BG102837A - Среда за култивиране на клетки от бозайници - Google Patents

Среда за култивиране на клетки от бозайници Download PDF

Info

Publication number
BG102837A
BG102837A BG102837A BG10283798A BG102837A BG 102837 A BG102837 A BG 102837A BG 102837 A BG102837 A BG 102837A BG 10283798 A BG10283798 A BG 10283798A BG 102837 A BG102837 A BG 102837A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
cells
culture medium
hepatocytes
hbm
cell
Prior art date
Application number
BG102837A
Other languages
English (en)
Inventor
Geoffrey Block
Original Assignee
University Of Pittsburgh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Of Pittsburgh filed Critical University Of Pittsburgh
Publication of BG102837A publication Critical patent/BG102837A/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/148—Transforming growth factor alpha [TGF-a]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до химически дефинирана културална среда за клетки от бозайници, която осигурява поддържане и дълготраен клонален растеж на хепатоцити от бозайници и други клетки.

Description

Настоящото изобретение най-общо се отнася до среда за култивиране на клетки от бозайници. В частност изобретението се отнася до културална среда, която позволява продължително отглеждане и поддържане на клетъчна популация от хепатоцити на бозайници, производни на хепатоцитите клетъчни линии, малигнени клетки производни на хепатоцитите и други клетки.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Известно е, че специфични клетъчни линии могат да растат in vitro в оптимално подбрана култура или хранителна среда. Примери за някои културални среди разработени за специални цели са: Среди RPMI 1640. среда за растеж на Влимфоидни клетки и малигнени клетки, Chancrs среда за растеж на клетки от амниотична течност, Среда 199 за растеж на миши фибробластни клетки, Среда (MEM) Minimal Essential Medium, среда минимум за растеж на клетки от бозайници, които са адхезивни и Среда на Leibovitz за растеж на клетки в отсъствие на СО2. Тези различни хранителни среди се отличават една от друга по това, че те съдържат различни, специфични компоненти по отношение на аминокиселини, витамини, органични соли, микроелементи и други органични съставки, които подпомагат максималния растеж на клетките в култура.
За растежа на клетки от бозайници към химично дефинираните среди се добавят различни серуми, предимно фетален телешки или телешки серум от новородено и други ненапълно дефинирани растежни фактори. Основният недостатък
на серума обаче е. че неговите компоненти могат да варират широко. като по този начин се внасят нелефинирани биологични компоненти в хранителната среда. които като резултат водят до различни биохимични и клетъчни събития. В допълнение, серумът е скъп и ако клетките се използват за клинични пели. като резултат това може да доведе до критични имунни реакции в пациентите.
Настоящото изобретение е насочено предимно за култивиране на хепатоцитни клетки от бозайници. като се използват химично дефинирани среди, които позволяват клетъчната популация да се отглежда продължително време. Терминът химично дефинирана среда се използва при тъканно култивиране, като с него се означава културална среда с известен химичен състав, както количествен, така и
качествен, за разлика от средите, които съдържат естествени съставки, като животински серум.
Регенерацията на черния дроб се осъществява предимно чрез делене на чернодробни клетки в организма, както е съобщено от Grisham, J. W., et al., Cancer Res.., 22:842 (1962), което е цитирано тук в литературата. Тези клетки, или фракция от тях, имат висок капацитет за клонален растеж, както е показано чрез експерименти с хепатоцитна трансплантация в ектопични места (Jirtle, R. L. , et al. .
Canser Res,. 42:3000 (1982), което е цитирано тук в
литературата) и в трансгенни миши модели (Rhim. J. А. , et
al. , Science. 263:1149 (1994), което е цитирано тук в
литературата). Обаче, в няколко изследвания е показано, че когато черен дроб се стимулира към регенерация и пролиферацията на зрелите хепатоцити е супресирана, се инициират и пролиферират Факултативни стволови клетки. Виж например Thorgeirsson, S. S. , et al.. Froc., Soc, Exp. Biol,
Med., 204:253 (1993), което е цитирано тук в литературата.
Такива клетки. които понякога ше означаваме като елипсовидни клетки, могат да съзряват в хепатоцити в определени животински модели или в каналчести структури изградени от клетки (дуктуларни хепатоцити) смес от хепатоцити и епителиални маркери за жлъчния канал. Виж
Gerber, М et al
Amer, J
Path.. 110:70 (1983) и
Vandersteenhoven, А. Μ.
et al. ,
Arch. Pathol. Lab. Med, ,
114:403 (1991), които са цитирани тук в литературата. Обаче малко се знае за техния произход и контролните механизми, регулиращи фенотипните им преходи към хепатоцити или
дуктуларни клетки.
Независимо от високия капацитет на хепатоцитите да пролиферират in vivo, директно или чрез растеж на факултативна стволова клетка, условията които определят техния потенциал за растеж и техните фенотипни преходи не са напълно изяснени. поради ограничения успех при растеж на хепатоцити в първична култура. Такъв типичен случай е, когато хепатопитите в първична култура под влияние на основни митогени влизат в един или два цикъла на делене и след това клетките дегенерират и умират. До сега различни изследователи не са успяли да създадат среда, която позволява на хепатоцитите да пролиферират и преживяват.
Например Berry, Ν. М. , et al., J. Cell»- Biol^ 43:506 (1969), който е цитиран тук в литературата, е въвел техниката на колагеназната перфузия, която позволява чернодробна тъкан да се дисоциира на своите компоненти, клетъчни елементи на базата на техните размери. По-късно Bissell, D. М. . et al., J. Cell. Biol. , 59(3):722 (1973) и
Bonnev. R. J., et al.. In Vitro. 9:399 (1974), които са цитирани тук в литературата, описват първите методи за култивиране на изолирани хепатоцити, които най-вероятно преживяват до един или два дни. Продължително култивиране на хепатоцити върху колагенови телове за максимум 7-10 дни е съобщено от Michalopoulos, G. , et al., Exp. Cell__Res.,
94(1):70 (1975), което е цитирано тук в литературата. Общата
характеристика на всички по-горе цитирани системи е, че хепатоцитите в тези системи са поддържани в култура без да има каквото и да е доказателство за клетъчна пролиферация. Вместо това, тези системи само поддържат култури от непролиферираши клетки за кратък период.
Първият успешен опит за иницииране на ДНК синтеза в хепатоцити използва новооткрития по това време епидермален растежен фактор (EGF), както е съобщено от
Richman, R.
et al., Proc
Nat. Acad. Sci. USA, 73:3589 (1976), което е цитирано тук в литературата. През следващите години, няколко други групи изследователи използват EGF като митоген за хепатоцитите и съобщават за митогенните ефекти на EGF и тяхната модулация от други фактори, като например, матрици от вида колаген тип I, цинк и пролин.
Хепатоцитният растежен
Фактор, известен също така като дифузен фактор (означаван по-нататък като HGF или
HGF/SF) беше открит, клониран и напълно секвениран в края на 1980 те години. Виж Michalopoulos, G. , et al.. Federation
Proceedings, 42:1023 (1983); Michalopoulos, G. , et al., AACR
Proceedings, 24:58 (1983); Michalopoulos, G., et al., Cancer
Res,, 44(10):4414 (1984) и Miyazawa, K. , et al., Biochem,
Biophys. Res. Comun., 163:967 (1989), които са цитирани тук в литературата. Намерено е, че HGF/SF е митоген за много
хепатоцити, както и за епителиални клетки. Значимостта на HGF/SF за черния дроб се дължи на факта, че той е тригер за чернодробната регенерация чрез ендокринен механизъм.
Съвсем наскоро няколко изследвания показаха, че HGF/SF, епидермалния растежен фактор (EGF) и трансформиращия растежен фактор a (TGFa) са основните митогени за хепатоцити в култура, които стимулират ограничена хепатоцитна ДНК синтеза в химически дефинирани среди. Вих например Michalopoulos, G. К. , Fed. Am, Soc. Exp. Biochem. J. . 4:176 (1990), който е цитиран тук в литературата. По-късно е открито, че тези растежни фактори в допълнение играят роля in vivo при регенерация на черен дроб след частична хепатектомия. Инжектиране на HGF/SF, TGFa или EGF в плъхове, индуцира синтеза на ДНК в хепатоцити. Виж .например Liu, М. L. , et al., Hepatology, 19,:1521 (1994), който е цитиран тук в литературата.
Съобщено е обаче, че във всички тези системи хепатоцитите започват синтеза на ДНК и встъпват в митоза само за ограничено време, обикновено от 1 до 3 дни. След 1 2 цикъла на ДНК синтеза и клетъчно делене културите дегенерират и всички клетки умират за около 7-10 дни. До сега не е документирано увеличение иа броя на хепатоцитите в клетъчна култура чрез добавяне само на EGF или HGF, или в комбинация. Клетъчната репликация в култури, съдържащи тези растежни фактори, всъщност е самоограничаваща се и броят на умиращите хепатоцити надвишава този на новополучените. По сходен начин клетъчната репликация в култури, съдържащи други хепатоцитни митогени, такива като трансформиращи растежни фактори, например TGFa и кисел фибробластен растежен фактор също е самоограничаваща се.
Съвсем наскоро. Mitaka. Т. . et al.. Hepatology. 13(1):21 (1991); Mitaka, T. . et al.. 16(2):440 (1992): Mitaka, T. , et al., Virchows Arch.......B. CellPathol, Incl. Mol, Pathol., 62:329 (1992) и Mitaka. T. . et al., CancerRes., 53:3145 (1993), които са цитирани τνκ в литературата съобщават, че добавянето на никотинамид, дексаметазон и EGF към конвенционална културална среда, води до образуване на колонии от малки хепатоцити, възникващи в плътна култура от стандартни по размери паоенхимни хепатоцити. В следващо изследване, Mitaka. Т. , et al., J, Cell. Physiol,, 157:461 (1993), който е цитиран тук в литературата, съобщава, че броят на колониите индуцирани от комбинацията на EGF + HGF, EGF + TGF-α и HGF + TGF-a не се различава от този на колониите, индуцирани от всеки един митоген поотделно. Обаче, в тези изследвания няма значително
увеличаване на тоталната клетъчна популация, няма
доказателство за клонален растеж и има загуба на
диФеренцировка.
До сега няма химически дефинирана среда. с или без
добавки, която е способна да поддържа дълго време пролиферания, диференпировка и жизнеспособност на хепатоцитите . Докато, поради много причини използването на недифинирана добавка е задоволително. то в случаите, когато се изследва растеж, метаболизъм, и/или диференпировка на клетките в култура, най-желателно е добавката да е дефинирана. Въвеждането на недифинирани компоненти към клетъчна култура може да доведе до контаминация, разнообразие и непредсказуемост в резултатите от изследванията и приложенията на клетъчните култури. Използването на дефинирани среди е особено важно и полезно при изследванияна метаболизма на лекарствени препарати, при изкуствено развитие на органи, клетъчна трансплантапия, генна терапия и при фундаментални изследвания на клетката.
По-горе описаният ограничен капацитет на хепатоцитите да пролиферират в първична култура, затруднява провеждането на дълготрайни изследвания или приложения, които изискват продължителна жизнеспособност или пролиферация. Поради тази причина са затруднени приложенията на хепатоцитни култури за клетъчна трансплантапия и генна терапия. Вследствие на това, продължава да съществува необходимостта от химически дефинирана среда, която пролиферират и преживяват приложения за такава среда и други клетки са генна ще позволи хепатоцитите да дълго време. Сред потенциалните и за така култивирани хепатоцити терапия, биоизкуствени органи, клетъчни трансплантанти, производство на лекарствени препа рати, лекарствени и химически тестове.
Както е показано по-горе, съвременните условия не осигуряват хепатоцитна културална система, в която хепатоцитите да се увеличават като клетъчна популация чрез
продължителна пролиферация и затова съществува необходимост от такава система. Настоящото изобретение осигурява напълно дефинирана културална среда, която позволява непрекъсната пролиферация и дълготрайно увеличение на хепатоцити.
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Според настоящото изобретение се осигурява нова, химически дефинирана културална среда. Тази среда поддържа продължителен клонален растеж на първични хепатоцити и хепатоцитни клетъчни линии, генетично трансформирани хепатоцити и хепатоцити, получени от неопластични източници,
водейки до увеличаване на клетъчната популация. Още повече, тази среда позволява пълно разграничаване на метаболитните, структурни и секреторни функции на клетъчния растеж. При тези условия хепатоцитите се подлагат на многократни пролиферативни цикли. След като се достигне конфлуентност или в присъствие на специфични матриксни компоненти, хранителни вещества и/или растежни фактори, тези пролифериращи клетки спират да се делят и поддържат зрял хепатоцитен фенотип за много месеци, или по-дълъг период от време.
Съответно, основният предмет на настоящото изобретение е да осигури културална среда за непрекъсната пролиферация и жизнеспособност на хепатоцити.
Друг предмет на настоящото изобретение е да осигури културална среда за непрекъсната диференцировка и жизнеспособност на хепатоцити.
Още един предмет на настоящото изобретение е да осигури културална среда за непрекъсната пролиферация на хепатоцити, които напълно се диференцират след спиране на растежа.
Друг предмет на настоящото изобретение е да осигури
културална среда за продължително увеличаване на хепатоцитите, която не съдържа серум, т.е. такава среда е напълно дефинирана.
Още един предмет на настоящото изобретение е да осигури културална среда за непрекъсната пролиферация, диференци ровка и жизнеспособност на хепатоцити върху различни матриксни субстрати.
Тези и други предмети на настоящото изобретение се постигат чрез едно или повече от следните изпълнения.
В един вариант изобретението характеризира химически дефинирана НВМ културална среда за поддържане, диференциране и продължителен растеж на хепатоцити от бозайници и включва:
а) синтетична основна сток среда, предназначена за култивиране на клетки от бозайници; и
б) растеж на хепатоцитни клетки, подпомогнат от група компоненти, избрани сред никотинамид, аминокиселини, трансферни, хормони, дексаметазон, микроелементи от групата на металите и прости въглехидрати, избрани от групата, съставена от D-глюкоза и D-галактоза и всякакви комбинации от тях.
В предпочитано изпълнение изобретението характезирашо
НВМ културалната среда, освен това включва буфер, антибиотици и албумин.
