KR20060000547A

KR20060000547A - 대량의 간세포 배양 및 간세포 구상체 형성용 고농도 배지

Info

Publication number: KR20060000547A
Application number: KR1020040049458A
Authority: KR
Inventors: 박정극; 이두훈; 이지현; 윤희훈; 김영진; 최정은
Original assignee: 라이프코드인터내셔날 주식회사; 박정극
Priority date: 2004-06-29
Filing date: 2004-06-29
Publication date: 2006-01-06

Abstract

본 발명은 대량의 간세포 배양 및 간세포 구상체 형성을 위한 고농도 배지에 관한 것으로, 간세포 배양배지에 있어서, 아미노산 및 비타민이 기존의 배지에 비해 5 내지 10 배 함유된 것을 특징으로 하는 본 발명의 간세포 배양 및 간세포 구상체 형성용 고농도 배지는 기존의 배지에 비해 높은 간세포 생존도 및 간세포 구상체 형성율을 나타내므로, 대량의 간세포 또는 간세포 구상체를 필요로 하는 간 보조 장치 등의 제조를 위한 세포 배양에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

대량의 간세포 배양 및 간세포 구상체 형성용 고농도 배지{HIGHLY ENRICHED MEDIUM FOR LARGE SCALE CULTIVATION OF HEPATOCYTES AND FORMATION OF HEPATOCYTE SPHEROID}

도 1a는 본 발명의 고농도 배지를 이용하여 돼지 간세포를 배양하기 위한 스피너 플라스크이고, 도 1b는 고농도 배지에서 배양된 간세포 구상체의 형성도를 트립판 블루로 관찰한 현미경 사진이고, 도 1c는 고농도 배지에서 배양된 간세포 구상체를 칼슘-알지네이트 캡슐로 고정화시킨 현미경 사진이고,

도 2a는 본 발명의 고농도 배지 EM-5 및 EM-10, 및 RPMI 1640 배지를 이용한 간세포 배양에서 간세포 생존도, 간세포 구상체의 형성율, 및 간세포 손상정도를 나타낸 그래프이고, 도 2b는 본 발명의 EM-5 및 EM-10 배지, 및 기존의 세포 배양 배지를 이용한 간세포 배양에서 간세포 생존도를 나타내고, 도 2c는 본 발명의 고농도 배지 EM-10, 및 RPMI 1640 배지를 이용하여 배양한 간세포의 LDH, GPT 및 GOT 활성도를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 고농도 배지에서 배양된 간세포 구상체의 생체 외(in vitro) 암모니아 제거능을 관찰하기 위한 실험 시스템의 개략도이고,

도 4는 본 발명의 고농도 배지에서 배양된 간세포 구상체의 생체 외(in vitro) 암모니아 제거능을 나타낸 그래프이고,

도 5는 전격성 간부전 모델인 무간기 돼지의 간 사진이고,

도 6은 본 발명의 고농도 배지에서 배양된 간세포 구상체의 생체 내(in vivo) 암모니아 제거능을 관찰하기 위한 실험 시스템의 개략도이고,

도 7은 본 발명의 고농도 배지에서 배양된 간세포 구상체의 생체 내(in vivo) 암모니아 제거능을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 대량의 간세포 배양 및 간세포 구상체 형성용 고농도 배지에 관한 것으로, 구체적으로는 기존의 배양 배지에 비하여 5 내지 10 배 농도의 아미노산 및 비타민을 함유하는, 대량의 간세포 배양 및 간세포 구상체 형성을 위한 고농도 배지에 관한 것이다.

인간의 생체조직 및 기관 중 간은 혈장 단백질 합성대사, 당대사, 지질대사, 해독작용과 담즙산염이나 담즙색소를 합성하여 분비하는 등 생존에 필요한 5백 가지가 넘는 여러 가지의 복합적인 기능을 가지고 있는 다목적 장기이다. 따라서, 심장이나 신장과는 달리 펌프나 투석막이 있는 단순 대용품으로 그 기능을 대체할 수 없다 (Mito M, Artificial Organs, 10: 214-218(1986)).

미국 내에서만 간의 대사이상, 경화, 암 환자가 한해 20만 5천명이 발생하였 으며 (Leigh JP, et al., Arch Intern Med, 161: 2231-2237(2001)), 이러한 질환으로 인하여 사용되는 의료 경비는 약 90억 달러에 달한다고 한다. 최근 장기 이식 기술의 발전으로 간이식 치료를 받은 환자가 높은 생존율을 기록하고 있지만 UNOS (United Network for Organ Sharing) 과학 등록(Scientific Registry) 자료에 의하면 극심한 장기 부족 현상으로 인하여 미국의 경우 약 10％의 환자만이 기증된 간을 이식 받고 있는 실정으로 해마다 간이식 대기자의 수는 급격히 증가하여 대기 중 사망하는 환자의 수도 급속히 증가하고 있다.

