CN109055305B - 一种奶牛肝干细胞的分离提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种奶牛肝干细胞的分离提取方法，属于细胞工程技术领域。本发明通过优化灌流法的操作步骤，结合Percoll液分离技术，建立了一种简便易行，提取效率高的奶牛肝干细胞分离提取方法。该方法用时短，可以减少离体组织细胞暴露在缺血缺氧环境中的时间，提高细胞活力达90％以上，分离得到的肝干细胞具有双向分化潜能，为解决体外研究奶牛疾病过程中所需的肝干细胞来源问题及奶牛营养代谢病发病机制提供支持。

Description

一种奶牛肝干细胞的分离提取方法

技术领域

本发明涉及一种奶牛肝干细胞的分离提取方法，属于细胞工程技术领域。

背景技术

近年来，我国规模化奶牛养殖模式飞速发展，大规模舍饲的管理模式在带来更高生产效益的同时也对奶牛的健康产生一定的影响。不同生理阶段的奶牛需要不同的能量摄入，但是目前奶牛的管理精细化程度远远不够，统一饲喂会带来更高的营养代谢风险。在分群不及时的情况下，围产期牛群中容易发生能量和物质代谢障碍。肝脏在动物体内承担着能量储存代谢、胆汁合成运输、氨基酸利用，解毒等多种重要生理功能。利用体外肝细胞模型研究奶牛代谢相关疾病的发生机制具有十分重要的意义。

以往我们认为在体内发生急性肝损伤时成熟肝细胞在体内能够迅速进行细胞分裂，不断复制以修复肝脏组织功能，说明肝细胞本身就具有很强的增殖能力。但是体外培养的原代肝细胞会失去增殖能力，且容易发生细胞凋亡。体外培养的原代肝细胞通常只能存活一到两周左右，这一缺陷大大增加了肝细胞的获取成本，限制了肝细胞相关实验的开展。

众所周知，干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，具有强大的自我增殖及分化潜能，研究表明干细胞体外培养可定向诱导为成熟肝细胞，这为肝细胞来源问题提供了一个新的思路。细胞根据功能可分为全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。全能干细胞如胚胎干细胞，虽然在体外增殖及活力上有不可比拟的优势，但存在可塑性差，分化率低等缺陷。肝脏中存在特异性的肝干细胞，并能够体外诱导分化成功能性肝细胞或胆管细胞。目前分离肝干细胞的方法多以两步灌流法为基础，再结合免疫磁珠分选、Percoll密度梯度离心或胰蛋白酶多次消化来分离肝干细胞。用免疫磁珠法分离细胞得率有限，且不利于后续培养；而用胰蛋白酶多次差速消化对细胞伤害较大，操作繁琐且细胞纯度不够。申请公布号为CN102787096A的中国发明专利申请公开了小鼠肝窦内皮细胞的提取方法。该方法结合了两步灌流、差速离心、Percoll离心、差速贴壁技术实现肝窦内皮细胞的分离。但该方法操作复杂，实验过程用时较长，成本较高。目前未发现更简单易行肝干细胞分离方法。

发明内容

本发明提供了一种奶牛肝干细胞的分离提取方法，该方法耗时短，操作简便。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种奶牛肝干细胞的分离提取方法，包括如下步骤：

(1)取奶牛肝脏用灌流液A进行灌流，流速为45～55mL/min，灌流时间为10～15min；观察到肝脏颜色呈土黄色且无颜色变化时，继续灌流2～3min；

(2)用灌流液B继续灌流，流速为45～55mL/min，灌流时间为2～3min；

(3)用灌流液C继续灌流13～17min，灌流速度为15～25mL/min；

(4)将肝脏组织终止消化后，过筛网得到组织悬液；

(5)将步骤(4)中的组织悬液离心，取沉淀即得肝脏非实质细胞；

(6)将肝脏非实质细胞重悬得细胞悬液；

(7)将上述细胞悬液加入到Percoll液上方，离心弃上清及分离液，即得肝干细胞。

上述奶牛肝干细胞的分离提取方法耗时短、操作简便、成本较低，通过该分离提取方法得到的肝干细胞细胞活力达90％以上。

上述奶牛肝干细胞的分离提取方法中，灌流液A包括以下重量份数的组分：NaCl 8～8.2份、KCl 0.4～0.6份、葡萄糖0.4～0.5份、HEPES 2～3份、EDTA 0.1～0.2份；灌流液B包括以下重量份数的组分：NaCl 8～8.2份、KCl 0.4～0.6份、葡萄糖0.4～0.5份、HEPES 6～7份、CaCl₂ 0.5～0.7份；灌流液C是将IV型胶原酶溶于灌流液B中得到的。上述灌流液的组分配比可以达到更好的灌流效果。