В друг вариант изобретението характезира среда за култивиране на клетки от бозайници, която включва състава на НВМ, както е определен в Таблици I и II, където основната сток среда от Таблица I включва комбинирана DMEM така, че предпочитаната крайна концентрация на D-глюкоза да е около 2.0 g/L и предпочитаното количество на D-галактоза да е около 2.0 g/L.
Други характеристики и предимства на изобретението ще станат очевидни от следващото описание на предпочитаното
изпълнение и от претенциите.
КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ГРАФИКИТЕ
Фигури 1А - 1С са графики показващи резултати от
изследвания, в които плъши хепатоцити са култивирани в НВМ
среда, която е описана тук, с добавени растежни фактори
както беше отбелязано. Всички точки показват значението и стандартната грешка на поне три отделни култури.
Фигура 1А показва процента белязани ядра с бромдезоксиуридин (BRdU) от пролифериращи клетъчни култури, в различни периоди след изолиране на хепатоцити. Клетките растат в НВМ, в която са добавени HGF/SF и EGF.
Фигура 1В показва включването на [3Н] тимидин (разпадания за минута) в ДНК в култури, в различни периоди след изолиране на хепатоцити. Клетките се подлагат на действието на HGF/SF в НВМ (О), EGF в НВМ (ο) , HGF/SF + EGF в НВМ (Δ) и контрола само НВМ (а).
Фигура 1С показва количеството на ДНК за петри, в различни дни от клетъчния растеж само в среда НВМ (контрола) (·); HGF/SF в НВМ (Δ); EGF в НВМ (V); и HGF/SF + EGF в НВМ (·).
Фигура 2 е графика, показваща ДНК за петри, на 15-ия ден от растежа на хепатоцити в НВМ с посочените растежни фактори. Клетките, означени като контрола (ден t=0) и ден 15 са отглеждани в НВМ среда, без каквито и да е растежни
фактори.
Фигура 3 е графика, показваща количеството синтезирана ДНК за петри (цд/култура) от плъши хепатоцити на 15 ден, в НВМ с добавен HGF/SF и EGF, растящи върху различни матрици. СС означава покрит с колаген; ECL е комерсиален матрикс; m COLL IV означава миши колаген IV; СС VITROGEN означава колаген тип I от говежда кожа; POLY D LYS означава поли DЛизин: m LAMININ означава миши ламинин; h FIBRONECT означава човешки фибронектин и m COL I означава миши колаген I.
Фигури 4А - 4G са фотографии на плъши хепатоцити, култивирани в НВМ при различни условия. както е описано тук.
Фигура 4А показва хепатоцити в НВМ среда с HGF/SF и EGF на първия ден след изолиране, сред които се наблюдават типични субконфлуентни непролиферираши хепатоцити.
Фигура 4В показва хепатоцити на четвърти ден в НВМ среда индуцирана с HGF/SF, които имат типична дифузна морфология.
Фигура 4С показва хепатоцитни култури, които са достигнали конфлуентност на 15 ден и които имат типична морфология.
Фигури 4D и 4Е са респективно електронни микрофотографии на клетките от Фигури 4А и 4С.
Фигури 4F и 4G са микрофотографии на оцветени хепатоцити, които са трансфектирани на 3 ден с lac-Z-съдържащ репликационнно дефицитен ретровирус и оцветени за експресия на 8-галактозидаза, както е описано по-долу и след това са снимани на 1 ден (Фиг. 4F) и на 10 ден (Фиг. 4G) след трансфекция. Клетките са култивирани в НВМ среда, в която са добавени HGF/SF и EGF. както е описано по-долу.
Фигури 5А и 5В са фотографии на Northern блотове, показващи експресия на специфични гени в различни дни в култури от плъши хепатоцити, поддържани в НВМ, в присъствие на HGF/SF и EGF, както е описано по-долу. Експресията на GAPDH и интензитетът на 28S РНК след оцветяване с етидиев бромид са използвани като вътрешни контроли.
Фигури 6А - 6F са фотографии на пролифериращи плъши хепатоцити, култивирани в среда НВМ в присъствие на HGF/SF и EGF, и след това са направени Northern блотове, както е описано тук.
Фигура 6А е фазово-контрастна микрофотография на култури от пролиферираши хепатоцити, покрити с Matriqel на 8 ден и фотографирани на 18 ден. Гранулираната цитоплазма и появата на жлъчни каналчета се виждат като светли линии
между клетките.
Фигури 6В и 6С са електронни микрофотографии, респективно на малко и голямо увеличение, на клетки от 18 дневна култура, 10 дена след покриване с Matriqel. Показани са типичните характеристики на хепатоцитна цитоплазма, такива като мембрани на ендоплазматичния ретикулум заобикаляши митохондрии, микротелца с централно разположена кристалополобна структура, жлъчни каналчета (с) (Фигура
6В), множество митохондрии (М) и гликоген (G”) (и двете на Фигура 6С).
Фигура 6D е фотография на
Northern блот, показваш повишена експресия на албуминова иРНК след прибавяне на
Matriqel.
Албуминовата иРНК се експресира в контролни култури, веднага след изолиране от черен дроб чрез колагеназна перфузия и преди култивиране.
Експресията е минимална на 8 ден от култивирането. На 3 и ден след добавяне на
Matriqel (стартовете са маркирани наблюдава повишена експресия на албуминова иРНК. Като вътрешна контрола експресията на
GAPDH.
Фигура
6Е е фотография на
Northern блот, показваща
ИНДУКЦИЯ на цитохром IIB1 иРНК
КУЛТУРИ, третирани с
Matriqel на ден и изложени на действието на
Фенобарбитол (РВ) 2 дена по-късно (десет дневна култура).
Клетките се събират на 15 ден от култивирането. Като вътрешна контрола за нивото на иРНК е използвана експресията на GAPDH.
Фигура 6F е фотография на Northern блот от клетки, култивирани допълнително с Matriael (добавен на 8 ден от култивирането). Експресията на цитокератин 19. маркер за жлъчни канали в пролиферирашите хепатопити е подтисната чрез добавяне на Matriael и не е подтисната в контролните култури, които не са получили Matriqel. Като вътрешна контрола е използвана 28S рРНК оцветена с етидиев бромид.
Фигури 7А - 7Е показват резултатите от изследвания, сочеши формирането на дуктуларно-ацинарни структури в култури от плъши хепатоцити, запазени от началото на култивирането между два слоя гел от колаген тип I в среда НВМ, в присъствие на HGF/SF. Фигури 7А - 7D са фотографии на 15 дневни култури.
Фигура 7А е фазово-контрастна микрофотография (100х), показваща появата на дуктуларни структури, обкръжени от колагенови Фибрили.
Фигура 7В е микрофотография (100х) на парафинови срези на колаген тип I теловете от Фигура 7А, оцветени с
хематоксилин и еозин.
Фигури 7С и 7D са електронограми на клетки, обграждащи един и същи лумен, но с различна локализация около него, на една от дуктуларните структури, които се виждат на Фигура 7В. Фигура 7С показва клетки с морфология подобна на епитела на жлъчен канал, с дълги успоредни контакти, свързани чрез много дезмозоми и изобилие от кератинови интермедиерни Филаменти. Фигура 7D показва клетки, наподобяващи повече на хепатоцитния фенотип, с гранулиран ендоплазматичен ретикулум и митохондрии, с плътно оцветени вторични лизозоми и по малко филаменти.
Фигура 7Е е фотография на Northern блот, която показва, че експресиятя на питокератини 18 и 19 се увеличава в култури с дуктуларно-ацинарни структури, докато експресията на албумин е ниска.
Фигура 8 показва фотографии на оцветени култури от човешки хепатоцити, отглеждани в НВМ. в която са добавени HGF/SF и EGF , взети на 1. 3, 5, 7, 10, 12 и 19 лен. както е описано тук.
ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Настоящото изобретение осигурява основна среда за хепатоцити, означена тук като НВМ, която позволява дълготрайно увеличаване, диференциране и преживяване на клетъчната популация от хепатоцити, от производни на хепато цитите клетъчни линии, като HepG2, на чернодробни ембрионални епителни клетки и на първична култура от хепатокарциномни клетки in vitro. В допълнение средата от настоящото изобретение може да се използва за култивиране на
клетки от панкреатични островчета, клетки от бъбречни каналчета, Ito клетки, епителни клетки на тънките черва и редица клетъчни линии, включващи MRC5. СаСо, и ЗТЗ клетки, както и други клетки. Средата НВМ оу настоящото изобретение поддържа метаболитни пътища и синтетични функции, т.е. дифеоенцировката на типичните за възрастния организъм зрели хепатоцити. В допълнение, когато НВМ от настоящото изобретение се комбинира със специфични митогени и съставки от извънклетъчния матрикс, хепатоцитите могат да се подтикнат към трансдиференцировка в структури, подобни на жлъчни каналчета. НВМ от настоящото изобретение може да се използва за култивиране на хепатоцити от бозайници и други
клетки, включително и, но не ограничени от човешки, плъши, кучешки, свински, миши и маймунски (от павиан) произход.
Средата НВМ съдържа подходящи концентрации от заменими и незаменими аминокиселини и изобилие от йони и микроелементи, буфери, витамини. въглехидрати, липиди, белтъци и хормони, които служат като хранителна среда за in vitro култивиране на клетки от бозайници.
В своя най-широк спектър изобретението характеризира химически дефинирана основна среда НВМ, като самата тя позволява продължително преживяване, диференциране и растеж на хепатоцити от бозайници и други клетки. В допълнение, клетки растяши в НВМ среда с добавки, в присъствие на растежни фактори, като HGF/SF, EGF или TGFa, както и на други митогени, имат по-бърз клонален растеж и по-бързо се увеличава клетъчната популация. Освен това, както е показано по-долу, когато средата НВМ от настоящото изобретение е с добавка на HGF/SF, заедно с някои матриксни конструкции, води до формиране на структури подобни на жлъчни каналчета. Обаче. както е посочено по-горе, такива растежни фактори не са необходими за специфичнна диференцировка на първичните култури, но те ускоряват растежа и увеличават популацията, ако това е необходимо при специални случаи.
Средата НВМ от настоящото изобретение се състои от химически дефинирана основна сток среда (от тук нататък означавана като SM), предназначена за култивиране на клетки от бозайници. Основната сток среда може да бъде конструирана по избор, като се използва модифицираната от Дюлбеко среда на Игъл /Dulbecco’s Modified Eagle Medium/ (DMEM), като една съставка, но настоящото изобретение не може да бъде ограничено, тъй като формулировките са в обхвата на изложените насоки. Примери за други дефинирани основни среди, които могат да се използват съгласно настоящото изобретение включват, но не се ограничават от: Основна среда на Игъл /Basal Media Eagle/ (ВМЕ), DMEM/F-12 (1:1 DMEM и F-12, vol:vol); Среда 199; F-12 (Ham) Nutrient Mixture; F-10 (Ham) Nutrient Mixture; Minimal Essential
Media (MEM); Williams' Media Е и RPMI 1640, като всичките могат да се доставят освен от Gibco-BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD и от други 4ирми. Налични са няколко различни варианти на много от тези среди, а онези, които са особено полезни за да се приготви НВМ включват, но не се ограничават само от: DMEM 11966, DMEM 10314, МЕМ 11095, Williams' Media Е 12251, Ham F12 11059, MEM-alfa 12561 и Среда 199 11151 (всички могат да се доставят от GibcoBRL/Life Technologies (каталог 1995-1996)). Следователно, ако например L-аргининът и/или D-глюкозата са вече в необходимите количества в основната сток среда, тогава не е нужно или е нужно да се прибави съвсем малко допълнителен компонент като добавка.
В зависимост от специфичния сфстав на основната сток среда, след това тя, SM средата се допълва както обстойно е описано тук с D-глюкоза и/или D-галактоза, никотинамид, други хранителни вещества в микроколичества, включващи аминокиселини, следови количества от метали, които не са присъствали в SM, такива като L-пролин, L-глутамин, Lаргинин, L-орнитин, цинк, манган, мед и селен, пречистен трансферин, към който е свързано елементарно желязо или апотрансферин в комбинация с железен глюконат, хормони като дексаметазон и инсулин и pH буфер като HEPES (N-[2hydroxyethyl]piperazine-N-[2-ethanesulfonic acid]). Също
така по избор могат да бъдат добавени антибиотици, като пеницилин и стрептомицин, pH индикатор, албумин и/или декстран, най-важните мастни киселини, алтернативни буфери, витамини, осмотични агенти и други форми от следови количества метали. Обикновено, основната среда има pH в областта между 6.5 - 8.2, като предпочитано pH е 7.0 - 7.7, а най-предпочитано pH е 7.2 - 7.5. Типичният индикатор, който се добавя за да се контролира pH е фенол ред. Средата НВМ от настоящото изобретение включва SM и добавките към нея.
Средата НВМ след това може да бъде допълнена по избор с един или повече растежни фактори, например като HGF/SF, EGF и TGFa, ако е необходимо ускоряване на растежа.
За да се конструира средата НВМ, към основната сток среда се добавят прости въглехидрати D-глюкоза и/или Dгалактоза. Ако се използват и двете D-глюкоза и D-галактоза, предпочитаната сума от техните тотални концентрации е 8.0 g/L или по-малко, но повече от 0.1 g/L, като се вземе предвид количеството на D-глюкоза, присъстващо в основната сток среда, ако има такова. Когато се използва само една от двете D-глюкоза или D-галактоза, предпочитаната концентрация е 5.0 - 0.1 g/L. Например, смесената основна сток среда
DMEM. която е използвана в този пример съдържа 2.0 g/L Dглюкоза и затова по-нататък не се добавя D-глюкоза. След това допълнително се прибавя 2.0 q/L D-галактоза.
Показано е, че друг компонент на НВМ, никотинамидът поддържа хепатоцитната диференцировка, повишава експресията на цитохром Р450 и удължава преживяемостта на хепатоцитите в стандартна култура до 10 - 14 дни. Виж, Rosenberq, М. R., et al., In Vitro, 18:775 (1982) и Inoue, C. , et al., Biol,
Chem.. 264(9):4747 (1989), които са цитирани τνκ в литературата.
