JP2004267207A - 多機能性臓器細胞の培養用培地 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】血清(B)と副腎質ホルモン(C)及び/又はアミノ酸(D)とを含有することを特徴とする多機能性臓器細胞培養用培地を用いる。(B)は非働化した牛胎児血清が好ましい。(B)の含有量は培地の容量に基づいて15〜25容量%が好ましい。(C)はヒドロコルチゾンが好ましい。(D)はプロリンが好ましい。また、血清(B)と副腎質ホルモン(C)及び/又はアミノ酸(D)とを含有する培地中で多機能性臓器細胞(A)を培養する工程を含むことを特徴とする多機能性臓器細胞の培養方法を用いる。骨髄細胞(E)を共培養することが好ましい。(E)は骨髄細胞全画分が好ましい。播種細胞数比率{(A)/(E)}は1/100〜1/2が好ましい。
【選択図】なし
Description
すなわち、本発明の目的は、多機能性臓器細胞を本来の機能を維持したまま長時間培養することができる培地を提供することである。
すなわち、本発明の多機能性臓器細胞培養用培地の特徴は、血清(B)と副腎質ホルモン(C)及び/又はアミノ酸(D)とを含有する点を要旨とする。
従って、本発明の多機能性臓器細胞培養用培地は、薬物代謝シミュレーター、医薬品生産装置及びハイブリッド型人工肝臓等の実用化に大きく貢献できる。
多機能性臓器細胞(A)としては、肝臓細胞、膵臓細胞、腎臓細胞、神経細胞、脾臓細胞、卵巣細胞、精巣細胞、肺細胞、前立腺細胞及び乳腺細胞等が挙げられる。これらのうち、肝臓細胞、膵臓細胞、腎臓細胞、神経細胞、脾臓細胞、卵巣細胞及び精巣細胞が好ましく、さらに好ましくは肝臓細胞、膵臓細胞及び腎臓細胞、特に好ましくは肝臓細胞である。
多機能性臓器細胞(A)の入手方法としては特に制限はなく、細胞バンクや販売業者等から入手してもよいが、多機能性臓器本来の機能をそのまま有するという観点等から、生体中の正常な多機能性臓器からフレッシュな細胞を直接取り出す方法が好ましい。
血清(B)としては、非働化処理をした血清が好ましい。非働化の方法としては、タンパク質を変性させずに血清中の補体(液体免疫)を不活性化できる方法であれば特に制限はなく、例えば、56℃の温水中で30分間加熱する方法が適用できる。
本発明の培地に含まれる基本培地としては公知のもの等が使用でき、例えば、DME培地、WE培地、MEM培地、BME培地、αMEM培地、IMEM培地、ES培地、DM−160培地、Fisher培地、F12培地及びRPMI培地等(朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」581頁に記載の基礎培地)、並びに市販の無血清培地[味の素(株)製無血清培地ASF103,同ASF104,同ASF301、ギブコ社製無血清培地CHO−SFM,同VP−SFM等]等、及びこれら混合物が挙げられる。これらの基本培地は、インビトロジェン社、味の素(株)及びギブコ社等から購入できる。これらのうち、DME培地及びWE培地が好ましく、さらに好ましくはDME培地である。
他の成分としては、細胞増殖因子、ホルモン、無機(塩)化合物、脂肪酸、抗生物質及び緩衝塩等が含まれる。
細胞増殖因子としては、FGF、VEGF、HGF、EGF、PDGF、IGF及びBMP等(財団法人名古屋大学出版会発行「上田実編ティッシュエンジニアリング(1999年)」43〜51頁に記載されているもの及び同文献に付記されている参考文献に記載されているもの)等が挙げられる。これらのうち、多機能性臓器細胞の機能発現の効果が高いという観点等から、FGF、VEGF、HGF及びEGFが好ましく、さらに好ましくはEGFである。
ホルモンとしては、インスリン及びトランスフェリン等が挙げられる。これらのうち、インスリンが好ましい。
無機(塩)化合物としては、金属化合物等が使用でき、銅化合物(硫酸銅等)、セレン化合物(亜セレン酸等)及び亜鉛化合物(硫酸亜鉛等)等が挙げられる。
脂肪酸としては、炭素数8〜18の脂肪酸等が使用でき、リノール酸及びリノレイン酸等が挙げられる。
