HU196238B - Process for producing mature hbsag surface antigen and vaccine against hepatitis b virus - Google Patents
Process for producing mature hbsag surface antigen and vaccine against hepatitis b virus Download PDFInfo
- Publication number
- HU196238B HU196238B HU822777A HU277782A HU196238B HU 196238 B HU196238 B HU 196238B HU 822777 A HU822777 A HU 822777A HU 277782 A HU277782 A HU 277782A HU 196238 B HU196238 B HU 196238B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- dna
- hbsag
- plasmid
- sequence
- surface antigen
- Prior art date
Links
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 36
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 36
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 35
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title claims description 30
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 18
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims abstract description 16
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 14
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 53
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 16
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 2
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 claims 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 56
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 21
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 7
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 abstract description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 abstract description 2
- 229960002520 hepatitis vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 abstract 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 102
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 8
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 4
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100022427 Plasmalemma vesicle-associated protein Human genes 0.000 description 2
- 101710193105 Plasmalemma vesicle-associated protein Proteins 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FLJPGEWQYJVDPF-UHFFFAOYSA-L caesium sulfate Chemical compound [Cs+].[Cs+].[O-]S([O-])(=O)=O FLJPGEWQYJVDPF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 101150087119 SAG gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 description 1
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- AUQXFIPJIKUKGT-UHFFFAOYSA-K [W+4].P(=O)([O-])([O-])[O-].[Na+] Chemical compound [W+4].P(=O)([O-])([O-])[O-].[Na+] AUQXFIPJIKUKGT-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000010218 electron microscopic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000029610 recognition of host Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
- A találmány a rekombináns dezoxiribonukleínsav-technológiának gerinccsallat-sejtkultúrában történő polipcptid-termelésrc való alkalmazására vonatkozik. így a találmány tárgya elsősorban olyan expresszió-hordozók felépítése, amelyek polipeptideket kódoló dezoxiribonukleinsav (a továbbiakban: DNS) szekvenciákat tartalmaznak, amelyek operábilisan kapcsolódnak az expressziót végző promotor-rendszerekhez és az így felépített expresszió-hordozókhoz.
Az ilyen expresszió-hordozók képesek replikációra és a kódolt polipeptid DNS-szekvcncía expressziójára, mind mikrobiális rendszerekben, mind pedig — érdekes módon — különböző gerincesállat-sejttenyészet rendszerekben is. Kiterjed továbbá a találmány az ilyen expresszió-hordozókkal transzformált és így a fent említett DNS-szekvenciák expressziójában irányított emlősállat-sejtkultúrákra is.
A találmány olyan különleges expresszió-vektorok előállítására vonatkozik, amelyek DNS-szckvcnciákat használnak fel replikációra, fenotípusos szelekcióra és a hepatitisz—B felületi antigén (HBsAg) génhez és expresszió-promotorjához való kapcsolásra; ezek a szekvenciák természetesek az alkalmazott gerincesállat-sejtrendszer számára és nem károsítják azt. A HBsAg antigén kiválasztódik a kultúra-közegbe körülbelül 22 nm méretű részecskék alakjában és a hepatitisz—B vírus (HBV) antigénes determinánsát vagy determinánsait tartalmazza. Az így termelt hepatitisz—B felületi antigén alkalmas a hepatitisz—B vírus elleni vakcinák előállítására; a jelen találmány kiterjed az ilyen sejtkultúra-exprcsszió végtermékeként keletkező HBsAg-nek a HBV vírus ellen hatásos készítményekké, például vakcinákká való átalakítására alkalmas módszerekre is.
A találmány technikai háttere
A) Rekombináns DNS-technológia bevezetésével a hasznos polipeptidek rendkívüli sokaságának mikrobiális termelése vál lehetségessé. A gerincesek szervezetében fontos szerepet játszó peptidek egész sorát, mint az emberi növekedési hormont, az emberi proinzulint, az alfa—1 dezacetíl-timozint, humán és hibrid Icukocíta interferonokat, humán fibroblaszt interferont és számos más terméket sikerült már különféle mikroorganizmusok segítségével előállítani. Ez a technológiai módszer a hasznos polipeptidek igen sokfele különböző fajtájának mikrobiológiai termelését tette lehetővé; így lehetővé vált számos különféle gyógyászatilag is alkalmazható hormon, enzim, antitest és vakcina mikrobiológiailag irányított gyártása is.
A rekombináns DNS-technológia egyik alapvető eleme a plazmid, a kettösszálú DNS extrakromoszomális hurka, amely gyakran sejtenként többszörös kópiában található a baktériumokban. A plazmid DNS-ben kódolt információ magában foglalja a plazmidnak a leány-sejtekben való reprodukciójához szükséges információt (tehát egy úgynevezett „replikont”, a replikáció forrását), továbbá rendszerint egy vagy több fenotípus-szelekciós jellemzőt, mint az antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát is, ami lehetővé teszi a gazdasejt számbajövő plazmidokat tartalmazó kiónjainak felismerését és szelektív közegekben való prefércnciális tenyésztését. A bakteriális plazmidc^ hasznossága abból a tényből ered, hogy ezeket specifikusan lehet hasítani az egyik vagy másik reszlrikciós endonukleáz vagy „reszlrikciós enzimé segítségével, minthogy ezek mindegyike egy-egy különböző helyet ismer fel a plazmid — DNS-ejr, Ezután heterogén gének vagy gén-fragmentek illeszthetők be a plazmidba oly módon, hogy végI elyzetben kapcsolják ezeket a hasítási helyhez vagy a hasítási hellyel szomszédos rekonstruált végekhez. így az úgynevezett replikábilis expreszszió-hordozókat alakítják ki.
A DNS-rekombinációt a gazda-organizmuson kívül folytatják te és az így kapott „rekombináns replikábilis expresszió-hordozó vagy plazmid a „transzformáció” néven ismert művelettel vihető be organizmusok sejtjeibe és így a transzformáns tenyésztése útján nagy mennyiségű rekombináns hordozót lehet kapni. Emellett, ha a gén a bekódoh DNS-iizcnet transzkripcióját és transzlációját irányító plazmid-rcszekhez viszonyítva helyesen van beiktatva, akkor az így kapott hordozó felfutszn; Iható a beiktatott gén által kódolt polipeptid közvetlen termelésére; ezt az eljárást nevezik expressziónak.
Az expresszió a „promotor” néven ismert DNS* tartományban kezdődik. Az expresszió transzkripciós fázisában a DNS kitekeredik és ezáltal templátja hozzáférhetővé válik a DNS-szekvenciából származó „messenger—RNS” inicíált szintézise számára. A messenger—RNS viszont riboszómák ált il van megkötve ott, ahol megtörténik a messenger—RNS transzlációja az mRNS által bekódolt aminosav-szekvcnciájú polipeptid-lánccá. Minden egyes aminosavat egy-egy nukleotid-triplett vagy „kodon” kódol be; ezek együtt képezik a „szerkezet gént”, vagyis a DNS-szekvenciának azt a részét, amely az exprimált polipeptid-termék aminosav-szekveuciáját bekódolja. A transzlációt egy „starf'-szignál iniciálja (ez rendszerint ATG, amelyből a keletkező messenger—RNS-ben AUG lesz). Az úgynevezett stop-kodonok a transzláció végét és így további aminosav-egységek termelését határozzák meg. A kapott termék — amennyiben ez szükséges — bakteriális rendszerekben lízisnek vethető alá: a termék a jelenlevő egyéb fehérjéktől alkalmas módon történő megtisztítás útján mentesíthető.
A gyakorlatban a rekombináns DNS-technológia alkalmazásával teljesen heterológ polipeptidek exprimálhutók — ez az úgynevezett közvetlen (direkt) expresszió — de alternatíve exprimálható olyan heterológ polipeptid is, amely egy homológ polipeptid aminosav-szekveneiájának egy részéhez van kapcsolva. Az utóbbi esetben előfordulhat, hogy az előállítani kívánt bioaktív termék a kapott összekapcsolt homológ/heterológ polipeptidben bioinaktívvá válik, mindaddig, míg le nem hasítják valamely sejten kívüli közegben; vö.: 2 007 676 A sz. brit szabadalmi közzétételi irat és Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).
Ha azt akarjuk, hogy a rekombináns DNS-tecbnológia teljes mértékben nyújtsa azt, ami tője várható, akkor oly rendszereket kell megtervezni, amelyek optimalizálják a gén-betétek expreszió ,ját, úgy hogy a szándékolt polipeptid-termékek szabályozott környezetben, nagy hozammal legyeinek elérhetők.
B) Sejtkultúra-technológia A genetikai és sejtfiziológiai tanulmányokra alkalmas sejt- és szövetkulti!rák előállítási és alkalmazási módja jól ismert. Rendelkezésre állnak az eszközök és módszerek különálló normális sejtekből folytatólagos sorozatos átvitel útján előállított állandó sejtvonalak fenntartására. Az ilyen sejtvonalak a kutatási munkában való felhasználás céljára vagy valamely folyékony közegben tartott szilárd hordozón, vagy pedig tápanyagokat tartalmazó szuszpenzióban való tenyésztés útján tartják fenn. A nagy méretekben történő termelés céljából való felnagyítás csupán mechanikai problémákkal jár. A technikai háttér további részleteire vonatkozólagvö.: Microbiology,2. kiadás, Harper artd Row Publishers, Inc. Hagerstown, Maryland (1973), különösen 1122. és köv. old., valamint Scientific American 245, 66. és köv. old. (1981).
A találmány leírása i A találmány a hepatitisz—B vírus (HBV) immu’nogenotikus determinánsait tartalmazó hepatitisz— B felületi antigén (HBsAg) gerincesállat-scjtkultúrárában történő előállítására [szolgáló eszközökre és 1 módszerekre] vonatkozik. Az így termelt HBsAg különálló szemcsék alakjában választódik ki a kultúra közegbe, mentesen mindenfajta akár a HBV-genom más része által, akár az alkalmazott vektorra! homológ DNS által bekódolt kísérő vagy hozzákötött mesterséges polipeptidíöl. Az így termelt HBsAg a találmány értelmében oly vakcinák előállítására alkalmazható, amelyek immunogenicitást biztosítanak HBV ellen az ilyen fertőzésre érzékeny embereknek. A találmány körébe tartozik az eljárás is ilyen vakcinák előállítására, valamint azoknak a fertőzéssel szemben érzékeny emberek HBV elleni immunizálást nyújtó beoltására történő alkalmazására is.
