CN113396225A - 细胞内的化合物的动态分析法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于使用细胞对药物等化合物的动态进行分析的方法和手段。具体地，本发明涉及一种化合物动态分析方法，其为使用细胞的化合物动态分析方法，包括：在容纳有含有对象化合物的细胞的容器中添加第1缓冲液，将前述容器内的温度调节至第1温度并保温，并且将前述容器内的温度调节至比前述第1温度低的第2温度的CE工序；在前述CE工序中，隔开间隔t1地测定前述第1缓冲液中前述化合物的量S和S’，基于前述量S和S’以及前述间隔t1算出前述化合物从前述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。

Description

细胞内的化合物的动态分析法
技术领域
本发明涉及包括化合物的摄取、代谢、排泄的化合物动态的整体情况的体外(invitro)分析和评价。
背景技术
新药开发工艺中，进行人体内给药来验证疗效的临床试验(“人体临床试验”)在药事法上是必需的，人体临床试验、动物实验需要庞大的开发费用。在转移至这样的动物实验、人体临床试验前的阶段，优选对候选药剂的药效、毒性进行验证、特别是用应用人源细胞的体外试验体系进行评价。
药剂为了在体内发挥药效，必须的是，暂时被肝脏摄取的药剂转变为代谢产物，或者不经代谢而直接作为原来的化合物(母体化合物)被排至血管侧后、再次顺着血流再循环而到达目标脏器、器官。因此，如果在体外试验体系中，也能够在给药后对排至血管侧的医药品候选化合物的再循环组分进行测定、评价作为新药开发中最重要的指标之一的药效，则会是非常有用的药物动态评价方法。而且，通过掌握包括胆管(胆汁)排泄后作为粪便被排泄至体外的从细胞排泄至毛细胆管的组分(消失组分)、细胞内存留部分在内的药物动态整体情况，能够求出在各组分中的分配比率。
专利文献1和专利文献2中公开了用药剂对培养细胞进行给药、对排泄至在细胞黏附间形成的毛细胆管的组分(消失组分)进行评价的方法。该评价方法是对给药药剂经胆汁排泄、然后作为粪便排泄至体外的药剂消失组分进行评价的方法。这些方法终归只是专门针对胆管(胆汁)排泄评价的方法。
为了获得具有药效的成分的信息，本发明人的研究组开发了用于对排泄至血管侧的成分的量直接进行评价的方法和装置(专利文献3和专利文献4)。利用该方法和装置，不是对药物动态的一部分进行评价，而是能够细分地对于给药药剂的血管(基底/基底外侧(Basal/Basolateral))侧排出组分、管腔(Apical)侧排出组分、细胞内存留组分等关于给药药剂在细胞在何处排泄、在何处存留进行定量，能够提供体外方式下的药物动态整体情况，进行精度更高的药效评价。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2005/118787号
专利文献2：国际公开WO94/12662号
专利文献3：国际公开WO2015/080106号
专利文献4：国际公开WO2016/166995号
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于，提供更迅速且简便、而且更容易理解和掌握的、用于使用细胞对药物等化合物的动态进行分析的方法和装置。
用于解决课题的方法
为了解决前述课题，本发明人进行了深入研究，结果发现，通过在使用细胞的化合物动态分析中，在多个时间点测定化合物的排泄和/或摄取，算出化合物的排泄速度和/或摄取速度，能够更好地理解和掌握化合物的动态，从而完成了本发明。本发明例如包括以下方式。
[1]一种化合物动态分析方法，其为使用细胞的化合物动态分析方法，
包括：在容纳有含有对象化合物的细胞的容器中添加第1缓冲液，将前述容器内的温度调节至第1温度并保温，并且将前述容器内的温度调节至比前述第1温度低的第2温度的CE工序；
在前述CE工序中，隔开间隔t1地测定前述第1缓冲液中前述化合物的量S和S’，
基于前述量S和S’以及前述间隔t1算出前述化合物从前述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
[2]根据[1]所述的化合物动态分析方法，
包括：
分别在各自容纳有含有前述化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中实施前述CE工序，分别从前述第1容器、前述第2容器和前述第3容器回收前述第1缓冲液的CE终止工序，以及
前述CE终止工序之后，在前述第1容器中添加含有解除细胞间黏附的试剂的第2缓冲液，将前述第1容器内的温度调节至第3温度并保温的EA1工序；
在前述EA1工序中，隔开间隔t2地测定前述第2缓冲液中前述化合物的量B1和B1’；
基于前述量B1和B1’以及前述间隔t2算出前述化合物从前述细胞的基底/基底外侧面和顶面的排出速度。
[3]根据[2]所述的化合物动态分析方法，
包括：前述CE终止工序之后，在前述第2容器中添加第3缓冲液，将前述第2容器内的温度调节至前述第3温度并保温的EA2工序；
在前述EA2工序中，隔开前述间隔t2测定前述第3缓冲液中前述化合物的量B2和B2’，
基于前述量B2和B2’以及前述间隔t2算出前述化合物从前述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
