KR20110091805A

KR20110091805A - 동물 간 세포의 배양 방법

Info

Publication number: KR20110091805A
Application number: KR1020117015397A
Authority: KR
Inventors: 료스케 다카하시; 아키코 히사다; 히로시 소노다
Original assignee: 가부시키가이샤 히타치세이사쿠쇼
Priority date: 2009-01-08
Filing date: 2009-01-08
Publication date: 2011-08-12
Also published as: CN102272288B; JPWO2010079602A1; EP2383332B1; CN102272288A; US8530237B2; KR101370222B1; US20110269232A1; WO2010079602A1; EP2383332A1; JP5337169B2; EP2383332A4

Abstract

간 세포를 3차원적으로 배양하여 간편하게 스페로이드를 형성하는 기술, 및 담관 배설을 담당하는 트랜스포터 MRP2의 발현이 종래법보다도 높은 스페로이드를 형성하는 기술을 제공한다. 상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 나노필라 시트 상에서 간 세포가 스페로이드를 형성하기 쉽게 되는 조건을 발견하였다. 구체적으로는, NP 시트에 도포하는 I형 콜라겐의 농도에 관한 것이다. 또한, 형성된 스페로이드의 배설에 관한 유전자의 발현량을 향상시키는 조건을 발견하였다. 구체적으로는 미리 스페로이드를 형성시킨 후에, 생물학적 매트릭스를 중층하는 것이다.

Description

동물 간 세포의 배양 방법 {METHOD FOR CULTURE OF ANIMAL HEPATOCYTE}

본 발명은 배양 기재를 이용하여 동물 간 세포를 배양한 간 세포 덩이인 3차원 스페로이드(spheroid), 또는 조직상 구조물의 형성 방법에 관한 것이다.

의약품 개발의 표준적인 프로세스는 크게 3가지 단계로 나누어진다. 제1 단계는 의약 필요를 조사하여 의약품 개발의 대상으로 하는 병을 선택한 후, 질병에 유효한 물질을 탐색하여, 목적으로 하는 의약 후보품을 창출(스크리닝)하는 단계이다. 계속해서 제2 단계는 의약 후보품이 대상으로 하는 병의 진단, 치료에 유효하고 안전한 것을 비임상 시험, 임상 시험을 통하여 입증하고, 그 평가 성적을 신약 승인 신청서에 정리하여 국가의 승인을 취득하는 단계이다. 그리고 제3 단계가 승인된 의약품이 시판되어 의료에 사용되는 단계이다. 이 창약 과정을 연구 개발에 드는 비용이라고 하는 관점에서 살펴 보면, 전체 연구 개발비의 30％부터 경우에 따라서는 50％에 상당하는 액수가 동물 실험에 소비되고 있다고 하는 보고가 있다.

동물 실험은 비임상 시험과 일부의 임상 시험이나 초기 스크리닝에 이용된다. 따라서, 동물 실험에 대체하는 저비용의 대체 시험법의 개발은, 신약 1 품목당 개발비가 1,000억엔에 육박한다고 하는 목하의 상황하에서는, 연구 개발비의 억제라고 하는 점에서 그 삭감 효과가 예상된다. 또한, 동물 복지ㆍ애호 측면으로부터도, 특히 최근의 EU의 움직임을 보면, 동물 실험의 삭감은 사회적으로는 이미 돌이킬 수 없는 큰 흐름으로 되고 있다. 또한, 세포를 이용한 시험관내 대체법은, 종래의 동물 실험으로는 이해가 어려웠던 약물 또는 화합물의 체내 동태의 작용 메카니즘의 해명, 특히 중요한 지표 중 하나인 간장에서의 대사나 해독, 담관 배설의 평가에 유리하다고 하는 지적도 있다(비특허문헌 1).

이러한 배경하에, 이제까지 세포를 이용한 대체법의 접근은 활발히 취해져 왔지만, 임상 반응을 예측하기에는 한계가 있는 경우가 많다. 이것은 이들 배양법에서는 세포가 실제의 생체내의 구조를 모의한 구조를 취하고 있지 않기 때문이라고 생각되고 있다(비특허문헌 2). 따라서, 보다 생체에 가까운 3차원 구조의 구축과 그것을 이용한 시험관내 분석계의 확립이 요구되고 있다. 그 중에서도 간 세포를 이용한 시험관내 분석에 대한 기대가 높아, 중요한 스크리닝 지표 중 하나인 간장에서의 대사나 모세 담관 배설의 평가계가 요구되고 있다. 모세 담관은 2개 이상의 간 세포에 의해 둘러싸여진 빈 곳이며, 타이트 결합에 의해 세포 사이 빈 곳을 폐쇄하여 담즙의 누설을 방지하고 있다. 간장은 세포막 상에 발현된 ATP 의존성 트랜스포터에 의해 간 세포로부터 모세 담관 내로의 담즙이나 대사 산물의 수송을 행하고 있다. 이러한 담관 배설량을 측정하는 기술에 샌드위치법이 있지만(비특허문헌 3), 현재까지 충분한 성능을 나타내는 실용화는 이루어져 있지 않다.

세포의 3차원 구조를 실현하기 위한 디바이스로서 나노필라 세포 배양 시트(이하, 「나노필라 시트」 또는 「NP 시트」)가 있다(특허문헌 1). NP 시트는 나노임프린트 기술의 미세 가공 기술을 응용하여 제작한, 세포 배양 또는 조직 배양용의 기반 재료이다. 나노필라 시트의 특징은, 인공적으로 설계한 미세한 입체 구조를 기반 재료로서 이용함으로써, 3차원 배양용 디바이스로서의 효과를 기대할 수 있다는 점에 있다. 나노필라 시트를 이용한 세포 배양에 관해서는 이제까지 몇가지 보고가 이루어져 있다(특허문헌 2, 3).