Трансферинът е белтък свързваш желязо, който взаимодейства с рецептора на трансферина върху клетъчната мембрана. Той отговаря за свързване и транпортиране на железни йони. Предпочитаният в настоящото изобретение трансферни е или холо-трансферин, 30% наситен с желязо, или е напълно ненаситен (апо-трансферин) и е комбиниран с железен глюконат.
Показано е, че дексаметазонът, синтетичен кортикостероид усилва EGF-индуцираната ЛНК синтеза. както е съобщено от Sand, Т. F. , et al., Acta . Endocrinol., 109:369 (1985), което е цитирано тук в литературата. Както е използвано в настоящото изобретение, дексаметазонът може да бъде всяко производно на кортизола, като преднизон,
преднизилон, кортизол, хидрокортизон и други производни.
Инсулинът и инсулин-подобни растежни фактори са необходими за усвояване на глюкоза, за транспорт на аминокиселини и за подържане на многобройните междинни метаболитни пътища. Тези ефекти помагат да се подържа диференцировката и пролиферацията.
Включването на L-аргинин в НВМ в основната сток среда, или добавянето към нея е много важно, зашото в култура хепатоцитите клонят към загуба на способността си да синтезират аргинин чрез цикъла на уреата. В отсъствие на L аргинин хепатоцитите в култура не могат да живеят много дълго, зашото са неспособни да синтезират L-аргинин, като по този начин се блокира техния белтъчен синтез. Използването на D-галактоза в допълнение към D-глюкоза е предимство за НВМ, зашото комбинацията води до увеличаване на растежния потенциал. повече отколкото ако се използва само едната субстанция.
Дискутираните по-горе HGF/SF. EGF и TGFa са митогени.
които, както е посочено по-долу.
показват усилваш пролиферативен ефект, когато се използват заедно или самостоятелно според настоящото изобретение. Гореспоменатият списък от митогени. които могат да се използват като добавка към НВМ в настоящото изобретение не е изчерпателен. Трябва
обаче да се отбележи, че тези митогени не са необходими за преживяване или диФеренцировка на М епатоцити, когато растат t в НВМ. Хепатоцити растящи в НВМ ще пролиферират по-бавно, отколкото ако се добавят митогени.
Инсулинът, EGF, HGF и TGFa използвани в настоящите заявени за претенции среди, могат да бъдат получени или рекомбинантно чрез генно инженерство. или да бъдат пречистени от естествени източници. Например, видовете могат да бъдат човешки, говежди, конски, миши, свински или плъши.
Няколко от предпочитаните основни сток среди - DMEM 11966, DMEM 10314, МЕМ 11095 и Williams' Medium Е 12251, съдържат следните компоненти за 1000 ml стерилна дейонизирана вода, както е показано по-долу в Таблица I:
ТАБЛИЦА I
Компоненти на основните сток среди (mq/L)
WILLIAMS'
КОМПОНЕНТ DMEM 11966 DMEM 10314 MEM 11095 MEDIUM Е 12251
НЕОРГАНИЧНИ СОЛИ:
СаС12 (анхид) 200.00 200.00 200.00 200.00
CuSO4.5Н2О - - - - - - 0.0001
Fe (NO3 )3.9Н2О 0.10 0.10 - - 0.0001
КС] 400.00 400.00 400.00 400.00
MnCl2.4H2O - _ - - 0.0001
MaS04 (анхид) 97.67 97.67 97.67 97.67
NaCl 6.400.00 6,400.00 6,800.00 6,800.00
NaHCO3 3,700.00 3,700.00 2,200.00 2,200.00
NaH2PO4.H2O 125.00 125.00 140.00 - -
NaH2PO4 - - - - - - 140.00
ZnSO4.7H2O - - - - - - 0.0002
ДРУГИ КОМПОНЕНТИ
D-глюкоза — — 4,500.00 1.000.00 2.000.00
Глутатион - - - - — — 0.05
Метил линолеат - - - - - - 0.03
Фенол ред 15.00 15.00 10.00 10.00
Натриев пируват - - - - - - 25.00
Ь-Аланин - - - - - - 90.00
Ь-Аргинин.НС1 84.00 84.00 126.00 - -
L-Аргинин - - - - - - 50.00
L-Аспаргин.Н20 - _ - - - - 20.00
L-Аспартова киселина - - - - - - 30.00
L-Цистеин - - - - - - 40.00
L-Нистин - - 48.00 - -
L-Цистин.2НС1 63.00 63.00 31.00 26.10
1.-Глутамин 584.00 584.00 292.00 - -
Ι,-Глутаминова киселина - - - - - - 50.00
Глицин 30.00 30.00 50.00
L-Хистидин.НС1.Н20 42.00 42.00 42.00 - -
L-Хистидин - - - - - - 15.00
L-Изолевцин 105.00 105.00 52.00 50.00
L-Левцин 105.00 105.00 52.00 75.00
Ь-Лизин.НС1 146.00 146.00 73.00 87.50
L-Метионин 30.00 30.00 15.00 15.00
L-Фенилаланин 66.00 66.00 32.00 25.00
L-Пролин - - - - - - 30.00
L-Серин 42.00 42.00 - - 10.00
L-Треонин 95.00 95.00 48.00 40.00
L-Триптофан 16.00 16.00 10.00 10.00
L-Тирозин.2Na.2Н2О 104.00 104.00 52.00 50.70
L-Валин 94.00 94.00 46.00 50.00
Аскорбинова киселина - - - - — — 2.00
Биотин - - - - - - 0.50
D-Ca пантотенат 4.00 4.00 1.00 1.00
Холин хлорид 4.00 4.00 1.00 1.50
ЕргокалциФерол - - - - - - 0.10
Фолиева киселина 4.00 4.00 1.00 1.00
i-инозитол 7.20 7.20 2.00 2.00
Менадион Na бисулфат - - - - - - 0.01
Ниацинамид 4.00 4.00 1.00 1.00
Пиридоксин НС1 - - 4.00 - - - -
Пиридоксал НС1 4.00 - - 1.00 1.00
Рибофлавин 0.40 0.40 0.10 0.10
а-Токоферол
Динатриев фосфат - - - - - - 0.01
Тиамин НС1 4.00 4.00 1.00 1.00
Витамин А ацетат - - - - - - 0.10
Витамин В12 - - - - - - 0.20
Според предпочитаното изпълнение на настоящото изобретение, към основните сток среди от Таблица I се добавят следните допълнителни съставки от Таблица II, в краен обем 1000 ml. Предпочитаните изброени количества съвпадат с тези, описани по-долу в примера, в който основната сток среда е конструирана от 445 ml DMEM 10314 и 555 ml 11966, за да се осигури концентрация на D-глюкоза от 2.0 q/L, така че да не е необходимо тя да се добавя допълнително. Ясно е, че когато се използват други основни сток среди, оптималните количества от тези компоненти, които се добавят, могат да варират.
ТАБЛИЦА II
Добавки към SM за НВМ
Предпочитано
Концентрационен количество единици/1 единици/1
D-Галактоза 2.0 q 0.01-5.0 q*
D-Глюкоза 2.0 q** 0.01-5.0 g*
Никотинамид 610.0 mq 1-3050 mq
L-Пролин 30,0 mq** 1-120 mg
L-Аргинин 84.0 mq** 1-150 mq
L-Орнитин 100 mq 1-500 mg
човешки холо-трансферин
(30% наситен с Fe) 5.0 mq 0.1-100 mq
h-Инсулин 5.0 mq повече от 1011 Μ
Дексаметазон 1 x IO7 M ΙΟ“12 - 10~3 Μ
ZnCl2 0.544 mq** 1-3000 pg
MnSO4 0.025 mq** 1-250 цд
ZnSO4.7Н2О 0.750 mq** 1-3000 цд
CuSO4.5Н2О 0.20 mq** 1-1000 pg
Селен 5.0 pq 1-150 pg
L-Глутамин***
I допълнително към SBM)
5.0 mM
2.0-10.0 тМ
HEPES
20.0 тМ 5-50 тМ горната граница е около 8.0 g/L или по-малко, като се вземат предвид количествата, присъстващи в споменатата основна сток среда, ако има такива.
Когато се използват двете, D-глюкоза или D-галактоза.
или само едната от тях, долната граница е около 0.01 g/L или по-голяма.
Например, използваната смесена DMEM среда в примера тук съдържа 2.0 g/L D-глюкоза без да се добавя допълнително количество, а се прибавя 2.0 g/L D-галактоза.
**
Ако не са вече в
L-глутаминът е
SM основната сток среда.
необходима хранителна съставка настояшото изобретение.
включен L-глутамин.
работещите с клетъчни разгради при окисление деградира за период производството му.
Много
Добре основни сток известно е среди са обаче за култури, че L-глутаминът ще така, че целият от няколко
Следователно, за да се
L-глутамин ше седмици след се компенсира това е необходимо към средата
НВМ да се добави допълнително L-глутамин, както описано в настоящото изобретение.
В Таблица III по-долу са изброени субстанциите, които могат избирателно да се добавят към средата НВМ, за оптимизиране на клетъчния растеж за по-специални цели, при специфичен видов произход на хепатоцити и специфични клетъчни линии, или малигнени клетки. Тези количества отново ще варират. в зависимост от това, дали отделния компонент вече присъства в използваната основна сток среда.
ТАБЛИЦА III
Добавкиза.....ИВИ
Предпочитано
Концентрационни
количество граници
единициZL единици/L
Албумин* 2.0 о 0-10.0 a
Пеницилин** 100 и 0-2500 U
Стрептомицин* * 100 pg 0-2500 pq
Натриев пируват 0.15 q 0-2.0 q
Гама токоферол 0.35 mg 0-3.5 mg
Алфа токоферол 0.15 mq 0-2.5 mq
Витамин D3 0.20 mg 0-1.8 mg
Декстран* 2.0 q 0-5.0 q
Железен глюконат*** 25.0 pq 0-100 pg
Лиоленова киселина 1.0 q 0-5.0 q
Апо-трансферин * * * 5.0 mq 0-20.0 mq
Ретинол 0.05 mq 0-2.0 mq
Витамин В12 0.15 mq 0-2.0 mq
Аскорбинова киселина 3.0 ma 0-10.0 mq
Холин хлорид 1.5 ma 0. .2-12.5 mq
Биотин 0.75 ma 0 .2-15.0 mq
Декстранът може да се замени с албумин
Могат да се използват други антибиотици, например като гентамицин.
*** Железният глюконат и апо-трансферинът могат да се заменят с наситен с желязо холо-трансферин.
Η
В случаите когато е необходим ускорен растеж, към НВМ от настоящото изобретение могат да се добавят различни растежни фактори. Въпреки че в момента се предпочитат HGF/SF, EGF и TGFa ясно е, че могат да бъдат използвани също така и други растежни фактори. Предпочитаното количество от такива растежни фактори обикновено варира в зависимост от особеностите на използвания източник. Следователно, изброените тук количества по необходимост са ограничени, в зависимост от използваните тук специфични източници. В примера по-долу HGF/SF се добавя към НВМ с предпочитана концентрация 40 ng/ml; предпочитаната концентрация при добавяне на EGF е 20 ng/ml; и за TGFa предпочитаната концентрация е 20 na/ml.
Следващите примери илюстрират изобретението и не ограничават обхвата на изобретението.
ПРИМЕРИ _ ЗА ИЗ.ПЬЛНЕНИЕНА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Махвснали м „метдди
Материали
Във всички експерименти, включващи изолиране на плъши хепатоцити са използвани мъжки плъхове Fischer 344 от Charles River, (Pennsylvania). EGF и Matrigel (смес от матриксни компоненти, произхождащи от EHS миши тумор) са получени от Collaborative Research (Waltham, МА). Г3Н] тимидин е получен от ICN Radiochemicals (Irvine, СА). Колагеназата за изолиране на хепатоцити е получена от Boehringer Mannheim (Indiannapolis, ΤΝ). За конструирането на теловете от колаген е използван Vitrogen (Celtrix Labs, Palo Alto, СА). Основните реагенти са получени от Sigma Chemical Co. (St. Louis, МО). Използваният в тези изследвания HGF/SF е л5 вариант. EGL матриксът е закупен от
Upstate Biotechnoloqy (Lake Placid. NY).
Изолиранеикултивиране на хепатоцити
Плъши хепатоцити са изолирани чрез адаптация на калциевата двустъпална техника на колагеназна перфузия, както е описана от Kost
D. Р. , et al., J. Cell. Physiol.,
147:274 (1991), който е цитиран тук в литературата. Всички тези процедури са предназначени за получаване на популация от чисти хепатоцити. За разлика от много други хепатоцитни културални системи, настоящото изобретение не изисква или не използва подхранваща клетъчна ко-култура или определена подхранваща клетъчна среда. След изолиране на хепатоцити клетките се суспендират в среда, необходима за прикрепването им към съдовете за култивиране. Тази среда е MEM (GIBCO
12570) с NEAA (GIBCO 11140), инсулин mq/L и гентамицин 5
Хепатопитите се засяват върху подложка от еднослоен колаген, както е описано по-долу и се оставят да се прикрепят за два часа. Използвани са шест-ямкови плата (9.8 квадратни сантиметра на плато) от Corninq. При експерименти, в които не може да се индуцира хепатоцитна пролиферация или които се извършва преценка на различни функции, клетките се засяват при плътност 80,000 хепатоцити на квадратен сантиметър от повърхността. При експерименти, целящи да се индуцира пролиферация или генетична трансдукция с чужда ДНК, клетките се засяват с начална плътност 1,000 или 10,000 хепатоцити на квадратен сантиметър от повърхността. Първоначалната среда се заменя с НВМ средата от изобретението два часа след като клетките са засяти и на всеки 48 часа след това. При смяна на средата се добавят тимидин, растежни фактори и други съставки, колкото е необходимо.
Човешки хепатоцити са изолирани чрез адаптирана колагеназна перфузионна техника, както е описано от Strom, s. с., et al., journal., ..sf _Hati.Qnal_салсег,Institute,. 65(5):771-8 (1982), която е цитирана тук в литературата. Клетките са култивирани както е описано по-горе за плъшите хепатоцити.
Колагеновите гелове са приготвени както е описано от
Michalopoulos, G.
Κ. , et
Res,. ,
94:70 (1975), което е цитирано тук в литературата.