[4]根据[3]所述的化合物动态分析方法，
基于前述量B1和B1’以及B2和B2’、前述间隔t2，算出前述化合物从前述细胞的顶面的排出速度。
[5]根据[3]所述的化合物动态分析方法，
包括：前述CE终止工序之后，在前述第3容器中添加前述第3缓冲液，将前述第3容器内的温度调节至比前述第3温度低的第4温度并保温的EA3工序；
在前述EA3工序中，隔开前述间隔t2地测定前述第3缓冲液中前述化合物的量B3和B3’，
基于前述量B3和B3’以及前述间隔t2算出前述化合物通过被动扩散从前述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
[6]根据[5]所述的化合物动态分析方法，
基于前述量B2和B2’以及B3和B3’、前述间隔t2，算出前述化合物通过转运蛋白途径从前述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
[7]根据[1]所述的化合物动态分析方法，
包括：
分别在各自容纳有含有前述化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中实施前述CE工序，分别从前述第1容器、前述第2容器和前述第3容器回收前述第1缓冲液的CE终止工序，以及
前述CE终止工序之后，在前述第2容器中添加第3缓冲液，将前述第2容器内的温度调节至第3温度并保温的EA2工序；
在前述EA2工序中，隔开间隔t2地测定前述第3缓冲液中前述化合物的量B2和B2’；
基于前述量B2和B2’以及前述间隔t2算出前述化合物从前述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
[8]根据[1]所述的化合物动态分析方法，
包括：
分别在各自容纳有含有前述化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中实施前述CE工序，分别从前述第1容器、前述第2容器和前述第3容器回收前述第1缓冲液的CE终止工序，以及
前述CE终止工序之后，在前述第3容器中添加第3缓冲液，将前述第3容器内的温度调节至比第3温度低的第4温度并保温的EA3工序；
在前述EA3工序中，隔开间隔t2地测定前述第3缓冲液中前述化合物的量B3和B3’，
基于前述量B3和B3’以及前述间隔t2算出前述化合物通过被动扩散从前述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
[9]一种化合物动态分析方法，其为使用细胞的化合物动态分析方法，
包括：
分别在各自容纳有含有对象化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中添加第1缓冲液，将前述容器内的温度调节至第1温度并保温，并且将前述容器内的温度调节至比前述第1温度低的第2温度的CE工序，
分别从前述第1容器、前述第2容器和前述第3容器回收前述第1缓冲液的CE终止工序，以及
前述CE终止工序之后，在前述第1容器中添加含有解除细胞间黏附的试剂的第2缓冲液，将前述第1容器内的温度调节至第3温度并保温的EA1工序；
在前述EA1工序中，隔开间隔t2地测定前述第2缓冲液中前述化合物的量B1和B1’，
基于前述量B1和B1’以及前述间隔t2算出前述化合物从前述细胞的基底/基底外侧面和顶面的排出速度。
[10]一种化合物动态分析方法，其为使用细胞的化合物动态分析方法，
包括：
分别在各自容纳有含有对象化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中添加第1缓冲液，将前述容器内的温度调节至第1温度并保温，并且将前述容器内的温度调节至比前述第1温度低的第2温度的CE工序，
分别从前述第1容器、前述第2容器和前述第3容器回收前述第1缓冲液的CE终止工序，以及
前述CE终止工序之后，在前述第2容器中添加第3缓冲液，将前述第2容器内的温度调节至前述第3温度并保温的EA2工序；
在前述EA2工序中，隔开间隔t2地测定前述第3缓冲液中前述化合物的量B2和B2’，
基于前述量B2和B2’以及前述间隔t2算出前述化合物从前述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
[11]一种化合物动态分析方法，其为使用细胞的化合物动态分析方法，
包括：
分别在各自容纳有含有对象化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中添加第1缓冲液，将前述容器内的温度调节至第1温度并保温，将前述容器内的温度调节至比前述第1温度低的第2温度的CE工序，
分别从前述第1容器、前述第2容器和前述第3容器回收前述第1缓冲液的CE终止工序，以及
前述CE终止工序之后，在前述第3容器中添加前述第3缓冲液，将前述第3容器内的温度调节至比前述第3温度低的第4温度并保温的EA3工序；
在前述EA3工序中，隔开间隔t2地测定前述第3缓冲液中前述化合物的量B3和B3’，
基于前述量B3和B3’以及前述间隔t2算出前述化合物通过被动扩散从前述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的化合物动态分析方法，