抗生物質としては、ペニシリン及びストレプトマイシン等が挙げられる。
緩衝塩としては、炭酸カルシウム、りん酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム及びHEPES{2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルフォン酸}等が挙げられる。
骨髄細胞(E)としては、(1)生体中の正常な骨髄から直接取り出されるもの(初代細胞)、及び(2)初代細胞から何代にも渡り継代できる細胞に形質転換させたもの(株化細胞)等があり、これらのいずれも使用することができる。これらのうち、多機能性臓器細胞の機能発現効果を高くでき得るという観点等から、(1)生体中の正常な骨髄から直接取り出されるものが好ましい。
骨髄細胞(E)の入手方法としては特に制限はなく、細胞バンクや販売業者等から入手してもよいが、多機能性臓器細胞の機能発現効果を高くでき得るという観点等から、生体中の正常な骨髄からフレッシュな細胞を直接取り出す方法が好ましい。
(1)従来、動物実験でしか行えなかった薬物の代謝速度の測定や代謝機構を判定(創薬研究分野)するための薬物代謝シミュレーション。例えば、初代肝臓細胞を骨髄細胞(E)と共培養させた状態で、培地に薬物を加え培養することにより、培地中の薬物や代謝産物の濃度を測定し、薬物がどのように変化するかが求めることができため、生体内の薬物代謝がシミュレートできる。
<実施例1>
インビトロジェン社製GibcoDME培地粉末;10.0g/L,和光純薬工業社製ヒドロコルチゾン;7.5mg/L,和光純薬工業社製L−プロリン;60mg/L,フナコシ社製EGF;50μg/L,シグマ社製インシュリン;10mg/L,和光純薬工業社製硫酸銅5水和物;0.1μモル/L,和光純薬工業社製亜セレン酸;3μg/L,和光純薬工業社製硫酸亜鉛7水和物;50pモル/L,シグマ社製リノール酸;50mg/L,シグマ社製ペニシリン;58.5mg/L,明治製菓社製ストレプトマイシン;100mg/L,和光純薬工業社製炭酸水素ナトリウム;1.05g/L,同仁化学社製HEPES;1.19g/Lを含有するように、滅菌済みイオン交換水を用いて無血清培地を調製した。次いで、この無血清培地80体積部と、インビトロジェン社製牛胎児血清を56℃の温浴中30分間加熱して得られた非働化牛胎児血清20体積部とを混合して本発明の多機能性臓器細胞培養用培地(1)を得た。
細胞播種後3、7、14及び21日目に、アンモニア代謝能{細胞百万個・1時間当りに換算したアンモニア代謝速度(μモル/百万個/日)}及びアルブミン分泌能{細胞百万個・1日当りに換算したアルブミン分泌速度(μg/百万個/日)}を測定することによって、肝細胞の機能発現を評価した。なお、アンモニア代謝能は、アンモニアテストワコーキット(和光純薬工業製)を用いて1mM−NH4Cl添加培地で6時間培養を行った際のアンモニア濃度変化量を、推奨処方の方法で求めた。また、アルブミン分泌能は、ELISAキット(Protein Detetector ELISA Kit HRP,ABTS System;Kirkegaard&Perry Laboratories,Gaithersburg,U.S.A.)を用いて培地中のアルブミン濃度を求めることにより得た(以下同様)。アンモニア代謝能の測定結果を表1に、アルブミン分泌能の測定結果を表2にそれぞれ示す。
7週齢のウィスター系雄性ラット1匹のラット大腿骨から得られた全ての骨髄細胞懸濁液を、実施例1の肝細胞懸濁培地に加え、肝細胞/骨髄細胞縣濁培地(肝細胞濃度;25万個/ml、骨髄細胞濃度;225万個/ml)を得た。これを12穴の細胞培養プレートに、全液量0.8ml/穴、肝細胞数20万個/穴となるように播種した。骨髄細胞の播種数は180万個/穴であった。37℃、5体積%二酸化炭素雰囲気のインキュベーター内で培養を開始し、1時間後の培地交換時に、培地上清を全て除去することで、骨髄細胞のうち、難壁付着性画分を除き、骨髄細胞として、骨髄細胞易壁付着性画分のみを肝細胞と共培養させた。その後は実施例1と同様にして、細胞培養を行い、細胞播種後3、7、14及び21日目に、アンモニア代謝能及びアルブミン分泌能を測定し、これらの測定結果を表1及び2に示した。