국내의 사정은 더욱 열악하여 98년 서울중앙병원의 경우 148명의 간이식 대기 환자 중 16명만이 간이식 수혜를 받고 있는 실정이다 (하해선, 간이식의 제반문제 - 대기기간, 비용, 이식 후 삶의 질 (1999)). 또한, 최근의 의학 발달에도 불구하고 전격성 간손상 (fulminant hepatic failure, FHF) 환자의 경우 치사율이 90％에 이르고 있으나 적당한 치료방법이 없는 실정이다. 따라서, 이러한 환자들에게 효과적이면서도 간편하게 적용하여 간 기능이 회복되거나 간이 재생되는 기간동안 혹은 간이식 대기 기간 동안 환자의 생명을 유지하면서 신경학적 손상을 포함한 간부전증의 후유증을 최소화하기 위한 간 기능 보조 장치 (인공간, artificial liver)의 개발이 절실히 기대되고 있다.

그러나, 독성물질을 제거하거나 희석하는 데에만 초점을 맞춘 혈액여과 (hemofiltration), 혈액투석 (hemodialysis), 혈액관류 (hemoperfusion), 혈장교환 (plasma exchange) 등의 치료로는 환자의 궁극적인 생존율을 높이는데 실패하였다. 따라서, 간세포가 수행하는 여러 생물학적 기능까지 부여하기 위하여 동물의 간세 포를 이용하게 되었으며 이를 이용한 인공간을 기존의 인공간과 구분하여 생인공간 (bioartificial liver)으로 명명하게 되었다 (Kamlot A, et al., Biotechnol Bioeng, 50: 382-391(1996)).

생인공간은 간세포 자체를 적용함으로써 독성 물질 제거 뿐만 아니라 정상적인 간에서 보여주는 인체에 필수적인 여러 대사물질들의 공급 및 변환을 가능케 하며, 이를 통해 간부전의 증상을 호전시키고 생존 기간을 연장시킨다.

생인공간은 일반적으로 간부전 환자의 혈장을 분리한 후 간세포가 고농도로 충진된 반응기로 처리하여 환자에게 되돌려 주는 시스템으로 구성된다. 따라서, 우수한 성능의 생인공간을 개발하기 위해서는 간기능 활성을 유지시킬 수 있는 간세포 배양법과 이를 고농도로 충진할 수 있는 생물반응기의 개발이 핵심 요소가 된다.

간에서 분리된 일차 간세포는 3차원 구조를 가지는 구형의 꽉 짜여진 집합체 (구상체, spheroid)를 재구성할 수 있다는 것이 알려졌으며 (Landry J, et al., J Cell Biol, 101: 914-923(1985)), 구상체로 존재하는 간세포 사이에는 긴밀한 접합 (tight junction)이 관찰되고 광범위한 세포 접촉과 담즙 세관과 비슷한 구조가 나타나는 등의 체내 간소엽 조직과 유사한 구조를 보이는 등 형태학적인 면, 생존력, 간 특이 기능의 활성 측면에서 간세포를 단층으로 배양하는 것 보다 우수하다는 것이 알려졌다 (Koide N, et al., Exp Cell Res, 186: 227-235(1990) 및 이재호, 박정극, 최태부, 세포형태에 따른 쥐 간세포의 분화기능, 한국생물공학회지, 7: 278-283(1992)).

간세포를 효과적으로 배양하는 기술로는 현재 세포-세포간 상호작용을 최대화하여 배양하는 구상체 배양, 각종 세포외 기질 성분을 이용한 방법, 간의 비실질 세포와 혼합 배양하는 방법 등이 개발되었으나 스케일 업의 문제나 반응기 설계의 문제로 인하여 아직 상용화 단계에 이른 것은 없다. 그러므로, 스케일 업을 통한 대용량 간세포 반응기로의 적용이 가능한 간세포 배양 기술을 개발하는 것은 생인공간 기술 발전의 첩경이라 판단된다.

본 발명의 목적은 대량의 간세포 배양 및 간세포 구상체 형성용 고농도 배지를 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 간세포 배양배지에 있어서, 아미노산 및 비타민이 기존의 배지에 비해 5 내지 10 배 함유된 것을 특징으로 하는 간세포 배양 및 간세포 구상체 형성용 고농도 배지를 제공한다.