Сухото покритие на платата от колаген и Matrigel също направено според инструкцията на производителя.
Галовете от Matrigel са направени чрез добавяне на 50 μΐ разтвор на Matrigel в 0.5 ml среда директно върху прикрепените клетки.
Синтезата на ДНК се измерва чрез усвояването на тритиев тимидин в преципитиран с трихлороцетна киселина (ТХО) материал, както е описано от Kost, D. Р. , et al. (1991), цитиран по-горе. Когато е необходимо, колагенови гелове се
разграждат с 2 mg колагеназа на ml използвана МЕМ среда.
След това се провежда инкубация за 30 минути на 37 *С.
Разградените гелове се третират с NaOH, последвана от ТХО за преципитация на ДНК, РНК и белтъци, както е описано от Kost,
D. Р., et al. (1991), цитиран по-горе.
състав.„.на....сввдажд,ЛВМ
DMEM, HEPES, L-глутаминът и антибиотиците са закупени от GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD). ITS сместа (инсулин, трансферни, селен) е закупена от Boehringer Mannheim. Всички други добавки за клетъчната култура са с качество (Sigma).
Ако няма някакви други указания за определени експерименти, основната сток среда се състои от DMEM 11966 смесена с DMEM 10314, за да се достигне крайна концентрация на D-глюкоза 2.0 q/L. В този случай се смесват 445 ml от DMEM 10314 с 555 ml от DMEM 11966, за да се достигне тази концентрация. Рецептите на тези основни сток среди са обяснени по-горе в Таблица I. Към получената смесена среда след това се добавят: пречистен говежди албумин 2.0 q/L, D-галактоза 2.0 q/L, L-орнитин 0.1 q/L, L-пролин 0.030 q/L, никотинамид 0.610 q/L, ZnCl2 0.544 mg/L, ZnSO4.7H2O 0.750 mq/L, CuSO4.5H2O 0.20 mq/L, MnSO4 0.025 mq/L, глутамин 5.0 mM, ITS (rh-инсулин 5.0 mq/L, човешки трансферни 5.0 mq/L Г30% наситен c дифери желязо], селен 5.0 pc/L), дексаметазон 107 М и HEPES буфер 20.0 mM. Добавят се пеницилин и стрептомицин с концентрация 100 U/L и 100 pq/L, респективно. Смесената основна НВМ се стерилизира чрез филтруване през нискомолекулна белтък-свързана филтърна система (Corninq), съхранява се при 4“С и се използва в период от 4 седмици. Когато е необходимо, растежните фактори се добавят към свежа НВМ със съответната специфична концентрация всеки път, когато се сменя средата.
Ретролирусна.^ .ОЦ®11Ка„ла„ХЛоналното нарастване
Хепатоцитите първоначално се засяват при плътност 104/см2 и растат в НВМ с добавка на HGF/SF (40 nq/ml) и EGF (20 nq/ml). След 68 часа средата се сменя със супернатанта от CRyP—кита, репликапионно-дефицитен амфотропен ретровирус (MFG ~ 5 х 105 единици за ml), съдържаш β-галактозидазен ген на Е. coli, контролиран от LTR промотор, както е описано от Zitvoqel, L. Н. et al.. Hum,Gene.Ther., 5:1493 (1994), което е цитирано тук в литературата. Добавя се 2 uq/ml
Polybrene. След 18 часа супернатантата се сменя с НВМ, в която е добавен EGF с концентрация 20 nq/ml и HGF/SF с концентрация 40 ng/ml. Краткият контакт със супернатантата съдържаща вируса няма неблагоприятен ефект върху преживява29 нето или пролиферацията на хепатоцитите. В посочените
времена клетките се фиксират с 0.5% глутаралдехид в PBS за 10 минути и реакцията се проявява с X-Gal субстрат при 37 *С за 16 часа. Трансдуцираните клетки, експресиращи гена на Е. coli се оцветяват положително, както е показано на Фигури 4G и 4F. Съответните контроли за всеки компонент са негативни по отношение на X-Gal оцветяване.
Трансмисионна електронна микроскопия
Пробите за трансмисионна електронна микроскопия (ТЕМ) се фиксират върху културалните плата за 1 - 1.5 часа в 0.1 М натриев какодилатен буфер (pH 7.4), който съдържа 2,5%
глутаралдехид и 2% формалдехид. След това платата се изплакват два пъти с 0.1 М натриев какодилатен буфер (pH 7.4) и два пъти с 0.1 М натриев какодилатен буфер, съдържащ 5% захароза (pH 7.4). След това те се държат в захарозния буфер за 1 - 7 дни, изплакват се два пъти с 0.1 М натриев какодилатен буфер (pH 7.4) и след това се провежда постфиксация за 1 час в 1% OsO4 в 0.1 М натриев какодилатен буфер. След това платата отново се изплакват с буфер и фиксираните и обработени колагенови гелове се нарязват на лентички с бръснарско ножче. След това лентичките се прехвърлят в стъклени лабораторни шишенца и се дехидратират чрез възходяща редица от етанол (25 - 100%) и два пъти с пропиленоксид, след което се включват в смола от EponAraldite (BioTec, TX). Смолата се сменя няколко пъти в продължение на два дена, тъй като колагеновите телове задържат пропиленоксида. Лентичките от колаген се включват хоризонтално и се оставят за една нощ при 60 ”С за полимеризация.
Анализ~_на-генна експресия чрез Northeгη блотове
Екстракция яатотална РНК..иL иРНК от култури
Тотална РНК се екстрахира от непромити клетъчни култури, като се използва 2.0 ml RNAzol В (BioTec) на ямка и се пречиства по указанията на производителя. Концентрацията и чистотата на РНК се определят чрез рутинна спектрофотометрия. За разделяне на РНК по молекулна маса се нанасят по 20 ца РНК на старт в денатурирани 1% агарозни телове, след което се прехвърлят върху найлонови мембрани (Amersham, Arlington Heiqhts, IL) чрез капилярния метод. След фиксация под UV светлина, мембраните се хибридизират за една нощ със специфични кДНК-и (както е отбелязано на Фигурите), които са белязани с [α-32ΡΊ dCTP чрез използване на Amersham random primer кит. В последствие мембраните се промиват в условия на висока йонна сила и се експонират с XAR филм (Eastman
Kodak, Rochester, NY) за 1 - 3 дни. Отчитането на хибридизи ралите РНК ивици се извършва чрез лазепна денситометрия.
Източници на кДНК проби
Пробите от кДНК, използвани за изследване на генната експресия са получени като дарение и доставени след заявка от следните източници: Цитокератин 8 от Dr. Norman Marceau (Laval Unibersity); Цитокератин 14 от Dr. Dennis Roop (Bavlor College of Medicine); Цитокератин 18 от Dr. Robert
Oshima (LaJolla Cancer Research Foundation); Питокератин 19 от Dr. Andre Royal (University of Montreal); TGFa (плъх) получен от Dr. David Lee (University of North Carolina at Chapel Hill); EGF-R (плъх) получен от Dr. Sheldon Earp (University of North Carolina at Chapel Hill); aFGF от American Type Culture Collection (ATCC) (каталожен fe 78222); aFGF-R от ATCC (каталожен 1» 65796); uPA получен от Dr. Jay
Degen (University of Cincinnati); цитохром 11B1 от Dr. Steve
Strom (University of Pittsburgh); анализи на кДНК-и за албумин, на а фетопротеин и на транскрипционен фактор са направени от Dr. Joe Locker (University of Pittsburgh).
ПОЛУЧЕНИ РЕЗУЛТАТИ
Роля, на компонентите от средите и . матриксните субстрати върху клетъчнатапролиферация
Пълно описание на НВМ средата е дадено по-горе. За да се оцени относителната значимост на отделни компоненти от средата, са проведени няколко експеримента, чиито резултати са показани по-долу в Таблица IV (А, В и С). Компонентите D глюкоза, албумин, дексаметазон, трансферни и селен, никотинамид и микроелементи са извадени поотделно от пълния състав на НВМ средата, както е показано в Таблица IV А. Там е показана тоталната ДНК на култура след 14 дневен растеж.
Както може веднага да се види, най-драматичен ефект има отстраняването на дексаметазон, последван от премахването на никотинамид. В Таблица IV В се сравнява растежа на клетки на 14 ден в среда НВМ, съдържаща дифери трансферни (наситен с желязо) с растежа в такава, в която трансферинът е ненаситен. Открито е, че добавянето на дифери трансферин (30% наситен) е много по-ефективно за повишаване на растежа.
Добавянето на елементарно желязо (FeSO4, 0.1 μΜ) към ненаситения трансферни е недостатъчно. за да се преодолее разликата. Таблица IV С дава информация за относителните влияния на D-глюкоза, D-галактоза и L-орнитин в среда НВМ. И трите компонента са потенциални източници на енергия за клетките. Отбелязва се пълно спиране на растежа, когато се отстранят и трите компонента. Добавянето само на D-глюкоза има най-голям ефект, докато добавянето само на D-галактоза е по-малко ефективно. Ако се добави само орнитин, ефектът е минимален. Намерено е, че концентрацията от 2 g на литър поотделно за албумина и D-глюкозата е оптимална, въпреки че ефектите не се различават статистически от тези, в случаите когато се използва 1 или 3 g на литър. Ефектът от пълното отстраняване на тези компоненти е показан в Таблица IV А.
Таблица IV
А. Влияние на отстраняване на. специфични компоненти от.....НВМ
Върху хе патоцитен растеж цд/ямка
ДНК в нулево време 13.90 + 3.60
ДНК на 14 ден в НВМ (с HGF/SF и EGF) допълнена с:
+ Всички компоненти 84.90 + 0.50
- Глюкоза 69.80 + 2.90
- Албумин 68.70 ± 0.50
- Дексаметазон 13.70 ± 0.20
- (Трансферни и селен) 63.10 + 2.00
- Никотинамид 35.20 ± 1.70
- Микроелементи 65.00 + 2.40
- Всички компоненти 20.20 + 4.30
в. Влияния н.а jKeHH3Q.jLJi’RaHcAePHH.върху...хепатрцитен растеж
ДНК в нулево време 9.21 + 1.01
Дифери трансферни (наситен с желязо)
Дифери трансферни плюс добавено желязо (5μΜ) Беден на желязо трансферни Беден на желязо трансферни добавено желязо
70.15 ± 1.21
1.83 ± 0.41
24.84 ± 4.30 с
1.10 ± 0.90
С. Влияние на отстраняване на глюкоза. орнитин или
Г ДЛ^КТОЗй
Нулево време 11.0 ± 0.4
Контрола (Глюк.+, Орн.+, Гал.+) 59.0 ± 2.5
Глюк.-, Орн.-, Гал.- 10.6 ± 0.8
Глюк.-, Орн. +, Гал. - 14.4 ± 0.9
Глюк.-, Орн.-, Гал. + 44.2 ± 6.0
Глюк. +, Орн.-, Гал. - 59.0 ± 4.0
Глюк.+, Орн.+, Гал.- 62.7 ± 1.4
Глюк.+, Орн.-, Гал.+ 63.6 ± 0.3
Отбелязаните компоненти от НВМ се отстраняват и
хепатоцитите растат в модифицираната среда 14 дни. Тоталната ДНК в микрограми на култура се измерва на 14 ден, за да се оцени растежа на клетъчната култура. Нулево време е пробата от хепатоцитна суспенсия, инокулирана в плаката незабавно след изолиране на клетки. Данните са изразени като средна стойност + стандартна грешка от три отделни плаки.
Дифузно Встъпване на хепатоцитите в пролиферация пол влияние на HGF/SF. EGF и TGFa
Фигури 1А и IB показват включването на тимидин за цд ДНК, както и индекса на белязаните с BRdU ядра в различни дни, в култура от клетки, растящи в присъствие на HGF/SF и EGF (респективно 40 и 20 ng/ml), както е описано по-горе. Както се вижда, най-голяма пролиферация се установява между 5-12 ден. На 15 ден културите са конфлуентни и синтезата на ДНК бавно спада. Високият индекс на белязане на ядрата по време на непрекъснатата пролиферация показва, че пролифериращите клетки произхождат директно от зрелите хепатоцити.
Към средата НВМ се добавят поотделно растежните фактори HGF/SF, EGF, TGFa, KGF (кератиноцитен растежен фактор), SCF (фактор за стволови клетки) и aFGF (кисел фибробластен растежен фактор). Добавянето на растежните фактори HGF/SF, EGF и TGFa (показано на Фигура 2 като TGFa) води до значителна клетъчна пролиферация, както е показано чрез тоталното количество ДНК за култура на 15 ден. Когато се добавят поотделно или в комбинация KGF. aFGF и SCF нямат пролиферативен ефект, както се вижда от Фигура 2. Когато се добавя отделно, TGFa има по-силен пролиферативен ефект, отколкото който и да е от останалите митогени. Заедно HGF/SF и EGF имат най-силен пролиферативен ефект за дадения интервал от време 15 дни, отколкото всеки един от другите митогени поотделно или в комбинации. Добавянето на всички растежни фактори заедно няма по-голям ефект, отколкото комбинацията на HGF/SF и EGF, както се вижда от Фигура 2. Детайлните клетъчни кинетики, индуцирани поотделно или в комбинация от HGF/SF и EGF са показани на Фигура 10. Тоталната ДНК за култура е показана като функция от времето в култура. Най-голямото количество от акумулирана ДНК на 15 ден се вижда при комбинация на HGF/SF и EGF. На 15 ден ДНК за култура е 12 пъти повече в сравнение с време 0, което показва увеличаване на броя клетки. HGF/SF и EGF са с равностойни възможности. Сам TGFa е по-митогенен отколкото HGF/SF или EGF поотделно.
Ефект на матриксни субстрати
В тази система няколко матриксни субстрата подпомагат
клетъчния растеж. Плъши хепатоцити се култивират за 15 дни в НВМ с добавка на HGF/SF (40 ng/ml) и EGF (20 ng/ml) и растат върху различни матрикси, както се вижда на Фигура 3.