包括：在前述CE工序之前，在容器内使前述细胞暴露于含有前述化合物的溶液，使前述化合物摄取入前述细胞的摄取工序；
在前述摄取工序中，隔开间隔t3地测定前述溶液中前述化合物的量A和A’，
基于前述量A和A’以及前述间隔t3算出前述细胞摄取前述化合物的摄取速度。
[13]根据[1]～[11]中任一项所述的化合物动态分析方法，前述细胞包括肝细胞。
发明效果
通过应用本发明，能够更迅速且准确地、而且更容易理解和掌握地对细胞内的化合物的动态进行分析。进一步，能够对医药品候选化合物(母体化合物和代谢产物)在转运蛋白途径和扩散途径中的血管(Basal/Basolateral)侧排出组分、管腔(Apical)侧排出组分、细胞内残留组分进行定量。通过对给药的医药品候选化合物的总量和各组分中的分配比率进行判定，能够评价给药的医药品候选化合物的动态，能够提高从数量庞大的医药品候选化合物中体外筛选发挥药效的候选药剂的精度。
附图说明
[图1]为显示化合物的动态分析的概念的图表。
[图2]显示的是样品制备流程的一例。
[图3]显示的是工序4、5、6的定量对象和化合物分布图像。
[图4]显示的是各组分的定义和荧光试剂CDF的结果的例子。
[图5]为显示荧光试剂CDF的分配比率的例子的图表。
[图6]为显示荧光试剂罗丹明123的分配比率的例子的图表。
[图7]显示的是培养板的一例。
[图8]为显示自动测量装置的构成例的图。
[图9]为样品制备部的顶视图。
[图10]为样品制备部的正视图。
[图11(a)]为自动测量装置的动作流程图。
[图11(b)]为自动测量装置的动作流程图。
具体实施方式
本发明涉及细胞中的(体外的)化合物动态分析方法的改良。本发明人以前开发的化合物动态分析方法(专利文献3和4)的概要如下。即，如图3所示，使用了三个试验区1～3，
在试验区1，从细胞向缓冲液(例如汉克斯(-)液)排出胆管侧排出(3)与第二血管侧排出(来自被动扩散(1)和转运蛋白(TP)(2)的排出)的总和组分，
在试验区2，不像试验区1那样使胆管崩溃，仅排出第二血管侧排出(被动扩散(1)和转运蛋白(2))，
在试验区3，通过设为比试验区1和2低的温度条件，抑制第二血管侧排出中从转运蛋白(1)排出的化合物，仅排出通过被动扩散(2)的排出组分。
该动态分析方法中，通过对试验区1～3的至少一个中回收的化合物的量进行定量分析，例如，通过从对试验区1中回收的化合物量进行定量而得的值减去对试验区2中回收的化合物量进行定量而得的值，能够分别算出胆管侧排出(3)的化合物量和第二血管侧排出的化合物量。此外，在试验区2与试验区3的比较中，能够算出(定量)通过转运蛋白途径的血管侧化合物排出量。各化合物中存在用于在细胞内外移动的特异性转运蛋白。因此，能够排除被动扩散途径的排出量、对转运蛋白途径的排出量进行定量意味着能够对各化合物的特异性排出量进行定量。
本发明涉及的方法中，为了进一步迅速且简便地进行上述动态分析方法、而且在视觉上进行掌握，至少在两个时刻测定化合物从细胞的排出，求出化合物的排出速度(图1)。此外，也可以至少在两个时刻测定细胞对化合物的摄取，求出化合物的摄取速度(图1)。通过求出化合物的排出速度(和任选地求出摄取速度)，能够例如在上述试验区1～3的细胞培养工序完成前对化合物的动态进行分析。此外，与仅测定实测值的情况相比，能够更准确地对变动进行分析、此外能够预测其后的化合物动态。进一步，通过制作图1中例示的那样的图表，能够在视觉上掌握化合物的动态。
本方法中，所谓细胞，是指想要评价化合物的摄取和/或排泄等动态的任意细胞，不做限定。作为细胞来源的生物体也没有特别限定，可以使用脊椎动物(例如哺乳类、鸟类、爬行类、鱼类、两栖类等)、无脊椎动物(例如昆虫、线虫、甲壳类等)、原生生物、植物、真菌、细菌等任意生物体来源的细胞。优选为哺乳类、特别是人的细胞。细胞的种类也没有特别限定，可以优选使用适合用于进行胆汁排泄或血中排泄评价的细胞、例如肝细胞。细胞通过本技术领域惯用的制备方法来制备，或者利用市售的细胞、保藏细胞(细胞株等)，本领域技术人员可以容易地理解。
此外，本方法中，评价对象化合物是想要评价向细胞的摄取和/或从细胞的排泄等细胞动态的任意化合物，不做限定。具体地，可以列举：天然生成的化合物例如氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物(糖等)、类固醇、糖肽、糖蛋白、蛋白聚糖等，天然生成的化合物的合成类似物或衍生物例如肽模拟物、核酸分子(适体、反义核酸、双链RNA(RNAi)等)等，不会天然生成的化合物例如低分子有机化合物(无机和有机化合物文库、或组合文库等)等，以及它们的混合物。此外化合物可以是单一物质，也可以是由多个物质构成的复合物、食品和食物等。
一个方式中，本公开提供一种化合物动态分析方法，其为使用细胞的化合物动态分析方法，
包括：在容纳有含有评价对象化合物的细胞的容器中添加第1缓冲液，将前述容器内的温度调节至第1温度并保温，并且将前述容器内的温度调节至比前述第1温度低的第2温度的CE工序；
在前述CE工序中，隔开间隔t1地测定前述第1缓冲液中前述化合物的量S和S’，
基于前述量S和S’以及前述间隔t1算出前述化合物从前述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