본 발명의 고농도 배지는 기존에 세포배양용 배지로 사용되고 있는 DMEM, RPMI 1640, 윌리엄 배지 E (Williams' medium E), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Modification), DMEM/Ham's F-12 혼합 배지 등 일반 배지에 비해 고농도의 아미노산과 비타민을 함유하고 있기 때문에 대량의 간세포 배양시 발생되는 영양분 부족, 산소 결핍 및 세포배양기 내에서의 전단응력 등 물리적 손상에 의한 낮은 생존도 및 낮은 간 특이 기능들을 향상시킨다는 데에 그 특징이 있다.

본 발명의 고농도 배지는 아미노산으로서 필수 아미노산 중 L-아르기닌, L-아스파라진, L-아스파르트산, L-시스틴, L-이소루이신, L-루이신, L-리신은 200 내지 2000 ㎎/ℓ, 필수 아미노산 중 방향족 아미노산인 L-페닐알라닌, L-트립토판, L-티로신은 25 내지 200 ㎎/ℓ, 필수 아미노산 중 나머지는 75 내지 300 ㎎/ℓ을 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 비타민으로서 수용성 비타민 B군인 바이오틴, D-Ca 판토테네이트, 리보플라빈은 1 내지 2.5 ㎎/ℓ을, 콜린 클로라이드, 엽산, 니아신아마이드, 파라-아미노벤조산, 피리독신 HCl, 티아민 HCl은 5 내지 30 ㎎/ℓ을, i-이노시톨은 175 내지 350 ㎎/ℓ을, 비타민 B₁₂는 0.025 내지 0.05 ㎎/ℓ을 함유하는 것이 바람직하다. 아울러, 본 발명의 배지는 글루타치온을 5 내지 10 ㎎/ℓ, 글루타민을 750 내지 1500 ㎎/ℓ, 포도당을 2000 내지 4000 ㎎/ℓ농도로 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, pH 완충효과를 지니는 중탄산나트륨 (NaHCO₃) 3200 내지 4000 ㎎/ℓ 및 헤피스 (HEPES, N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid]) 2383 내지 4766 ㎎/ℓ, 세포-세포간 부착에 중요한 미네랄 성분인 Ca 및 Mg를 각각 76.5 내지 153 ㎎/ℓ 및 49 내지 98 ㎎/ℓ의 농도로 함유하고, 삼투압을 280 내지 320 mOsm/kg으로 맞추기 위하여 염화나트륨을 2000 mg/ℓ 내지 300 mg/ℓ의 농도로 포함시키는 것이 특히 더욱 바람직하다.