各培地交換時に、回収した培地上清から遠心分離によって骨髄細胞(難付着性画分)を回収し、新しく加える培地とともに細胞培養系に戻すことによって、全画分の骨髄細胞を肝細胞と共培養させること以外は実施例2と同様にして、共培養をさせた。その後は実施例1と同様にして、細胞培養を行い、細胞播種後3、7、14及び21日目に、アンモニア代謝能及びアルブミン分泌能を測定しこれらの測定結果を表1及び2に示した。
インビトロジェン社製GibcoDME培地粉末;10.0g/L,和光純薬工業社製ヒドロコルチゾン;7.5mg/L,和光純薬工業社製L−プロリン;60mg/L,フナコシ社製EGF;50μg/L,シグマ社製インシュリン;10mg/L,和光純薬工業社製硫酸銅5水和物;0.1μモル/L,和光純薬工業社製亜セレン酸;3μg/L,和光純薬工業社製硫酸亜鉛7水和物;50pモル/L,シグマ社製リノール酸;50mg/L,シグマ社製ペニシリン;58.5mg/L,明治製菓社製ストレプトマイシン;100mg/L,和光純薬工業社製炭酸水素ナトリウム;1.05g/L,同仁化学社製HEPES;1.19g/Lを含有するように、滅菌済みイオン交換水を用いて無血清培地を調製した。次いで、この無血清培地95体積部と、インビトロジェン社製牛胎児血清を56℃の温浴中30分間加熱して得られた非働化牛胎児血清5体積部とを混合して本発明の多機能性臓器細胞培養用培地(2)(非働化牛胎児血清濃度5%)を得た。
次に6週齢のウィスター系雄性ラットから2段階コラゲナーゼ灌流法により初代ラット肝細胞を含む肝細胞を取り出し、また同一固体のラット大腿骨から得られた骨髄細胞懸濁液を取り出し、多機能性臓器細胞培養用培地(2)に加え、肝細胞/骨髄細胞縣濁培地(肝細胞濃度;25万個/ml、骨髄細胞濃度;250万個/ml)を得た。これを12穴の細胞培養プレートに、0.8ml/穴(肝細胞数20万個/穴)で播種した。37℃、5体積%二酸化炭素雰囲気のインキュベーター内で培養を開始した。細胞播種4時間後、1日後、及び以降2日毎に培地交換(培地交換時の細胞培養プレートの室温放置時間:1時間)を行った。
細胞播種後7日目に、アルブミン分泌能2{1穴・1日当りに換算したアルブミン分泌速度(μg/穴/日)}を測定することによって、肝細胞の機能発現を評価した。アルブミン分泌能2の測定結果を表3に示す。なおアルブミンは、ELISAキット(Protein Detetector ELISA Kit HRP,ABTS System;Kirkegaard&Perry Laboratories,Gaithersburg,U.S.A.)を用いて測定した(以下同様)。
実施例4で得た無血清培地を90体積部とし、非働化牛胎児血清を10体積部として、多機能性臓器細胞培養用培地(3)(非働化牛胎児血清濃度10%)とする以外は、実施例4と同様にした。アルブミン分泌能2の測定結果を表3に示す。
実施例4で得た無血清培地を85体積部とし、非働化牛胎児血清を15体積部として、多機能性臓器細胞培養用培地(4)(非働化牛胎児血清濃度15%)とする以外は、実施例4と同様にした。アルブミン分泌能2の測定結果を表3に示す。
実施例4で得た無血清培地を80体積部とし、非働化牛胎児血清を20体積部として、多機能性臓器細胞培養用培地(5)(非働化牛胎児血清濃度20%)とする以外は、実施例4と同様にした。アルブミン分泌能2の測定結果を表3に示す。
実施例4で得た無血清培地を50体積部とし、非働化牛胎児血清を50体積部として、多機能性臓器細胞培養用培地(6)(非働化牛胎児血清濃度50%)とする以外は、実施例4と同様にした。アルブミン分泌能2の測定結果を表3に示す。
