse for HBsAg (13), ble overflateantigenproduksjonen påvist i kulturmediet så tidlig som 4 dager etter innføringen av DNA. Kvantitative analyser viste at et monolag av 1x10^ CV-1 celler fremstilte opptil 3,8 pg HBsAg for hver infek-sjonssyklus, en ekvivalent på 9xl0<7> molekyler/ celle. Dette tallet er nesten identisk med det beregnede antall SV40 VP-1 proteinmolekyler fremstilt i en enkelt lnfeksjonssyklus (1). ;For å fastslå hvorvidt det rekombinante SV40 genomet inn-lemmes og vokser i CV-1 celler på samme måte som I SV40 virus, ble en plate med CV-1 celler infisert ved 41°C med ts SV40 virus pluss en aliquot av lysatet fra de opprinnelige, samtidig infiserte cellene. DNA med lav molekylvekt fra de infiserte cellene ble isolert ved hjelp av metoden til Hirt (14) 72 timer etter infeksjon. Den isolerte DNA ble enten ikke behandlet eller spaltet med restriksjonsendonukleaser og fraksjonert ved hjelp av gel elektroforese på agarose. Den fraksjonerte DNA ble deretter denaturert og overført til nitrocellulosepapir ved hjelp av metoden til Southern (15) og utprøvet med <32>p-merket pHS94 DNA. Som det kan sees av fig. 7 eksisterer de rekombinante DNA molekylene som Inneholder hepatitt gen sekvens, for det meste som lukket-ring-DNA med en størrelse som ikke lar seg skille fra SV40 virus DNA (felt A). Mesteparten av den rekombinante DNA regenererer sitt BamHI sete gjennom in vivo llgering (felt B). Som forventet, kan Bam-EcoRI fragmentet som inneholder området som koder for hepatitt B overf lateantigen (se fig. 3), også isoleres i en uendret form. ;En 150 mm plate med CV-1 celler dyrket til 90 prosent sammenflytning ble infisert med et lysat fremstilt fra et opprinnelig transfeksjonseksperiment (som inneholdt både rekombinant og tsA28 virus) og inkubert ved 41'C etter supplering med overskudd tsA28 virus. 70 timer etter infeksjon ble mediet høstet for å karakterisere det syntetiserte HBsAg. I tillegg ble det Isolert Intracellulært DNA med lav molekylvekt ifølge metodene til Hirt (14). Den isolerte DNA ble suspendert på nytt i 1 ml puffer som inneholdt Tris-Cl (pH 7,4), 1 mM EDTA. 5 ul ukuttet DNA og 5 pl BamHI nedbrutt DNA ble deretter fraksjonert ved hjelp av elektroforese gjennom en 0,8 prosent agarosegel i TBE buffer sammen med SV40 DNA behandlet på samme måte som en kontroll. DNA mønsteret på gelen ble overført til et ark nitrocellulosepapir og hybridisert til <32>p-merket pHS94 DNA (15), som en kilde for HBsAg gen prøve. Fig. 7 viser det autoradiografiske utseende av <32>p-merket pHS94 DNA etter hybridisering. Felt A og B er henholdsvis ubehandlet Hirt supernatant og BamHI nedbrutt Hirt supernatant DNA. I, II og III viser posisjonen til form I, form II og form III av kontroll SV40 DNA hvis posisjoner ble bestemt ved hjelp av etidiumbromidfarging før DNA ble overført til nitrocellulosepapir. ;Hepatitt overflateantigen kodet for av pSVHBSA syntetiseres i en partikkelform ;Hepatitt overflateantigen syntetiseres og utskilles fra infiserte leverceller som en partikkel (6). Sekvensanalyse av diverse klonet hepatitt DNA antyder muligheten av at det fullt utviklede overflateantigen kan være avspaltet fra et større forløperprotein (8). Ettersom bare DNA som koder for det fullt utviklede HBsAg molekyl, pluss noen 3<*> uoversatte sekvenser, er inkorporert i SV40 genomet i den beskrevne konstruksjon, kan det reises et spørsmål om hvorvidt det tenkte forløperpeptid spiller noen funksjonell rolle i utformingen av 22 nm partikkel og i dens eventuelle utskil-lelse fra cellen. Hittil har det syntetiserte hepatittover-flateantigenet blitt karakterisert ved å sammenligne dets egenskaper med autentisk protein gjennom sedimentasjonshastighet, sedimentasjonslikevekt og elektronmikroskop-analyse. Som vist i fig. 8, har hepatitt-overflateantigenet syntetisert i dette vektorsystemet en sedimentasjonshastighet som ikke lar seg skille fra hepatitt-overflateantigen isolert fra mediet til en infisert levercellelinje (17) og har en oppf lytningsdensitet på 1,22 g/cm<3>, på nytt likt med en autentisk overflateantigen 22 nm partikkel (6). Undersøkelse ved hjelp av elektronmikroskop av renset overflateantigen har også avslørt en overveiende partikkelstruktur med en gjennom-snitlig diameter på 200 Å (22 nm), som er morfologisk identisk med autentisk 22 nm partikler (fig. 8 og 9). Den fullstendig utviklede hepatitt-overflateantigenprotein-monomeren er derfor den eneste viktige strukturelle kompo-nentdel kodet for av hepatittvirus som kreves for utviklingen av 22 nm partikkelen.