Hepatitisz—B vírus
A hepatitisz—B (szérum-hepatitisz) vírus emberről-emberrc vivődik át és a fertőzött személyt krónikusan legyengítő fertőzésben nyilvánul meg, amely progrediálva súlyos májkárosodást, primer karcinomát és halált is eredményezhet. A legtöbb esetben ugyan a hepatitisz—B fertőzésekből való teljes felgyógyulás várható, azonban — különösen számos afrikai és ázsiai országban — a népesség széles rétegei a fertőzés krónikus hordozói, ami a betegség széles körű. pandemiás terjesztésének veszélyét hordozza magában.
A hepatitiszt egy vírus-vektor (hepatitisz—B vírus, HBV) okozza, amely teljes állapotában az úgynevezett Dane-részecske — a viriont képviseli és egy DNS-molekulát magába záró, 27 nm méretű nukleokapszidbó! és a nukleokapszidot körülvevő burokból áll. Avirionnal társuló fehérjék közé a mag-antigén (HBcAg), egy DNS-polimeráz és a fertőzött vagy fertőzést hordozó emberek szérumában talált felületi antigén (HBsAg) tartozik. Úgy vélik, hogy a HbsAg az a HBV-aiítigen, amely kiváltja az immunogén antitest (anti— HBs) termelést és így ez lenne a fő alkotórész egy HBV-vakcinában. Az e tárgyra vonatkozó iroda5 lomból különösen Dane és munkatársai Láncét, 1970 (1), 695 (1970); Hollinger és munkatársai; J. Immunology 107, 1099 (1971); Ling és munkatársai; .1. Immunology 109, 834 (1972); Blumberg: Science 197, 17 (1977); peterson és munkatársai:
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 1530 (1977); Vitai Hepatitis, A Contemporary Assessment of Etiology, Epidemiology, Pathogenesis and Prevention (Vyas és munkatársai, kiadók), Franklin Insitute Press, Philadelphia, 1978, érdemelnek figyel15 met; a felsorolt közlemények tartalma hozzátartozik a jelen találmány hátterét képező technika e leírásban történt ismertetéséhez.
A HBsAg a fertőzött plazmában túlnyomórészt körülbelül 16—'5 nm átmérőjű gömbalakú ré20 szecskák — úgynevezett „22 nm-es részecskék” — alakjában van jelen. Ezek a jelenlegi felfogás szerint egy nem-fertőző virális burkot képviselnek. Minthogy a HBsAg elleni antitestek védelmet nyújtanak a HBV-fertőzéssel szemben, ezek a nem-fertőző részecskék hatásosan alkalmazhatók vakcinaként.
Minthogy a hepatitisz—B vírus nem volt fertőzőképes a sejtkultúrákban és csupán fertőzött emberekből vagy inagasabbrendű emberszabású majmokból nyerhető, nem álltak rendelkezésre oly eszközök vagy módszerek, amelyek segítségével elegendő mennyiségű HBV lett volna nyerhető és fenntartható a HBV ellen immunizáló antigén termelésének céljaira.
A technika jelenlegi állása
A 2 034 323A sz. nagy-britanniai közrebocsátási irat, valamint a 13 828 és20251 európai szabadalmi közrebocsátási irat ismerteti a HBV genom elkülönítését és klónozását, a HBV mag-antigén expressziéiül, valamint a HBsAg egy részét állítólag tartalmazó fúziós fehérjének E. coli mikroorganiz45 musban történő termelését. A Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4549 (1980) közlemény beszámol egér-kromoszómának egér-sejtek tandem-klónozott hepatitisz-B genomokkal történt transzformációja útján lefolytatott integrációjáról.
cn Moriarty és munkatársai — Proc, Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 2606 (i981) leírják egy HBV—DNS fraginentet hordozó rekombináns majom 40—vírus (SV40) felépítését. A majomvesc-sejtkultúrákat a virális rekombinánssal fertőzték és így egy cg olyan 22 nm-es részecskét hoztak létre, amely állítólag jellemző a hepatitisz—B-vel fertőzött betegek szérumában talált részecskékre. A Moriarty és munkatársai által alkalmazott rekombináns vektor tartalmazta a HBsAg szekvenciát magában £0 hordozó HBV genomnak egy nagy szegmentjét, tartalmazott továbbá az SV40 tumor-fehérjéket és esetleg más HBV-fehérjéket kódoló DNS-szekvenciákat is. Emellett szerkezetük magában foglalta a HBsAg—DNS-t az SV40 vírus szekvenciáját kódoló VP—2 fehérje keretében. Nem világos a közleményből, hogy érett HBsAg exprimálása is történt-e.
19Ö238 .
A rajzok rövid ismertetése
Az 1. ábra egy SV40 DNS-t tartalmazó pSVR plazmid szerkezetét ábrázolja, a VP—1 fehérjét kódoló tartomány elhagyásával.
A 2. ábra egy HbsAg DNS-t magába foglaló pHS94 plazmid szerkezetét ábrázolja.
A 3. ábra egy HVsAg DNS-t és SV40-ből és pBR322-ből származó DNS-szekvenciákat tartalmazó pSVHBSA plazmid szerkezetét ábrázolja. A B-részben a VP— 1 fehérje ATG-iniciáló kodonját (a felső sorban bekeretezve) körülvevő DNSszekvenciát összehasonlítjuk a rekombinánsban létrehozott HbsAg szekvenciájával (bekeretezett ATG az alsó sorban). Az EcoRl hellyé átalakított Hind III hely alá van húzva.
A 4. ábra plazmid-DNS majom-sejtekben történő replikációját ábrázolja. Cos-scjtek egysejtes rétegét tenyésztettük 6 cm-es műanyag-edényekben, 50—60%-os egybefolyasig. A sejteket Dulbecco-féle módosított közeggel mostuk, majd 2 ml 1 pg plazmid DNS-t és 200 pg DEAE-extránt tartalmazó közeggel kezeltük őket .37 °C hőmérsékleten 12 óra hosszat. A DNS-oklatot azután eltávolítottuk, a sejteket ugyanazzal a közeggel egyszer mostuk, majd 10% magzati borjú-szérumot tartalmazó közeget adtunk a sejtekhez és 37 °C hőmérsékleten 1, iiletőleg 3 napig inkubáltattuk őket a DNS extrakciója előtt. Ekkor kisméretű szuper-tekercseit plazmid—DNS-t különítettünk el Hirt — J. Mól. Bioi. 26, 365 (1967) — módszere szerint. A kapott DNS-t agaróz-gél elektroforézisnek vetettük alá, majd nitrocellulózra vittük át. vö.: Ε. M. J. Southern, J. Mól. Bioi. (18, 503 (1975). A replikálódó plazmidok láthatóvá tétele céljából a nitrocellulóz-szűrőt J-P-vel jelzett HBV DNS-sel kezeltük. Az „a” jelzésű sávok a pRI — Bgl-lcl transzficiált sejtek Hirt-féle lizátumaiból kapott DNS-t szemléltetik; a „b jelzésű sávok a pBs34S—L-le! transzficiált sejtek Hirt-féle lizátumaiból kapott DNS képei; az „M” jelzésű sáv 1 pg pHBs348—L DNS-t szemléltet. A nyilak a zárt cirkuláris DNS (1), illető'eg a nyílt cirkuláris DNS (II) helyét mutatják.
Az 5. ábra a Cos-scjtek ten rekombináns plaztnidok által szintetizált HBsAg mennyiségeit mutatják. A Cos-sejtck egysejt-rétegeit körülbelül 50%os összefolyásig tenyésztettük 6 cm-es műanyagtálkákban. majd a 4. ábrán ábrázolt módon előkészítettük őket DNS-transzfekcióra. 2 ml módosított, 10% magzati borjú szérumot tartalmazó Dulbecco-féle közeget adtunk a tenyészetekhez a transzfekciót követően és a közeget 24 órai akkumuláció után különböző időpontokban vizsgáltuk HbsAg-expresszióra. A HBsAg-expresszió mértéket a 0,2 ml hígítatían közegben kapott percenkénti expresszió-számban (eps, sount per minute) fejeztük ki, a RÍA (Abbott Laboratories) meghatározási módszere szerint.
A 6. ábra a majom-sejtekből származó HbsAg iinmunogenitásáí ábrázolja. A 20 darab, egyenként 15 cin-cs tálban tenyésztett. pH Bs348—L-lel transzfektált Cos-sejtekről kapott közeget cs a HbsAg-t ugyanolyan módon tisztítottuk, amint ezt fentebb, az elektronmikroszkópos vizsgálat céljára történt tisztítás esetében leírtuk. Három, egyenként 5—5 egérből álló csoport állatait 2,8 pg.
•' 0,6 pg, illetőleg O,fOfrpg tiszirtpttJ^gsAg teljes.
... beadni.'
Útján immunizáltuk; kon troli-e gere jj immunizátósara hasonló mennyiségű autentikus» humáp W5 rumból szármázd HBsAg-t (North.' American krgieals (né), alkalmaztunk. As egeret az imspU-” · «jutást követően különböző időpontokban νότςζte'.tük a farkukon; a'RIA (Abbott Laboratories) útján meghatározott anti = HBsAg antitest-tarBd10 mát az egerenkénti átlagos titer alapján fejeztük^ ki A szövetkultúrából kapott HBsAg-vel immuni- záá egerek azonos titert mutattak, mipt a humán szérumból származó HbsAg-vel immunizált ege>15
A 7. ábra az SV40 részeként replikálódó HBS-. szekvenciák jelenlétét igazolja v
A 8A. ábra a rekombináns vektora útján szinte’ tizált HBsAg szacharózgrádiens ülepedését szemlélteti. A 8B. ábra ugyanennek a megfelelő CsCl20 gradiens centrifugálását mutatja.
\ 9. ábra a találmány szerint, 22 nm-es részecskeként szintetizált HBsAgelektron-mikrogrammja.