특히 본 발명에서는 CaCl₂ 153 ㎎/ℓ, Ca(NO₃)·4H₂O 100 ㎎/ℓ, KCl 400 ㎎/ℓ, MgSO₄98 ㎎/ℓ, NaCl 2000 ㎎/ℓ, NaHCO₃4000 ㎎/ℓ, Na₂HPO₄800 ㎎/ℓ, D- 글루코스 2000 ㎎/ℓ, 글루타치온 5 ㎎/ℓ, HEPES 2383 ㎎/ℓ, 페놀 레드 5 ㎎/ℓ, L-아르기닌 1000 ㎎/ℓ, L-아스파라진 250 ㎎/ℓ, L-아스파라긴산 250 ㎎/ℓ, L-시스틴·2HCl 250 ㎎/ℓ, L-글루탐산 100 ㎎/ℓ, L-글루타민 1500 ㎎/ℓ, L-글리신 50 ㎎/ℓ, L-히스티딘 75 ㎎/ℓ, L-하이드록시프롤린 100 ㎎/ℓ, L-이소루이신 250 ㎎/ℓ, L-루이신 250 ㎎/ℓ, L-리신·HCl 200 ㎎/ℓ, L-메티오닌 75 ㎎/ℓ, L-페닐알라닌 75 ㎎/ℓ, L-프롤린 100 ㎎/ℓ, L-세린 150 ㎎/ℓ, L-트레오닌 100 ㎎/ℓ, L-트립토판 25 ㎎/ℓ, L-티로신·2Na·2H₂O 100 ㎎/ℓ, L-발린 100 ㎎/ℓ, 바이오틴 1 ㎎/ℓ, D-Ca 판토테네이트 1.25 ㎎/ℓ, 콜린 클로라이드 15 ㎎/ℓ, 엽산 5 ㎎/ℓ, i-이노시톨 175 ㎎/ℓ, 니아신아마이드 5 ㎎/ℓ, 파라-아미노벤조산 5 ㎎/ℓ, 피리독신 HCl 5 ㎎/ℓ, 리보플라빈 1 ㎎/ℓ, 티아민 HCl 5 ㎎/ℓ 및 비타민 B₁₂ 0.025 ㎎/ℓ로 이루어진 배지; 또는 CaCl₂ 153 ㎎/ℓ, Ca(NO₃)·4H₂O 100 ㎎/ℓ, KCl 400 ㎎/ℓ, MgSO₄98 ㎎/ℓ, NaCl 300 ㎎/ℓ, NaHCO₃4000 ㎎/ℓ, Na₂HPO ₄800 ㎎/ℓ, D-글루코스 2000 ㎎/ℓ, 글루타치온 10 ㎎/ℓ, HEPES 2383 ㎎/ℓ, 페놀 레드 5 ㎎/ℓ, L-아르기닌 2000 ㎎/ℓ, L-아스파라진 500 ㎎/ℓ, L-아스파라긴산 500 ㎎/ℓ, L-시스틴·2HCl 500 ㎎/ℓ, L-글루탐산 200 ㎎/ℓ, L-글루타민 1500 ㎎/ℓ, L-글리신 100 ㎎/ℓ, L-히스티딘 150 ㎎/ℓ, L-하이드록시프롤린 200 ㎎/ℓ, L-이소루이신 500 ㎎/ℓ, L-루이신 500 ㎎/ℓ, L-리신·HCl 400 ㎎/ℓ, L-메티오닌 150 ㎎/ℓ, L-페닐알라닌 150 ㎎/ℓ, L-프롤린 200 ㎎/ℓ, L-세린 300 ㎎/ℓ, L-트레오닌 200 ㎎/ℓ, L-트립토판 50 ㎎/ℓ, L-티로신·2Na·2H₂O 200 ㎎/ℓ, L-발린 200 ㎎/ℓ, 바이오틴 2 ㎎/ℓ, D-Ca 판토테네이트 2.5 ㎎/ℓ, 콜린 클로라이드 30 ㎎/ℓ, 엽산 10 ㎎/ℓ, i-이노시톨 350 ㎎/ℓ, 니아신아마이드 10 ㎎/ℓ, 파라-아미노벤조산 10 ㎎/ℓ, 피리독신 HCl 10 ㎎/ℓ, 리보플라빈 2 ㎎/ℓ, 티아민 HCl 10 ㎎/ℓ 및 비타민 B₁₂ 0.05 ㎎/ℓ로 이루어진 배지가 바람직하다.

본 발명에 따라 제조된 고농도 배지는 1 ℓ의 배양 부피에 0.5∼1.5×10⁶세포/ml 농도의 돼지 간세포를 24시간 이상 부유 배양시켰을 경우 80 ％ 이상의 생존도를 지니는 간세포 구상체를 형성시킬 수 있고(도 2a 및 2b), 간세포 손상을 최소화할 수 있으며(도 2c), 추가적인 산소 공급이나 배지 교환이 없는 저산소 상태에서도 간단하게 대량의 간세포를 배양할 수 있으므로, 대량의 간세포 또는 간세포 구상체를 필요로 하는 시스템의 세포 배양에 유용하게 사용될 수 있다.

이러한 적용범위의 일례로 본 발명의 고농도 배지에서 배양된 돼지 간세포 구상체를 암모니아가 단계적 또는 연속적으로 첨가되는 생체 외(in vitro) 실험 및 전격성 간부전 돼지 모델을 이용한 생체 내(in vivo) 실험에 적용했을 경우 암모니아 제거능이 매우 우수함을 확인할 수 있다(도 4 및 도 7).

이하 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 대량의 돼지 간세포 배양 및 간세포 구상체 제조

(단계 1)