本发明在奶牛肝干细胞的分离提取过程中，灌流液A的用量为600～900mL或600～800mL。

上述奶牛肝干细胞的分离提取方法中，所述的灌流液A、灌流液B、灌流液C均经36～38℃预热。36～38℃更接近奶牛的体温，在36～38℃温度下预热可以达到更好的分离效果。

步骤(4)中所述的终止消化采用胎牛血清进行。胎牛血清可以终止肝脏的消化。

步骤(4)中所述的筛网目数为80～180目。筛网目数在80～180目时可以将杂质去除，得到较纯的肝脏组织悬液。

步骤(5)中所述的离心方法为先在50～55g的转速下离心5～10min，再在200～220g的转速下离心5～10min。通过该离心方法可以将悬浮于肝脏组织悬液中的肝脏非实质细胞沉淀析出。

步骤(6)中所述细胞悬液的密度为1×10⁶cells/mL。采用1×10⁶cells/mL密度细胞悬液进行纯化，能有效提高纯化细胞回收效率。

步骤(7)中所述的Percoll液质量百分数为50％，所述离心的条件为4℃离心10min，转速为600g。质量百分数为50％的Percoll液，肝干细胞分离纯化效果更好，4℃离心可以防止离心过程中的温度较高而降低肝干细胞的活力。

步骤(7)中所述的Percoll液和细胞悬液的体积比略大于1:1。体积比略大于1:1，能得到纯化后清晰的分界。

本发明的有益效果：

本发明通过优化两步灌流法操作步骤，结合Percoll液分离技术，建立了一种简便易行，提取效率高的奶牛肝干细胞分离提取方法。该方法用时短，可以减少离体组织细胞暴露在缺血缺氧环境的时间，提高细胞活力达90％以上，分离得到的肝干细胞具有双向分化潜能，为解决体外研究奶牛疾病过程中所需的肝细胞来源问题及奶牛营养代谢病发病机制提供支持。

附图说明

图1为本发明中奶牛肝干细胞的分离纯化的对比例2中多密度Percoll分离液纯化结果的显示照片；

图2为本发明中奶牛肝干细胞的分离纯化的实施例中50％单密度Percoll分离液纯化结果的显示照片；

图3为本发明中奶牛肝干细胞的分离纯化的实施例中50％单密度梯度纯化后的离心结果的显示照片；

图4为本发明中肝干细胞与肝细胞分离纯化的试验例2中奶牛肝干细胞放大倍数50×的显示照片；

图5为本发明中肝干细胞与肝细胞分离纯化的试验例2中奶牛肝细胞放大100×的显示照片；

图6为本发明中肝干细胞的原代培养的试验例3中奶牛肝干细胞原代培养结果的显示照片；

图7为本发明中肝干细胞的传代培养的试验例4中奶牛肝干细胞传代培养结果的显示照片；

图8为本发明中P3代细胞HE染色鉴定的试验例5中P3代肝干细胞HE染色结果的显示照片；

图9本发明中P3代细胞免疫荧光染色的试验例6中P3代肝干细胞荧光免疫染色结果的显示照片；

图1中，1代表70％Percoll层，2代表50％Percoll层，3代表其他细胞悬液，4代表肝干细胞层；

图2中，5代表其他细胞悬液，6代表50％Percoll层；

图3中，7代表离心后的肝干细胞；

图6中，a-c放大倍数为200×，d-f放大倍数为50×；其中图a为培养72h细胞形态的显示照片，图b为培养96h细胞形态的显示照片，图c-e为继续培养一周内的不同时刻的细胞形态变化的显示照片，图f为图c-e继续培养到10d后的细胞形态显示照片；

图7中，a为P0代的细胞状态显示图，b为P1代细胞状态显示图，c、d为P2代细胞状态显示图，e、f为P3代细胞状态显示图；

图8中，a、c标尺为100μm，b、d标尺为50μm；

图9中各图的标尺为100μm，其中，a₁、a₂、a₃、a₄、a₅分别为CY3荧光染料标记的C-KIT、CD34、EpCAM、CK18、CK19阳性表达效果图，相应的特异性蛋白发红光；b₁、b₂、b₃、b₄、b₅均为DAPI核染图，发蓝光；c₁为a₁和b₁的叠加效果图，c₂为a₂和b₂的叠加效果图，c₃为a₃和b₃的叠加效果图，c₄为a₄和b₄的叠加效果图，c₅为a₅和b₅的叠加效果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明。