Sejtkultúra-rendszerek — sejtkulíúra-vektorok
Az emlősállat-sejtek kultúrában történő szaporítása (szövetkultúra) az utóbbi években rutin-eljárássá fejlődött (vö.: Tissue Culture, Academic
Press, szerkesztők: Krusc és Pattérson, 1973). Itt a majomveüe-fibroblasztok CV—1 vonalát alkalmaztuk gazdasejtként HBsAg termelésére. Az itt részletesen ismertetett kísérleteket azonban le lehetne folytatni bármely olyan sejtvonallal, amely képes valamilyen kompatibilis vektor replikáeiójára és expressziójára, tehát például a WI38, BHK, 3T3, CHO, VERŐ vagy HELA sejt vonalakkal. További követelmény az ilyen expressziós vektorral szemben, hogy legyen egy replikáció-kezdó40 pontja és egy promotorja az exprimálandó génnel szemben és vele egy leolvasó-fázisban, a szükséges riboszóma-kötési helyekkel, RNS-hasítási helyekkel, poliadenilezési hellyel és transzkripcionális terminátor-szekvenciákkal együtt. Bár a leírt kí45 serietekben az SV40 említett lényeges elemeit hasznosítottuk és a találmányt ennek az előnyös ' kiviteli módnak az alapján ismertetjük, meg kell jegyezni, hogy a találmány nincs ezeknek a szekvenciáknak az alkalmazására korlátozva. így pél5Q dául felhasználható valamely más vírus (például Polyma, Adeno, Retro, VSV, BPV stb.) vektorainak replikáció-kezdópontja, valamint a DNS-replikáció cclluiáris kezdőpontja is, amelyek nem-intégláit állapotban működhetnének.
55 Emellett az SV40 DNS repíikácjója egy egyedülálló helyen kezdődik és két irányban halad előre [vö.: J. Tooze (szerkesztő); DNS Tumor Viruses,
2. kiadás, Cold Spring Harbor Láb., New York, 1980[. A genetikai bizonyítékok arra mutatnak, g0 hogy csupán egyetlen vírus-gén termék szükséges a vfrus-DNS replikációjához. Ez az A-gén terméke (T- antigén), amely szükséges ahhoz, hogy iniciálja a vtus-DNS szintézisének minden, egyes ciklusát [yö : P. J. Tegtmcyer; J. Virology 10, 591 (1972)}.
Az itt leírt kísérletek azt bizonyították, hogy az SV4Í) DNS-replikácjójánaJk kezdőpontját tartalmazó rekombináns plazmidok majomsejtekben, ,az SV40 nagy T-antigcnjc jelenlétében képesek a replikációra fvö.: Mycrs és Tjian: Proc. Natl.' lAcad. Sci. (USA) 77, 6491 (1981); Lusky és Botchan: Natúré 293, 79 (1981)]. Olyan vektorok megszerkesztése volt kívánatos, amelyek mind a replikúciós, mind a promotor-funkciót megtartják. Kimutattuk azt is, hogy egy ilyen rendszer alkalmazható heterológ gének komplementer segítő-vírus távollétében történő expressziójára.
A találmány részletes leírása
A VP—1 fehérje kódolási tartománya nélküli SV40 DNS felépítése
Az SV40 DNS teljes nukleotid-szekvcnciája már ismeretes [Ν. H. Acheson a J. Tooze által szerkesztett Molecular Biology of Tumor Viruses c. műben, Cold Spring Harbor Láb. Ν. Y. 2. kiadás,
2. rész, 125—204 old. (1980)], ezért a különböző SV40-kódolt fehérjék fizikai helyei közvetlenül korrelációba hozhatók a különféle resztrikciós enzimes hasítási helyekkel. A VP— 1 fehérje kódolási tartományát körülvevő nukleotid-szekvencia vizsgálata (Ν. H. Acheson fent idézett munkájában) két jól definiált resztrikciós endonukleáz-haSÍtási hely jelenlét mutatta (1. ábra). Ezek közül az plső egy Hindin resztrikciós endonukleáz-hasítási hely a 1493 nukleotid-helyzetben, hat 5'-nuk!cotidra a PV—1 fehérje iniciáló kodonjától. A második egy Sí.'/nHl resztrikciós endonukleáz-hasítási hely a 2533 nukleotid-helyzetben, 50 5'-nukleotidra a VP— 1 fehérje terminációs kodonjától. Abból a célból, hogy SV40 DNS-t kapjunk az 1493-nál levő Hindiit hely és a 2533-nal levő β«/ηΗΙ hely közötti rész elhagyásával, az 1. ábrán szemléltetett kísérleteket folytattuk le. Ez röviden úgy történt, hogy vad-típusú SV40 DNS-t először önmHI-val hasítottunk, hogy így megkapjuk a teljes hosszúságú lineáris DNS-t, azután ezt Hmdlll-ma! hasítottuk olyan körülmények között, hogy az egyes DNS-molekulák átlagosan csak egy hasítást szenvedjenek (hat Hindiit hasítási hely van, az SV40 genom hosszában elosztva). Elméletileg az így enzimes kezelés útján kapott 12 DNS-elegyből egy mutatná a kívánt kombinációt. Ezután a dAGCTGAATTC szintetikus dekanukleotidot |R. Crea és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978)] kapcsoltuk az így Eo/uHl és Hindiit enzimmel kezelt SV40 DNS-heza Hindiit hasítási helyeknek (—TCGA) és a dekanukleotidoknak a kohezív végein keresztül. Az egész elegyet azután EcoRI enzimmel kezeltük (hogy kohezív véget hozzunk létre az EcoRI helyen a hozzáadott nukleotidon) és pBR322-höz klónoztuk a Bum és EcoRI helyek [D, V. Goedde! és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 106 (1979)] útján. Az. SV40 szekvenciákat tartalmazó plazmid DNS-t azután resztrikciós analízis útján [R. W. Davis és munkatársai: Advanced Bactcrial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Ν. Y., 116—125 old. (1980)] szűrővizsgálatnak vetettük alá, a kívánt deléciót mutató fragnientet elkülönítettük és pSVR elnevezéssel jelöltük meg.
Az említett szintetikus dekanukleotid hozzáadásának két célja van. Egyrészről a hozzáadott dekanukleotid hasítási helyet tartalmaz az EcoRI resztrikciós endonukleáz számára; az SV40 DNS e részében nincsen ilyen hasítási hely. Ezért a kívánt SV40 DNS vektor-fragment könnyen nyerhető nagy mennyiségekben a pSVR plazmid E. coli mikroorganizmusban történő tenyésztése [D. H.
lamer és P. Leder: Cell, 18, 1299 (Í979)], majd EcoRI és Em«l II endonukleázzal való hasítás útján. Másrészről a hozzáadott dekanukleotid helyreállítja az eredeti fizikai távolságot a Hindiit hasítási hely és a VP—1 fehérje iniciálé kodonja között, ha valamely idegen gén kódoló szekvenciáit tartalmazó, helyesen felépített DNS-t kapcsoljuk ehhez az SV40 DNS-hez az EcoRI kapcsolási helyen keresztül (lásd a 3B. ábrát).
A Eo/jjHI enzimmel hasított lineáris, teljes hoszszúságú SV40 vírus —DNS (amely a vad-típusú SV40 vírus—DNS vagy a PBR322 EomHI helyén klónozott SV-10 DNS Eo/nHl enzimmel történő hasítása útján nyerhető) 8 pg mennyiségét 2 egység Hindill (BRL) enzimmel kezeltük egy 50 pl térfogatú, 20 mmol/l trisz-kloridot (pH=7,5), 60 mmol/l nátrium-kloridot és 7 mmol/l magnézium-kloridot tartalmazó elegyben. 30 percig inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten, majd feleslegben levő ctiléndiamin-letraccetsav (EDTA) hozzáadása útján megállítottuk a reakciót cs a reakcióelegyet fenollal való extrahálás, majd etanollal való lecsapás útján mentesítettük a fehérjéktől. Az enzimmel részlegesen hasított DNS-t azután 10 μ! TEpufferoldatban (10 mmol/l trisz-klorid, pH=7,5 és 1 mmol/l EDTA) újra szuszpendáltuk.
A Hindill helyen levő kohezív végnek EcoRI helyen levő kohezív véggé történő átalakítása céljából 0,1 mmol szintetikus dAGCTGAATTC dekanukleotidot először adenozintrifoszfáttal (ATP) foszforilezlünk T4 polinukleotid-kináz segítségével, 10 pl térfogatú, 50 mmol/l glicin-pufíert (pH=9,l), 10 mmol/l magnézium-kloridot, 5 mmol/l DTT-t, 0,5 mmol/l ATP-t és 10 egység kinázt tartalmazó reakcíóelegyben. 37CC hőmérsékleten inkubáltuk l óra hosszat. A kinázos reakcióelegy 3 pl alikvot-részét azután hozzáadtuk egy 20 pl térfogatú, 66 mmol/l trisz-kloridot (pH=?,5), 6,6 mmol/l magnézium-kloridot, mmol DTT-t, 0,05 mg/m! BSA-t, 0,5 mmol/l ATP-t, 4 pg Hindiit enzimmel részlegesen hasított SV40 DNS-t (lásd fentebb) és 10 egységT4 DNS-ligázt tartalmazó kapcsolási reakcióelegyhez. A kapcsolási reakciót 20 °C hőmérsékleten körülbelül 16 óra hosszat inkubáltuk.
A fenti módon kapcsolt DNS-t azután EcoRI resztrikciós endonukleázzal kezeltük, hogy EcoRI kohezív véget hozzunk létre a hozzákapcsolt kapcsoló-tagon, majd a terméket fenollal mentesítettük a fehérjéktől, etanollal lecsaptuk és egy 15 μΙ térfogatú, fenti összetételű kapcsolási reakeióelegyben kapcsoltuk a pBR322 EoorHI — EcoRI fragmentjéhez (0,5 pg); az így kapott terméket azután E. coli 294 tanszformálására használtuk fel. Az így kapott transzformánsokból elkülönített plazmidokat azután szűrővizsgálatnak vetettük alá, hogy megfelelő SV40 DNS-fragmenteket iktathassunk be különböző resztrikciós enzimekkel történő kezelés útján.