6週齢のウィスター系雄性ラットから2段階コラゲナーゼ灌流法により初代ラット肝細胞を含む肝細胞を取り出し、また同一固体のラット大腿骨から得られた骨髄細胞懸濁液を取り出し、多機能性臓器細胞培養用培地(5)(非働化牛胎児血清濃度20%)に、肝細胞と骨髄細胞との播種細胞数比率が1/20(肝細胞濃度;25万個/ml、骨髄細胞濃度;500万個/ml)になるように各細胞を加えた。これを12穴の細胞培養プレートに、全液量0.8ml/穴、肝細胞数20万個/穴となるように播種した。骨髄細胞の播種数は200万個/穴であった。37℃、5体積%二酸化炭素雰囲気のインキュベーター内で培養を開始した。細胞播種4時間後、1日後、及び以降2日毎に培地交換(培地交換時の細胞培養プレートの室温放置時間:30分間)を行った。
細胞播種後7日目に、アルブミン分泌能2{1穴・1日当りに換算したアルブミン分泌速度(μg/穴/日)}を測定することによって、肝細胞の機能発現を評価した。アルブミン分泌能2の測定結果を表4に示す。
肝細胞と骨髄細胞との播種細胞数比率を1/10(肝細胞濃度;25万個/ml、骨髄細胞濃度;250万個/ml)とする以外は、実施例9と同様にして培養した。アルブミン分泌能2の測定結果を表4に示す。
肝細胞と骨髄細胞との播種細胞数比率を1/5(肝細胞濃度;25万個/ml、骨髄細胞濃度;125万個/ml)とする以外は、実施例9と同様にして培養した。アルブミン分泌能2の測定結果を表4に示す。
肝細胞と骨髄細胞との播種細胞数比率を1/1(肝細胞濃度;25万個/ml、骨髄細胞濃度;25万個/ml)とする以外は、実施例9と同様にして培養した。アルブミン分泌能2の測定結果を表4に示す。
肝細胞と骨髄細胞との播種細胞数比率を1/0(肝細胞濃度;25万個/ml、骨髄細胞濃度;0万個/ml)とする以外は、実施例9と同様にして培養した。アルブミン分泌能2の測定結果を表4に示す。
非働化牛胎児血清を使用しないこと以外は実施例1と同様にして比較用培地(2)を得た。そして、この培地(2)を用いて、実施例1と同様にして、肝細胞の単独培養を行い、細胞播種後3、7及び14日目にアンモニア代謝能及びアルブミン分泌能を測定した。これらの測定結果を表1及び2に示した。
ヒドロコルチゾン及びL−プロリンを使用しないこと以外は実施例1と同様にして比較用培地(3)を得た。そして、この培地(3)を用いて、実施例1と同様にして、肝細胞の単独培養を行い、細胞播種後3、7及び14日目にアンモニア代謝能及びアルブミン分泌能を測定した。これらの測定結果を表1及び2に示した。
多機能性臓器細胞培養用培地(1)に換えて比較用培地(3)を使用すること以外は実施例3と同様に肝細胞と骨髄細胞の共培養を行い、細胞播種後3、7及び14日目にアンモニア代謝能及びアルブミン分泌能を測定した。これらの測定結果を表1及び2に示た。
非働化牛胎児血清を使用しないこと以外は実施例4と同様にして比較用培地(4)を得た。そして、この培地(4)を用いて、実施例4と同様にして、肝細胞の単独培養を行い、アルブミン分泌能2を測定した。これらの測定結果を表3に示した。
Claims (10)
- 血清(B)と副腎質ホルモン(C)及び/又はアミノ酸(D)とを含有することを特徴とする多機能性臓器細胞培養用培地。
- 血清(B)が非働化した牛胎児血清である請求項1に記載の培地。
- 血清(B)の含有量が培地の容量に基づいて15〜25容量%である請求項1又は2に記載の培地。
- 副腎質ホルモン(C)がヒドロコルチゾンである請求項1〜3のいずれかに記載の培地。
- アミノ酸(D)がプロリンである請求項1〜4のいずれかに記載の培地。
- 多機能性臓器細胞(A)が、肝臓細胞、膵臓細胞、腎臓細胞、神経細胞、脾臓細胞、卵巣細胞及び精巣細胞からなる群より選ばれる少なくとも1種である請求項1〜5のいずれかに記載の培地。
- 血清(B)と副腎質ホルモン(C)及び/又はアミノ酸(D)とを含有する培地中で多機能性臓器細胞(A)を培養する工程を含むことを特徴とする多機能性臓器細胞の培養方法。
- 多機能性臓器細胞(A)を培養する工程において、骨髄細胞(E)を共培養する請求項7に記載の培養方法。
- 骨髄細胞(E)が、骨髄細胞全画分である請求項8に記載の培養方法。
- 多機能性臓器細胞(A)と骨髄細胞(E)との播種細胞数比率{(A)/(E)}が、1/100〜1/2である請求項8又は9に記載の培養方法。
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