材料及主要试剂

1、操作对象：1日龄健康荷斯坦公犊牛(45～50kg)。

2、主要试剂的配制

(1)灌流液的配制：

灌流液A、B按下表1中的配方称取后分别加入800mL的蒸馏水溶解，用1mol/L的HCl或NaOH调节pH至7.2，定容至1000mL，用0.22μm细菌滤膜过滤除菌，4℃封存待用。

表1灌流液配方

灌流液C的配制：取100mg IV型胶原酶溶于500mL灌流液B中，除菌4℃保存待用。灌流液C中的Ca²⁺可与IV型胶原酶协同，利于分离细胞。

(2)培养液的配制：

高糖DMEM培养液干粉13.4g、NaHCO₃ 3.7g、青链霉素(终浓度均为100UI/mL)，溶于800mL蒸馏水。用磁力搅拌器搅拌均匀，待液面稳定后，向培养液中滴加1mol/L HCl或1mol/L NaOH，用pH计调节培养液pH至7.2，用蒸馏水定容至1000mL，0.22μm细菌滤膜过滤除菌后加入10％胎牛血清封存待用。

(3)Percoll液的配制：

Percoll母液：将Percoll原液与10×PBS按照9:1的比例混匀，使之达到生理渗透压，即得到100％Percoll。

Percoll工作液：将Percoll母液与稀释的1×PBS按1:1混匀，得到密度为50％的Percoll分离液。

奶牛肝干细胞的分离纯化的实施例

1、实验前准备

(1)灌流液的准备：水浴锅温度调至38℃，将提前配制好的灌流液A、灌流液B、灌流液C进行水浴加热。

(2)动物的准备：将1日龄荷斯坦犊牛进行全身麻醉，仰卧保定并注射血液抗凝剂，术部消毒后用无菌钝头手术剪无菌剪取犊牛肝脏尾状突部分，并迅速移入无菌间的超净工作台。将尾状突适当修整，使截面大小适中，同时暴露大小合适的血管以利于灌流。

2、肝干细胞的分离

(1)用提前预热的灌流液A冲洗尾状突表面血液，稍加修剪截面，暴露出肝脏横切面的血管断端，用一次性血管插管(去掉针头)从血管断端处对肝脏进行灌流，过程中可随时调整，从不同血管对肝组织进行充分灌注，灌流顺序为灌流液A→灌流液B→灌流液C。灌流液A中不含Ca²⁺，灌流过程中可使肝干细胞间半桥粒充分打开，使组织易于消化。用灌流液A的灌流速度为50mL/min，灌流时间为10min。当观察到肝脏由红色逐渐变为土黄色且无颜色变化时，继续灌流3min停止。该过程所需灌流液A 700mL。

(2)用提前预热的灌流液B继续对肝脏组织进行灌流，直至残留的灌流液A完全冲出，灌流速度为50mL/min，灌流时间为3min。其中灌流液B中含Ca²⁺，可以给IV型胶原酶消化提供含Ca²⁺环境。

(3)用提前预热的灌流液C继续对肝脏组织进行灌流，此步是整个灌流过程的关键环节。灌流过程中控制灌流液的温度为38℃，当明显观察到肝脏被膜下组织疏松呈龟裂状，触摸组织变软失去弹性，且流出的灌流液开始出现浑浊时立即停止灌流，灌流速度为20mL/min，灌流时间为15min。

(4)灌流结束后迅速将肝脏组织剪成小块儿并加入适量预冷胎牛血清终止消化，剔除组织血管、筋膜，剪碎后依次经80目、180目筛网过滤得到组织悬液。

(5)将组织悬液在50g的转速下离心5min后收集上清，上清转移至新的离心管进行第二次离心，转速200g离心5min，留取沉淀即得到肝脏非实质细胞，用PBS清洗2遍(2～3遍均可)后用高糖DMEM培养液重悬，细胞计数板计算细胞浓度，调整至密度为1×10⁶cells/mL待下一步纯化。

3、肝干细胞的纯化

50％Percoll液单密度梯度纯化：取少量胎牛血清润洗15mL离心管，将配好的50％Percoll液沿管壁缓慢注入管内，再将密度调整至1×10⁶cells/mL的细胞悬液缓缓加入50％Percoll液面上方，Percoll液与细胞悬液体积比略大于1:1即可，结果如图2所示，其中，5代表其他细胞悬液，6代表50％Percoll层，从图2中可观察到明显分层。然后4℃条件下600g的转速离心10min，吸去上清及分离液，重悬管底细胞沉淀，PBS清洗2次即可，结果如图3所示，图3为图2单密度梯度纯化后的离心结果，从图3中可以明显地看出细胞悬液和分离液的分层，7代表离心后肝干细胞所在的位置，离心后的肝干细胞分布在50％Percoll层，铺于试管底部。