A. Sammenligning av sedimentasjonshastigheten til HBsAg syntetisert i CV-1 celler og HBsAg syntetisert og utskilt av en Hepatoma cellelinje PLC (17 og 18). (Fig. 8A). Kulturmedium høstet fra eksperimentet beskrevet i fig. 7 var kilden for HBsAg anvendt i dette eksperiment. HBsAg fremstilt av PLC cellelinjen (17 cg 18) ble høstet fra kulturmediet. HBsAg fra begge kulturene ble først utfelt ved hjelp av ammoniumsulfat i 45 prosent metning og suspendert på nytt (til en slutt konsentrasjon a\ HBsAg på 0,5 pg/ml) i en buffer som inneholdt 20 mM tris-Cl (pH 7,4), 0,5 mM EDTA og 0,5 mM NaCl. 200 pl av hver prøve ble tilført to parallelle 5 ml sukrose-gradienter (5-20 prosent sukrose) i den samme buffer. Sentrifugering ble utført ved 45.000 rpm i en Beckman W 50.1 rotor I 80 minutter ved 4°C. HBsAg ble bestemt ved å anvende det kommersielle HBsAg analysesettet (Ausria 11-125). Utvinning av HBsAg var konstant større enn 80 prosent.

B. Oppflytningsdensitetbestemmelse av HBsAg syntetisert i CV-1 celler (flg. 8B). 2 pg HBsAg fra sammenslått infisert kulturmedium ble utfelt ved hjelp av ammoniumsulfat i 45 prosent metning, fraksjonert over en agarosegel gjennom-trengningskolonne (A 5,0 M, Bio-Rad), og deretter sedimentert gjennom en 5-20 prosent sukrosegradient som beskrevet i A. Etter sukrosegradient sentrifugering, ble sammenslått HBsAg dialysert mot gradientbuf f er uten sukrose og fast CsCl ble deretter tilsatt, hvorved oppløsningen (7 ml) fikk en sluttdensitet på 1,2 g/cm<3>. Den ble deretter sentrifugert ved 50.000 omdreininger pr. minutt i en Sorvall T 865,1 rotor i 68 timer. Analyser ble utført som beskrevet i A. Utvinning av HBsAg i CsCl gradienter var ca. 70 prosent. Toppfraksjoner ble deretter slått sammen, dialysert mot 10 mM TrisCl, 100 mM NaCl og 0,5 mM EDTA buffer, konsentrert og preparert for elektronmikroskopundersøkelse.

For å preparere antigenet for elektronmikrografi, ble det fremstilt karbonbelagte kobbergittere. En dråpe buffer inneholdende HBsAg protein (1 ug/ml) ble plassert på et gitter i 30 minutter ved værelsestemperatur. Proteinoppløs-ningen ble trukket av gitteret radielt og vasket en gang med 4 dråper H2O. Gitteret ble deretter farget med 1,0 prosent Na-fosfortungstat, pH 7,6, i ett minutt, og tørket med filterpapir. Elektronmikrografier ble tatt på en Phillips E. M. 400 ved forstørrelse 77700. Dette ga et negativ hvorfra et positivt bilde ble laget med forstørrelse (ca. 10 ganger) som vist i fig. 9.