/, 1 IBsAg szerkezeti gén elkülönítése
A fenti módon felépített SV40 vektort a hepatitisz—B vírus felületi antigénjét (HBsAg) kódoló gén expressziójára terveztük. A HBsAg egy 25 0(W molekulasúlyú, rendes körülmények között komplex részccskés szerkezetű (22 nm átmérőjű részecskékkel), részlegesen glikozilezett polipeptid, amely a fertőzött májsejt külső felületére választódik ki [O.'Blumberg: Science /97, 19 (1977)].
A HBsAg-nek’a fenti módon megszerkesztett SV40 vektorban történő expressziójára alkalmazható és a HBsAg kódoló szekvenciáját tartalmazó ideális DNS-fragmentnek a következő feltételeket kellene kielégítenie: Először, ennek a DNS-nek egy EcoRI resztrikciós helyet kell tartalmaznia az egyik végén, egy EoozHI helyett pedig a másik végén. Másodszor, az EcoRI helynek közvetlenül 5' re kell elhelyezkednie a HbsAg iniciáló kodonjához képest, úgy, hogy helyreállítható legyen a VP—1 fehérjében az ATG eredeti helyzete. Végül, a keletkező rekombináns SV40 molekulának hasonló méretűnek kell lennie a vad-típusú SV40 DNS-hez, hogy eredményesen bevihető legyen vírus-részecskékbe. E feltételek kielégítésének í biztosítása céljából egy kísérletsorozatot végez' tünk, amelynek részleteit a 2. ábra szemlélteti.
E szerkezet egyik fontos vonása egy EcoRI rcszt; rikciós hely létrehozása közvetlenül 5'-re a HbsAg 1 feltételezett ATG iniciáló kodonjához. Ezt egy szintetikus dATGGAGAACATC dodekámer használata útján értük cl; ez a dodekamer az iniciáló kodonnak és a következő 3 aminosavnak megfelelő szekvencia a HbsAg-ban és egy helyzetspecifikus primer az E. coli DNS-polimerázhoz, a DNS-nek egyszálú klónozott HBV DNS-ből történő szintézisére. A szintetikus DNS-t azután, megfelelő enzimes kezelés után összekapcsoltuk a klónozott HBV DNS-sel egy intakt HBsAg gén helyreállítása céljából és így egy a végén EcoRI helyet tartalmazó kezelt vektor DNS-í kaptunk a kívánt EcoRI hely újbóli helyreállítására. Az így kapott plazmidot pHS94 névvel jelöltük meg.
A HBsAg-t kódoló sz< rkezeti gént egy a teljes HBV-genomot tartalmazó és a pBR322 EcoRI helyzetébe klónozott pHBV—T—1A plazmidból nyertük ki. Ezt a kiónt hasonló módszerekkel állítottuk elő, mint amilyeneket P. Valenzuela és munkatársai — Natúré 280, 815 (1978) — valamint
P. Charnav és munkatársai — Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76, 2222(1979) — nemrégiben leírtak.
Az említett szerkezeti gént kétféle úton módosítottuk: í. abból a célból, hogy bevigyünk egy egyedülálló resztrikciós helyet közvetlenül a kezdeti ATG metionin kodon előtt, és 2. hogy a HbsAg génhez távolesó HBV Hpa 1 helyet toinpavégűen kapcsoljuk a pBR322 betöltött EcoRI helyéhez. A HBsAg szerkezeti gént tartalmazó DNS-fragment említett két módosítását az alábbi módon hajtottuk végre.
1. 50 pgpHBV—T—1A DNS-t először 80 egység Hpa II enzimmel kezeltünk 200 μ! térfogatú, az enzim szállítója (BRL) által megadott összetételű reakcióelegyben, az ugyancsak a szállító által megadott reakciókörülmények között és így egy
1,7 kb. DNS-fragmentet kaptunk, amelyben a HBsAg kódoló szekvenciáinak iniciáló kodonja szorosan az irány-szál (sense-strand) 5'-végének közelében körülbelül 400 bp) helyezkedett el. A DNS-t poliakrilamid-gélen végzett elektroforézissel tisztítottuk. A tisztított Hpall fragmentet ezután 2 egység lambda-exonukleázzal kezeltük 100 μΐ reakcióelegyben (a New England Biolab cég készítménye) 30 percig 37 °C hőmérsékleten. A lambda-exonukleáz egy a kétszálú DNS enzimes hasítására alkalmas 5'-exonukleáz. Ez a hasítási reakció lebontja a „sense-strand” DNS 5'-felét a HBsAg-kódoló szekvenciákról és szabaddá teszi az ellenértelmű szálat (antisense strand) a hozzáadott printerrel való párosításra. A lambda-exonukleázzal kezelt DNS-t fehérjementesítettük és újból szuszpendáltuk egy 50 μΐ térfogatú, 40 mmol/I kálium-foszfát puffért (pH=7,4) 1 mmol/I DTT-t, 50 pg/ntl BSA-t, 6 mmol/I magnézium-kloridot, 0.5 mmol/1 mindegyik fajta dNTP-t és 0,2 n mól dATGGAGAACATC-t (az 5'-\égen 32P-jclzett, polinukelotid kináz segítségével) tartalmazó reakcióelegyben. Az elegyet először 1 percig 90°C hőmérsékleten tartottuk, majd hirtelen lehűtöttük 0°C-ra és 30 percig ezen a hőmérsékleten tartottuk, azután pedig3 óra hoszszat inkubáltuk 2 egység E. colt DNS-polimeráz 1 Klenow-fragment [H. Jacobsen és munkatársai: Eur J. Biochem. 45, 625 (1974)] jelenlétében. A DNS-polimeráz a hozzáadott primer által iniciált DNS-t és 3'—OH végeket tartalmazó, lebontott. egyszálú DNS-t szintetizál és így tompavégű DNS-molekulákat hoz létre. A kapott DNS-t azután mentesítettük a fehérjéktől, 45 egység Xba I enzimmel 100 pl reakcióelegyben történő kezelés útján hasítottuk egy a HbsAg génen belüli helyen és vágiil poliakrilamid-gélen frakcionáltuk. így egy 91 bázis-páros, a HbsAg gén első 30 kodonját tartalmazó DNS-fragmentet különítettünk el autoradtografikus detekció után („A” fragment).
Egy egyedülálló resztrikció-heíynek közvetlenül a H£<sAg géntől 5'-re történő létesítése céljából a pBR322 plazmid egy pNCV elnevezésű származékát [Goeddel etc,, Natúré 287,413 (1980)] használtuk fel, amely az
AATTCTGCAG
GACGTCTÍAA szekvenciájú szintetikus DNS-szegmentet tartalmazz t az EcoRI helyen. Egy Pstl hely is be van iktaö a ebbe a szintetikus DNS-szekvenciába. Először 10 pg pNCV DNS-l hasítottunk 24 egység Pstl enzimmel 100 μΐ reakcióelegyben, majd 2 egység E. coli DNS-polimcrázKlenowfragmenttel kezeltük 50 μΐ reakcióelegyben a fentebb leírt módon, 1 óra hosszat 8°C hőmérsékleten. A DNS-polimerázza! való kezeléssel a Pstl enzimes kezelés által létrehozott 4 bázis-páros 3'-nyúlványt távolítottuk el, majd BnmHI-vel hasítottunk, s így egy érintetlen EcoRI resztrikció-helyet tartalmazó tompavégű DNS maradt vissza „B” fragmentként, amely tartalmazta a pBR322 replikációjának kezdőpontjait. A fentebb leírt módon előállított tompavégű „A HbsAg gén-fragmentet ezután kapcsoltuk a „B” fragment EcoRI helyéhez. Ezt a műveletet egy háromfragment-kapcsolással hajtottuk végre és így a pHS94 plazmidot hoztuk létre. A harmadik fragmentet („C” fragment) a következő módon állítottuk elő:
2. A pHBV—T—1A plazmidból Hpal enzimmel történő hasítás útján egy a HBsAg gént tartalmazó 1700 bp fragmentet hasítottunk ki. A Hpal helyet a pBR322 plazmid egy előzőleg DNS-polimeráz l Klenow fragmenttel [H. Jacobsen és munkatársai: Eur. J. Biochem. 45, 623 (1974)] kitöltött EcoRI helyéhez kapcsoltuk. Ezt a pBR322 származékának szubklónozása útján hajtottuk végre és így a pHS42 plazmidot kaptuk. Ezt a plazmidot azután az Xbal enzimmel (amely 31 kodonnál hasít) és a EuwHI enzimmel (amely 375 bázis-párt hasít le a pBR322 EcoRI helyéről) hasítottuk, és így a HBsAg gén legnagyobb részét, a HBsAg géntől különálló körülbelül 150 bázispárt, valamint a tetraciklin-rezisztencia-gén első 200 bázis-párját tartalmazó promotor/operátort tartalmazza. Ezt a Akai és Bam Hí enzimekkel kötött „C” DNS-fragmentet poliakrilamid-gélen történő frakcionálással különítettük cl cs a fentebb leírt háromfragment-kapcsolásban használtuk fel a pHS94 plazmid előállítására (2. ábra).
HBsAg szintetizálására képes rekombináns SV40 DNS felépítése
Annak biztosítására, hogy nagy mennyiségű megfelelően kapcsolt DNS álljon rendelkezésünkbe majomsejtek transzfekciójához, a kapcsolt 'DNS-t E. coliban klónoztuk a következő módon:
A pSVR-ből származó, SV40 DNS-ϊ tartalmazó BfímH! EcoRI fragmentet a 3. ábrán szemléltetett módon először a pHS94 plazmidból származó hepatitisz felületi antigént tartalmazó EcoRI — ZfawHJ fragmenttel kapcsoltuk az EcoRI helyen keresztül, majd az így kapott fragmentet a pBR322 Bo/mHI helyébe klónoztuk.