奶牛肝干细胞的分离纯化的对比例1

实验准备及肝干细胞分离、纯化的操作过程均同实施例，区别仅在于将实施例中肝干细胞纯化过程中50％Percoll液替换为70％Percoll液进行单密度梯度纯化，不能分离出肝干细胞。

奶牛肝干细胞的分离纯化的对比例2

实验准备及肝干细胞分离、纯化的操作过程均同实施例，区别仅在于将实施例中肝干细胞纯化过程中50％Percoll液的单密度梯度纯化替换为多密度梯度纯化。将70％Percoll液加入到离心管最下层，然后将细胞悬液缓慢加入到70％Percoll液上方，再将50％Percoll液加入到细胞悬液上方，结果如图1所示，其中1代表70％Percoll层，2代表50％Percoll层，3代表其他细胞悬液，4代表肝干细胞层，结果可以看出，离心后肝干细胞分布在50％Percoll层，即多密度梯度纯化也可分离出肝干细胞。

不同密度的Percoll液纯化的试验例1

将实施例的分离纯化结果和对比例1、对比例2进行对比，结果如图1、2、3所示。结果显示，图1代表的多密度梯度纯化、图2代表的50％Percoll液单密度梯度纯化两种方法均能分离出肝干细胞，而70％Percoll液单密度梯度纯化不能将肝干细胞分离出来。但是多密度梯度纯化加液时难度较大，耗时较长，收集细胞时操作亦较繁琐。综上，50％Percoll液单密度梯度纯化方法简便，效果更好。

肝干细胞与肝细胞分离纯化的试验例2

将分离得到的肝干细胞与同期分离的肝细胞培养对比，两种细胞呈现不同的生长特性，结果如图4、5所示。

图4为肝干细胞放大显示照片，放大倍数为50×，肝干细胞呈卵圆形，细胞均为单核，形态均一，呈上皮样生长；图5为肝细胞放大显示照片，放大倍数为100×，肝细胞呈多角形，大多双核至多核，岛屿状排列。

肝干细胞的原代培养的试验例3

用高糖DMEM培养液重悬调整细胞密度为2×10⁴cells/mL接种于T25培养瓶中进行原代培养，每隔24h在倒置显微镜下拍照观察其生长状态及形态变化，间隔48h换液，结果如图6所示，图6中，a-c放大倍数为200×，d-f放大倍数为50×。

体外培养的原代肝干细胞，光镜下观察细胞形态大小均一，约5-10μm，折光率高。细胞接种后48h开始贴壁(如图6a所示)，72h时可见细胞体积变大，伸出伪足，有的可以观察到正在分裂的细胞板；96h即可观察到小圆形细胞增殖成片，周围伸展出长梭形细胞(如图6b所示)；随后一周内细胞逐渐连接并环绕小圆细胞呈集落样生长(如图6c-e所示)；集落面积逐渐扩大10d后铺满整个视野(如图6f所示)，若不继续传代，集落将不会继续扩增。

肝干细胞的传代培养的试验例4

待细胞生长融合程度达到至80％时，用胰蛋白酶消化传代，每天观察细胞增殖情况，间隔48h换液，结果如图7所示。

图7中，a为P0代的细胞状态显示图，b为P1代细胞状态显示图，c、d为P2代细胞状态显示图，e、f为P3代细胞状态显示图。体外培养P0代细胞增殖形成的集落，经消化可进行传代培养(如图7a所示)；传代接种2～4h即可全部贴壁，且增殖速度加快，5～7d可传代一次(如图7b所示)；P2代细胞活力最强(如图7c-d所示)；传至P3代的细胞虽保持较强的分裂能力，但开始出现新生细胞无法贴壁的现象，细胞随之慢慢干枯或脱落死亡(如图7e-f所示)。

P3代细胞HE染色鉴定的试验例5

取生长状态良好的P3代细胞，胰蛋白酶消化传代，调整细胞悬液密度为1×10⁵cells/mL，取100μL细胞悬液接种于细胞爬片上，培养3d后，固定染色，显微镜下观察细胞形态，HE染色结果如图8所示。