일본 특허 공개 제2004-170935호 공보 일본 특허 공개 제2006-223197호 공보 일본 특허 공개 제2008-054566호 공보

J.Cell Biol.101: 914-923(1985) J Biomol. Screen. 9: 273-285(2004) FASEB J 3: 174-177(1989)

종래의 샌드위치 배양법(이하, SW 배양)은 간 세포의 저면에 I형 콜라겐, 간 세포의 상면에 생물학적 매트릭스를 중층하고, 이들 2종의 물질 사이에 세포를 끼워 2차원 평면적으로 배양하는 방법이며, 담관에 배설된 대사 산물을 정량할 수 있다고 하는 특징을 갖고 있다. 그러나, 시험관내 계의 SW 배양에서는 계측의 다이나믹 범위가 좁아 미소한 변동을 계측할 수 없는 것이 문제로 되고 있다. 이것은 생체내로부터 생체외로 일단 취출한 간 세포는 본래의 세포 기능이 저하하는 것, 배양 디쉬에서 재구성시킨 구조물에서는 형성되는 모세 담관의 수가 생체내와 비교하여 적은 것이 원인이라고 생각되고 있다.

따라서, 세포를 생체내 조직의 구조에 가까운 3차원으로 배양함으로써, 상기 문제점을 해결하는 움직임이 급속하게 확산되어 오고 있다. 구체적으로는, NP 시트를 이용한 배양이 시도되고 있다. 그러나, NP 시트를 이용한 세포 배양에 관해서도 특허문헌 2, 3에서는 지방 세포의 3차원 배양, 또는 신경 세포의 배양에 관한 기술은 있지만, 간 세포의 배양은 고려되어 있지 않아 간 세포 배양에 특화된 기술은 없다. 따라서, 특허문헌 2 및 3의 방법을 간 세포 배양에 적용하고자 하는 경우, 원하는 스페로이드가 형성되지 않는다고 하는 문제가 있었다.

이들 이유로부터, 본 발명은 생체에 가까운 구조, 기능을 갖는 3차원 간 세포 스페로이드를 NP 시트를 이용하여 형성시키기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 나노필라 시트 상에서 간 세포가 스페로이드를 형성하는 조건을 발견하였다. 구체적으로는, NP 시트에 도포하는 I형 콜라겐을 도포하는 것이다. 또한, 형성된 스페로이드의 배설에 관한 유전자의 발현량을 향상시키는 조건을 발견하였다. 구체적으로는 미리 스페로이드를 형성시킨 후에 생물학적 매트릭스를 중층하는 것이다.

본 발명을 적용함으로써 나노필라 시트 상에서 간편하게 간 세포의 3차원 구조인 스페로이드를 형성할 수 있다. 형성된 스페로이드는 담관 배설을 담당하는 트랜스포터 MRP2의 발현이 종래법보다도 높고, 보다 생체에 가까운 담관 배설능을 갖는다. 이러한 스페로이드를 이용함으로써, 미량의 배설도 계측할 수 있는 다이나믹 범위가 넓은 계측이 가능하게 된다. 계측의 다이나믹 범위가 넓어지면, 창약 과정의 약물 동태 시험에 적용하는 것이 가능하게 된다.

도 1은 간 세포 스페로이드 배양의 배양 공정을 나타내는 도면이다.
도 2는 I형 콜라겐 용액 농도를 바꾸어 코팅한 4종류의 NP 시트 상에서 배양한 간 세포의 위상차 현미경상을 나타내는 도면이다.
도 3은 간장 동결 조직 절편, NP 스페로이드, 평면 배양 세포의 면역 조직 화학을 나타내는 도면이다.
도 4는 암모니아 대사능을 나타내는 도면이다.
도 5는 CDFDA를 이용한 담관 배설 계측의 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 리얼 타임 PCR에 의한 유전자 발현 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 자동 배양 장치의 전체 구성도이다.
도 8은 자동 배양 장치 중의 감압부(A)와 배양부(B)를 나타내는 도면이다.
도 9는 배양 자동화의 공정을 나타내는 플로우차트이다.
[부호의 설명]
101: NP 시트
102: 세포 배양 디쉬
103: 접착제
104: I형 콜라겐 용액
105: 감압용 용기
106: 감압용 펌프
107: 세정용 생리 식염수(Phosphate buffered saline(-); 이하, PBS(-))
108: 배지
109: 간 세포
110: 간 세포 스페로이드
111: 감압 챔버
112: 감압부 투입ㆍ취출구
113: 개폐 밸브
114: 접속부
115: 감압 펌프
116: 인큐베이터
117: 액화 탄산 가스 봄베
118: 탈이온수
119: 투입구
120: 취출구
121: 내부 투입구
122: 내부 취출구
123: 보관실

배양 기재를 이용하여 간 세포를 배양하고, 간 세포 덩이인 3차원 스페로이드 또는 조직상 구조물의 형성 방법을 실현하기 위한 최선의 형태에 대하여, 이하 상세하게 설명한다.

<실시예 1>

실시예 1에서는 NP 시트 상에서 간 세포 스페로이드를 형성하기 위한 공정을 나타낸다.