A helyesen felépített pSVHBSA DNS azután a EuoiHI reszt rikció-endonukleázzal hasítható, amikor is a DNS 5382 nukleotidot tartalmazó fragmentjét kapjuk, ez egy rekombináns SV40 genomból áll, amelyben a PV - 1 fehérje kódolási tartománya helyett hepatitisz felületi antigént kódoló gén kódoló tartománya van jelen
A pSVHBSA DNS felépítése céljából 0,3 (tg (SV40 DNS-t tartalmazó) DNS-fragmentet a BamHI + EcoRl enzimmel kezelt pSVR DNS-röl, SO ng (pBR322-t tartalmazó) DNS-fragmentet a Bíí/nHJ-vel kezelt pHBV—T— 1A DNS-böl és 0,2 ng (HBsAg-t tartalmazó) DNS-szekvenciát a BatnHI + EcoRI enzimmel kezelt pHS94 plazmidból, T4 DNS-ligáz segítségével összekapcsoltunk BamHí, illetőleg EcoRI helyeiken keresztül, 15 ml ligációs elegyben éjjelen át történő inkubáció útján. A helyesen kapcsolt DNS-termékck egyik része a pBR322 egy intakt tetR génjét rekonstituálta és így ez a telK alapján kiszelektálható a vektor DNS ön-ligációja útján keletkezett nagyszámú tets rekombináns közül. A pSVHBSA szerkezetét azután resztrikciós enzimmel való kezelés útján igazoltuk.
Rekombináns SV40 vírus szaporítása és HbsAg expressziója majomsejtekben
A hepatitisz felületi antigén ilyen vektor-rendszerben történő szintézisének hatásosságát oly módon ellenőriztük, hogy a BeoiHI-vel hasított pSVHBSA DNS-t a DEAE-dextrán módszerrel jJ. H. McCutehan és J. S. Pagano: J. Nat. Cancer Inst. 41, 351 (1968)] bevittük CV-1 sejtek egysejtrétegébe [J. E. Mertz és P. Berg: Virology 62, 112 (1974)] ésa sejteket vagy tsA28 vagy tsA58 vírussal [P. J. Tcgtmeyer: J. Virology 10, 591 (1972)] fertőztük. A CV —1 egysejt-réteget azután 41 °C hőmérsékleten inkubáltuk megfelelő körülmények között (vö.: J. H. McCutehan és J. S. Pagano, i.m.). A tsA28 és tsA58 egyaránt hőmérsékletre érzékeny mutánsok az SV40T antigénben és ezért 41 °C hőmérsékleten nem képesek szaporodni [vö.: N. J. Acheson: Molecular Biology of Tumor Viruses (szerk. J. Tooze), Cold Spring Harbor Láb., Ν. Y. 2. kiad., 2. rész, 125—204old. (1980)]. Plasonlóképpen, a csupán rekombináns SV40 genomot (pSVNBSA) tartalmazó CV—1 sejtek nem termelnek fertőző vírust, mert a pSVHBSA-nak h ányzik a VP —1 gén. Amint várható volt, 4 nap múlva citopátiás hatást észleltünk azonban a CV— 1 sejtekben, amelyek mind a ts SV40 vírust, mind a rekombináns SV40 genomot tartalmazták. Kétheti inkubálás után teljes sejt-lízis volt megfigyelhető. Azokban a CV — 1 sejtekben viszont, amelyek csak vagy rekombináns SV40 genomot, vagy ts SV40 vírust kaptak, citopátiás hatást nem tapasztaltunk. Szokásos ipari radioimmunológiai módszert („Austria 11 — 125”, Abbott Laboratories) alkalmaztunk a HbsAg kimutatására. és így azt tapasztaltuk, hogy a DNS bevitele után már 4 nap múlva kimutatható a felületi antigén termelése a kultúra-közegben. A mennyiségi meghatározás azt mutatta, hogy 1,106 CV— 1 sejt egysejt-rétege 3,8 pg-ig menő mennyiségű HbsAg antigént termel az egyes fertőzési ciklusokban, ami sejtenként 9,107 molekulának felel meg. Ez a szám csaknem azonos az egy-egy fertőzési ciklusban SV40 VP—1 fehérje-molekulák becsült számával (vö.: Ν. H Acheson, i.m.),
Annak meghatározása céljából, hogy a rekombináns SV40 genom az SV40 vírushoz hasonlóan a CV— i sejtekben van-e bezárva és ott szaporodik-e, a CV—1 sejtek egy rétegét 41 °C hőmérsékleten ts SV40 vírussal és emellett az eredeti együtt fertőzött sejtek lizátumának egy hányadrészével fertőztük. 72 órával a fertőzés után kis molekulasúlyú DNS-t különítettünk el a fertőzött sejtekből, Β. I. Hírt [J. Mól. Bioi. 26, 365 (1967)] módszere szerint. Az elkülönített DNS-t vagy kezeletlenül vagy resztrikciós endonukleázokkal való kezelés után, agarázon történő gél-elektroforézissel frakcionáituk. A frakciónak DNS-t azután denaturáltuk és nitrocellulóz-papírra vittük át Ε. M. J. Southern [J. Mól. Bioi. 98, 503 (1975)] módszere szerint, majd ,2P-vel jelzett pHS94 DNS-sel kezeltük. Amint a 7. ábrán látható, a hepatitisz génszekvenciát tartalmazó rekombináns DNS molekulák legnagyobbrészt zárt-cirkuláris DNS alakjában vannak jelen, az SV40 vírus-DNS-től megkülönböztethetetlen mérettel („A” sáv). A rekombináns DNS nagyobb része in vivő ligáció útján regenerálja őmnHI helyét („B” sáv). Amint várható volt, a hepatitisz—B felületi antigén kódolási tartományát tartalmazó Bam EcoRI fragment (3. ábra) változatlan alakban szintén elkülöníthető.
CV—1 sejtek egy 150 mm átmérőjű lemezpt 90%-os összefolyásig tenyésztettük, majd egy eredeti transzfekciós kísérletből származó, rekombináns és tsA28 vírusokat egyaránt tartalmazó lizátummal fertőztük a tenyészetet és feleslegben levő tsA28 vírust adtunk hozzá és 41 °C hőmérsékleten inkubáltuk. 70 órával a fertőzés után a közeget begyűjtöttük a szintetizált HBsAg jellemzése céljából. Emellett intracelluláris kis molekuiasúlyú DNS-t különítettünk el B. J. Hirt módszere (lásd fentebb) szerint. Az elkülönített DNS-t újból szuszpendáltuk 1 ml térfogatú, trisz-kloridot (pH=7,4) és 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó pufferoldatban.
Ezután 5 mi hasítatlan DNS-t és 5 μ] ThwiHI-vel kezelt DNS-t 0,8%-os agaráz-gélen, TBE pufferben lefolytatott eiektroforézissel frakcionáltunk; kontrollként SV40 DNS-t kezeltünk ugyanilyen módon. A gélen kapott DNS-képet nitrocellulózpapírra vittük át és a HbsAg gén-minta forrásaként alkalmazott ’-'P-vel jelzett pHS94 DNS-ra hibridizáltunk [vő.·, E. M. J, Southern: J. Mól. Bioi. 98, 503 (1975)]. A HP-vel jelzett pHS94 hibridizáció utáni autoradiografikus képet a 7. ábra mutatja. Az „A” és „B sávok kezeletlen Hirt-féle szuper: natáns, illetőleg Bíz/wl ll-vel kezelt Hirt-féle szuprenatáns DNS képei. Az „I”, „II” és „III” jelek a kontroll SV40 DNS I, II illetőleg 111 alakjának a ; helyzetét mutatják; ezeket a helyzeteket etidium' bromiddal való megfestés útján határoztuk meg, a
DNS nitrocellulóz-papírra történt átvitele előtt.
A pSVHBSA által kódolt hepatitisz felületi antigén részecske-alakban történő szintézise
A fertőzött májsejtek a hepatitisz felületi antigént részecske-alakban szintetizálják és választják ki [vö.: O. Blomberg: Science 797, 19 (1977)].
' A különféle klónozott hepatitisz—DNS-ek szekvencia-analízise arra a lehetőségre utal, hogy az érett felületi antigén egy nagyobb molekulájú prekurzor-fehérjéből hasítható 1c [P. Charnay és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 2222 (1979)]. Minthogy a leírt szerkezeti felépítésű SV40 genom csak érett HBsAg-molekulát kódoló DNS-t tartalmaz, néhány 3'-helyzetben transzlatálatlan szekvencia mellett, felmerül a kérdés, hogy a feltételezett prekurzor-fehérje játszík-e valamilyen funkcionális szerepet a 22 nm-es részecske szintézise és a szintézis befejezése utáni kiválasztása során. Ezért a szintetizált hepatitisz felületi antigén jellemző tulajdonságait (ülepedési sebesség, ülepedést egyensúly és elektron-mikroszkópiái analízis) az autentikus fehérjéivel hasonlítottuk össze. Amint a 8. ábrán látható, az általunk alkalmazott vektor-rendszerben szintetizált hepatitisz felületi antigén ülepedési sebessége nem különbözik a fertőzött májsejt-vona! közegéből [J. J. Alexander és munkatársai: S. Afr. Med J. 50, 2124 (1976)] elkülönített hepatitisz felületi antigénétől, úsztatási sűrűsége l,22g/cin’, ami szintén hasonló a 22 nm-es részecske-alakú autentikus felületi antigénéhez (vö.: O. Blumberg,
i.m.). A tisztított felületi antigén elektron-mikroszkópos vizsgálata is azt mutatta, hogy a szintetizált felületi antigén túlnyomóan részccske-szcrke8 zetű, 220 A (22 nm) átlagos részecske-átmérővel, tehát morfológiailag azonos az autentikus 22 nincs részecskékkel (8. cs 9. ábra). Ennek alapján megállapítható, hogy az érett hepatitisz felületi antigén fehérje-monomer az egyetlen olyan hepatitisz vírus által kódolt lényeges szerkezeti komponens, amely szükséges a 22 nm-es részecskék felépítéséhez.