在上述方法中，求出图1的CE工序中[1]的经时变化(曲线图的斜率)。图3所示S1、S2和S3是S1≒S2≒S3，因此进行S和S’的测定(第1缓冲液中化合物的取样)的试验区是图3的试验区1～3中的哪一个都可以。
这里，CE工序的意思是Conditioning Efflux(预处理流出物)，是进行细胞预处理的工序(相当于实施例中的工序4)。CE工序是下述工序：在作为前工序(相当于实施例中的工序3)的低温(例如4℃)下的细胞清洗之后，在规定时间内以培养温度(例如37℃)进行温育，使培养容器冷却，回收上清组分。通过该CE工序，能够将在前工序中未被完全除去的、吸附于细胞上的化合物组分除去，能够抑制对之后的工序的排出评价数据的影响。省略该CE工序的情况下，化合物吸附组分(＝噪音)包含在CE工序后的工序(相当于实施例中的工序5)的组分中。此外，还能够实现与由细胞内化合物量减少导致的CE工序后的工序的排出减速相伴随的排出评价的稳定化。例如，能够降低同时对多个样品进行取样时的微小时间差的影响。另一方面，例如，对于可忽略吸附的化合物等，也可以缩短或放弃(或无限接近0)CE工序。
进一步，通过对CE工序中上清组分的定量值进行比较，能够检查从细胞培养到CE工序为止的样品间(例如孔间)的细胞和液体处理状态，例如能够进行特异值的掌握、除去。即，能够在样品间对从细胞培养到CE工序为止的细胞本身的状态和到CE工序为止的液体处理是否为同等进行检查。
如果CE工序过长，则用于之后的工序的化合物的细胞内浓度减小，分析数据容易产生波动。另一方面，如果CE工序过短，则无法将细胞上吸附的化合物充分除去，有可能会影响之后的工序的分析数据。因此，CE工序的长度根据细胞的种类、对象化合物的种类等适当设定。
具体地，CE工序中，在容纳有含有评价对象化合物的细胞的容器中添加第1缓冲液(例如汉克斯液)，将容器内的温度调节至第1温度(例如37℃)并保温，并且将容器内的温度调节至比第1温度低的第2温度(例如4℃)。
容纳细胞的容器只要是本技术领域公知的细胞培养用容器即可，没有特别限定，可以根据所用细胞的种类等适当选择。使用多个容器的情况下，容器可以是分开的容器，也可以是多孔滴定板那样由多个孔构成的容器。
容器中含有细胞和评价对象化合物。细胞的数量和化合物的量(浓度)也可以适当设定。
第1缓冲液是以可维持所用细胞的功能的方式含有无机盐类、在等渗条件下进行了调节、具有缓冲能力的以平衡盐溶液、生理盐水等为基础的缓冲液，可以根据所用细胞的种类适当选择。例如可以使用汉克斯平衡盐溶液、Earle’s平衡盐溶液、Dulbecco’s磷酸缓冲生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、Puck’s平衡盐溶液等。在容器中的添加量根据细胞的种类、培养(温育)时间、预定的取样次数等适当设定。
添加第1缓冲液后，将容器内的温度调节至第1温度并保温。第1温度是所用细胞的最适培养温度，可以根据所用细胞的种类适当选择。一般是作为生物体内环境的体温，例如约为37℃。接下来，将容器内的温度调节至比第1温度低的第2温度。第2温度是抑制摄取了化合物的细胞将该化合物向外部排出的温度，可以根据所用细胞的种类适当选择。通常，例如在约4℃的冷却(冰冷)条件下。
在该CE工序中，隔开间隔t1地测定第1缓冲液中化合物的量S和S’。即，隔开间隔t1的时间，至少进行两次取样，测定第1缓冲液中化合物的量。为了更准确地求出经时变化即速度，优选进行两次以上取样。但根据情况的不同，方便起见，也可以在该工序的起始时刻进行第一次取样。
多次取样可以通过任意方法来进行。例如，可以采用在每个进行取样的时刻(以下也称为时间点)设置不同的孔的方法。设定两个时间点的情况下，条件一致的孔至少为2个即可。或者，也可以通过从同一孔对缓冲液进行取样来进行多次取样。该方法中，能够对基于同一孔、即基于相同细胞的化合物排出速度进行分析。该从同一孔对缓冲液进行取样的方法进一步大致分为：
-取样后在该孔中补充与取样量等量的缓冲液的方法(但补充后的孔内缓冲液与补充前的孔内缓冲液相比，化合物的浓度低)，以及
-取样后不补充缓冲液的方法(但取样后的孔内缓冲液的液量减少，因此在化合物从细胞的排出速度一定的情况下，与未取样的孔内的缓冲液相比，经过规定时间后化合物的浓度增大)。
以这种方式从同一孔中对缓冲液进行取样的方法有时会影响孔内缓冲液中化合物的浓度。优选根据细胞、评价对象化合物的性质选择适当的方法或者试用多个方法。
时间点可以设为工序(CE工序)中浓度曲线为直线(来自细胞的化合物的摄取速度或排出速度一定)的时刻(例如图1中用[1]例示的直线)。然而，很多情况下，浓度曲线在哪一时刻变为直线是未知的。有时在工序刚刚起始之后和刚刚终止之后，化合物的摄取速度和排出速度的变化变得急剧，因而，时间点优选设在工序的中段。最适时间点因评价对象化合物的种类、所用细胞的种类而异，CE工序中，例如隔开数秒～数十分钟的间隔而设定至少两次、优选两次以上的时间点。通过以这种方式设定时间点，能够适当进行CE工序中化合物的动态(速度)分析。但根据情况的不同，方便起见，也可以在该工序的起始时刻进行第一次取样。
例如，一个实施方式中，隔开间隔t1进行的两次测定在容器内的温度为同一条件、例如第1温度期间实施。