<간 세포의 조제>

간 세포의 조제는 계내(in situ) 콜라게나제 관류법에 따랐다. 상세하게는 이하와 같다. 피셔(Fisher)344계 수컷 래트(7 내지 10주령)를 펜토바르비탈 마취하에서 개복하고, 문맥에 카테터를 삽입하여 전관류액(Ca² ⁺와 Mg² ⁺ 불포함, EGTA를 포함하는 행크스액)을 주입한다. 동시에 간장 하부의 하대 정맥을 절개하여 혈액을 방출시킨다. 다음으로 흉강을 열어 우심방에 들어가는 하대 정맥을 절개하고, 간장 하부의 하대 정맥을 매듭으로 막아 관류를 행한다. 간장으로부터의 탈혈이 충분히 이루어진 것을 확인한 후에 관류를 멈춘다. 관류액을 콜라게나제 용액으로 바꾸어 관류를 행한다. 본 실시예에서는 0.05％ 콜라게나제를 포함하는 행크스액을 이용하여 관류를 행하지만, 이것에 한정되지 않는다. 세포 사이 조직이 콜라게나제에 의해 소화된 것을 확인한 후, 관류를 멈춘다. 간장을 분리하고, 차가운 행크스액 중에서 세절하여 피펫팅에 의해 세포까지 분산시킨다. 이어서 거즈 여과에 의해 미소화된 조직을 제거한다. 세포 현탁액은 50G, 1분의 원심 분리를 수회 반복하여 비실질 세포를 제거한다. 이어서 등장 퍼콜액을 사용하여 500G, 5분의 원심 분리에 의해 상해가 있는 간 세포를 제거한다. 얻어진 간 세포의 생존율은 트리판 블루 배제법에 의해 계측하고, 생존율 85％ 이상의 간 세포를 배양에 사용한다. 여기서는 생존율 85％ 이상의 간 세포를 배양에 사용하지만, 반드시 해당 조건에 한정되는 것이 아니라는 것은 물론이다. 또한, 간 세포의 조제는 반드시 계내 콜라게나제 관류법에 한정되는 것이 아니다.

또한, 인간 간 세포에 대해서도 마찬가지의 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다.

<I형 콜라겐을 도포한 NP 시트의 준비>

배양 디쉬(102) 저면에 NP 시트(101)를 첩부한다(도 1의 (a)). NP 시트(101)의 첩부는 특별히 한정되는 것이 아니며, 예를 들면 순간 접착제이어도 되고, 양면 테이프이어도 된다. 또한, NP 시트(101)를 첩부하는 용기도 특별히 한정되는 것이 아니며, 시판되고 있는 세포 배양용 디쉬이어도 되고, 챔버 슬라이드이어도 된다. 실시예 1에서는 시판되고 있는 세포 배양 디쉬(102)에 순간 접착제(103)에 의해 NP 시트(101)를 첩부한 예를 나타낸다. NP 시트(101)는, 후술하는 소정의 두정부(頭頂部) 직경을 갖는 NP 시트를 복수 이용하는 것으로 한다.

다음으로, 약산성 용액에 용해되어 있는 I형 콜라겐을 소정의 농도까지 멸균수로 희석한 희석액(I형 콜라겐 용액)(104)의 1 내지 1.5mL를 챔버 슬라이드에 첩부한 NP 시트(도 1의 (a))에 첨가한다(도 1의 (b)).

다음으로, 첨가한 I형 콜라겐을 NP 시트에 완전히 흡착시키기 위하여, 감압용 용기(105) 내에서 감압 펌프(106)에 의해 감압 조작을 실시한다(도 1의 (c)). 감압 조작은 0.04 기압 이하에서 행한다. 감압 시간은 특별히 한정되는 것이 아니지만, 본 실시예에서는 10분간 행한다. 감압에 이용하는 장치는 특별히 한정되는 것이 아니다. 여기서 희석액의 소정 농도의 범위는 1/10⁶％(W/V) 이상 1/10⁸％(W/V) 이하이다. 반드시 상기 범위에 한정되는 것이 아니지만, 상기 범위 이상이거나, 상기 범위 이하이면 스페로이드가 형성되지 않을 가능성이 있다.

마지막으로, I형 콜라겐을 제거하고 PBS(-)(107)를 첨가한다(도 1의 (d)). 이 조작을 3회 행하여 I형 콜라겐을 세정한다.

<간 세포의 배양>

상술한 바와 같이 계내 콜라게나제 관류법에 의해 조제한 간 세포(109)를 배지(108)에 현탁하고, 동일하게 상술한 바와 같이 준비한 I형 콜라겐을 도포한 NP 시트에 파종한다(도 1의 (e)). 배지는 특별히 한정되는 것이 아니지만, 혈청(FCS), 인슐린, 덱사메타손을 포함한 배지(이하, 배지(10％ FCS+))를 포함하는 윌리엄스 E 배지를 이용한다. 본 실시예에서는 특히 10％ FCS, 8.6nM 인슐린, 255nM 덱사메타손을 포함한 윌리엄스 E 배지를 이용한다. 파종 후, CO₂ 인큐베이터를 이용하여 5％ CO₂, 37℃의 조건하에서 배양을 개시하고, 18시간 이상 경과한 후에 최초의 배지 교환을 행하고, 이후 24시간마다 배지 교환을 행한다. 파종 후 18시간째 이후의 배양에 이용하는 배지는 특별히 한정되는 것이 아니지만, 본 실시예에서는 배지(10％ FCS+)로부터 FCS를 제외한 배지(이하, 배지(FCS-))를 이용한다. 또한, 간 세포의 파종 밀도는, 본 실시예에서는 1×10⁵ 세포/ml로 하였지만, 이 농도에 한정되지 않는다. 여기서, 배양에 이용하는 NP 시트에는, (1) 두정부의 직경이 0.18㎛인 NP 시트(이하, 0.18NP), (2) 두정부의 직경이 0.5㎛인 NP 시트(이하, 0.5NP), (3) 두정부의 직경이 1.0㎛인 NP 시트(이하, 1.0NP), (4) 두정부의 직경이 2.0㎛인 NP 시트(이하, 2.0NP)의 4종류로 한다. 또한, NP 시트에 첨가하는 I형 콜라겐의 농도는 (1) 1/10⁶％(W/V) 이상, (2) 1/10⁶％(W/V), (3) 1/10⁸％(W/V), (4) 1/10⁸％(W/V) 이하의 4종류로 한다. 총 16종류의 조건에서 배양을 행한다. 조건에 따라서는 스페로이드(110)가 형성되는 것도 있다(도 1의 (f)). 16종류의 조건에서 배양한 결과는 도 2에 나타낸 바와 같으며, 이에 따라 스페로이드 형성을 위한 최적의 조건이 결정된다. 이에 따르면, 어느 NP 시트를 이용하여도 I형 콜라겐 농도가 1/10⁶％(W/V) 이상 1/10⁸％(W/V) 이하가 가장 바람직한 조건인 것이 명확하게 되었다.