Клетките се култивират както е описано по-горе. Сухото покритие от колаген тип IV (миши), тип I (говежди), фибронектин и ламинин е еднакво ефективно в поддържане на клетъчния растеж, което се установява чрез измерване на ДНК за култура на 15 ден. Сухото покритие с ECL (търговски дериват на EHS гел, UBI) има по-добри ефекти. Покритието с тип Т колаген (търговски препарат Vitrogen) е стандартен метод използван в експериментите, ако не е указан друг. Понадолу е описан ефектът на матриксните телове в поддържане
на специфични фенотипни промени в тези култури.
Фенотипни. промени на„хепатоцити по време на лролиферация
Морфологията на пролиферирашите клетки (култивирани в НВМ, както е описано по-горе, с добавка на 40 ng/ml HGF/SF и 20 ng/ml EGF) варира в различни времена след стимулиране на клетъчната пролиферация. От нормална хепатоцитна морфология, както се вижда на Фигура 4А, пролифериращите клетки в първите 4 дни придобиват дълги израстъци, като приемат описания типичен фенотип, дължащ се на дифузния ефект на HGF/SF върху хепатоцитите, както се вижда от Фигура 4В,
което е описано от Michalopoulos, G. К. , et al , J,.Cell. Physiol.156:443 (1993), който е цитиран тук в литературата. Между 6 и 8 ден пролифериращите клетки губят голяма част от техните цитоплазмени гранули, ядрата стават по-слабо видими, загубва се окръглеността на клетките и те започват да растат като монослойни зони. Евентуално тези зони се сливат, като клетките продължават да растат, за да образуват непрекъснат монослой, което се вижда от Фигура 4С. Електронномикроскопското изследване, показано на Фигури 4D и 4Е сочи, че повечето от отличителните характеристики, типични за зрелите хепатоцити липсват. На 15 ден няма мембрани на ендоплазматичния ретикулум, обграждащи митохондриите, няма агломерати от гликоген или пероксизоми. Отсъстват жлъчни каналчета. Наблюдава се значително увеличение на групи от кератинови интермедиерни филаменти. Ядрата са с ъгловата форма и много ясно изразени ядърца. След достигане на конфлуентност, постепенно се възстановява морфологията на зрелите диференцирани хепатоцити с мембрани на ендоплазматичния ретикулум, митохондрии, гликоген, пероксизоми, жлъчни каналчета и т.н. , подобна на тази от Фигури 6В и 6С.
Клоналният растеж на пролифериращите плъши хепатоцити е показан на фигури 4F и 4G. Хепатоцитите са трансфектирани на 3 ден от култивирането с репликационно-дефицитен ретровирус. съдържащ lac-Z гена под контрола на вирусния LTR и са оцветени за експресия на 0-галактозидаза. Най-вече единични клетки се оцветяват положително на 4 ден след култивирането (първи ден след трансфекцията), което се вижда от Фигура 4F. От друга страна, оцветявянето на 10 ден и продължаващо до 28 ден показва групи от положително оцветени хепатоцити, което
Ml
е в съответствие с клоналния растеж на първоначално трансфектираните хепатоцити. както се вижда от Фигура 4G. Процентът на lac-Z-позитивните клетки (-20%) не се променя по време на култивиране.
Пролиферирашилецатоцити експресират променливи..... нива на различни, „гени
Анализирана е експресията на няколко специфични гена в пролиферираши хепатоцити. Те включват иРНК гени свързани с хепатоцитна диференцировка (албумин, цитохром IIB1 (означен като Р450 на Фигура 5А)), гени кодиращи цитокератинови маркери (цитокератини 14, 18 и 19) или свързани с хепатоцитния растеж (урокиназа (υΡΑ), HGF/SF и неговия рецептор c-met (означен като MET на Фигура 5А) , EGF (означен като EGFR) и TGFa и техния рецептор, киселия FGF и неговия рецептор, и TGFBj). Тези гени са изследвани чрез Northern блот анализ на РНК от култури, растящи в присъствие или на комбинирани HGF/SF (40 ng/ml) и EGF (20 ng/ml) (Фигури 5А и 5В) , или само с TGFa (20 ng/ml) (данните не са показани). Изолирана е тотална РНК от култури на 0, б, 10, 15 и 21 ден. В изследванията на което и да е от посочените времена не се открива експресия на HGF/SF или TGFB^ иРНК.
Както се вижда, иРНК за албумина и цитохром IIB1 присъства в нулево време и постепенно намалява. иРНК за албумина се увеличава на 21 ден, като в същото това време се открива и иРНК за а фетопротеин (AFP). иРНК за цитокератини 14, 18 и 19 се увеличава по време на култивирането. Има постоянно увеличаване на иРНК за aFGF и TGFa. иРНК за рецепторите на HGF/SF (MET, Фигура 5А) и aFGF (Фигура 5В aFGFR) остава постоянна през време на култивирането. иРНК за
EGF рецептора (EGFR) намалява от нулев ден, но запазва експресия. Експресията на иРНК за GAPDH се използва като еталон за конститутивно експресираните housekeeping гени.
Забелязва се драматично увеличение в експресията на урокиназа, както и на цитокератини 14 и 19. Наблюдавани са някои различия от горните примери, където културите вместо с HGF/SF и EGF, са поддържани в присъствие на TGFa (20.0 ng/ml). В тези култури експресията на албумина и експресията на HGF/SF рецептора се запазват πο-добре по време на пролиферацията, докато AFP се появява по-рано (данните не са показани). Независимо от наблюдаваните различия в примерите на генна експресия, не се наблюдават морфологични различия между клетки, растящи в присъствие на TGFa или HGF/SF плюс EGF, след като веднъж е достигната конфлуентност.
ПролиЛерираши. хеплхоиитиселревръаат. .......в зрели^ хепатоцити ..под влияние..,яа_ .....непаренхимни клетки, илинакултивиран®
Когато на 8 ден върху културите е нанесен MatrigeJ, то
се наблюдава бърза поява (за 2 дни) на жлъчни каналчета и клетките се организират в структури подобни на въже.
Отличителните характеристики на тези клетки са показани на
Фигура 6А. Както се вижда от електронната микроскопия на
Фигури 6В и 6С, тези клетки имат типични маркери на зрели хепатоцити, включващи обграждано на митохондриите от ендоплазматичния ретикулум, жлъчни каналчета и присъствие на гликоген. От култури, третирани с Matrigel за 10 дни (култура между 8-18 ден) са изготвени препарати от иРНК. Сравнена е експресията на албумина между нулев ден култивиране (веднага след колагеназна перфузия), на осми ден от култивирането (преди нанасянето на Matrigel) и култури на трети и седми ден след нанасяне на Matrigel, както е показано на Фигура 6D. Добавянето на Matrigel води до драматично увеличаване на експресия на иРНК на албумина, в сравнение с контролните пролифериращи култури, в които тя е слабо забележима. Също така, както е показано на Фигура 6Е, е измерен ефектът на фенобарбитол (РВ) върху нивата на цитохром Р450 IIB1 иРНК, в култури третирани с Matrigel. Marigel се добавя към културите на 8 ден. РВ се добавя 2 дена по-късно (10 ден от култивиране). Клетките се събират 5 дена след добавяне на РВ (15 ден от култивиране). Добавянето на РВ индуцира цитохром IIB1 иРНК :3?амо в култури, третирани с Matrigel. Индукцията на тази иРНК от фенобарбитол е типична за хепатоцити и не се среща в който и да е друг тип клетки, както е съобщено от Michalopoulos, G. , et al, Science (Wash. DCl, 193:907 (1976), който е цитиран тук в литературата. Типично, хепатоцитните култури бързо губят способността си за отговр към РВ. Това откритие подкрепя доказателството, че добавянето на Matrigel към култури от пролифериращи хепатоцити индуцира фенотипа на зрели хепатоцити. както се вижда от електронномикроскопската структура, показана на Фигури 6В и 6С. Експресията на цитокератин 19 (СК19) (Фигура 6F), жлъчен дуктален маркер експресиран от пролифериращи хепатоцити преди въвеждане на диференциращите условия, също спира след добавяне на Matrigel, както се вижда от Фигура 5В.
Измерена е синтезата на ДНК в култури, третирани с Matrigel и се установява значително намаляване. За да се оцени дали диференцировката към морфологично зрели хепатоцити изисква синтез на ДНК, към НВМ средата се добавят
mM хидроксиуреа. Показано е (Michalopotilos, G. K. , et al.. CancerВеа.л 38:1866 (1978), който е цитиран тук в литературата), че се преустановява програмираната по полуконсервативен механизъм синтеза на ДНК в хепатоцити чрез инхибиране на рибонуклеотидната редуктаза. Хидроксиуреята се добавя към културите преди да се нанесе Matrigel и се поддържа през време на следващия 5-дневен период. Синтезата на ДНК намалява до 3.93% от контролата (без хидроксиуреа) в пролифериращи култури, поддържани в отсъствие на Matreigel и до 6.27% от контролата (без хидроксиуреа) в култури, поддържани в присъствие на Matrigel. Въпреки че синтезата на ДНК (+ Matrigel, без хидроксиуреа) намалява до 6.27% от контролните нива, превръщането на пролиферирашите хепатоцити в хепатоцити със зряла морфология не се повлиява и включва цялата популация.
HGFJ. SF. (нр_______не „TGFg..........или EGF)________индуцира _ пролиферирали хепатацити_дя._се_лиФ.еренц№ . j?
тури в .„г^лове_рт^олаге^н^ип..._1
Хепатоцити, поддържани между два слоя колагенов гел, запазват морфологията и диференцировката си за продължителни периоди от време, както е описано от Michalopoulos, G. К. , et. al, J. Cell· Physiol. , 15.6:443 (1993), което е цитирано тук в литературата. Хепатоцити, поддържани в сандвичи от колагенов гел в култура с конвенционална среда, съдържаща HGF/SF, се подлагат на интензивна пролиферация, формират изпъкнали повърхности и започват евентуално да се организират в структури, напомнящи чернодробни пластинки. Оценено е поведението на хепатоцити, поддържани между два слоя от колагенов гел, както е описано предварително, но в присъствие на НВМ, допълнена или с HGF/SF, или с EGF, както е описано по-горе. Трябва да се отбележи, че в среда допълнена с EGF, хепатоцитите претърпяват типични фенотипни преходи, както е описано по-горе. От друга страна, в култура от хепатоцити в НВМ, към която е добавен само HGF/SF, в която става увеличаване на клетките идентични по външен вид с пролифериращите хепатоцити описани по-горе, се появяват
множествени дуктуларно оформени структури между 10 и 15 ден. Това става забележимо и обхваща повечето от клетките, представени в културите. Започвайки приблизително от 10 ден, до 15 ден повечето клетки в културата са организирани в такива дуктуларни структури. Външният вид на тези структури е показан на Фигура 7А. Хистологични срези са показани на Фигура 7В (светлинна микроскопия) и на Фигури 7С и 7D (електронна микроскопия). Структурите имат дуктуларна или ацинарна конфигурация. Някои от клетките, обграждащи тези структури са много удължени и външния им вид както под светлинен, така и под електронен микроскоп е идентичен с епитела на жлъчните каналчета. Други обаче, са по-големи и
наподобявт до голяма степен дуктуларните хепатоцити, описани в предишни изследвания, в in vivo модели . Пролиферацията на клетки (данните не са показани) под действие или на EGF, или на HGF/SF в сандвичи от колагенови гелове е много по-малка (<25% в най-високата точка) отколкото тази, която се наблюдава в културите върху пластмаса, покрита със сух колаген. В повечето случаи пролиферацията спира на 10 ден и каналоподобните структури се появяват след спиране на клетъчна пролиферация (ден 10 - 15). В тези култури, когато HGF/SF и EGF са комбинирани, се забелязват също дуктуларно ацинарни структури, но те са по-малко в сравнение с тези, при използване само на HGF/SF. Както при наслояване с Matriqel, добавянето на хидроксиуреа за инхибиране на ДНК синтеза (инхибирането намалява до 5.1% от контролата) не влияе на формирането на дуктуларни структури (данните не са показани). Фигура 7Е показва, че тези клетки експресират цитокератин 19, което е характеристика на дуктуларните клетки. (Виж Sirica, А. Е., Prog. Liver Dis.., 10:63 (1992) и Sirica, A. E. , Hi.st.ol.,... Histopathol,., 10:433 (1995), които са
цитирани тук в литературата). Запазва се също така експресия на малко количество албумин, в съответствие с наличието на хепатоцит-подобни клетки в дуктуларните структури, както се вижда на Фигура 7D. Отбелязано е, че дуктуларните клетки, поддържат експресия на СК19 в непролифериращо състояние (Фигура 7F), за разлика от клетките диференциращи се в посока към зрял хепатоцитен п оизход, които спират експресията на този маркер за жлъчния канал.
Продължил®лйн. .jbaszsk._ jLiMmiaMML лпопулация . ат „новещки хепатоцити .> .Ж_1
Въпреки че културите от човешки хепатоцити не са така обстойно характеризирани както тези от плъх, наличните литературни данни показват, че тези клетки също претърпяват ограничен цикъл на ДНК синтеза, след стимулиране с растежни фактори и бързо дегенерират в култура. Виж, Ismail, Т. , et al., Hepatology 14:1076 (1991), който е цитиран тук в литературата. Изследван е отговорът на човешки хепатоцити към HGF/SF (40 ng/ml) и EGF(20 ng/ml) в среда НВМ. Резултати, сходни с тези, описани за плъши хепатоцити са показани в първична култура от човешки хепатоцити, както се вижда от Фигура 8. Човешките клетки започват бързо да
пролиферират на 3 - 4 ден от култивирането и достигат конфлуентност на 19 ден.
Както е уточнено по-горе, необходима е среда, която ще позволи на хепатоцити, култивирани in vitro да се увеличават като клетъчна популация. Средата НВМ от настоящото изобретение позволява такова увеличение и следователно дава възможност да се правят най-необходимите изследвания с пролифериращи хепатоцити. Настоящото изобретение ще бъде също така много полезно за редица д уги приложения изложени по-долу.