第1缓冲液中化合物量的测定可以根据对象化合物的种类，使用本领域技术人员习惯使用的方法或试剂来进行。优选多个时间点的测定使用同一方法或试剂来进行。
这里，化合物的测定的意思是对缓冲液中的化合物或其代谢物的量或浓度优选进行半定量或定量测定，该量可以是绝对量，或者，也可以是相对量。测定可以直接或间接进行。直接测定包括基于与化合物的分子数直接相关的信号测定其量或浓度。间接测定是从次要成分(即化合物以外的成分)例如配体、标记物或酶反应生成物得到的信号的测定。
不是对化合物本身进行分析、而是对化合物的代谢物的动态进行分析的情况下，将分析式的分母和分子按每个蛋白质或每个细胞的分子数来计算即可。将测得的浓度换算为分子数。另一方面，测定化合物本身的情况下，除了分子数以外，还可以按浓度来计算。使用浓度的情况下，增加取样率进行计算。
通过利用上述方法分析CE工序的经时变化(图1中[1]的斜率)，能够求出化合物从细胞的基底/基底外侧面的排出速度、即总血中排出速度(被动扩散+转运蛋白途径)。具体地，由隔开间隔t1地测得的化合物量S和S’，通过式(S’-S)/t1，算出化合物从细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
通过如上所述对CE工序进行经时分析，能够测定总排泄(血中排泄组分的总量＝主动+被动)的初始速度。
另一方式中，本公开提供一种化合物动态分析方法，其为使用细胞的化合物动态分析方法，
包括：
分别在各自容纳有含有化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中实施上述CE工序，从前述第1容器、前述第2容器和前述第3容器分别回收第1缓冲液的CE终止工序，以及
前述CE终止工序之后，在前述第1容器中添加含有解除细胞间黏附的试剂的第2缓冲液，将前述第1容器内的温度调节至第3温度并保温的EA1工序；
在前述EA1工序中，隔开间隔t2地测定前述第2缓冲液中前述化合物的量B1和B1’，
基于前述量B1和B1’以及前述间隔t2算出前述化合物从前述细胞的基底/基底外侧面和顶面的排出速度。
通过上述方法，求出图1的EA工序中[2]的经时变化(曲线图的斜率)。进行B1和B1’的测定(第2缓冲液中化合物的取样)的试验区为图3的试验区1。
首先，分别在各自容纳有含有化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中实施上述CE工序，进行从第1容器、第2容器和第3容器分别回收第1缓冲液的CE终止工序。
接下来，进行EA工序。这里，EA工序的意思是Efflux Assay(流出物检测)，是用于用同一平台(工序、样品)对来自细胞的胆汁和血中(转运蛋白途径和被动扩散)排泄组分进行识别评价的工序(相当于实施例中的工序5)。本方法中，将EA工序分别在试验区1～3中区分，分别作为EA1工序、EA2工序和EA3工序。
具体地，EA1工序中，在CE终止工序之后，在第1容器中添加含有解除细胞间黏附的试剂的第2缓冲液，将第1容器内的温度调节至第3温度并保温。
通过使用解除细胞间黏附的试剂解除细胞的细胞间黏附，使除了残留于细胞内的化合物以外的化合物全部放出(图3的试验区1，37℃崩溃体系)。作为解除细胞间黏附的试剂，可以使用本技术领域公知的试剂，例如可以使用螯合剂(乙二醇醚二胺四乙酸EGTA等)。EGTA具有抑制与细胞间黏附分子的黏附相关的Ca2+、Mg2+的作用的螯合作用，作为用于解除细胞间黏附的试剂广为人知。
将含有该解除细胞间黏附的试剂的第2缓冲液(例如汉克斯(-)液)添加在第1容器中，将第1容器内的温度调节至第3温度。第3温度是所用细胞的最适培养温度，可以根据所用细胞的种类适当选择。一般是作为生物体内环境的体温，例如约为37℃。
在上述EA1工序中，隔开间隔t2地测定第2缓冲液中化合物的量B1和B1’。即，隔开间隔t2的时间，进行至少两次取样，测定第2缓冲液中化合物的量。取样的最适时间点因评价对象化合物的种类、所用细胞的种类而异，在EA1工序中，例如隔开数秒～数十分钟的间隔，设定至少两次、优选两次以上的时间点。但根据情况的不同，方便起见，也可以在该工序的起始时刻进行第1次取样。
多次取样和化合物量的测定如上所述。在试验区1(图3的37℃崩溃体系)，细胞间黏附崩溃(胆管内存在的成分经时性向外放出)。
在试验区1，胆管侧排出(3)、第二血管侧排出(来自被动扩散(1)和转运蛋白(TP)(2)的排出)的总和组分从细胞向缓冲液(例如汉克斯(-)液)被排出(图3)。因此，通过用上述方法对EA1工序的经时变化(图1中[2]的斜率)进行分析，能够求出化合物从细胞的基底/基底外侧面和顶面的排出速度。具体地，由隔开间隔t2地测得的化合物量B1和B1’，利用式(B1’-B1)/t2，算出化合物从细胞的基底/基底外侧面和顶面的排出速度。
此外，另一方式中，本公开提供一种化合物动态分析方法，其为使用细胞的化合物动态分析方法，
包括：上述CE终止工序之后，在第2容器中添加第3缓冲液，将前述第2容器内的温度调节至第3温度并保温的EA2工序；
在前述EA2工序中，隔开间隔t2地测定前述第3缓冲液中前述化合物的量B2和B2’，
基于前述量B2和B2’以及前述间隔t2算出前述化合物从前述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