<실시예 2>

실시예 2에서는 실시예 1에서 설명한 NP 간 세포 스페로이드의 유효성을 평가한다. 이하, 각 평가법에 대하여 평가 절차와 평가 결과의 순서로 설명한다.

<면역 염색>

형성된 간 세포 스페로이드의 구조가 생체내의 간장 조직의 구조에 가까운 것을 나타내기 위하여 면역 염색을 행한다. 주목한 분자는 세포-세포간 접착 단백질인 E-카드헤린과 세포 골격 단백질인 액틴이다. E-카드헤린이란, 세포-세포간의 접착 결합을 담당하는 막 단백질 중 하나이며, 세포끼리 서로 결합하여 보다 고차의 조직을 구축해 가는 점에서 필수 단백질이다. 또한, 액틴이란 세포끼리 접착하여 고차 구조를 형성해 갈 때에 세포에 대하여 물리적인 지지를 제공하는 세포 골격 단백질이다. 이들 2가지 단백질의 발현은 조직이 조직으로서 성립되고 있는 것을 나타내기 위해서는 필수 지표이다.

면역 염색의 절차를 이하에 나타낸다. 우선, 실시예 1에 따라, I형 콜라겐을 도포한 NP 시트를 이용하여 간 세포 스페로이드를 형성시킨다(이하, NP 통상 배양). 본 실시예에서는 실시예 1의 결과로부터 목적으로 하는 골격 단백질인 액틴과 세포-세포간 접착 단백질인 E-카드헤린이 그 중에서도 발달하여, 구형에 가까운 스페로이드를 구축하고 있는 2.0NP에 1/10⁶％(W/V)의 I형 콜라겐을 도포하여 스페로이드를 형성시켰지만, 반드시 이 조건에 한정되는 것이 아니다. 형성된 스페로이드를 PBS(-)로 3회 세정하여 고정한다. 본 실시예에서는 4％ 파라포름알데히드를 이용하여 15간 고정하지만, 반드시 이 방법에 한정되지 않는다. PBS(-)로 3회 세정하고, 비이온 계면 활성제에 5분간 침지하여 세포막을 파괴한다. 본 실시예에서는 0.5％ 트리톤(Triton) X를 이용하였지만 반드시 이 물질에 한정되지 않는다. PBS(-)로 3회 세정한 후, 블록킹을 행한다. 본 실시예에서는 1％ FBS(Fetal Bovine Serum; 소태아 혈청)에 30분간 침지하여 블록킹을 행하였지만, 반드시 이 방법에 한정되지 않는다. 그 후, 1차 항체를 작용시킨다. 본 실시예에서는 래트 항 인간 E-카드헤린 모노클로날 항체를 작용시켰지만, 반드시 면역 동물 종류는 래트에 한정되는 것이 아니며, 예를 들면 마우스이어도 되고 염소이어도 된다. 또한 1차 항체의 작용 온도와 시간은, 본 실시예에서는 4℃에서 1일간 행하였지만, 이것들에 한정되지 않는다. 계속해서, 비이온 계면 활성제를 포함하는 PBS(-)로 세정한 후, PBS(-)만으로 세정한다. 본 실시예에서는 0.05％ 트윈(Tween) 20/PBS(-)를 이용하였지만, 이 물질에 한정되지 않는다. 그 후, 형광 색소를 갖는 2차 항체를 작용시킨다. 본 실시예에서는 FITC 부가 항 래트 IgG 항체를 작용시켰지만, 반드시 면역 동물 종류는 래트에 한정되는 것이 아니며, 예를 들면 마우스이어도 되고 염소이어도 된다. 또한, 작용 온도와 시간은, 본 실시예에서는 37℃에서 1시간으로 하였지만, 이 방법에 한정되지 않는다. 계속해서 동일한 방법을 이용하여 세정한다. 다음으로 액틴 섬유의 염색을 행한다. 본 실시예에서는 로다민 부가 팔로이딘을 실온에서 5분간 작용시켰지만, 작용 시간은 이것에 한정되지 않는다. PBS(-)로 1회 세정하여 핵 염색을 행한다. 본 실시예에서는 헥스트 33342를 실온에서 5분간 작용시켰지만, 이 방법에 한정되지 않는다. 마지막으로 밀리(Milli)-Q 물로 세정하고 봉입한다.

비교를 위해, 여기서 종래의 평면 배양에 의해 얻어지는 간 세포에 대하여, 면역 염색을 행하여 E-카드헤린 및 액틴의 발현량에 대하여 검증한다. 종래의 평면 배양이란 이하와 같다. 시판되고 있는 콜라겐 코팅 배양 디쉬에 간 세포를 1×10⁵ 세포/ml의 밀도로 상기에 기재된 배지에 현탁하여 파종한다. 파종 후 18시간 이상 경과한 후에 최초의 배지 교환을 행하고, 이후 24시간마다 배지 교환을 행한다. 파종 후 18시간째 이후의 배양에 이용하는 배지는 상기에 기재된 바와 같다(이하, 평면 배양). 이러한 평면 배양에 의해 얻어진 세포에 대하여, 상기에 기재된 방법에 의해 면역 염색을 실시한다.