A) A CV—1 sejtekben szintetizált HBsAg ülepedési sebességének összehasonlítása a PLChepat ima-sejtvonal [vö.: J. J. Alexander és munkatársai: S. Afr. Med. J. 50, 2124 (1976); P. L. Marion és munkatársai: J. of Virol. 32, 796 (1979)] által szintetizált és kiválasztott HbsAg ülepedési sebességével (8Á. ábra):
Az e kísérletben alkalmazott HBsAg a 7. ábrán szemléltetett kísérletben kapott kultúra-közegből származott; a PLC sejtvonal által termelt HBsAg-t c sejtvonal kultúra-közegből nyertük. A kétféle kultúra által termelt HBsAg-t ammónium-szulfáttal történő 45%-os telítés útján választottuk le a kultúra-közegekből, majd 20 mmol/1 trisz-kloridot (pH=7,4), 0,5 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat és 0.5 mmol/1 nátrium-khuidot tartalmazó pufferoldatban újra szuszpendáltuk őket 0,5 pg/ml HBsAg végső koncentrációban. Mindegyik mintából 200 -200 μΙ mennyiséget vittünk fel 2—2 párhuzamos kísérletben 5—5 ml ugyanilyen pufferoíd.ittál készített sacharóz-grádiensre (5—20% szacharóz-tartalommal). A mintákat egy Beckman SáV 50.1 rotorban 45 000 percenkénti fordulattal 80 percig centrifugáltuk 4°C hőmérsékleten, A HBsAg-tartalom meghatározására egy „Ausria
11—25” (Abbott Laboratories) HBsAg-meghatározó készletet használtunk. A HBsAg-visszanyercs mindkét fajta HBsAg esetében 80% felett volt.
B) A CV — 1 sejtekben szintetizált HBsAg úsztatásos sűrűség-meghatározása (8B. ábra):
Az összegyűjtött fertőzött kultúra-közegből ammónium-szulfáttal 45%-ig történő telítés útján lecsapott 2 pg HBsAg-t agaróz-gél permeációs oszlopon (A 0,5 M, Bio-rad) frakcionáltuk, majd
5—20%-os szacharóz-gradiensen keresztül ülepítettük, az A) bekezdésben leírt módon. A szacharóz-grádiens centrifugálása után az összegyűjtött HBsAg-t szacharóz nélküli grádiens-pufferrel szemben dializáltuk, azután szilárd cézium-kloridot adtunk hozzá, olyan mennyiségben, hogy a 7 ml térfogatú oldat végső sűrűsége 1,2 g/cm’ légy,m. Ezután Sonvall T 865.1 rotorban, percenként 50000 fordulattal 68 óra hosszat centrifugáltuk. A meghatározást az A) bekezdésben leírt módon végeztük. A HBsAg visszanyerése a cézium-szulfát gradiensben körülbelül 70% volt. A csúcs-frakciókat azután egyesítettük, 100 nnnl/1 nátrium-kloridot és 0,5 mmoi/1 etiléndiamin-tetraeeetsavat tartalmazó 10 inml/l-es trisz-klorid pufferoldattal szemben dializáltuk, betöményítettük és előkészítettük az elektronmikroszkópiái vizsgálathoz.
Az antigén elektronmikroszkópiái viszgálatra való előkészítése céljából szénnel bevont rész-rácsokat készítettünk. A 1 pg/ml HBsAg-fehérjét tartalmazó puffcroklatból egy cseppet vittünk fel egy rácsra cs szobahőmérsékleten 30 percig állni hagytuk. A feherjeoldatot sugárirányban fel itattuk a rácsról cs 4 csepp vízzel egyszer mostuk. A rácsot
96238 ‘azután 1,0%-os nátrium-foszförvolframát-oldattal (pH=7,6) egy percig kezeltük, majd szűrőpapírral megszárítottuk. Az elektronmikrogrammokat Phillips Ε. N. 400 elektronmikroszkóppal készítettük, 77700-szoros nagyítással. A kapott negatív felvételről körülbelül 10-szeres nagyítással készítettünk pozitív képet (9. ábra).
HBsAg-t exprimáíő neni-litikus vektorok felépítése
Olyan rekombináns plazmidokat gyűjtöttünk össze, amelyek a pML plazmidból [Lusky és Botéban, Natúré 293, 79 (1981)] származó pBR322 szekvenciákat, a DNS-replikáció kezdeti zónáját, valamint korai és késői transzkripciós egységek promotor-szekvenciáját magába foglaló 348 bázispárok SV40—DNS-t és a HBsAg génjét kódoló HBV-szekvenciákat tartalmaztak. Az SV40 kezdő-helyét az SV40—DNS HindllI enzimmel való lebontása útján izoláltuk, és a HindlII-végeket konverter (AGCTGAATTC) hozzáadása útján EcoRI-végekké alakítottuk át. Ezt a DNS-t azután PvuII enzimmel hasítottuk és EcoRI-kapcsoiókat (linkereket) adtunk hozzá. EcoRI enzimmel való kezelés után a kezdőpontot átfogó, 348 bázis-párt tartalmazó fragmentet poliakrilamid-gélen végzett elektroforézis és elektroelució útján elkülönítettük ,és pBR322-ben klónoztuk. A pHBs348 —E cs 'pHBs348—L expressziós plazmidokat oly módon építettük fel, hogy a pHBV—Τ—IA plazmidból nyert HBV genom EcoRI és BglII enzimekkel való kezelése útján kapott és a HBsAg-t kódoló gént átfogó, 1986 bázis-párt tartalmazó fragmentet [vö.: Animál Vírus Genetics (szerk.: Fields, Jaenisch és Fox) 5. fejezet, 57. old., Academic Press, N. Y. (1980] a pML plazmidba klónoztuk (vö.: Lusky és Botchan, i.m.) az EcoRI és BamHI helyen. (A* pML plazmid a pBR322 oly származéka, amelyből deléció következtében hiányzanak a plazmid-replikációt majomsejtekben gátló szekvenciák, vö.: Lusky és Botchan, i.m.). A kapott plazmidot (pRI —Bgl) azután EcoRI segítségével linearizáltuk és az SV40 kezdő-tartományát képviselő, 348 bázis-párból álló fragmentet beviftük pRI —Bgl plazmid EcoRI helyére. A kezdő-tartományi fragment bármelyik orientációban beléphet. Minthogy ez a fragment a replikáció kezdőtartomány mellett az SV40 korai és késői promotorait is kódolja, a HBV gének expressziója lehetséges volna bármelyik promotor irányításával, annak orientációjától függően (így pHBS348—E a korai promotor irányítása alatt exprimált HBS*t, pHBS348—L pedig a késői promotor irányítása alatt exprimált HBS-t képviseli).
Az SV40—HBV plazmid replikációja majomsejtekben
A FIBV—SV40 rekombináns plazmidoknak a COS—7 majom-sejtvonalban történő replikációja a következő módon bizonyítható:
A DEAE-dextrános módszerrel történő DNStranszfekció után különböző időpontokban kis molekulasúlyú DNS-t különítettünk el Hirt [J. Mól. Bioi. 26, 365 (1967)] módszere szerint, majd ezt agaráz-gélen elektroforézissel frakcionáltuk és
Southern [J. Mól. Bioi. 98, (1975)] hibridizációs módszerével elemeztük a terméket. A 4. ábra mutatja, hogy közvetlenül a transzfekció után a COS-sejtekben összegömbölyödött plazmid alig vagy egyáltalán nincs jelen. Három nappal a transzfekció után azonban a bevitt DNS kiterjedt replikációja következett be, a pHBS348—L DNS („b” sáv) vagy pHBS348— E bevitelét követően. Amint várható volt, a pRI — Bgl plazmid transzfekcióját követően plazmid-replikáció nem volt megfigyelhető. [A pRI—Bgl plazmidból hiányoznak az SV40-kezdeti szekvenciák, egyébként azonban ez a plazmid azonos a fenti expresszió-plazmidokkai („a” sávok)].
HBsAg szintézise rekombináns plazmidokkal transzfektált majomsejtekben
ApML,pRI-Bgl,pHBS348-EéspHBS348L plazmidoknak a COS—7 majom-sejtvonal [Guzman: Cell 23, 175 (1981)] sejtjeibe való bevitele során a DEAE-dextrános módszert [J. H. McCutchan és .1. S. Pagano: J. Nat. Cancer Inst. 41, 351 (1968)] annyiban módosítottuk, hogy a kezelési időt cs a sejtek DEAE-dextránnal és DNS-nek való kitétdi idejéf 12 órára növeltük. A COS—7 sejtvonal az SV40 egy korai szakaszának egy integrált kópiáját fogadja magába és konstitutív módon exprimálja az SV40 A gén-terméket (T-antigén). Az SV40— DNS-replikáció egy funkcionális kezdőpontját tartalmazó plazmídokró! kimutatták, hogy majomsejtekben SV40T-antigén jelenlétében replikálódnak [vö.: Myers és Tjian: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 6491 (1980); Lusky és Botchan: Natúré 293, 79 (1981)]. Az 5. ábra mutatja, hogy a plIBS348—E és pHBS348—L plazmidokkal transzfektált COS-sejtek a 2. napon kezdték meg HBsAg szignifikáns mennyiségekben való expresszióját és két heten át folytatják ezt az expressziót. a pHBS348—L által irányított expresszió szintje valamivel magasabb, mint a pHBS348—E által irányított expresszióé. E kísérleti eredmények egyik lehetséges magyarázata az, hogy késői S V40 promotor talán hatásosabb ebben a rendszerben a korai promotornái.
A szövetkultúrából származó HbsAg immunogén hatású az állatokban
Miután kimutattuk, hogy a HBsAg szövetkultúrából származó részecskéi antigén-aktivitásúak, kívánatos volt megállapítani azt is, hogy vajon ezek a részecskék állatokban immunogén hatásúak-e. Ezért a COS—7 sejtek által termelt antigént ammónium-szulfáttal történő lecsapás, szacharózgradiens centrifugálás és cézium-kloridos sűrűséggradiens centrifugálás útján tisztítottuk, majd a tisztított szövetkultúra-eredetú HBsAg-t injekció útján beadtuk egy kísérleti egér-csoport mindegyik egerének, míg a kontroli-csoport egereit a kereskedelemben beszerezhető humán szérumból származó HBsAg (a North American Biologicals Inc. cég készítménye) azonos mennyiségeivel immunizáltuk. Az immunizálás után különböző időpontokban meghatároztuk az anti —HBsAg titert az állatokban. A 6. ábra mutatja, hogy szignifikáns anti-HBsAg litert találtunk, mind az autentikus HBsAg-vel immunizált egerekben, mind a szövetkultúrából származó HBsAg-vel immunizált egerekben is. Emellett az anti-HBsAg antitest megjelenésének kinetikája és titere a szövetkultúrából származó HBsAg-vel immunizált egerekben nem volt megkülönböztethető az autentikus HBsAg-vel immunizált egerekben megfigyelttől. Ezért joggal következtethetünk arra, hogy a rnajomsejtekben rekombináns DNS technikával szintetizált HBsAg immunogenitás szempontjából legalább is hasonló, sőt feltehetően azonos a humán szérumból származó HBsAg-vel, amelynek vakcinaként való hatásossága a gyakorlatban már teljesen beigazolódott.