通过上述方法，求出图1的EA工序中[3]的经时变化(曲线图的斜率)。进行B2和B2’的测定(第3缓冲液中化合物的取样)的试验区为图3的试验区2。
首先，与上述同样地进行CE终止工序。然后在EA2工序中，CE终止工序之后，在第2容器中添加第3缓冲液，将第2容器内的温度调节至第3温度并保温。
第3缓冲液是适合细胞培养的缓冲液，例如可以使用第1缓冲液(汉克斯液)等。第3温度与上述EA1工序是同样的。
EA2工序中，隔开间隔t2地测定第3缓冲液中化合物的量B2和B2’。即，隔开间隔t2的时间，进行至少两次取样，测定第3缓冲液中化合物的量。取样的最适时间点因评价对象化合物的种类、所用细胞的种类而异，EA2工序中，例如隔开数秒～数十分钟的间隔设定至少两次、优选为两次以上时间点。多次取样和化合物量的测定如上所述。但根据情况的不同，方便起见，也可以在该工序的起始时刻进行第一次取样。
在试验区2，仅排出第二血管侧排出(被动扩散(1)和转运蛋白(2))(图3)。因此，通过利用上述方法分析EA2工序的经时变化(图1中[3]的斜率)，能够求出化合物从细胞的基底/基底外侧面的排出速度。具体地，由隔开间隔t2地测定的化合物量B2和B2’，通过式(B2’-B2)/t2，算出化合物从细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
在进一步的另一方式中，本公开提供一种化合物动态分析方法，其为使用细胞的化合物动态分析方法，
包括：上述CE终止工序之后，在第3容器中添加第3缓冲液，将前述第3容器内的温度调节至比第3温度低的第4温度并保温的EA3工序；
在前述EA3工序中，隔开间隔t2地测定前述第3缓冲液中前述化合物的量B3和B3’，
基于前述量B3和B3’以及前述间隔t2算出前述化合物通过被动扩散从前述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
通过上述方法，求出图1的EA工序中[4]的经时变化(曲线图的斜率)。进行B3和B3’的测定(第3缓冲液中化合物的取样)的试验区为图3的试验区3。
首先，与上述同样地进行CE终止工序。然后在EA3工序中，CE终止工序之后，在第3容器中添加第3缓冲液，将第3容器内的温度调节至比第3温度低的第4温度并保温。
第3缓冲液与上述工序EA2是同样的。此外，第4温度是抑制摄取了化合物的细胞将该化合物向外部排出的温度，可以根据所用细胞的种类适当选择。一般例如约为4℃(4℃±1℃)，优选为4℃。
在EA3工序中，隔开间隔t2地测定第3缓冲液中化合物的量B3和B3’。即，隔开间隔t2的时间，进行至少两次取样，测定第3缓冲液中化合物的量。取样的最适时间点因评价对象化合物的种类、所用细胞的种类而异，在EA3工序中，例如隔开数秒～数十分钟的间隔设定至少两次、优选为两次以上时间点。多次取样和化合物量的测定如上所述。但根据情况的不同，方便起见，也可以在该工序的起始时刻进行第一次取样。
在试验区3，抑制第二血管侧排出中由转运蛋白(1)排出的化合物，仅排出通过被动扩散(2)的排出组分(图3)。因此，通过利用上述方法分析EA3工序的经时变化(图1中[4]的斜率)，能够求出化合物通过被动扩散从细胞的基底/基底外侧面的排出速度。具体地，由隔开间隔t2地测得的化合物量B3和B3’，通过式(B3’-B3)/t2，算出化合物通过被动扩散从细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
进一步的方式中，本公开提供一种化合物动态分析方法，其为上述化合物动态分析方法，
基于前述量B1和B1’以及B2和B2’、间隔t2，算出前述化合物从前述细胞的顶面的排出速度。
通过对EA1工序与EA2工序的经时变化的差进行分析，能够求出化合物从细胞的顶面的排出速度。具体地，由隔开间隔t2地测得的化合物量B1和B1’以及化合物量B2和B2’，通过式{(B1’-B2’)-(B1-B2)}/t2，算出化合物从细胞的顶面的排出速度。
另一方式中，本公开提供一种化合物动态分析方法，其为上述化合物动态分析方法，
基于前述量B2和B2’以及B3和B3’、间隔t2，算出前述化合物通过转运蛋白途径从前述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
通过对EA2工序与EA3工序的经时变化的差进行分析，能够求出化合物通过转运蛋白途径从细胞的基底/基底外侧面的排出速度。具体地，由隔开间隔t2地测得的化合物量B2和B2’以及化合物量B3和B3’，通过式{(B2’-B3’)-(B2-B3)}/t2，算出化合物通过转运蛋白途径从细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
本说明书中，将EA工序中取样的间隔表示为“t2”，EA1、EA2和EA3各工序(试验区)中的间隔t2可以相同，或者也可以不同。例如，可设想在EA1、EA2和EA3工序中在不同的时间点进行取样。更具体地，在EA工序中，设想在t2i、t2ii、t2iii、……t2x的时间点进行取样的情况。基于取样并测得的化合物量制作曲线图，为了在更接近直线的范围内求出经时变化(速度)，可以在EA1工序中求出t2i～t2ii之间的经时变化、在EA2工序中求出t2i～t2iii之间的经时变化、在EA3工序中求出t2iv、……t2x之间的经时变化。