Например, всички утвърдени съвременни методи, отнасящи се до генна терапия на черен дроб като обект, при които се извършва продължителна експресия на пренесени гени, изискват активно делящи се клетки по време на началната трансфекция. В нормалния черен дроб само 1 от 20, 000 хепатоцита е в S фаза на растеж във всеки отделен ден. Обикновено, за да се повиши клетъчната пролиферация, голяма част (2/3) от черния дроб на пациента трябва да се отстрани. Впоследствие източника-носител на гена за черния дроб се инжектира
интраваскуларно. Алтернативата на тази драстична мярка е да се отстрани малко парче от черния дроб (10%), да се култивират хепатоцитите, да се трансфектират в култура и след това да се влеят клетките обратно в черния дроб. Този последен метод, макар и по-сигурен, по-евтин и поконтролируем отколкото предишния, днес е с ограничено приложение поради липсата на културална среда като НВМ, която позволява продължителна пролиферация, клонално увеличаване на почти всички култивирани клетки и продължителна жизнеспособност на клетките.
Замисълът на съвременните подходи за култивиране на черен дроб извън тялото се базира на биоизкуствена чернодробна тъкан, чиито клетъчни елементи се осигуряват от трансформирани (туморни) хепатоцити или животински хепатоцити. Животинските клетки не преживяват повече от няколко дена в биореакторите, които се използват и не пролиферират, което прави необходимода се създават по-често биореактори и да се поддържат в по-голяма близост всички
необходими условия, материали и животински донори, за да са в наличност при нужда. В допълнение, животинските клетки могат да имат различни нежелателни аспекти, които ги правят клинически трудни или опасни за използване. Също така, при туморните клетки, използвани при тези подходи, съществува риск от изтичане на клетки в пациента и, следователно, съществува потенциална възможност да се предизвика образуване на тумори в пациента. Средата НВМ от настоящото изобретение ще позволи производство на биореактори, съдържащи животински и/или човешки хепатоцити, и/или други клетки и осигурява уникалната способност на клетките да
увеличават броя си, като се поддържат дълго време жизнеспособни и напълно диференцирани. Такива реактори биха могли да се използват също така в производството на лекарства, изследвания на лекарствения метаболизъм, в токсикологични и комплексни биологични изследвания.
Друга възможност за използване на НВМ средата от настоящото изобретение е при автотрансплантация на хепатоцити. Хепатоцитен трансплантант е относително нов подход при лекуване на пациенти с крайна фаза на чернодробно заболяване. Методът се основава на използване на донорни органи, които не са използвани като органен трансплантант.
Автотрансплантацията има предимството, че не изисква имуносупресивни лекарства, но не е приложима, ако не е възможно да се увеличи броят на клетките и да се поддържат те живи достатъчно дълго, за да се върнат обратно в донора. В крайна сметка чернодробните експланти могат също да служат като източник на хепатоцитен донор при избрани условия, включващи инкапсулиране или генетична манипулация. Незави симо от източника на хепатоцити, увеличаването на броя клетки в дълготрайна култура и реплантацията (в далак,
портална система, перитонеум, бъбречна капсула и т. н.) води до ефективно повишаване на чернодробни синтетични и детоксикационни процеси за продължителен период от време. Ограничаващата точка е липсата на хепатоцити. НВМ има възможност да елиминира този недостиг на клетки и по този начин значително да се увеличи чернодробни увреждания, които могат подобен начин автотрансплантацията броя на пациенти с да бъдат лекувани. По или хетеротрансплантацията с други клетки, растящи средата от настоящото изобретение може да увеличи броя на пациентите и списъка на
възможните лечения с биоклетъчни терапии.
Средата НВМ от настоящото изобретение може също да се използва при провеждане на лекарствени и химически тестове. Всъщност всички лекарства, химикали и други производствени продукти могат да се тестуват за мутагенност и токсичност в хепатоцитни култури като част от FDA, USDA, NIOSH и ЕРА разпоредби. Понастоящем тези тестове се провеждат върху плъши хепатоцити в краткотрайни култури, поради липса на дълготрайна жизнеспособност или значителна пролиферация. Използването на НВМ (1) ще разшири периода на тестуване (дълготрайна жизнеспособност), (2) ще позволи по-дълги периоди на експонация при ниски концентрации, (3) ще позволи по-дълго наблюдение за мутагенност и токсичност върху пролифериращи хепатоцити и (4) ще направи възможно доставяне на човешки хепатоцити, които могат да се използват в други токсикологични изследвания.
Въпреки че изобретението е описано подробно, за да се илюстрира по-добре, трябва да се знае, че такива детайли са
дадени единствено с тази цел и в него могат да бъдат направени вариации от специалистите в областта без да се отклоняват от смисъла и обхвата на изобретението, освен ако това не е ограничено от претенциите.

Claims (43)

  1. Патентни претенции
    1. Химически дефинирана НВМ културална среда за поддържане, диференпировка и дълготраен растеж на хепатоцити от бозайници, характеризираща се с това, че съдържа:
    а) синтетична основна сток среда, предназначена за клетъчни култури от бозайници и б) количество от компоненти, подпомагащи растежа на
    хепатоцитната клетка, избрани между никотинамид, аминокиселини, трансферни, хормони, дексаметазон, микроелементи и прости въглехидрати избрани от групата, съдържаща D-глюкоза и D-галактоза и каквато и да е комбинация от тях.
  2. 2. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 1, характеризираща се с това, че съдържа и буфер.
  3. 3. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 2, характеризираща се с това, че споменатият буфер е HEPES.
  4. 4. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 2, характеризираща се с това, че съдържа и антибиотици.
    5. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 4, характеризираща се с това, че споменатите антибиотици са избрани от групата, съставена от пеницилин и стрептомицин , и каквато и да е комбинация от тях. 6. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 4, характеризираща се с това, че съдържа и албумин. 7. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 6,
    характеризираща се с това, че споменатият албумин е избран от групата, съставена от телешки серумен албумин, човешки албумин, плъши албумин, свински албумин и конски албумин.
    8. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 1, характеризираща се с това, че споменатата синтетична основна сток среда е избрана от групата, съставена от DMEM, МЕМ,
    Williams Media Е, BME, DMEM/F-12, Среда 199, F-12 (Ham)
    Nutrient Mixture, F-10 (Ham) Nutrient Mixure и Среда RPMI 1640.
    9. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 1 характеризираща се с това, че споменатите аминокиселини са избрани от групата, съставена от L-глутамин, L-орнитин, Lпролин и L-аргинин, и всяка комбинация от тях.
    10. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 1, характеризираща се с това, че споменатите микроелементи включват цинк, манган, мед и селен.
    11.
    Културалната среда НВМ съгласно
    Претенция 1, характеризираща се с това, че споменатите микроелементи освен това включват ZnCl2, ZnSO4.7H2O, MnSO4, CuSO4.5Н2О и
    NaSeSO4.
    12. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 1, характеризираща се с това, че споменатия трансферни е избран от групата, съставена от холо-трансферин 30% наситен с желязо и апо-трансферин в комбинация с железен глюконат.
    13. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 1, характеризираща се с това, че споменатите хормони включват инсулин и дексаметазон.
    14. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 1, характеризираща се с това, че споменатата синтетична основна среда е DMEM.
    15. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 14, характеризираща се с това, че споменатата DMEM съдържа около 0.1 - 5.0 g/L D-глюкоза, за предпочитане около 2.0 g/L.
    16. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 1, характеризираща се с това, че съдържа и растежни фактори в количество, повишаващо клетъчния хепатоцитен растеж.
    17. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 16, характеризираща се с това, че споменатите растежни фактори са избрани от групата, съставена от HGF/SF, EGF и TGFa.
    18. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 6, характеризираща се с това, че съдържа и растежни фактори в количество, повишаващо клетъчния хепатоцитен растеж.
    19. Културалната среда НВМ съгласно Претенция 18, характеризираща се с това, че споменатите растежни фактори са избрани от групата, съставена от HGF/SF, EGF и TGFa.
    20. Културална среда за клетки от бозайници, характеризираща се с това, че съдържа състава на НВМ, както е определен в Таблици I и II, където основната сток среда от Таблица I съдържа комбнирана DMEM така, че предпочитаната крайна концентрация на D-глюкоза е около 2.0 g/L, а предпочитаното количество D-галактоза е около 2.0 g/L.
    21. Културалната среда, съгласно Претенция 20, характеризираща се с това, че съдържа и компонентите, изброени в Таблица III.
    22. Културалната среда съгласно Претенция 20, характе- ризираща се с това, че съдържа и растежни фактори в количество, повишаващо клетъчния хепатоцитен растеж.
    23. Културалната среда съгласно Претенция 22, характе ризираща се с това, че споменатите растежни фактори са избрани от групата, съставена от HGF/SF, EGF и TGFa.
    24. Културалната среда съгласно Претенция 21, характеризираща се с това, че съдържа и растежни фактори в количество, повишаващо клетъчния хепатоцитен растеж.
    25. Културалната среда съгласно Претенция 24, характеризираща се с това, че споменатите растежни фактори са избрани от групата, съставена от HGF/SF, EGF и TGFa.
    Патентни претенции
    1. Среда за клетъчно култивиране, способна да увеличи хепатоцитите in vitro без серум, характеризираща се с това, че съдържа: никотинамид, трансферни свързан с желязо, инсулин или инсулин-подобни растежни Фактори, глюкокортико- стероид, микроелементи, въглехидрат избран от групата, съставена от глюкоза и галактоза, аргинин, пролин и глутамин, в количества достатъчни, за да се повиши общия брой на клетките в култура, над обшия брой живи клетки внесени в културата.
    2. Среда за клетъчно култивиране, способна да увеличи хепатоцитите in vitro без серум, характеризираща се с това, че съдържа:
    (а) основна сток среда за култивиране на клетки от бозайници и (б) никотинамид, трансферни свързан с желязо, инсулин или инсулин-подобни растежни фактори, глюкокортикостероид, микроелементи, въглехидрат избран от групата съставена от глюкоза и галактоза, аргинин, пролин и глутамин, когато някой от тях не се съдържа в основната сток среда в количества достатъчни, за да се повиши общия брой клетки в култура, над общия брой живи клетки внесени в културата.
    3. Културалната среда съгласно претенция 1 или 2, характеризираща се с това, че съдържа и един или повече допълнителни растежни фактори в средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2, където споменатият растежен фактор функционира като митоген за споменатите клетки.
    4. Средата за клетъчно култивиране съгласно претенция
    1, характеризираща се с това, че съдържа и един или повече
    Заместваща страница от следните: растежни фактори функциониращи като митоген за споменатите клетки; албумин, 0-10 g/L; натриев пируват, 02.0 g/L; гама токоферол, 0-3.5 mg/L, алфа токоферол, 0-2.5 mg/L; витамин D3, 0-1.8 mg/L; декстран, 0-5.0 g/L; линоленова киселина, 0-5.0 g/L; апо-трансферин, 0-20.0 mg/L и железен глюконат, 0-100 pg/L; ретинол, 0-2.0 mg/L; витамин В12, 0-2.0 mg/L; аскорбинова киселина, 0-10.0 mg/L; холин хлорид, 0.2-12.5 mg/L; биотин, 0.2-15.0 mg/L.
  5. 5. Културалната среда съгласно претенция 2, характеризираща се с това, че съдържа и един или повече от следните:
    растежен фактор, функциониращ като митоген за споменатите клетки; албумин,
    2.0 g/L; натриев пируват, 0.15 g/L; гама токоферол, 0.35 mg/L, алфа токоферол, 0.15 mg/L; витамин D3,
    0.20 mg/L; декстран,
    2.0 g/L;
    линоленова киселина, 1.0 g/L;
    апо-трансферин, 5.0 mg/L и железен глюконат, 25.0 pg/L;
    ретинол, 0.05 mg/L;
    витамин
    В12,
    0.15 mg/L; аскорбинова киселина, 3.0 mg/ L ,* холин хлорид,
    1.5 mg/L;
    биотин, 0.75 mg/L.
  6. 6. Културалната среда съгласно претенция
    3, характеризираща се с това, че споменатите един или повече допълнителни растежни фактори са избрани съставена от хепатоцитен растежен фактор, растежен фактор и трансформиращ растежен фактор от групата, епидермален алфа.
  7. 7. Културалната среда съгласно претенция 2, характеризираща се с това, че споменатата основна сток среда е избрана от групата, съставена от DMEM, MEM, Williams’ Media Е, ВМЕ, DMEM/F-12, Среда 199, F-12 (Ham) Nutrient Mixture, F-10 (Ham) Nutrient Mixure и Среда RPMI 1640.
    Заместваща страница
  8. 8. Културалната среда съгласно претенция 7, характеризираща се с това. че споменатата основна среда е DMEM.
  9. 9. Културалната среда съгласно претенция 8, характеризираща се с това, че споменатата DMEM съдържа 2.0 g/L Dглюкоза.
  10. 10. Културалната среда съгласно претенция 1 или 2, характеризираща се с това, че споменатите микроелементи включват цинк, манган, мед и селен.
  11. 11. Културалната среда съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че споменатите микроелементи освен това включват ZnCl2, ZnSO4 и CuSO4.
  12. 12. Средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2, характеризираща се с това, че споменатия глюкокортикостероид е избран от групата, съставена от кортизол, производни на кортизола, като преднизон, преднизолон и хидрокортизон, и дексаметазон.
  13. 13. Среда за клетъчно култивиране, способна да увеличи хепатоцитите in vitro, характеризираща се с това, че съдържа основна сток среда със следните компоненти: СаС12 (анхидрид), 200.0 mg/L; Fe(NO3)3.9H2O, 0.10 mg/L; KCL, 400 mg/L; MgSO4 (анхидрид), 97.67 mg/L; NaCL, 6,400.00 mg/L; NaHCO3, 3,700.00 mg/L; NaH2PO4.H2O, 125.00 mg/L; L4Hcthh.2HCL, 63.00 mg/L; глицин, 30.00 mg/L; Lхистидин.HCL.H20 , 42.00 mg/L; L-изолевцин, 105.00 mg/L; L левцин, 105.00 mg/L; L-лизин.НС!, 146.00 mg/L; L-метионин. 30.00 mg/L; L-фенилаланин, 66.00 mg/L; L-серин, 42.00 mg/L; L-треонин, 95.00 mg/L: L-триптофан. 16.00 mg/L; Lтирозин.2Na.2H20, 104.00 mg/L; L-валин, 94.00 mg/L: D-Ca пантотенат, 4.00 mg/L: холин хлорид, 4.00 mg/L; фолиева
    Заместваща страница киселина. 4.00 mg/L; i-инозитол. 7.20 mg/L; пиридоксин HC1. 4.00 mg/L; пиридоксал HC1, 4.00 mg/L; рибофлавин, 0.40 mg/L; тиамин.НС!, 4.00 mg/L; D-галактоза, 0.01-5.0 g/L; D-глюкоза,
    0.01-5.0 g/L; никотинамид, 1-3050 mg/L; L-пролин, 1-120 mg/L: Ь-аргинин, 1-150 mg/L; L-орнитин, 1-500 mg/L; човешки холо-трансферин (30% наситен c Fe), 0.1-100 mg/L; h-инсулин, повече от 10_11M; дексаметазон, 10~12-10-13 М; ZnCl2, 1-3000 pg/L; MnSO4, 1-250 pg/L; ZnSO4.7H2O, 1-3000 pg/L: CuSO4.5H2O,
    1-1000 pg/L; селен, 1-150 pg/L: L-глутамин, 2.0-10.0 mM;
    HEPES. 5-50 mM.