图8中，a、c标尺为100μm，b、d标尺为50μm。结果显示，体外分离培养的P3代奶牛肝干细胞为单核长梭形或多角形细胞，细胞核占比大，呈幼稚低分化状态(如图8所示)；细胞生长较密的区域，细胞形态恢复卵圆或多角形(如图8a、8b所示)；细胞较稀的区域，细胞会伸出长的伪足相互连接，呈长梭形(如图8c、8d所示)。

P3代细胞免疫荧光染色的试验例6

取生长良好的P3代细胞，当细胞融合程度达到70～80％，用4％多聚甲醛固定12h，将细胞破膜处理，用3％BSA封闭30min，加一抗4℃孵育12h后加二抗孵育50min，最后滴加DAPI(10μg/mL)避光复染10min后封片镜检采集图像，结果如图9所示。

图9中各图的标尺为100μm。其中，a₁、a₂、a₃、a₄、a₅分别为CY3荧光染料标记的C-KIT、CD34、EpCAM、CK18、CK19阳性表达效果图，相应的特异性蛋白发红光；b₁、b₂、b₃、b₄、b₅均为DAPI核染图，发蓝光；c₁为a₁和b₁的叠加效果图，c₂为a₂和b₂的叠加效果图，c₃为a₃和b₃的叠加效果图，c₄为a₄和b₄的叠加效果图，c₅为a₅和b₅的叠加效果图。结果显示，P3代细胞阳性表达造血干细胞表面标志C-KIT、CD34(分别如图9a₁、图9a₂所示)，卵圆细胞常用标记物EpCAM(如图9a₃所示)、肝细胞表面标志CK18(如图9a₅所示)和胆管细胞标志CK19(如图9a₄所示)，结合DAPI复染核的结果可见该细胞表达蛋白阳性率均为98％以上。多种表面标记物检测结果表明本申请的方法分离得到了一种类似于卵原细胞的胚胎肝干细胞，而它们又同时表达肝细胞表面标志CK18和胆管细胞表面标志CK19，这提示该胚胎肝干细胞具有潜在分化为肝细胞和胆管上皮细胞的潜能。

本发明利用灌流法结合50％Percoll单密度梯度法分离得到奶牛肝干细胞，本发明的实验过程简便，用时短。进一步免疫荧光法检测细胞表面抗原发现该细胞阳性表达造血干细胞表面标志C-kit、CD34，同时表达卵圆细胞常用标记物EpCAM、肝细胞表面标志CK18和胆管细胞标志CK19，说明用该方法能分离得到一种具有双向分化潜能的肝干细胞。

Claims (3)

1.一种奶牛肝干细胞的分离提取方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取奶牛肝脏用灌流液A进行灌流，流速为45～55mL/min，灌流时间为10～15min；观察到肝脏颜色呈土黄色且无颜色变化时，继续灌流2～3min；

(2)用灌流液B继续灌流，流速为45～55mL/min，灌流时间为2～3min；

(3)用灌流液C继续灌流13～17min，灌流速度为15～25mL/min；

(4)将肝脏组织终止消化后，过筛网得到组织悬液，所述终止消化采用胎牛血清进行，所述筛网目数为80～180目；

(5)将步骤(4)中的组织悬液离心，取沉淀即得肝脏非实质细胞，所述离心方法为先在50～55g的转速下离心5～10min，再在200～220g的转速下离心5～10min；

(6)将肝脏非实质细胞重悬得细胞悬液；

(7)将上述细胞悬液加入到Percoll液上方，离心弃上清及分离液，即得肝干细胞，所述的Percoll液质量百分数为50％，所述离心的条件为4℃离心10min，转速为600g，所述Percoll液和细胞悬液的体积比大于1:1；

所述灌流液A包括以下重量份数的组分：NaCl 8～8.2份、KCl 0.4～0.6份、葡萄糖0.4～0.5份、HEPES 2～3份、EDTA 0.1～0.2份；所述灌流液B包括以下重量份数的组分：NaCl 8～8.2份、KCl 0.4～0.6份、葡萄糖0.4～0.5份、HEPES 6～7份、CaCl2 0.5～0.7份；所述灌流液C是将IV型胶原酶溶于灌流液B中得到的。

2.根据权利要求1所述的奶牛肝干细胞的分离提取方法，其特征在于：所述灌流液A、灌流液B、灌流液C均经36～38℃预热。

3.根据权利要求1所述的奶牛肝干细胞的分离提取方法，其特征在于：步骤(6)中细胞悬液的密度为1×10⁶cells/mL。

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