대동물 실험에 대비하여 살아있는 돼지에서 전체 간을 관류하여 대량의 간세포를 얻는 실험을 쉘라프(Sielaff) 등이 보고한 방법(Sielaff TD, et al., Transplantation, 27: 1459-1463(1995))에 따라 실시하였다. 무게 5 kg인 돼지를 수술 전날 저녁부터 금식(물은 제외)시키고 아트로핀(atropine) 0.25 mg과 케타민(ketamine) 75 mg을 혼합하여 근육주사하여 돼지를 진정한 후, 펜토탈(pentotal) 50 mg과 베크로늄(vecronium) 1 mg을 정맥주사하여 마취를 유도한 다음, 산소를 공급하고 기도삽관하여 마취를 유지하였다. 개복 후, 총문맥 튜브를 연결하여 1단계 관류용액(NaCl 8 g/ℓ, KCl 0.4 g/ℓ, NaH₂PO₄·2H₂O 0.078 g/ℓ, Na₂HPO₄·12H2O 0.151 g/ℓ, HEPES (4-(2-HydroxyEthyl)-1-PiperazineEthane-Sulfonic acid) 2.38 g/ℓ, EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) 0.19 g/ℓ, 탄산수소나트륨 0.35 g/ℓ, 글루코스 0.9 g/ℓ, 페니실린 100 Unit /㎖, 스트렙토마이신 10 mg/㎖, 암포테리신 B(Amphotericin B) 25 ㎍/㎖)으로 관류한 후, 간을 적출하여 2단계 콜라게네이즈 용액(콜라게네이즈 0.5 g/ℓ, 트립신 억제제 0.05 g/ℓ, NaCl 8 g/ℓ, KCl 0.4 g/ℓ, CaCl₂ 0.56 g/ℓ, NaH₂PO₄·2H₂O 0.078 g/ℓ, Na₂HPO₄·12H₂O 0.151 g/ℓ, HEPES 2.381 g/ℓ, 탄산수소나트륨 0.35 g/ℓ, 페니실린 100 Unit/㎖, 스트렙토마이신 10 mg/㎖, 암포테리신 B 25 ㎍/㎖)의 관류부터는 무균 작업대에서 순환시켜 오염 가능성을 줄였다. 인공심폐기(CapioxSX-10, Terumo, Japan)를 사용하여 충분한 산소가 간으로 공급되도록 하였으며 관류되는 용액의 온도도 37℃로 정확히 유지되도록 하였으며, 관류 속도도 분당 400 mL 이상으로 유지되도록 하였다. 총 1.3×10¹⁰개의 살아 있는 간세포를 얻었으며 이를 트립판 블루 염색 배제(trypan blue dye exclusion) 방법으로 측정한 결과 간세포의 생존도는 97 ％로 나타났다.

(단계 2)

하기 표 1에 나타낸 바와 같와 같이, 기존의 배지에 비해 아미노산 및 비타민이 5 내지 10배 함유된 EM-5 및 EM-10 배지 조성 각 1 ℓ에 간세포 배양을 위한 인슐린 5 mg/ℓ, 알부민 0.1％, 상피세포 성장인자 10 ㎍/ℓ를 추가로 첨가한 다음 스피너 플라스크(spinor flask)(도 1a)에 분주하고 상기 단계 1에서 분리된 간세포를 0.5×10⁶ 세포/㎖ 농도로 접종하여 24 시간 동안 부유 배양하였다. 비교군으로는 RPMI 1640 배지를 이용하였다.

	RPMI 1640	EM-5	EM-10
CaCl₂		153	153
Ca(NO₃)·4H₂O	100	100	100
KCl	400	400	400
MgSO₄	48.84	98	98
NaCl	5300	2000	300
NaHCO₃	2000	4000	4000
Na₂HPO₄	800	800	800
D-글루코스	2000	2000	2000
글루타치온	1	5	10
HEPES	5958	2383	2383
페놀 레드	5	5	5
L-아르기닌	200	1000	2000
L-아스파라진	50	250	500
L-아스파르트산	50	250	500
L-시스틴·2HCl	50	250	500
L-글루탐산	20	100	200
L-글루타민	300	1500	1500
L-글리신	10	50	100
L-히스티딘	15	75	150
L-하이드록시프롤린	20	100	200
L-이소루이신	50	250	500
L-루이신	50	250	500
L-리신·HCl	40	200	400
L-메티오닌	15	75	150
L-페닐알라닌	15	75	150
L-프롤린	20	100	200
L-세린	30	150	300
L-트레오닌	20	100	200
L-트립토판	5	25	50
L-티로신·2Na·2H₂O	20	100	200
L-발린	20	100	200
바이오틴	0.2	1	2
D-Ca 판토테네이트	0.25	1.25	2.5
콜린 클로라이드	3	15	30
엽산	1	5	10
i-이노시톨	35	175	350
니아신아마이드	1	5	10
파라-아미노벤조산	1	5	10
피리독신 HCl	1	5	10
리보플라빈	0.2	1	2
티아민 HCl	1	5	10
비타민 B₁₂	0.005	0.025	0.05

도 1b 및 도 1c는 각각 본 발명의 고농도 배지에서 배양된 간세포 구상체의 형성도를 0.4％ 트립판 블루 용액으로 염색하여 관찰한 현미경 사진 및 이를 칼슘-알지네이트 캡슐로 고정화시킨 현미경 사진으로, 본 발명의 고농도 배지를 이용하는 간세포 배양에서는 간세포의 구상체 형성율 및 생존율이 매우 높음을 알 수 있다.