  14. 14. Културалната среда съгласно претенция 11, характе ризираща се с това, че следните компоненти се намират в определените количества: пречистен говежди албумин; Dглюкоза, 2.0 g/L; D-галактоза, 2.0 g/L; L-орнитин, 0.1 g/L;
    L-пролин, 0.030 g/L; никотинамид, 0.610 g/L; ZnCl2, 0.544 mg/L; ZnSO4.7H2O, 0.750 mg/L; CuSO4.5H2O, 0.20 mg/L; MnSO4, 0.025 mg/L; глутамин, 5.0 mM; ITS (rh-инсулин, 5.0 mg/L; човешки трансферни, 5.0 mg/L (30% наситен c дифери желязо);
    селен, 5.0 pg/L); дексаметазон, ΙΟ-7 М и HEPES буфер 20.0 mM.
  15. 15. Смес от компоненти, характеризираща се с това, че когато се добави към течността се приготвя среда за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2.
  16. 16. Метод за изготвяне на среда за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2, характеризиращ се с това, че включва добавяне на сухи компоненти към течност, за да се формира споменатата културална среда.
  17. 17. Смес, характеризираща се с това, че съдържа хепатоцити в културалната среда съгласно претенция 1 или 2.
    Заместваща страница
  18. 18. Метод за увеличаване на хепатоцитите in vitro, характеризиращ се с това, че включва внасяне на хепатоцити в средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2 и култивиране на споменатите внесени хепатоцити в споменатата среда.
  19. 19. Метод за увеличаване на хепатоцити in vitro, характеризиращ се с това, че включва внасяне на хепатоцити в средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2, като позволява да се осъществи клетъчна пролиферация чрез култивиране на хепатоцитите в споменатата среда.
  20. 20. Метод за промяна на хепатоцитния фенотип към послабо диференцирано състояние in vitro, характеризираш се с това, че включва внасяне на хепатоцити в средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2, култивиране на споменатите внесени хепатоцити в средата, за да се осъществи клетъчна пролиферация, позволява клетъчната пролиферация да се осъществи за достатъчно време, за да се получат клетки, които са по-слабо диференцирани отколкото споменатите внесени хепатоцити.
  21. 21. Метод за получаване на хепатоцити in vitro, характеризираш се с това, че включва внасяне на хепатоцити в средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2, култивиране на споменатите хепатоцити към по-слабо диференцирано състояние, като позволява да се осъществи клетъчна пролиферация за достатъчно време иводи до това, споменатите по-слабо диференцирани клетки да развият характеристиките на внесените хепатоцити, където споменатото развитие на хепатопитни характеристики е постигнато чрез метод избран от групата, която включва добавяне на
    Заместваща страница извънклетъчен матриксен материал и достигане на конфлуентност на по-слабо диференцираните клетки.
  22. 22. Методът съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че споменатият матрикс включва един или повече от фибронектин, колаген, ламинин и полилизин.
  23. 23. Методът съгласно претенция 21, характеризираш се с това, че споменатият матрикс включва ентактин, ламинин и колаген тип IV.
  24. 24. Метод за получаване на клонален растеж на клетки с хепатоцитен произход in vitro, характеризиращ се с това, че споменатият метод включва внасяне на хепатоцити в средата съгласно претенция 1 или 2, като позволява да се осъществи клетъчна пролиферация и клонален растеж чрез култивиране на хепатоцитите в средата.
  25. 25. Метод за формиране на дуктуларни или ацинарни структури от хепатоцити in vitro, характеризиращ се с това, че включва внасяне на хепатоцити в средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2, култивиране на споменатите хепатоцити към по-слабо диференцирано състояние, като позволява да се осъществи клетъчна пролиферация за достатъчно време и води до това, споменатите по-слабо диференцирани клетки да развият характеристиките на внесените хепатоцити, където се използва матрикс за развитие на споменатите характеристики и Споменатите структури се формират чрез добавяне на един или повече растежни фактори към споменатите клетки върху споменатия матрикс.
  26. 26. Метод за увеличаване на клетки in vitro, характеризираш се с това, че включва внасяне на клетки в средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2 и култивиране на споменатите внесени клетки в споменатата
    Заместваща страница
    Ί среда, където споменатите клетки са избрани от групата.
    съставена от клетки на панкреатични островчета. клетки на бъбречни каналчета, чернодробни перицити и епителни клетки на тънките черва.
  27. 27. Метод за увеличаване на клетки in vitro, характеризираш се с това, че включва внасяне на клетки в средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2, катопозволява да се осъшестви клетъчна пролиферация чрез култивиране на клетките в споменатата среда, където споменатите клетки са избрани от групата. съставена от клетки на панкреатични островчета, клетки на бъбречни каналчета, чернодробни перицити и епителни клетки на тънките черва.
  28. 28. Метод за промяна на клетъчен фенотип към по-слабо диференцирано състояние in vitro, характеризиращ се с това, че включва внасяне на клетки в средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2, култивиране на споменатите внесени клетки в средата, за да се осъществи клетъчна пролиферация, осъществяване на клетъчна пролифера- ция за достатъчно време, за да се получат клетки, които са по-слабо диференцирани от споменатите внесени клетки, където споменатите клетки са избрани от групата. съставена от клетки на панкреатични островчета, клетки на бъбречни каналчета, чернодробни перицити и епителни клетки на тънките черва.
  29. 29. Метод за получаване на клетки in vitro, характеризиращ се с това, че включва внасяне на клетки в средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2, култивиране на споменатите клетки към по-слабо диференцирано състояние, като позволява да се осъществи клетъчна
    Заместваща страница пролиферация за достатъчно време и води до това. споменатите слабо диференцирани клетки да развият характеристиките на внесените клетки, където споменатото развитие на клетъчни характеристики е постигнато чрез метод, избран от групата съставена от добавяне на извънклетъчен матриксен материал и достигане на конфлуентност на по-слабо диференцираните клетки, където споменатите клетки са избрани от групата, съставена от клетки на панкреатични островчета, клетки на бъбречни каналчета, чернодробни перицити и епителни клетки на тънките черва.
  30. 30. Метод за получаване на клонален растеж на клетки с клетъчен произход in vitro, характеризиращ се с това, че споменатият метод включва внасяне на клетки в средата съгласно претенция 1 или 2, катопозволява да се осъществи клетъчна пролиферация и клонален растеж чрез култивиране на клетките в средата, където споменатите клетки са избрани от групата, съставена от клетки на панкреатични островчета, клетки на бъбречни каналчета, чернодробни перицити и епителни клетки на тънките черва.
  31. 31. Метод за увеличаване на клетки in vitro, характеризираш се с това, че включва внасяне на клетки в средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2 и култивиране на споменатите внесени клетки в споменатата среда, където споменатите клетки са избрани от гоупата, съставена от MRC5 , СаСо и ЗТЗ клетъчни линии.
  32. 32. Метод за увеличаване на клетки in vitro, характеризиращ се с това, че включва внасяне на клетки в средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2, като позволява да се осъществи клетъчна пролиферация чрез култивиране на клетките в споменатата среда, където
    Заместваща страница споменатите клетки са избрани от групата, съставена от MRC5, СаСо и ЗТЗ клетъчни линии.
  33. 33. Метод за получаване на клонален растеж на клетки с клетъчен произход in vitro, характеризираш се с това, че споменатият метод включва внасяне на клетки в средата съгласно претенция 1 или 2, катопозволява да се осъществи клетъчна пролиферация и клонален растеж чрез култивиране на клетките в средата, където споменатите клетки са избрани от групата, съставена от MRC5, СаСо и ЗТЗ клетъчни линии.
  34. 34. Клетки, получени чрез метода съгласно претенция 18.
  35. 35. Фармацевтична смес, характеризираща се с това, че съдържа и клетките съгласно претенция 34.
  36. 36. Метод за получаване на рекомбинантни клетки, експресиращи хетероложен ген, характеризиращ се с това, че включва трансформиране на всяка от клетките съгласно претенция 34 с нуклеинова киселина, способна да експресира споменатия ген в споменатите клетки.
  37. 37. Метод за използване на клетките съгласно претенция
    36, характеризираш се с това, че включва вливане на споменатите клетки в пациент и позволява да се осъществи експресията на споменатия ген.
  38. 38. Метод за използване на клетките съгласно претенция
    34, характеризиращ се с това, че включва вливане на споменатите клетки в пациент.
  39. 39. Метод за хепатоцитна трансплантация, характеризираш се с това, че включва внасяне на хепатоцитите съгласно претенция 18 в пациент.
  40. 40. Метод за производство на генен продукт, характеризиращ се с това, че включва култивиране на клетки съгласно претенция 36 и получаване на генния продукт.
    Заместваща страница
  41. 41. Метод за тестуване на лекарствен препарат, характеризиращ се с това, че включва въвеждане на споменатия лекарствен препарат във всяка от клетките съгласно претенция 34 и анализиране на ефекта на лекарствения препарат.
  42. 42. Хепатоцити в културална среда, характеризираща се с това, че съдържа аргинин и свързан с желязо трансферни.
  43. 43. Метод за поддържане на диференцирани хепатоцити.
    характеризиращ се с това, че споменатият метод включва култивиране на споменатите хепатоцити в средата за клетъчно култивиране съгласно претенция 1 или 2.
BG102837A 1996-03-18 1998-10-12 Среда за култивиране на клетки от бозайници BG102837A (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/617,325 US6043092A (en) 1996-03-18 1996-03-18 Cell culture media for mammalian cells
PCT/US1997/003880 WO1997034999A1 (en) 1996-03-18 1997-03-12 Cell culture media for mammalian cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG102837A true BG102837A (bg) 1999-05-31

Family

ID=24473190

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG102837A BG102837A (bg) 1996-03-18 1998-10-12 Среда за култивиране на клетки от бозайници

Country Status (18)

Country Link
US (5) US6043092A (bg)
EP (1) EP0929662B1 (bg)
KR (1) KR20000064667A (bg)
CN (1) CN1217745A (bg)
AT (1) ATE343629T1 (bg)
AU (1) AU733373B2 (bg)
BG (1) BG102837A (bg)
BR (1) BR9708105A (bg)
CA (1) CA2249289A1 (bg)
CZ (1) CZ297198A3 (bg)
DE (1) DE69736861D1 (bg)
EA (1) EA199800835A1 (bg)
IL (1) IL126273A0 (bg)
NO (1) NO984314L (bg)
NZ (1) NZ331935A (bg)
PL (1) PL328922A1 (bg)
TR (1) TR199801859T2 (bg)
WO (1) WO1997034999A1 (bg)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2260097A (en) 1996-03-12 1997-10-01 Life Technologies, Inc. Hematopoietic cell culture nutrient supplement
JP2000517188A (ja) 1996-08-30 2000-12-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 無血清哺乳動物細胞培養培地およびその使用
US6692961B1 (en) 1996-10-11 2004-02-17 Invitrogen Corporation Defined systems for epithelial cell culture and use thereof
EP0953633A1 (en) * 1998-04-28 1999-11-03 Livercell L.L.C. Cell culturing method and medium for producing proliferated, normal, differentiated human liver cells
JP2003523166A (ja) 1998-09-29 2003-08-05 ガミダ セル リミテッド 幹細胞および前駆細胞の増殖と分化を制御する方法
JP3553858B2 (ja) * 1999-08-25 2004-08-11 東洋紡績株式会社 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール
DE60037819T2 (de) * 1999-08-27 2009-01-08 Invitrogen Corp., Carlsbad Metallbindende verbindungen und deren verwendung in zusammensetzungen für zellkulturmedien
US6767741B1 (en) 1999-08-27 2004-07-27 Invitrogen Corporation Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions
IL136232A0 (en) * 2000-05-18 2001-05-20 Bar Ilan University Res Author Measurements of enzymatic activity in a single, individual cell in population
EP1291415A4 (en) * 2000-06-01 2004-07-14 Hokkaido Tech Licensing Office PROCESS FOR THE PREPARATION OF SMALL COLONIES OF HEPATOCYTES WHICH CAN BE PRESERVED IN THE LYOPHILIZED STATE AND METHOD OF CONSERVATION THEREOF
US6762053B2 (en) * 2000-06-09 2004-07-13 Vitrolife, Inc. Mammalian gamete and embryo culture media and culture media supplements
US20040029153A1 (en) * 2000-11-17 2004-02-12 Junzo Takahashi Method for estimating metabolic function of xenobiotic and induction thereof
US6506576B2 (en) 2001-03-14 2003-01-14 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Serum-and steroid-free culture media for cerebellar granule neurons
WO2002103033A1 (fr) * 2001-05-16 2002-12-27 Kanagawa Academy Of Science And Technology Procede pour detecter et isoler des cellules hepatiques indifferenciees au moyen de dlk
EP1321515A1 (en) * 2001-12-21 2003-06-25 Ingenium Pharmaceuticals AG Method of culturing cells
IL152904A0 (en) * 2002-01-24 2003-06-24 Gamida Cell Ltd Utilization of retinoid and vitamin d receptor antagonists for expansion of renewable stem cell populations
EP1465982A4 (en) 2002-01-25 2006-06-07 Gamida Cell Ltd PROCESS FOR EXPANSION OF STEM AND PRESERVATIVE CELLS AND EXPANDED CELL POPULATIONS THEREWITH OBTAINED
WO2003078567A2 (en) * 2002-03-18 2003-09-25 Gamida-Cell Ltd. Methods of inducing differentiation in ex vivo expanded stem cells
TWI288779B (en) * 2002-03-28 2007-10-21 Blasticon Biotech Forschung Dedifferentiated, programmable stem cells of monocytic origin, and their production and use
WO2003084431A2 (en) * 2002-03-29 2003-10-16 Singapore Eye Research Institute Method for growth of human conjunctival tissue equivalents for research, clinical ocular surface transplantation and tissue engineering
JPWO2003085100A1 (ja) * 2002-04-04 2005-08-11 第一化学薬品株式会社 肝細胞の長期間培養法
WO2003102134A2 (en) * 2002-05-28 2003-12-11 Becton, Dickinson And Company Pancreatic acinar cells into insulin producing cells
US20050054097A1 (en) * 2002-11-17 2005-03-10 Tony Peled EX-VIVO expansion of hematopoietic system cell populations in mononuclear cell cultures
ATE488600T1 (de) * 2002-12-23 2010-12-15 Bristol Myers Squibb Co Produktqualitätsverbesserung in säugerzellkulturverfahrenzur proteinproduktion
IL154677A0 (en) * 2003-02-27 2003-09-17 Univ Bar Ilan A method and apparatus for manipulating an individual cell
US20050054103A1 (en) * 2003-03-07 2005-03-10 Tony Peled Expansion of renewable stem cell populations using modulators of PI 3-kinase
US20040229355A1 (en) * 2003-05-14 2004-11-18 Board Of Regents University Of Texas System Culture medium for long-term culture of hepatocytes
EP1896092A1 (de) * 2003-05-24 2008-03-12 JUVENA (International) AG Kosmetische oder dermatologische Zubereitung umfassend eine Nährmedienphase
US7888110B2 (en) 2003-06-26 2011-02-15 Seng Enterprises Ltd. Pico liter well holding device and method of making the same
US8597597B2 (en) 2003-06-26 2013-12-03 Seng Enterprises Ltd. Picoliter well holding device and method of making the same
US9200245B2 (en) 2003-06-26 2015-12-01 Seng Enterprises Ltd. Multiwell plate
WO2005005608A2 (en) * 2003-06-30 2005-01-20 Lifescan, Inc. Compositions and methods for differentiating adipose stromal cells into pancratic beta cells
US7982751B2 (en) * 2003-07-11 2011-07-19 The University Of North Carolina Methods and systems for controlling a computer using a video image and for combining the video image with a computer desktop
US20050064524A1 (en) * 2003-08-11 2005-03-24 Mordechai Deutsch Population of cells utilizable for substance detection and methods and devices using same
ATE466073T1 (de) 2003-12-26 2010-05-15 Makoto Asashima Basalmedium zur kultivierung von es-zellen
JP2007520546A (ja) * 2004-02-03 2007-07-26 ケマジス リミティド モンテルカストナトリウムの安定な非晶質性形態
EP1609462B1 (en) * 2004-04-22 2015-07-29 La Prairie Group AG Cosmetic or dermatological preparation comprising a nutrient medium phase
KR20060000547A (ko) * 2004-06-29 2006-01-06 라이프코드인터내셔날 주식회사 대량의 간세포 배양 및 간세포 구상체 형성용 고농도 배지
US7403647B2 (en) * 2004-09-13 2008-07-22 Seng Enterprises Ltd. Method for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component
WO2006030442A2 (en) 2004-09-16 2006-03-23 Gamida-Cell Ltd. Methods of ex vivo progenitor and stem cell expansion by co-culture with mesenchymal cells
ES2352344T3 (es) 2005-01-25 2011-02-17 Seng Enterprises Limited Dispositivo de microfluido para estudio de células.