Konstruksjon av ikke- lvtiske vektorer som uttrykker HBsAg Rekombinante plasmider ble fremstilt som inneholdt pBR322 sekvenser avledet fra plasmidet pML (21), 348 basepar SV40 DNA som omfatter opphavsområdet for DNA replikasjon såvel som promotersekvensene for både de tidlige og sene transkrlp-sjonsenhetene og HBV sekvenser som koder for genet for HBsAg. Opphavet for SV40 ble Isolert ved å bryte ned SV40 DNA med Hindlll, og omdanne Hindlll endene til EcoRI ender ved tilsetning av en omdanner (AGCTGAATTC). Denne DNA ble kuttet med PvuII og RI linkere tilsatt. Etter nedbryting med Eco RI, ble 348 base-par fragmentet som spenner over opphavet, isolert ved polyakrylamidgel elektroforese og elektro-eluering, og klonet i pBR322. Ekspresjons-plasmidene pHBs348-E og pHBs348-L ble konstruert ved å klone det 1986 basepar store fragmentet som resulterer fra EcoRI og Bglll nedbryt-ning av HBV (22) (som spenner over genet som koder for HBsAg) inn i plasmidet pML (21) ved EcoRI og BamHI setene. (pML er et derivat av p3R322 som har en utstrykning som eliminerer sekvenser med inhiberende virkning på plasmidreplikasjon i apeceller (21)). Det resulterende plasmid (pRI-Bgl) ble deretter gjort lineært ved hjelp av EcoRI og det 348 basepar store fragmentet som utgjør opphavsområdet for SV40, ble introdusert i EcoRI setet til pRI-Bgl. Opphavsfragmentet kan innføres orientert I begge retninger. Ettersom dette fragmentet koder for både de tidlige og sene SV40 promotere i tillegg til opphavet for replikasjon, kan HBV gener uttrykkes under kontrollen av begge promotere avhengig av denne orientering (pHBS348-E angir HBs uttrykt under kontroll av den tidlige promoter; pHBs348-L angir HBs uttrykt under kontroll av den sene promoter).

Replikasjon av SV40- HBv plasmider 1 apeceller

Replikasjonen av HBV-SV40 rekombinantplasmider I COS-7 linjen av apeceller ble demonstrert på følgende måte: Til forskjellige tider etter DNA-transfeksjon ved hjelp av DEAE-dekstran-teknikk ble DNA med lav molekylvekt isolert ved hjelp av metoden til Hirt (14), fraksjonert ved elektroforese i agarosegeler og analysert ved hjelp av Southern-flekkhybridi-sering (15). Fig. 4 viser at umiddelbart etter transfeksjon, er det lite eller ingen superoppkveilet plasmid tilstede i COS celler. Tre dager etter transfeksjon har det imidlertid oppstått utbredr, replikasjon av det innførte DNA, etterfulgt av introduksjon av enten pHBs348-L DNA (felt b) eller pHBs348-E DNA. Som forventet observeres det Ikke noen plasmid replikasjon etter transfeksjon av plasmid pRI-Bgl (som mangler SV40 stamsekvensene, men ellers er identisk med de ovenfor nevnte ekspresjonsplasmidene) (felt a).

Syntese av HGsAg i apeceller transfisert med rekombinante plasmider

Plasmidene pML, pRI-Bgl, pHBs348-E og pHBs348-L ble innført i COS-7 linjen av apeceller (23), modifisert ved hjelp av DEAE-dekstranfremgangsmåten (11) ved å øke tiden for behandling og eksponering av cellene mot DEAE-dekstran og DNA til 12 timer. CoS-7 cellelinjen inneholder en integrert kopi av det tidlige området til SV40 og uttrykker i vesentlig grad SV40 A genproduktet (T antigen). Det er påvist at plasmider som inneholder et funksjonelt opphav for SV40 DNA replikasjon, replikerer i apeceller i nærvær av SV40 T antigen (20, 21). Fig. 5 viser at Cos-celler transfisert med plasmider pHBs348-E og pHBS348-L begynner å uttrykke signifikante mengder av HBsAg på dag nr. 2 og fortsetter ekspresjon utover en toukers periode. Ekspresjonsnivået bestemt av pHBs348-L er noe høyere enn det som bestemmes av pHBs348-E. En forklaring på disse resultater er at den sene SV40 promoter kan være mere effektiv enn den tidligere promoter 1 dette systemet.

HBsAg avledet fra vevkultur er immuninduserende hos dyr Etter å ha demonstrert at HBsAg partikler avledet fra vevkultur er antlgenisk aktive, var det ønskelig å bestemme hvorvidt disse partiklene er immuninduserende hos dyr. Antigenet fremstilt av CoS-7 celler ble derfor renset ved en kombinasjon av ammoniumsulfatutfelling, sukrosegradient sentrifugering og CsCl densitet gradient sentrifugering. HBsAg avledet fra vevkulturen ble injisert i prøvemus mens kontrollmus ble immunisert med identiske mengder kommersielt tilgjengelig HBsAg avledet fra menneskeserum. Titeret av anti-HBsA- ble så bestemt til forskjellige tider etter immunisering. Fig. 6 illustrerer at det oppsto signifikante titere av anti-HBsAg hos mus immunisert med autentisk HBsAg, likesåvel som hos mus immunisert med HBsAg avledet fra vevkultur. Dertil var kinetiske forhold og titere av anti-HBsAg antistoff fremkommet hos mus immunisert med HBsAg avledet fra vevkultur ikke til å skjeldne fra de samme observert hos mus immunisert med autentisk HBsAg. Vi konklu-derer derfor med at HBsAg syntetisert i apeceller ved hjelp av rekombinante DNA teknikker, med hensyn til Immuninduserende evne er lik med, om ikke identisk med, HBsAg avledet fra menneskeserum, hvis effektivitet som en vaksine er utførlig demonstrert.