실시예 2 : 간세포 구상체 형성 정도 및 간세포 손상 정도 측정

간세포를 부유 배양시켰을 경우 구상체 형성능을 알아보기 위하여, RMPI 1640 배지, DMEM 배지, DMEM/F-12(1:1) 배지, IMDM 배지, 윌리엄 배지 E, 및 본 발명의 EM-5 및 EM-10 배지 1000 ㎖을 각각 함유하는 스피너 플라스크에 상기 실시예 1의 단계 1에서 분리된 돼지 간세포를 5×10⁵ 세포/㎖의 농도로 접종하여 부유 배양시켰다.

24시간 후 구상체 형성율, 트립판 블루 염색 배제율, MTT 전환율을 검사하여 그 결과를 도 2a에 나타내었다. 도 2a에서 보는 바와 같이, 본 발명의 고농도 배지를 사용할 경우 기존의 RPMI 1640 배지에서 배양된 간세포에 비하여 간세포 구상체 형성율 및 생존도가 매우 높음을 알 수 있다.

또한, 도 2b는 트립판 블루 염색 배제율의 측정 결과를 나타난 것으로, 본 발명의 고농도 배지를 사용할 경우, 기존의 RPMI 1640, DMEM, DMEM/F-12, IMDM 및 윌리엄 배지 E의 경우보다 높은 트립판 블루 염색 배제율을 나타내어 간세포 구상체 형성율 및 생존도가 매우 높음을 알 수 있었다.

또한, RPMI 1640 배지 및 본 발명의 EM-10 배지에서 상기와 같은 방법으로 배양한 후 간세포의 손상 정도를 나타내는 LDH (lactate dehydrogenase), GPT (glutamic-pyruvic transaminase), GOT (glutamic-oxaloacetic transaminase)의 활성도를 측정한 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 고농도 배지를 사용할 경우, 기존의 RPMI 1640 배지의 것보다 더 낮은 LDH 및 GOT 활성도를 나타내어 간세포 손상이 매우 적음을 알 수 있었다.

실시예 3 : 간세포 구상체의 암모니아 제거능에 대한 생체 외( in vitro ) 실험

생체 외에서 간세포 구상체의 암모니아 제거능을 관찰하기 위하여 도 3에 도시된 통상적인 생인공간 (bioartificial liver; BAL) 시스템을 이용하여 암모니아를 주기적(보통 4시간 간격)으로 주입하면서 암모니아 제거능을 관찰하였다. 이 시스템은 실제 생체 내 실험을 할 경우와 동일한 구성으로 이루어져 있다. 저장고(reservoir)에 암모니아를 1000 ㎍/㎗ 추가하면서 1 시간 간격으로 저장고에서 유출된 직후 (A) 및 실시예 1에서 제조된 간세포 구상체가 충진된 생인공간 모듈(BAL module)을 통과한 후 (B) 채취하여 암모니아가 제거되는 정도를 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, 초기에 1000 ㎍/㎗이던 암모니아가 1시간 후 763 ㎍/㎗이 제거되었으며, 3시간 후 다시 1000 ㎍/㎗을 첨가한 다음 이로부터 1시간 후에 737 ㎍/㎗이 제거되었으며, 다시 2시간 후 1000 ㎍/㎗을 첨가한 다음 이로부터 1시간 후에 899 ㎍/㎗가 제거되는 등의 결과로 보아 첨가된 암모니아가 효과적으로 제거됨을 알 수 있다.

실시예 4 : 간부전 돼지 모델을 이용한 생체 내( in vivo ) 실험

(단계 1) 무간기 돼지 모델의 제조

생체 내에서 간세포 구상체의 암모니아 제거능을 관찰하기 위하여, 문맥대정맥우회술(end-to-side portocaval shunt)로 전격성 간부전 무간기(Anhepatic phase) 돼지를 준비하였다. 즉, 50 kg 내외의 돼지를 전신마취시킨 후 기관내 삽관하고, 혈관을 확보하여 IIVC(infrahepatic inferior vena cava)와 문맥(portal vein)을 연결하여 혈류를 경정맥으로 우회 순환시켰다. 도 5는 전격성 간부전 모델인 무간기 돼지 모델의 사진이다.

상기 준비된 무간기 돼지의 활력 징후 변화 및 간기능 변화를 시간별로 측정한 결과, 혈압은 급격히 감소하였으며, 혈중 암모니아, 크레아틴, GOT (glutamine oxaloacetic transaminase), ALP (alkaline phosphatase) 등의 수치가 급격히 증가하고 뇌간압 (intra-cranial pressure)은 점차 증가됨을 확인하였는 바, 이로부터 간부전이 충분히 유발되어 간기능이 급격히 저하된 상태임을 알 수 있다.