마찬가지로 비교를 위해, 동결 간장 조직 절편에 대해서도 면역 염색을 행하여 E-카드헤린 및 액틴의 발현량에 대하여 검증한다. 동결절편의 제조 방법은 이하와 같다. 래트를 개복한 후, 전관류액에 의해 탈혈할 때까지는 실시예 1과 같다. 그 후, 간장의 일부를 절취하고, 포매제를 첨가하여 -80℃의 동결기에서 동결한다. 동결 샘플을 이용하여 동결 마이크로톰에 의해 절편을 제작한다. 이렇게 하여 얻어진 동결절편에 대하여, 상기에 기재된 방법에 의해 면역 염색을 실시한다.

이상과 같이 하여 제조한 NP 스페로이드, 평면 배양, 동결절편의 3종류의 면역 염색의 결과를 도 3에 나타낸다. 간장 절편(도 3의 (a))와 마찬가지로 간 세포 스페로이드(도 3의 (b))에 있어서도 E-카드헤린이 세포-세포 사이에 농축되어 있는 것이 명확하게 되었다. 또한, E-카드헤린과 마찬가지로 액틴에 대해서도 간장 절편(도 3의 (d))와 스페로이드(도 3의 (e))에서 모두 세포막의 부분에 국재되어 있어, 세포막을 보강하고 있는 모습이 명확하게 되었다. 그에 대하여, 종래의 평면 배양에서는 생체의 간장 조직에서 발현하고 있는 E-카드헤린이 발현되고 있지 않은 것(도 3의 (c)), 액틴 스트레스 파이버를 형성하고 있는 것(도 3의 (f))이 나타나서, 본래의 구조와는 명확히 다른 것을 알 수 있다. 이와 같이 종래의 평면 배양에 대하여, NP 시트에 의한 스페로이드 배양에 의해 구조면에서는 생체의 조직에 가까워지는 것이 가능하게 된다. 이상과 같이 NP를 이용한 배양에서는 액틴 스트레스 파이버를 형성하고 있지 않고, E-카드헤린의 발현이 검출되었기 때문에, 세포-세포간의 접착이 세포-기재간의 접착보다도 상회하였으므로, 세포-세포간의 접착이 발달한 3차원적인 입체 구조를 형성하였다고 생각된다.

<암모니아 대사능 측정>

다음으로, 생체에 가까운 구조를 갖는 스페로이드의 기능을 검증하기 위하여, 간장의 중요한 기능인 암모니아 대사능을 측정한다. 생체내에서는 암모니아는 주로 장내나 신장에서 생성되어, 혈류를 타고 간장에 도착하며, 간장은 요소 회로를 이용하여 암모니아를 요소로 변환한다. 이러한 간장의 암모니아 대사능을 측정하기 위하여 시판되고 있는 전용 키트를 사용한다. 우선, 상기에 기재된 방법에 따라 2.0NP 시트를 이용한 NP 통상 배양에 의해 간 세포 스페로이드를 형성시킨다. 비교를 위해, 상기에 기재된 평면 배양법에 따라 배양을 행한다. 모두 배양 개시 72시간 후에 암모니아 배지로 교환하고, 배지의 일부를 샘플링한다. 배지 교환 후 24시간 배양 후에 마찬가지로 배지를 샘플링한다. 각 샘플링액에 대하여, 키트의 설명에 따라 샘플을 제조한다. 630nm의 흡광도를 측정하고, 해당 24시간의 암모니아 감소 (대사)량을 산출한다. 또한, 미리 암모니아 농도가 기지인 샘플을 사용하여 검량선을 구해 둔다. 한편, 샘플링 시점에서의 세포수의 측정은, 세포를 SDS에 의해 가용화한 후, 헥스트 33258을 첨가하여 형광 강도를 측정하여 구한다(여기 파장 355nm, 형광 파장 460nm). 본 실시예에서는 시판되고 있는 키트를 채용하였지만, 어느 방법이어도 상관없다.

이와 같이 하여 NP 시트에서 재구성한 3차원 구조인 스페로이드의 암모니아 대사능을 측정한 바, 종래의 평면 배양에 비하여 NP 스페로이드에서 우위적으로 높고, 암모니아 대사가 활발하게 행해지고 있는 것이 명확하게 되었다(도 4). 간 세포 본래에 가까운 구조를 취함으로써, 동시에 생체내에서의 간 세포가 본래 유지하고 있는 극성을 회복하여 기능의 향상으로 연결되었다고 생각된다.

<모세 담관 배설의 검토>

NP에 의해 형성한 스페로이드의 간 기능을 검증하기 위하여, 간장의 중요한 기능 중 하나인 모세 담관으로의 배설능을 측정한다. 본 실시예에서는 모세 담관을 형성하는 세포막 상에 국재하는 단백질인 MRP2의 기질인 5-카르복시-2',7'-디클로로플루오레세인 디아세트산(CDFDA)을 투여하여 담관으로의 배설 유무를 검증하였다. MRP2가 활성을 갖고 있으면 5-카르복시-2',7'-디클로로플루오레세인(CDF)으로서 담관에 배설된다.

측정 방법은 이하와 같다. 우선, 상기에 기재된 방법에 따라 2.0NP 시트를 이용한 NP 통상 배양에 의해 간 세포 스페로이드를 형성시킨다. 비교를 위해, 담관 배설의 정량 계측에서 선행되고 있는 샌드위치 배양(이하, SW 배양)을 채용하였다. SW 배양은 이하와 같다. 시판되고 있는 콜라겐 코팅 배양 디쉬에 간 세포를 1×10⁵ 세포/ml의 밀도로 상기에 기재된 배지에 현탁하여 파종한다. 배양을 개시하고, 4시간 후에 최초의 배지 교환을 행하고, 24시간 후에 생물학적 매트릭스를 포함하는 배지(이하, 생물학적 매트릭스 배지)로 교환하고, 이후 24시간마다 상기에 기재된 방법에 따라 배지 교환을 행하여 배양한다(모식도는 도 5의 (k)). 모두 배양 개시 후 24, 48, 72, 96시간 후에 측정을 행한다. 각 시간에서, 세포를 행크스액(Ca² ⁺, Mg² ⁺포함)에 의해 1회 세정하여 CDFDA를 포함하는 배지로 교환한 후, 37℃에서 20분간 인큐베이션한다. 행크스액(Ca²⁺, Mg²⁺포함)에 의해 3회 세정하고, 형광 현미경으로 관찰한다. 본 측정은 반드시 상기 조건으로 한정되는 것은 아니다. 또한, 여기서 생물학적 매트릭스에는 매트리겔(등록 상표) 등을 이용한 예를 나타내었지만, 반드시 이것에 한정되는 것이 아닌 것은 명확하다.