此外，另一方式中，本公开提供一种化合物动态分析方法，其为上述化合物动态分析方法，
包括：在前述CE工序之前，在容器内使前述细胞暴露于含有前述化合物的溶液，使前述化合物摄取入前述细胞的摄取工序；
在前述摄取工序中，隔开间隔t3地测定前述溶液中前述化合物的量A和A’，
基于前述量A和A’以及前述间隔t3算出前述细胞摄取前述化合物的摄取速度。
通过上述方法，求出图1的化合物摄取工序中的初始摄取速度。图3所示S1、S2和S3为S1≒S2≒S3，因此进行A和A’的测定(溶液中化合物的取样)的试验区为图3的试验区1～3中任一个均可。
这里，化合物摄取工序是使细胞暴露于含有化合物的溶液、使化合物摄取入细胞的工序(相当于实施例中的工序2)。
化合物摄取工序中的初始摄取速度可以通过一些方法求出。例如，上述CE工序和EA工序后，经过IA工序(求出细胞内残留量的细胞内分析(Intracellular Assay))后(经过实施例中的工序3～6后)，通过计算，求出摄取至细胞中的化合物量。或者，在实施例中的工序3之后进行工序6，此时改变时间而实施2孔以上，从而求出摄取至细胞中的化合物量。此外在另一方法中，根据上清中的化合物量随着时间的流逝而减少(培养基损失，medialoss)，对上清进行取样，求出摄取至细胞中的化合物量。
一个实施方式中，在摄取工序中，隔开间隔t3地测定溶液中化合物的量A和A’。化合物量的测定可以与上述同样地进行。
通过分析摄取工序的经时变化，能够求出细胞摄取化合物的摄取速度。具体地，由隔开间隔t3地测得的化合物量A和A’，通过式(A’-A)/t3，算出细胞摄取化合物的摄取速度。
此外，优选在化合物摄取工序(实施例中的工序2)中求出化合物的最适初始浓度。例如，设定多个初始浓度，由化合物的摄取数据制成图1那样的曲线图，对得到的曲线图进行比较，设定最适初始浓度，即不会对细胞产生严重损伤、能够进行准确的数据分析(例如转运蛋白不饱和)的浓度。
通过如上述那样算出细胞对化合物的摄取速度、以及化合物从细胞的排出速度，能够使用细胞，在体外简便且准确地、而且容易理解和掌握地对化合物的动态进行分析。通过求出化合物动态的速度，能够将化合物的摄取量、排泄量可视化(图表化)，化合物的动态变得更容易理解，判断材料增多。例如，能够理解化合物的摄取与排泄的相互作用，预测测定后的排泄。
以下，通过实施例对本发明的具体实施方式进行说明，但本发明不受以下实施例的限定。
实施例1
本实施例中，按照图2的工序0～6对应用本发明的化合物动态分析方法进行说明。此外，使用图3对工序4～6进行详述。
需说明的是，以下的实施例是用于对本发明进行说明的一些例子，本实施例所示缓冲液、温度、时间等具体条件也可以使用其他条件，只要作为技术思想而言具有同样的效果即可。
本实施例中，对使用试验区1～3这3个试验区的情况进行说明。各试验区中存在保持细胞的保持区域，这些保持区域可以在每个各试验区使用不同的容器，也可以对具有多个保持区域的一个容器内进行分区、设定各试验区。
<工序0：细胞的制备与培养>
本工序中，首先进行用于分析化合物动态的细胞的制备、培养。以下显示的是一个例子。
(1)肝细胞
肝细胞的制备按照原位胶原酶灌注法。详细如下。在戊巴比妥麻醉下对大鼠(5～6周龄)进行开腹，在门静脉中插入导管，注入前灌注液(不含Ca2+和Mg2+、含有乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)的汉克斯液)。在确认肝脏的脱血充分进行后，停止灌注。将灌注液换成胶原酶溶液，进行灌注。本实施例中使用含有0.05％胶原酶的汉克斯液进行灌注，但不限定为这种情况。确认细胞间组织被胶原酶消化后停止灌注。将肝脏切下，在冷的汉克斯液中切碎，通过吹吸(Pipetting)分散为细胞。使用等渗Percoll液，通过500G、5分钟离心分离，将有损伤的肝细胞除去。通过台盼蓝拒染法测定得到的肝细胞的生存率，将生存率85％以上的肝细胞用于培养。这里将生存率85％以上的肝细胞用于培养，但不一定限定为该条件。此外，肝细胞的制备不一定限定为原位胶原酶灌注法。所用肝细胞不限定为大鼠来源，大鼠的品系也不做限定。本实施例中利用的是肝细胞，但不限定为该细胞。
(2)其他细胞
除了从人或动物等的肝脏制备的肝细胞以外，也可以在实验中应用由小鼠等表达的人源化肝细胞、从iPS细胞分化诱导的iPS细胞来源肝细胞。此外，细胞系(细胞株)的HepaRG细胞、HepG2细胞也同样可以应用。而且，各种脏器来源细胞也能够在本发明中应用。
(3)将如上所述制备的细胞悬浮在培养基中，在市售的胶原蛋白包被培养皿中，将肝细胞按5X105细胞/mL的密度悬浮接种在培养基中。接种密度、培养基、培养板001没有特别限定。将培养板的一例示于图7。这里，显示的是包括24个培养区域(孔，002)的24孔培养板，但不限定为这种情况，只要是能够保持规定细胞的容器即可，也可以使用其他形状的容器。接种后，使用CO2培养箱，在5％CO2、37℃的条件下开始培养。经过18小时以上后，进行最初的培养基替换。接种第18小时以后的培养中使用的培养基没有特别限定，本实施例中，使用的是在从培养基(10％FCS+)去掉FCS而得的培养基(以下的培养基(FCS-))中添加基质胶而得的培养基。以后每24小时使用培养基(FCS-)进行培养基替换。如后所述在工序5中进行3种不同条件下的试验(试验区1、2、3，在工序5中详述)，因此在该时刻准备3块独立的相同条件的培养板。在工序0至4和工序5中，3种试验区均进行同样的试验操作。