Gyógyszerkészítmények
A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek az ilyen célokra ismert ejárásokkal alakíthatók gyógyászati felhasználásra alkalmas készítményekké, oly módon, hogy a polipeptidet valamely gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal keverjük össze. Az e célra alkalmas vivőanyagokat cs a készítmények előállítása során alkalmazható eljárásokat például az E. W. Martin által szerkesztett „Remington’s Pharmaceutical Science” c. mű ismerteti. Az ilyen készítmények a polipeptid hatásos mennyisége mellett a vivőanyag megfelelő mennyiségét tartalmazzák. A készítményeket előnyösen parenterális beadásra alkalmas alakban készítjük el. Az állatgyógyászati készítmények a humán gyógyszerkészítményekhez hasonló módon — a szakmabeliek számára kézenfekvő módosításokkal — állítjuk elő.
Vakcinák előállítása
Vakcinákat a találmány érteimében önmagukban ismeri eljárásokkal állíthatunk elő, valamely a találmány szerinti eljárással előállított polipeptidnek valamely vakcinák előállítására alkalmas vivőanyaggal való összekeverése útján. Vivöanyagként például sóoidatok alkalmazhatók, önmagukban ismert segédanyagok és/vagy vírusos fertőzések megelőzésére szolgáló készítményekben szokásos egyéb adalékok hozzáadásával. Az ilyen vakcinák a polipeptid hatásos mennyisége mellett az említett vivóanyag megfelelő mennyiségét tartalmazzák. Előállításukra vonatkozólag utalunk például a „New Trends and Deveíopments in Vaccines” (szerk.: A. Voller és H. Friedman, University Park Press, Baltimore, 1978) c. művére, amelyben a vakcinák előállítására vonatkozólag további részletes adatok találhatók.
A találmány szerinti eljárás során az ilyen vakcinák hatóanyagának előállítására alkalmazott különleges módszerek következtében e vakcinák lényegileg mentesek idegen fehérjéktől és egyéb vírus- vagy sejt-komponensektől. Ezért a vakcinák alkalmazása esetén kevésbé valószínű a teljes elölt vagy legyengített vírust tartalmazó vakcinák esetében ismert szövődmények fellépése.
A szakmabeliek számára a fenti ismertetés alapján nyilvánvaló, hogy a találmány köre nem korlá. tozódik a részletesen ismertetett előnyös kiviteli alakokra, hanem általásosságban kiterjed az alábbi igénypontokban meghatározott oltalmi körre.
Claims (4)
- Szabadalmi igénypontok 10 1 Eljárás prcszekvencia nélküli érett hepatitisz—B felületi antigént mintegy 22 nm átlagos átmérőjű részecskék alakjában tartalmazó antigén-hatóanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy — előnyösen pHBV—T— 1 i-ből eredő — HBV genom, pBR322 15 és SV4í) DNS-szekvenciákat és alkalmas promotort szolgáltató vektorok, célszerűen pHBV—Τ—1A, pML plazmid és/vagy SV40 felhasználásával, önmagukban ismert rekombinációs műveletek útján a prcszekvencia nélküli érett HBsAg felületi antigén szekvenciájának kifejezésére alkalmas plazmid-vektorokat, célszerűen a pSVHBSA vagy pHBS348— E illetőleg pHBS348—L plazmid-vektort építünk fel, és ezzel valamely emlősállat-sejtkultúrát, előnyösen majomvcse-fibroblaszt CV— 1 vagy COS—7
- 2$ sejtkultúrát transzformálunk, majd a transzformált szövettenyészetet megfelelő tápközegben szaporítjuk cs a termelt antigén-hatóanyagot a közegből kinyerjük. (Elsőbbség: 1981. 12.03.)2. Eljárás prcszekvencia nélküli érett hepati30 tisz—B felületi antigént mintegy 22 nm átlagos átmérőjű részecskék alakjában tartalmazó antigén-hatóanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy — előnyösen pHBV—Τ—11-ből eredő — HBV genom. pBR322 és SV40 DNS-szekvenciákat és35 alkalmas promotort szolgáltató vektorok, célszerűen pHBV—Τ— 1 A, pML plazmid és/vagy SV40 felhasználásával, önmagukban ismert rekombinációs műveletek útján a prcszekvencia nélküli érett HBsAg felületi antigén szekvenciájának kifejezé40 sere alkalmas plazmid-vektorokat, célszerű pSVHBSA vagy pHBS348-E illetőleg pHBS348 —L plazmidvektort építünk fel, és ezzel valamely emlősállat-sejtkultúrát. előnyösen majomvcse-fibroblaszt SV— 1 sejtkultúrát transzfor45 múlunk, majd a transzformált szövettenyészetet megfelelő tápközegben szaporítjuk és a termelt antigén-hatóanyagot a közegből kinyerjük. (Elsőbbség: 1981.08.31.)
- 3. Eljárás hepatitisz—B vírus elleni vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy prcszekvencia nélküli érett HBsAg felületi antigént mintegy 22 nm átmérőjű részecskék alakjában tartalmazó, az1. igénypont szerinti eljárással előállított antigénhatóanyagot gyógyászati szempontból elfogadható55 vakcira-vivőanyaggal és/vagy a vakcinakészítésben szokásos anyaggal keverünk össze. (Elsőbbség: 1981. 12. ()3.)
- 4. Eljárás hepatitisz—B vírus elleni vakcina előállítására. azzal jellemezve, hogy prcszekvencia 60 nélkül; érdi HBsAg felületi antigént mintegy 22 nm átmérőjű részecskék alakjában tartalmazó, a2. igénypont szerinti eljárással előállított antigénhatóanyagot gyógyászait szempontból elfogadható vakéina-vivőanyaggal és/vagy a vakcinakészítésθ5 ben szokásos anyaggal keverünk össze. (Elsőbbség: 1981.08. 31.')
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US29823581A | 1981-08-31 | 1981-08-31 | |
| US32698081A | 1981-12-03 | 1981-12-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU196238B true HU196238B (en) | 1988-10-28 |
Family
ID=26970555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU822777A HU196238B (en) | 1981-08-31 | 1982-08-30 | Process for producing mature hbsag surface antigen and vaccine against hepatitis b virus |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0073656B1 (hu) |
| JP (3) | JPS5856685A (hu) |
| AU (2) | AU555575B2 (hu) |
| BR (1) | BR8205078A (hu) |
| DE (1) | DE3280310D1 (hu) |
| DK (1) | DK173592B1 (hu) |
| ES (1) | ES8401134A1 (hu) |
| GB (1) | GB2105344B (hu) |
| GR (1) | GR76906B (hu) |
| HK (1) | HK29689A (hu) |
| HU (1) | HU196238B (hu) |
| IE (1) | IE53873B1 (hu) |
| IL (1) | IL66637A (hu) |
| KE (1) | KE3838A (hu) |
| NO (1) | NO165598C (hu) |
| NZ (1) | NZ201706A (hu) |
| ZW (1) | ZW18282A1 (hu) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5196194A (en) * | 1979-05-24 | 1993-03-23 | The Regents Of The University Of California | Vaccines containing Hepatitis B S-protein |
| US4769238A (en) | 1981-08-04 | 1988-09-06 | The Regents Of The University Of California | Synthesis of human virus antigens by yeast |
| ZW18282A1 (en) | 1981-08-31 | 1983-03-23 | Genentech Inc | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
| JPS5936698A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Science & Tech Agency | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞 |
| CA1209501A (en) * | 1982-09-16 | 1986-08-12 | Nikos Panayotatos | Expression vector |
| US4820642A (en) * | 1983-04-04 | 1989-04-11 | The Regents Of The University Of California | Amplified expression vector |
| US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| NZ209308A (en) | 1983-08-30 | 1991-08-27 | Genentech Inc | Vaccine against hsv involving a truncated membrane-free derivative of a membrane-bound protein |
| US7264817B1 (en) | 1983-08-30 | 2007-09-04 | Genentech, Inc. | Immunogenic composition based on a truncated derivative of a membrane bound protein and process for making it |
| EP0140762A1 (fr) * | 1983-10-03 | 1985-05-08 | Transgene S.A. | Vecteurs d'expression d'une proteine antigenique de la rage dans les cellules eucaryotes et leur application à la préparation d'un vaccin |
| FR2552776B1 (fr) * | 1983-10-03 | 1986-05-09 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression d'une proteine antigenique de la rage dans les cellules eucaryotes et leur application a la preparation d'un vaccin |
| JPS6078999A (ja) * | 1983-10-05 | 1985-05-04 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｓ抗原の精製方法 |
| US5639639A (en) * | 1983-11-02 | 1997-06-17 | Genzyme Corporation | Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof |
| US5118627A (en) * | 1984-02-27 | 1992-06-02 | Amgen | Papova virus construction |
| FR2560890B1 (fr) * | 1984-03-07 | 1987-10-16 | Grp Genie Genetique | Composition utile pour la fabrication de vaccins contenant des particules portant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et le recepteur de l'albumine serique humaine polymerisee, cellules animales capables de produire de telles particules et procede pour leur obtention |
| US4777240A (en) * | 1984-03-08 | 1988-10-11 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
| US4855224A (en) * | 1984-03-09 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned diagnostic product and method of use |
| US4663281A (en) * | 1984-03-22 | 1987-05-05 | Mass Institute Of Technology | Enhanced production of proteinaceous materials in eucaryotic cells |
| FR2564106B1 (fr) * | 1984-05-09 | 1988-04-22 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression du facteur ix, cellules transformees par ces vecteurs et procede de preparation du facteur ix. |