측정 결과, 24시간의 시점에서는 NP 스페로이드, SW 배양 모두 취입된 CDFDA가 세포 내에 축적되는 모습이 관찰되었다(도 5의 (a), (f)). 이것은 파종 후 24시간에서는 담관이 형성되어 있지 않거나, 형성되었다고 하여도 기능을 가진 MRP2가 담관 부위에서 발현하고 있지 않기 때문이라고 생각된다. 그 후, 48시간에서는 세포 내와 담관의 양쪽에 축적되어 있고(도 5의 (b), (g)), 72시간(도 5의 (c), (h)), 96시간(도 5의 (d), (e), (i), (j))에서는 세포 내에는 남지 않고, 담관에 배출된다. 이것은 시간의 경과에 따라 점차로 담관이 형성되어 CDFDA가 CDF로서 담관에 배출되었기 때문이라고 생각된다. 이 결과로부터 SW법과 마찬가지로 NP 스페로이드에서도 담관이 형성되고, 기능을 가진 MRP2가 담관에 국재되어 있는 것이 명확하게 되었다.

<리얼 타임 PCR>

형성된 스페로이드가 간장 조직과 같은 고차 구조를 유지하고 있는 것, 또는 간장 특이적인 기능을 유지하고 있는 것을 검증하기 위하여, 리얼 타임 PCR법을 이용하여 정량적인 유전자 발현 해석을 행한다. 채취 직후의 간 세포의 타겟 유전자(표 1)의 발현량을 측정하고, 그 값을 1로 하였을 때의 각 배양 조건에서의 발현량을 산출하여 발현량의 비교를 행한다.

3종류의 배양 조건의 사이에서 비교를 행한다(도 6의 (b)). 첫번째는 상기에 기재된 2.0NP 상에서의 NP 통상 배양(도 6의 (b), 2.0NP)이다. 두번째는 2.0NP 상에 간 세포를 파종한 후 48시간째에 생물학적 매트릭스를 중층화하는 조건(이하, NP 생물학적 매트릭스 중층 배양, 도 6의 (b), 2.0NP+M)이다. 생물학적 매트릭스는 세포외 매트릭스로부터의 추출 성분이며, 보다 생체에 가까운 환경을 제공하는 것으로서, 이제까지 세포 생물학의 실험에 사용되어 왔다. 또한, 상술한 SW법에 있어서도 생물학적 매트릭스를 이용함으로써 간 기능의 향상을 실현하고 있다. 이것들로부터 NP 스페로이드에도 생물학적 매트릭스를 작용시킴으로써 보다 높은 효과를 기대할 수 있다고 생각하였다. 동시에, 이제까지의 셀룰라인을 이용한 검토로부터 스페로이드가 지나치게 크면(직경 50㎛ 이상) 배지 성분의 침투나 산소의 공급이라고 하는 점에서 불리해지고, 스페로이드 내부로부터 괴사해 버리는 것이 명확하게 되었기 때문에, 스페로이드의 직경을 50㎛ 이하인 채로 유지하는 것도 스페로이드의 기능의 향상에 중요한 요인이라고 생각하였다. 이상의 예비 검토 결과, 생물학적 매트릭스를 중층함으로써 고기능화를 기대할 수 있고, 또한 스페로이드의 크기를 제어할 수 있는 가능성을 생각할 수 있었기 때문에, 이 방법을 채용하기로 한다. 생물학적 매트릭스 중층 배양의 구체적인 방법은 이하와 같다. 10^-6％(W/V)의 I형 콜라겐을 도포한 NP 시트에 간 세포를 파종한다. 배지(10％ FCS+)를 사용하여 배양을 개시하고, 18시간 후에 최초의 배지 교환을 행하고, 24시간 후에 무혈청의 배지(배지(10％ FCS-))로 교환하였다. 또한 24시간 후에 생물학적 매트릭스 배지로 교환하고, 이후 24시간마다 배지(10％ FCS-)를 이용하여 배지 교환을 행하여 96시간 배양하였다. 그리고, 세번째는 SW 배양이다(도 6의 (b), SW).

실험의 계획안을 도 6의 (b)에 나타낸다. 이와 같이 하여 얻어진 NP 통상 배양, NP 생물학적 매트릭스 중층 배양, SW 배양에 대하여, 배양 개시 24, 48, 72, 96시간 후에 스페로이드 및 세포를 트립신 처리에 의해 회수하고, 1,500rpm, 4℃에서 5분간 원심한다. 전용 키트를 이용하여 전체 RNA를 추출한다. 1.0㎍의 전체 RNA에 대하여, 역전사 반응을 행하여 cDNA 샘플을 얻는다. 얻어진 cDNA를 이용하여 리얼 타임 PCR을 행한다. 내부 표준 유전자에는 TBP를, 타겟 유전자에는 MRP2를 채용하고, 채취 직후의 간 세포의 발현량을 1로 하였을 때의 각 조건의 상대값을 발현량으로 한다. 해석 수법으로 _ΔΔCt법(1 사이클의 검출의 차이에서 증폭 산물에 2배량의 차가 있다고 하는 이론을 사용함, 검량선 작성이 불필요하기 때문에 다샘플을 처리할 수 있다고 하는 메리트가 있음, 비교 Ct법이라고도 함)을 채용하였지만 검량선법이어도 상관없다.