(단계 2) 간세포 구상체의 생체 내 (in vivo) 암모니아 제거능 관찰

실시예 1에서 제조된 간세포 구상체가 충진된 생인공간 모듈이 장착된 도 6에 도시된 통상적인 생인공간 시스템을 이용하여 간세포 구상체의 생체 내 암모니아 제거능을 관찰하였다.

상기 단계 1에서 준비된 무간기 돼지의 경정맥으로 삽입된 삽입관을 통해 혈 액을 체외 순환계와 연결하여 순환시켰다. 혈액은 최대 100 ml/분의 속도로 혈장 분리기 (COBE Spectra, COBE Laboratories, Inc.)로 공급하였으며, 혈장 분리기로부터 분리된 혈장은 혈구와 분리시켜 저장하였다. 실시예 1에서 얻은, 칼슘-알지네이트 캡슐에 고정화된 간세포 구상체는 하트만액(포도당 50 g/ℓ, 염화나트륨 6 g/ℓ, 염화칼륨 0.3 g/ℓ, 염화칼슘 0.2 g/ℓ 및 젖산나트륨 6.2 g/ℓ)로 세척한 후 인공간 모듈 (직경 10 cm, 높이 15 cm, working volume 1.2 ℓ)에 충진하였다. 인공간 모듈로 유입되는 혈장은 소아용 산화기 및 열 교환기를 통과하면서 95 ％ O₂, 5 ％ CO₂로 포화시키고, 온도는 37 ℃로 예열하였다. 혈장 저장 백으로부터 관류되는 혈장의 관류 속도는 300 ml/분으로 조정하였다. 상기 실시예 1에서 배양된 간세포 구상체가 충진된 인공간 모듈에서 반응한 혈장은 다시 혈장 분리기에 공급되어 혈구와 혼합 후 돼지의 경정맥으로 주입하였다.

상기 생체 내 시스템의 수행 결과, 도 7에서 나타낸 바와 같이, 무간기 돼지의 혈장 내에 함유된 암모니아는 간세포 구상체가 포함된 생인공간 반응기를 통과한 후 효과적으로 제거되었음을 확인하였다.

이상과 같이, 본 발명에 따른 고농도 배지는 기존의 일반 배지에 비하여 높은 간세포 생존도 및 간세포 구상체 형성율을 나타내므로 대량의 간세포 또는 구상체를 필요로 하는 체외순환형 간 보조 장치 등의 제조를 위한 세포 배양에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

간세포 배양배지에 있어서, 아미노산 및 비타민이 기존의 배지에 비해 5 내지 10 배 함유된 것을 특징으로 하는 간세포 배양 및 간세포 구상체 형성용 배지.
제 1 항에 있어서,

기존의 배지가 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지, RPMI 1640 배지, 윌리엄 배지 E(Williams' medium E), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Modification) 배지 또는 DMEM/Ham's F-12 혼합 배지인 것을 특징으로 하는 배지.
제 1 항에 있어서,

아미노산으로서 L-아르기닌, L-아스파라진, L-아스파르트산, L-시스틴, L-이소루이신, L-루이신 및 L-리신이 200 내지 2000 ㎎/ℓ로, L-페닐알라닌, L-트립토판 및 L-티로신이 25 내지 200 ㎎/ℓ로, 그리고 L-메티오닌, L-트레오닌 및 L-발린이 75 내지 200 ㎎/ℓ로 포함되는 것을 특징으로 하는 배지.
제 1 항에 있어서,

비타민으로서 바이오틴, D-Ca 판토테네이트, 리보플라빈이 1 내지 2.5 ㎎/ℓ로, 콜린 클로라이드, 엽산, 니아신아마이드, 파라-아미노벤조산, 피리독신 HCl, 티아민 HCl이 5 내지 30 ㎎/ℓ로, 그리고 i-이노시톨이 175 내지 350 ㎎/ℓ로 포함되는 것 을 특징으로 하는 배지.
제 1 항에 있어서,

글루타치온 5 내지 10 ㎎/ℓ, 글루타민 750 내지 1500 ㎎/ℓ, 포도당 2000 내지 4000 ㎎/ℓ, 중탄산나트륨 (NaHCO₃) 3200 내지 4000 ㎎/ℓ 및 헤피스 (HEPES, N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid]) 2383 내지 4766 ㎎/ℓ, Ca 76.5 내지 153 ㎎/ℓ, Mg 49 내지 98 ㎎/ℓ 및 염화나트륨 2000 mg/ℓ 내지 300 mg/ℓ 이 포함되는 것을 특징으로 하는 배지.
제 1 항에 있어서,