| US5683688A (en) * | 1984-05-31 | 1997-11-04 | Genentech, Inc. | Unglycosylated recombinant human lymphotoxin polypeptides and compositions |
| WO1986006405A1 (en) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel transformant and its use |
| EP0213628A3 (en) * | 1985-09-03 | 1988-09-21 | Yeda Research And Development Company, Ltd. | Expression of superoxide dismutase in eukaryotic cells |
| SE8505027D0 (sv) * | 1985-10-24 | 1985-10-24 | Kabigen Ab | A lytic virulent phage, a hostcell containing same and a process for protein production |
| IE60285B1 (en) * | 1985-12-18 | 1994-06-29 | Microgenesys Inc | Method for producing selected polypeptides in virally infected insect cells and polypeptides isolated therefrom |
| AU582288B2 (en) * | 1986-03-07 | 1989-03-16 | Damon Biotech Inc. | Vector and method for achieving high level expression in eukaryotic cells |
| US5004693A (en) * | 1986-07-18 | 1991-04-02 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Pseudorabies virus recombinants and their use in the production of proteins |
| NZ219516A (en) * | 1987-02-10 | 1991-02-26 | Wellcome Found | Fusion proteins of hbcag (hepatitis b virus core antigen) |
| US5024939A (en) * | 1987-07-09 | 1991-06-18 | Genentech, Inc. | Transient expression system for producing recombinant protein |
| US5578468A (en) * | 1987-08-10 | 1996-11-26 | Duke University | Site-specific RNA cleavage |
| US5443964A (en) * | 1987-08-10 | 1995-08-22 | Duke University | Poxvirus insertion/expression vector |
| JPH01285196A (ja) * | 1988-05-11 | 1989-11-16 | Chisso Corp | 発光蛋白エクオリンの製造法 |
| US5709995A (en) | 1994-03-17 | 1998-01-20 | The Scripps Research Institute | Hepatitis C virus-derived peptides capable of inducing cytotoxic T lymphocyte responses |
| JP4085231B2 (ja) | 2000-02-28 | 2008-05-14 | 株式会社ビークル | タンパク質中空ナノ粒子とそれを用いた物質運搬体、ならびに細胞への物質導入方法 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
| US4164565A (en) * | 1975-03-14 | 1979-08-14 | New York Blood Center, Inc. | Vaccine for active immunization containing hepatitis B surface antigen and associated antigen |
| FR2480779B2 (fr) * | 1979-08-30 | 1986-07-18 | Anvar | Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur |
| FR2444713A1 (fr) | 1978-12-18 | 1980-07-18 | Pasteur Institut | Procede de production d'un adn comprenant le genome du virus de l'hepatite b et vecteur le comportant |
| ES487106A0 (es) | 1978-12-22 | 1981-05-16 | Biogen Nv | Un metodo para producir al menos un polipeptido que muestra antigenicidad de hbv |
| IE52036B1 (en) * | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
| JPS5610119A (en) * | 1979-07-05 | 1981-02-02 | Alpha Therapeutic Corp | Manufacture of b type hepatitis infection preventive vaccine |
| US4399216A (en) * | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
| ZA811895B (en) * | 1980-04-07 | 1982-04-28 | Univ California | Expression of hormone genomic clones |
| FR2480780B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1985-12-06 | Pasteur Institut | Procede de transformation de cellules, notamment eucaryotes, par un adn circulaire tel que celui du virus de l'hepatite b et preparations contenant les produits d'expression desdits adn |
| EP0038765B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1987-09-02 | Institut Pasteur | Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin |
| EP0062574A3 (en) * | 1981-03-31 | 1982-12-29 | The Regents Of The University Of California | Virus protein synthesis |
| JPS5813598A (ja) * | 1981-06-22 | 1983-01-26 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | 組み替えｄｎａクロ−ニング・ベクタ−ならびにその真核細胞性および原核細胞性被形質転換体 |
| NZ201705A (en) * | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
| ZW18282A1 (en) * | 1981-08-31 | 1983-03-23 | Genentech Inc | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture |
| US4442205A (en) * | 1981-09-22 | 1984-04-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Simian virus recombinant that directs the synthesis of hepatitis B surface antigen |
| AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
| FR2521165A1 (fr) * | 1982-02-08 | 1983-08-12 | Pasteur Institut | Fragments d'adn codant pour un peptide immunogene susceptible d'introduire in vivo la synthese d'anticorps anti-poliovirus |
| US4446235A (en) * | 1982-03-22 | 1984-05-01 | Genentech, Inc. | Method for cloning human growth hormone varient genes |
-
1982
- 1982-08-06 ZW ZW182/82A patent/ZW18282A1/xx unknown
- 1982-08-25 NZ NZ201706A patent/NZ201706A/en unknown
- 1982-08-25 IL IL66637A patent/IL66637A/xx not_active IP Right Cessation
- 1982-08-26 DE DE8282304512T patent/DE3280310D1/de not_active Revoked
- 1982-08-26 EP EP82304512A patent/EP0073656B1/en not_active Revoked
- 1982-08-26 EP EP87202618A patent/EP0291586A3/en not_active Withdrawn
- 1982-08-26 GB GB08224527A patent/GB2105344B/en not_active Expired
- 1982-08-26 ES ES515260A patent/ES8401134A1/es not_active Expired
- 1982-08-27 AU AU87798/82A patent/AU555575B2/en not_active Expired
- 1982-08-27 IE IE2084/82A patent/IE53873B1/en not_active IP Right Cessation
- 1982-08-30 BR BR8205078A patent/BR8205078A/pt unknown
- 1982-08-30 HU HU822777A patent/HU196238B/hu unknown
- 1982-08-30 GR GR69154A patent/GR76906B/el unknown
- 1982-08-30 DK DK198203869A patent/DK173592B1/da not_active IP Right Cessation
- 1982-08-30 JP JP57150627A patent/JPS5856685A/ja active Granted
- 1982-08-30 NO NO822926A patent/NO165598C/no not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-08-20 AU AU61671/86A patent/AU589673B2/en not_active Expired
-
1988
- 1988-10-25 KE KE3838A patent/KE3838A/xx unknown
-
1989
- 1989-04-06 HK HK296/89A patent/HK29689A/xx not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-07-30 JP JP5189904A patent/JP2634371B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-08-07 JP JP7201034A patent/JP2726641B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL66637A (en) | 1991-11-21 |
| ZW18282A1 (en) | 1983-03-23 |
| NO165598B (no) | 1990-11-26 |
| ES515260A0 (es) | 1983-12-01 |
| GB2105344A (en) | 1983-03-23 |
| NO165598C (no) | 1991-03-06 |
| EP0073656B1 (en) | 1991-03-06 |
| NZ201706A (en) | 1986-05-09 |
| EP0073656A3 (en) | 1984-10-24 |
| GR76906B (hu) | 1984-09-04 |
| AU589673B2 (en) | 1989-10-19 |
| IL66637A0 (en) | 1982-12-31 |
| AU555575B2 (en) | 1986-10-02 |
| HK29689A (en) | 1989-04-14 |
| DK173592B1 (da) | 2001-04-09 |
| NO822926L (no) | 1983-03-01 |
| JPH06261748A (ja) | 1994-09-20 |
| DE3280310D1 (de) | 1991-04-11 |
| EP0073656A2 (en) | 1983-03-09 |
| AU6167186A (en) | 1987-01-08 |
| GB2105344B (en) | 1985-10-09 |
| BR8205078A (pt) | 1983-08-09 |
| JPH0587518B2 (hu) | 1993-12-16 |
| JP2726641B2 (ja) | 1998-03-11 |
| KE3838A (en) | 1988-12-02 |
| IE53873B1 (en) | 1989-03-29 |
| EP0291586A2 (en) | 1988-11-23 |
| AU8779882A (en) | 1983-03-10 |
| JPS5856685A (ja) | 1983-04-04 |
| ES8401134A1 (es) | 1983-12-01 |
| EP0291586A3 (en) | 1988-12-07 |
| DK386982A (da) | 1983-03-01 |
| JP2634371B2 (ja) | 1997-07-23 |
| IE822084L (en) | 1983-02-28 |
| JPH0937777A (ja) | 1997-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU196238B (en) | Process for producing mature hbsag surface antigen and vaccine against hepatitis b virus | |
| JP2511394B2 (ja) | 酵母菌中でのｂ型肝炎表面抗原の製造 | |
| EP0013828B1 (en) | Recombinant DNA, hosts transformed with it and processes for the preparation of polypeptides | |
| US5314808A (en) | Method for the transformation of cells, particularly eukaryotes by a DNA originating from viruses of hepatitis, more particularly from virus of a B viral hepatitis, and preparations containing the expression products of said DNAs | |
| EP0101617B1 (en) | Recombinant dna containing a hepatitis b virus gene, mammalian cells transformed with the cloned viral dna, and production of hepatitis b virus proteins | |
| JP2001136966A (ja) | 改良組換ｄｎａ分子 | |
| JPS59173096A (ja) | ポリシストロン性発現ベクターおよびそれを用いた方法 | |
| JPH0884588A (ja) | ヘテロポリマー系蛋白質 | |
| US4741901A (en) | Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture | |
| EP0182442B1 (en) | Recombinant dna molecules and their method of production | |
| US4803164A (en) | Preparation of hepatitis b surface antigen in yeast | |
| JPH0314840B2 (hu) | ||
| GB2102006A (en) | Deoxyribonucleic acids, their production and use | |
| EP0105141A2 (en) | Recombinant DNA molecules, process for their production, their use for production of hepatitis B surface antigen (HBsAg) and pharmaceutical compositions containing this HBsAg | |
| CA1341644C (en) | Recombinant dna molecules and their method of production | |
| CN118240882A (zh) | 多基因缺失的高产杆状病毒表达载体Bac6.0s及其应用 | |
| JPS63245682A (ja) | プレープロ分泌型リーダー配列の欠損による改良α−接合型因子プロモーター | |
| JPH02303497A (ja) | サケ成長ホルモンのピキア属メチロトローフ酵母での発現 | |
| JPS62190083A (ja) | ポリペプチド発現ベクタ−、該ベクタ−で形質転換した宿主及び該宿主によるポリペプチドの製造法 | |
| HU196236B (en) | Process for producing polypeptides showing hepatitis b virus antigenicity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 |