실험 결과, 간장 특이적인 트랜스포터인 MRP2는 NP 스페로이드에 생물학적 매트릭스를 중층하는 2.0NP+M의 조건에서, 생물학적 매트릭스를 중층하지 않는 2.0NP나 SW 배양보다도 높은 발현을 나타내었다(도 5의 (a)). 이것은 단순히 생물학적 매트릭스의 중층만이 효과적인 것이 아니라, 간 세포가 스페로이드를 미리 형성해 두는 것의 중요성을 시사하는 것이다.

<실시예 3>

실시예 1에서 설명해 온 일련의 배양 공정의 자동화를 실현하는 배양 장치 구성 및 자동 배양 공정을 이하에 설명한다. 자동 배양 장치 전체 구성도를 도 7, 자동 배양 장치 중의 감압부와 배양부의 상세를 도 8, 배양 자동화 플로우차트를 도 9에 나타내었다. 입력부에서 조건을 입력하고, 표시부에 표시시킨다. 입력하는 조건은, I형 콜라겐 주입부에서의 I형 콜라겐 주입량, 감압부에서의 감압 챔버 내 압력, 감압 시간, 액체 주입ㆍ흡인부에서의 콜라겐액 흡인량, 주입 세정액량, 세정 횟수, 세포 현탁액 주입부에서의 세포액 주입량, 배양부에서의 배양부 내 온도, 배양부 내 CO₂ 농도, 배지 교환까지의 배양 시간(배지 교환 주기), 배지 교환부에서의 배양 상청 흡인량, 교환용 배지, 교환용 배지 온도, 배지 교환량, 및 배양부와 배지 교환부의 양쪽을 제어하기 위한 총 배양 시간 등이다. 표시부에는 입력한 이들 정보가 표시된다.

또한, 상기 입력의 조건은 미리 복수 조건을 조합하여 메모리에 기억시켜 둠으로써 입력을 간소화시키는 것도 가능하다. 복수 조건을 기억시켜 두고, 표시부를 통하여 어느 조건에서 공정을 실행할지를 선택하도록 하여도 된다.

입력된 정보는 제어부에 전송되어, 메모리 등에 저장된다. 입력된 정보에 기초하여 일련의 커맨드(command)를 메모리로부터 호출하여, 배양 공정이 개시된다. 또한, 배양 공정의 동작 제어에 대해서는, 제어부에 탑재되는 중앙 처리 장치에서 통괄적으로 관리된다. 전체 공정은 클린 룸 내에서 행한다.

또한, 배양 디쉬의 각각에는 바코드 또는 RFID 태그 등이 탑재되고, 공정을 실행하는 장치의 각각에 이것들을 판독하는 장치를 설치하고, 전자 통신에 의해 제어부에서 배양 디쉬의 각각의 공정을 관리하도록 하는 것도 가능하다.

NP 시트의 반송은 로봇 아암, 벨트 컨베이어, 또는 그 외 방법에 의해 행한다. 또한, 공정의 일부가 별개의 기기로 독립되어 있는 경우에는, 조작자에 의해 배양 디쉬를 반입출하도록 하여도 된다.

NP 시트가 첨부된 배양 디쉬는 우선 I형 콜라겐 주입부에 보내져, 투입ㆍ취출구로부터 안에 넣어진다. I형 콜라겐 주입부에는 I형 콜라겐, I형 콜라겐을 배양 디쉬에 주입하는 노즐이 구비되어 있다. I형 콜라겐 주입량은 미리 메모리에 기억되어 있지만, NP 시트 돌기 선단부가 가릴 정도의 양이 바람직하다.

I형 콜라겐이 주입된 배양 디쉬는 투입ㆍ취출구로부터 밖으로 나와지고, 계속해서 감압부(도 8의 (A)-1, 2. 도 8의 (A)-1은 감압부를 위에서 본 도면, 도 8의 (B)-2는 감압부를 옆에서 본 도면임)로 보내진다. 감압부 투입ㆍ취출구(112)로부터 배양 디쉬는 감압 챔버(111)에 넣어지고 도어가 폐쇄된다. 감압 동작 제어는 제어부에서 행한다. 구체적으로는, 배양 디쉬를 챔버(111)에 투입한 후, 감압 챔버와 감압 펌프(115)의 접속부(114)에 부수되는 개폐 밸브(113)를 개방하고, 0.04 기압 이하로 감압한다. 10분 이상 감압을 행한 후, 개폐 밸브(113)를 폐쇄하고, 대기압이 동일 정도가 되는 것을 기다려 감압 조작은 종료가 된다. 해당 감압 펌프나 도어, 밸브의 개폐 동작은 감압 조작 종료 후, 감압부 투입ㆍ취출구(112)로부터 나와서 세정부에 보내진다. 세정부에는 흡인 노즐을 선단에 보유한 흡인 장치, 및 주입 노즐을 선단에 보유한 세정액이 구비되어 있다. 세정액은 어떠한 것이어도 상관없지만, 본 실시예에서는 PBS(-)를 사용한다. 또한 각 노즐의 선단부는 오염물을 방지하기 위하여 교환 가능한 수단을 갖고 있다. 세정부에서 I형 콜라겐액의 흡인, 세정액의 주입 후, 세정액의 흡인과 주입을 소정 횟수 반복한다. 주입량 및 세정 횟수는 미리 메모리에 기억되어 있다.