인슐린 5 mg/ℓ, 알부민 0.1％ 및 상피세포 성장인자 10 ㎍/ℓ가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 배지.
제 1 항에 있어서,

CaCl₂ 153 ㎎/ℓ, Ca(NO₃)·4H₂O 100 ㎎/ℓ, KCl 400 ㎎/ℓ, MgSO₄98 ㎎/ℓ, NaCl 2000 ㎎/ℓ, NaHCO₃4000 ㎎/ℓ, Na₂HPO₄800 ㎎/ℓ, D-글루코스 2000 ㎎/ℓ, 글루타치온 5 ㎎/ℓ, HEPES 2383 ㎎/ℓ, 페놀 레드 5 ㎎/ℓ, L-아르기닌 1000 ㎎/ℓ, L-아스파라진 250 ㎎/ℓ, L-아스파라긴산 250 ㎎/ℓ, L-시스틴·2HCl 250 ㎎/ℓ, L-글루탐산 100 ㎎/ℓ, L-글루타민 1500 ㎎/ℓ, L-글리신 50 ㎎/ℓ, L-히스티딘 75 ㎎/ℓ, L-하이드록시프롤린 100 ㎎/ℓ, L-이소루이신 250 ㎎/ℓ, L-루이신 250 ㎎/ℓ, L-리신·HCl 200 ㎎/ℓ, L-메티오닌 75 ㎎/ℓ, L-페닐알라닌 75 ㎎/ℓ, L-프롤린 100 ㎎/ℓ, L-세린 150 ㎎/ℓ, L-트레오닌 100 ㎎/ℓ, L-트립토판 25 ㎎/ℓ, L-티로신·2Na·2H₂O 100 ㎎/ℓ, L-발린 100 ㎎/ℓ, 바이오틴 1 ㎎/ℓ, D-Ca 판토테네이트 1.25 ㎎/ℓ, 콜린 클로라이드 15 ㎎/ℓ, 엽산 5 ㎎/ℓ, i-이노시톨 175 ㎎/ℓ, 니아신아마이드 5 ㎎/ℓ, 파라-아미노벤조산 5 ㎎/ℓ, 피리독신 HCl 5 ㎎/ℓ, 리보플라빈 1 ㎎/ℓ, 티아민 HCl 5 ㎎/ℓ 및 비타민 B₁₂ 0.025 ㎎/ℓ로 이루어진 배지.
제 1 항에 있어서,

CaCl₂ 153 ㎎/ℓ, Ca(NO₃)·4H₂O 100 ㎎/ℓ, KCl 400 ㎎/ℓ, MgSO₄98 ㎎/ℓ, NaCl 300 ㎎/ℓ, NaHCO₃4000 ㎎/ℓ, Na₂HPO₄800 ㎎/ℓ, D-글루코스 2000 ㎎/ℓ, 글루타치온 10 ㎎/ℓ, HEPES 2383 ㎎/ℓ, 페놀 레드 5 ㎎/ℓ, L-아르기닌 2000 ㎎/ℓ, L-아스파라진 500 ㎎/ℓ, L-아스파라긴산 500 ㎎/ℓ, L-시스틴·2HCl 500 ㎎/ℓ, L-글루탐산 200 ㎎/ℓ, L-글루타민 1500 ㎎/ℓ, L-글리신 100 ㎎/ℓ, L-히스티딘 150 ㎎/ℓ, L-하이드록시프롤린 200 ㎎/ℓ, L-이소루이신 500 ㎎/ℓ, L-루이신 500 ㎎/ℓ, L-리신·HCl 400 ㎎/ℓ, L-메티오닌 150 ㎎/ℓ, L-페닐알라닌 150 ㎎/ℓ, L-프롤린 200 ㎎/ℓ, L-세린 300 ㎎/ℓ, L-트레오닌 200 ㎎/ℓ, L-트립토판 50 ㎎/ℓ, L-티로신·2Na·2H₂O 200 ㎎/ℓ, L-발린 200 ㎎/ℓ, 바이오틴 2 ㎎/ℓ, D-Ca 판토테 네이트 2.5 ㎎/ℓ, 콜린 클로라이드 30 ㎎/ℓ, 엽산 10 ㎎/ℓ, i-이노시톨 350 ㎎/ℓ, 니아신아마이드 10 ㎎/ℓ, 파라-아미노벤조산 10 ㎎/ℓ, 피리독신 HCl 10 ㎎/ℓ, 리보플라빈 2 ㎎/ℓ, 티아민 HCl 10 ㎎/ℓ 및 비타민 B₁₂ 0.05 ㎎/ℓ로 이루어진 배지.