US7409239B2 (en) * 2005-05-05 2008-08-05 The Hong Kong Polytechnic University Method for predicting the blood glucose level of a person
DE102005031532A1 (de) * 2005-07-01 2007-01-04 Cytonet Gmbh & Co. Kg Lagermedium für Zellen
US20070128685A1 (en) * 2005-07-01 2007-06-07 Rodolfo Faudoa Methods and compositions for cell culture
US20070003541A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-04 Rodolfo Faudoa Methods and compositions for therapeutics
US20070004036A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-04 Rodolfo Faudoa Methods and compositions for keratinocyte culture
WO2007044418A2 (en) * 2005-10-06 2007-04-19 Moscatello David K Cell culture media, kits and methods of use
WO2007052245A1 (en) 2005-11-03 2007-05-10 Seng Enterprises Ltd. Method and device for studying floating, living cells
US8846393B2 (en) * 2005-11-29 2014-09-30 Gamida-Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
US20070231901A1 (en) * 2005-12-02 2007-10-04 Shuichi Takayama Microfluidic cell culture media
US20090004159A1 (en) * 2006-01-24 2009-01-01 The Board Of Trustees Of The University Of Illinoi Polymerized Hemoglobin Media and Its Use in Isolation and Transplantation of Islet Cells
WO2008021577A2 (en) * 2006-01-24 2008-02-21 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Polymerized hemoglobin media and its use in isolation and transplantation of islet cells
US20060223999A1 (en) * 2006-05-10 2006-10-05 Chemagis Ltd. Process for preparing montelukast and precursors thereof
US9975118B2 (en) 2007-11-15 2018-05-22 Seng Enterprises Ltd. Device for the study of living cells
US9145540B1 (en) 2007-11-15 2015-09-29 Seng Enterprises Ltd. Device for the study of living cells
US20090190135A1 (en) * 2007-11-28 2009-07-30 University Of Massachusetts Lowell CELL CULTURE HYDROGEL WITH pH INDICATOR
EP2412800A1 (en) 2010-07-29 2012-02-01 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Liver organoid, uses thereof and culture method for obtaining them
JP5458112B2 (ja) 2009-02-03 2014-04-02 コーニンクレッカ ネザーランド アカデミー ヴァン ウェテンシャッペン 上皮幹細胞および該幹細胞を含むオルガノイドのための培養培地
ES2440289T3 (es) * 2009-06-26 2014-01-28 Novo Nordisk A/S Preparación que comprende insulina, nicotinamida y arginina
EP2467149B1 (en) * 2009-08-17 2018-04-04 Ashok K. Singh Fluid from skin and omentum for medical use
CN102344904B (zh) * 2010-08-02 2014-04-30 深圳华大基因科技有限公司 一种猪细胞培养基
US9506029B2 (en) 2010-12-30 2016-11-29 University Of Massachusetts Lowell Responsive cell culture hydrogel
CN102399742B (zh) * 2011-09-30 2014-07-30 东莞中山大学研究院 用于哺乳动物唾液腺上皮细胞和唾液腺干细胞培养的无血清培养液
CA2863795A1 (en) 2012-02-13 2013-08-22 Gamida-Cell Ltd. Culturing of mesenchymal stem cells
US9493744B2 (en) 2012-06-20 2016-11-15 Genentech, Inc. Methods for viral inactivation and other adventitious agents
US9567569B2 (en) 2012-07-23 2017-02-14 Gamida Cell Ltd. Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
WO2014082685A1 (en) * 2012-11-30 2014-06-05 Swiss Stem Cell Foundation Serum-free medium for human mesenchymal stem cells
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
PT3795171T (pt) * 2014-07-11 2024-05-08 Grifols Worldwide Operations Ltd Transferrina para utilização em transplante renal
CN106318998B (zh) * 2015-07-08 2019-08-20 浙江海正博锐生物制药有限公司 用于提高重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白唾液酸化水平的组合物
TW202340452A (zh) 2015-08-04 2023-10-16 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
CA3102627A1 (en) * 2018-06-18 2019-12-26 Oakbio, Inc. Methods for producing rich cell culture media using chemoautotrophic microbes
EP4008773A4 (en) * 2019-08-03 2023-08-09 Shenzhen Mytang Biotechnology Co., Ltd. POULTRY EGG CULTURE MEDIUM
CN115369087B (zh) * 2021-05-17 2024-02-09 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 肝癌原代细胞的培养基及培养方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4439521A (en) * 1981-10-21 1984-03-27 Ontario Cancer Institute Method for producing self-reproducing mammalian pancreatic islet-like structures
FR2543158B1 (fr) * 1983-03-24 1985-11-15 Inst Nat Sante Rech Med Milieu de culture de cellules animales sans serum, sans hormones et sans facteurs de croissance et procedes de culture primaire et d'obtention de lignees cellulaires utilisant ce milieu
US4902295A (en) * 1985-08-26 1990-02-20 Hana Biologics, Inc. Transplantable artificial tissue
NO162160C (no) * 1987-01-09 1989-11-15 Medi Cult As Serumfritt vekstmedium, samt anvendelse derav.
DE3711699A1 (de) * 1987-04-07 1988-11-10 Fraunhofer Ges Forschung Medium zur kultivierung und proliferation von epithelialen zelltypen
JPH03504330A (ja) * 1988-12-14 1991-09-26 アメリカ合衆国 ヒト肝上皮細胞系のための細胞培地
US5529920A (en) * 1988-12-14 1996-06-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Human liver epithelial cell line and culture media therefor
US5380660A (en) * 1989-02-02 1995-01-10 New England Medical Center Hospitals, Inc. Method of treating serum or serum-containing medium to inactivate an inhibitor of hepatocyte differentiation
EP0449445A3 (en) * 1990-03-27 1993-08-25 Pfizer Inc. Preparation of beta-ketoesters useful in preparing quinolone antibiotics
JPH0728732B2 (ja) * 1990-04-17 1995-04-05 日本石油株式会社 動物細胞増殖促進剤及び無血清培地
US5122469A (en) * 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
DK0605428T5 (da) * 1991-06-24 2003-01-06 Hcell Technology Inc Hormonsecernerende pancreasceller opretholdt i langtidskultur
US5116753A (en) * 1991-07-30 1992-05-26 The Salk Institute For Biological Studies Maintenance of pancreatic islets
EP0597964A4 (en) * 1991-08-07 1994-11-30 Einstein Coll Med PROLIFERATION OF HEPATOCYTE PRECURSORS.
DK0671923T3 (da) * 1992-10-09 2001-08-13 Advanced Tissue Sciences Inc Leverreserveceller
US5405772A (en) * 1993-06-18 1995-04-11 Amgen Inc. Medium for long-term proliferation and development of cells
US5587309A (en) * 1994-04-29 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of stimulating proliferation and differentiation of human fetal pancreatic cells ex vivo
US5695998A (en) * 1995-02-10 1997-12-09 Purdue Research Foundation Submucosa as a growth substrate for islet cells

Also Published As

Publication number Publication date
EP0929662A1 (en) 1999-07-21
US6670180B2 (en) 2003-12-30
WO1997034999A1 (en) 1997-09-25
EP0929662A4 (en) 2002-12-04
IL126273A0 (en) 1999-05-09
US7022520B2 (en) 2006-04-04
US6043092A (en) 2000-03-28
PL328922A1 (en) 1999-03-01
EP0929662B1 (en) 2006-10-25
KR20000064667A (ko) 2000-11-06
TR199801859T2 (xx) 1999-02-22
US6413772B1 (en) 2002-07-02
DE69736861D1 (de) 2006-12-07
US20040166579A1 (en) 2004-08-26
US20060141447A1 (en) 2006-06-29
CZ297198A3 (cs) 1999-03-17
NZ331935A (en) 2000-05-26
US20020155603A1 (en) 2002-10-24
EA199800835A1 (ru) 1999-02-25
NO984314D0 (no) 1998-09-17
BR9708105A (pt) 2000-01-04
CN1217745A (zh) 1999-05-26
CA2249289A1 (en) 1997-09-25
AU733373B2 (en) 2001-05-10
ATE343629T1 (de) 2006-11-15
NO984314L (no) 1998-11-17
AU2528797A (en) 1997-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG102837A (bg) Среда за култивиране на клетки от бозайници
US5712159A (en) Glucose responsive insulin secreting β-cell lines and method for producing same
US6692961B1 (en) Defined systems for epithelial cell culture and use thereof
Ambesi-Impiombato et al. Thyroid cells in culture
US7217570B2 (en) Organotypic intestinal culture and methods of use thereof
Brandi et al. Bovine parathyroid cells: cultures maintained for more than 140 population doublings.
Romijn Development and advantages of serum‐free, chemically defined nutrient media for culturing of nerve tissue
WO2005085422A9 (en) Adult stem cells and uses thereof
JP2009106301A (ja) ヒトｃｎｓ神経幹細胞の培養
JP2004121258A (ja) 神経芽細胞の産生方法
BR112012009848B1 (pt) Método de obtenção de células-tronco/progenitoras multipotentes de mamíferos capazes de se diferenciar em linhagens hepáticas e pancreáticas
Kost et al. Effect of 2% dimethyl sulfoxide on the mitogenic properties of epidermal growth factor and hepatocyte growth factor in primary hepatocyte culture
Hoffmann et al. Proliferation of fetal rat hepatocytes in response to growth factors and hormones in primary culture
CA2537462A1 (en) Cell culture media comprising fructose as the primary energy source
Takigawa et al. Establishment from a human chondrosarcoma of a new immortal cell line with high tumorigenicity in vivo, which is able to form proteoglycan‐rich cartilage‐like nodules and to respond to insulin in vitro
JP2016515403A (ja) ニューロン細胞培養のための培地組成物
Rizzino et al. The effects of laminin on the growth and differentiation of embryonal carcinoma cells in defined media
RU2333243C2 (ru) Дедифференцированные программируемые стволовые клетки моноцитарного происхождения и их получение и применение
WO1997016536A1 (en) Method for ex vivo proliferation and differentiation of adult pancreatic islet cells, media useful therefor and uses thereof
Toda et al. Plural cells organize thyroid follicles through aggregation and linkage in collagen gel culture of porcine follicle cells
JP2003530103A5 (bg)
JP2000512128A (ja) 哺乳類細胞用の細胞培養培地
MXPA98007554A (en) Cellular cultivation media for mamif cells
EP1059352A1 (en) Long term cell culture of human carcinoma
WO2005045012A1 (en) Endodermal stem cells in liver and methods for isolation thereof