Forbindelsene som fremstilles Ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres 1 henhold til kjente metoder for å fremstille farmasøytisk nyttige preparater, idet polypeptidet her beskrevet kombineres i blanding med et farmasøytisk aksep-tabelt bærehjelpemiddel. Passende hjelpemidler og deres formulering er beskrevet i Remington's Pharmaceutical Science av E.W. Martin, som det herved refereres til. Silke preparater vil inneholde en effektiv mengde av polypeptidproduktet sammen med en passende mengde bærehjelpemiddel for å til-berede farmasøytisk akseptable preparater egnet for effektiv administrering til verten. En foretrukket administråsjonsmåte er parenteral. Egnede veterinærmedisinske preparater fremstilles på samme måte som farmasøytiske preparater.

Vaksiner som inneholder et passende polypeptid fremstilt som her beskrevet, kan fremstilles i henhold til kjente metoder hvor nevnte polypeptid kombineres i blanding med et passende hjelpemiddel. Passende hjelpemidler omfatter f.eks. salt-vannsoppløsninger, forskjellige kjente hjelpestoffer eller andre tilsetningsmidler som er anerkjent innen teknikken for anvendelse i preparater beregnet på å forhindre virus-infeksjoner. Slike vaksiner vil inneholde en effektiv mengde av polypeptidet og en passende mengde hjelpemiddel for å fremstille en vaksine som er anvendbar for effektiv administrering til verten. Oppmerksomheten henledes også mot New Trends and Developments In Vaccines, Editors: A. Voller and H. Friedman, University Park Press, Baltimore, 1978.

På grunn av de unike fremgangsmåtene hvorved den aktive bestanddel av disse vaksinene fremstilles, er det sannsynlig at vaksinene i det vesentlige er fri for fremmedprotein(er) og for andre virus og cellulære bestanddeler. Det er derfor mindre sannsynlig at de gir komplikasjonene til de fullstendig drepte eller svekkede virusvaksinepreparatene.

Bibliografi

1. N.H. Acheson i Molecular Biology of Tumor Viruses.

(J. Tooze ed.) Cold Spring Harbor Lab. N.Y. 2nd edl. Part 2. pp. 125-204 (1980). 2. R. Crea, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 75, 5765

(1978) .

3. D.V. Goeddel, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 76, 106

(1979) .

4. R.W. Davis, et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold

Spring Harbor Laboratory, N.Y. pp. 116-125 (1980).

5. D.H. Hamer and P. Leder, Cell, 18, 1299 (1979).

6. 0. Blumberg, Science 197, 19 (1977).

7. P. Valenzuela, et al., Nature, 280, 815 (1979).

8. P. Charnay et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 76, 2222

(1979). 9. H. Jacobsen et. al., Eur. J. Biochem. 45, 623 (1974). 10. J.E. Mertz and P. Berg., Virology, 62, 112 (1974). 11. J.H. McCutchan and J.S. Pagano, J.Nat. Cancer Inst. 41, 351 (1968).

12. P.J. Tegtmeyer, J. Virology 10, 591 (1972).

13. Ausria 11-125. Abbott Lab.

14. B.J. Hirt, J. Mol. Biol. 26, 365 (1967).

15. E.M.J. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 (1975).

16. C-J. Lai and D. Nathans, J. Mol. Biol. 89, 179 (1974). 17. J.J. Alexander et al., S. Afr. Med. J. 50, 2124 (1976).

18. P.L. Marion et. al., J. of Virol. 32, 796 (1979).

19. DNA Tumor Viruses 2nd Ed. (Ed J. Tooze), Cold Spring

Harbor Lab., N.Y. (1980).

20. Myers and Tjian, Proe. Nati. Acad. Sel. (USA) 77, 6491 (1980 ).

21. Lusky and Botchan, Nature 293, 79 (1981).

22. Animal Virus Genetics (E-. Fields, Jaenisch and Fox),

Chapter 5, p 57, Academic Press, N.Y. (1980).

23. Gluzman, Cell 23, 175 (1981).

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for ekspresjon av hepatitt B overflateantigen i cellekultur, karakterisert ved at cellen omdannes med en vektor innbefattende en DNA-sekvens som koder for endelig hepatitt B overflateantigen uten noen forløper-sekvens, ved at ATG-startkodonet plasseres ved siden av den fullt utviklede N-terminus til hepatitt B overflateantigenet.

2. Vektor, karakterisert ved at den innbefatter en DNA-sekvens som koder for endelig hepatitt B overflateantigen uten noen forløpersekvens, ved at ATG-startkodonet er plassert ved siden av den fullt utviklede N-terminus til hepatitt B overflateantigenet.