세정 조작 종료 후, 배양 디쉬는 세포 현탁액 주입부로 보내진다. 세포 현탁액 주입부에서는 세포 현탁액과, 배양 디쉬에 세포 현탁액을 주입하는 노즐이 구비되어 있다. 미리 메모리에 기억된 소정량이 주입된다. 또한, 세포 현탁액 주입부에는 주입된 세포 현탁액이 배양 디쉬에 균일하게 파종되도록 스테이지가 상하 좌우로 진동하도록 되는 구성으로 되어 있다. 또한 세포 현탁액 주입부는 단열재를 배치하여, 제어부에 의해 온도 제어가 가능하다.

세포 현탁액이 주입된 배양 디쉬(이후, 배양 세포)는 계속해서 배양부(도 8의 (B)-1, 2. 도 8의 (B)-1은 감압부를 위에서 본 도면, 도 8의 (B)-2는 감압부를 옆에서 본 도면임)로 보내진다. 배양부는 인큐베이터(116) 내의 CO₂ 농도를 일정하게 유지하기 위하여, 액화 탄산 가스 봄베(117)와 탄산 가스 모니터를 배치하고 있다. 또한, 인큐베이터 내의 습도를 일정하게 유지하기 위하여 탈이온수(118)를 배치하고 있다. 제어부에 의해 온도 제어와 시간 관리가 가능하다. 배양부에 보내진 배양 세포는 투입구(119)로부터 인큐베이터 내로 보내지고, 내부 투입구(121)를 거쳐 상단의 보관실(123)로 보내진다. 배양부에서는 인큐베이터 내부를 2구획으로 구획함으로써, 대량의 배양 세포의 배양, 및 CO₂ 농도의 변동을 낮게 억제하는 것이 가능하게 된다. 소정 시간 배양된 배양 세포는 내부 취출구(122), 취출구(120)를 거쳐 배지 교환부에 보내진다.

배지 교환부에는 흡인 노즐을 선단에 보유한 흡인 장치, 및 주입 노즐을 선단에 보유한 배지가 구비되어 있다. 배지 교환부는 제어부에 의해 온도 제어가 이루어지는 방이 몇개 있으며, 배양 세포는 목적에 따라 소정의 온도의 배지 교환실로 보내져 배지 교환을 행한다. 각 노즐의 선단부는 오염물을 방지하기 위하여 교환 가능한 수단을 갖고 있다. 배지 교환을 끝낸 배양 세포는 다시 배양부로 보내져 배양된다.

배양 및 배지 교환을 각각의 소정 시간, 소정 횟수 행하여 원하는 스페로이드를 얻을 수 있다.

이제까지 세포 배양은 2차원 평면 상에서의 단층 배양이 주류이었지만, 생체내 환경은 3차원으로서, 이 환경을 모방한 세포 배양계 및 3차원 구조를 가진 세포군의 형성이 불가결하다. 본 발명은 NP 시트에 도포하는 I형 콜라겐의 농도를 규정함으로써, 이러한 3차원 구조를 가진 세포 덩이인 스페로이드의 형성이 용이해질 뿐만 아니라, 본 발명에 의해 형성된 스페로이드는 담관 배설능을 유지한 생체의 간장 조직에 가까운 기능을 발현하는 스페로이드로서, 창약 스크리닝 분야에서의 이용 가치가 높다.

Claims

동물 간 세포의 배양 방법에 있어서,
간 세포의 상당 직경보다도 작은 상당 간격을 갖는 나노필라 시트에 소정의 농도로 희석된, 인테그린과 결합하는 단백질을 도포하는 공정과,
인테그린과 결합하는 단백질이 도포된 상기 나노필라 시트에, 소정의 배지에 소정의 세포 밀도로 조제된 간 세포를 파종하는 공정과,
소정 시간 주기로 배지 교환하는 공정을 갖고,
상기 나노필라 시트에 인테그린과 결합하는 단백질을 도포하는 공정 후에, 감압 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 동물 간 세포의 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 간 세포를 파종하는 공정에서는, 상기 간 세포가 나노필라 시트에는 접착하지만, 액틴 스트레스 파이버를 형성할 때까지는 가지 않는 범위로 접착시켜, 간 세포 스페로이드(spheroid)를 형성시키는 것을 특징으로 하는 동물 간 세포의 배양 방법.
제1항에 있어서, 배양액 중에 인슐린 및 덱사메타손을 첨가하는 것을 특징으로 하는 동물 간 세포의 배양 방법.
제3항에 있어서, 배양액 중의 인슐린의 농도는 1nM 내지 100nM의 범위이며, 덱사메타손의 농도는 1nM 내지 250nM의 범위인 것을 특징으로 하는 동물 간 세포의 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 간 세포의 파종 밀도가 1×10⁴내지 1×10⁶ 세포/ml의 밀도인 것을 특징으로 하는 동물 간 세포의 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 간 세포를 상응 표면 처리를 실시한 나노필라 시트에 파종한 후, 24 내지 48시간 후에 생물학적 매트릭스를 중층하는 것을 특징으로 하는 동물 간 세포의 배양 방법.
제6항에 있어서, 생물학적 매트릭스가 기저막 유래 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 간 세포의 배양 방법.
제1항에 있어서, 형성된 스페로이드의 직경이 30 내지 100im 이하인 것을 특징으로 하는 동물 간 세포의 배양 방법.
제1항에 있어서, 인테그린과 결합하는 단백질은 세포외 매트릭스의 성분인 것을 특징으로 하는 동물 간 세포의 배양 방법.
제9항에 있어서, 세포외 매트릭스 성분은 I형 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 간 세포의 배양 방법.
제10항에 있어서, 상기 I형 콜라겐의 농도는 1/10⁶ 내지 1/10⁸％(W/V)의 범위인 것을 특징으로 하는 동물 간 세포의 배양 방법.
제1항에 있어서, 배지 교환을 하는 시간 주기는 4시간 내지 24시간인 것을 특징으로 하는 동물 간 세포의 배양 방법.