<工序1：细胞的预处理>
在本工序中，对通过工序0培养的细胞，完成适合动态分析的预处理。以下显示的是一个例子。
将通过工序0培养4天的细胞的培养上清除去，添加400μL作为缓冲液的汉克斯液，37℃温育10分钟(图2的工序1)。缓冲液的种类和量没有特别限定。
工序1的操作优选重复两次。通过以这种方式将细胞所适应的成分从工序0的培养中使用的培养基替换为缓冲液(例如汉克斯液)，能够为了通过以下工序进行准确的测定、分析打下基础。其中，工序1重复几次是根据所用缓冲液的种类、细胞的种类任意改变的。
<工序2：化合物给药>
本工序中，用进行动态分析的对象化合物对细胞进行给药。以下显示的是一个例子。
将缓冲液除去后，在孔中添加200μL的10μM羧基二氯荧光素(CDF，荧光试剂)，37℃温育30分钟，然后4℃保持5分钟(图2的工序2)。试剂的种类、浓度、量没有特别限定。CDF发出荧光，因此能够作为模型试剂，用读板器简便地定量。此外，将给药量设为200μL，这选择的是孔内的细胞整体浸入试剂的量。CDF的浓度只要是以往作为细胞的荧光测定使用的浓度即可。作为用于用读板器检测的试剂量，也优选应用本浓度。温育的时间设为30分钟，这是基于化合物的摄取与排出达到大体平衡状态的时间为30分钟的预研究的结果采用的。出于防止给药的化合物向细胞外漏出的目的，30分钟温育后将板温度设为4℃。因为，通过降低容器内的温度，会发生抑制细胞将化合物向外部排出的现象。
通过以这种方式将细胞的温度设为规定温度以下，化合物留在细胞内，能够抑制向细胞外漏出的现象。本实施例中设为4℃，只要是能够抑制给药的化合物向细胞外漏出的温度即可，不限定为这一温度。此外，只要是能够抑制给药的化合物向细胞外漏出、例如给予抑制剂那样的方法即可，不限定为降低温度的方法。无论哪种方式，工序2中的温度均为比工序1中设定的板温度低的温度。因为在工序1的预处理中，与工序2相反，细胞内化合物的吸收、排出现象发生活化的温度(例如37℃)是更为优选的。
化合物给药的时机不受本实施例的限定。例如，也有从试验日的前一天或者数天前开始进行化合物给药的情况。这种情况下，也可以在工序0的阶段用化合物给药、省略工序1、2。
工序2中，在改变温育时间的同时、即在多个时间点从孔对培养基进行取样。例如，在时间点T和T’(T+t3)从孔对培养基进行取样。取样的培养基中化合物的测定方法如后所述。由此，在CE工序(工序4)之前的化合物摄取工序中，求出隔开间隔t3的化合物量A和A’。通过式(A’-A)/t3，算出细胞摄取化合物的摄取速度。但根据情况的不同，方便起见，也可以将该工序的起始时刻用作时间点T。
<工序3：细胞清洗>
本工序中，通过工序3，将细胞内所含的化合物以外的物质冲洗掉。以下对一个例子进行说明。
在使板保持4℃的状态下，使用400μL冰冷的汉克斯液，清洗3次(图2的工序3)。4℃的目的与上述是同样的。培养时培养基的量为400μL，出于将残留于孔内壁的培养基成分除去的目的，将清洗汉克斯液的量设为400μL。一般的生化测定中惯例是清洗次数为3次，遵循这一惯例。各条件不做限定。由此，能够将除了作为测定对象的化合物以外的物质除去，使后面工序中的动态分析精度更高。
<工序4(CE工序)：血管侧排出组分回收>
作为对化合物动态进行分析的一个指标，分析给药的化合物容易长时间留在细胞内、或者难以仅短时间停留是有效的。因此，本工序中，为了获得用于上述指标的数据，在通过后述工序5评价各试验区内的细胞前，使化合物在规定时间以内从细胞内漏出。以下显示的是一个例子。
首先，用前处理用的缓冲液(例如汉克斯液)给药，37℃温育30分钟，回收含有化合物的汉克斯液(上清)(图2的工序4)。缓冲液可以使用与工序5中使用的缓冲液相同种类的缓冲液，也可以使用其他种类的缓冲液。到工序3为止，为了使细胞(图3，形象图中101)内存留的化合物在汉克斯液中通过第一血管侧排出、即被动扩散途径(图2的工序4、图3(1)’)、以及转运蛋白(TP)途径(图2的工序4、图3(2)’和形象图中的102)排出，维持37℃。如后所述，工序5中血管侧排出也会进行，因此，为了对两者进行区别，将工序4中的血管侧排出定义为第一血管侧排出，将工序5中的血管侧排出定义为第二血管侧排出。本质上都是从细胞内向血管侧(基底/基底外侧(Basal/Basolateral))(上清)排出的工序。转运蛋白是在细胞膜上表达的负责物质运输的膜蛋白，负责细胞内外的主动物质运输。此外，被动扩散是除了转运蛋白途径以外向细胞外的排出，包括从细胞膜的漏出等。将工序4中排出至汉克斯液的化合物定义为血管侧排出组分是因为，朝向汉克斯液的细胞上表面部分相当于基底(Basal)/基底外侧(Basolateral)面(图3、形象图中104)、被设想成生物体内朝向血管的部分。
在下面说明的工序5中，是通过3种不同的操作进行化合物的回收的工序(试验区1、2、3)，通过在工序5之前已通过工序4如上所述获得了第一血管侧排出组分(排出至汉克斯液的化合物)，能够获得验证化合物是否容易留在细胞内的指标。
此外，为了掌握血管侧排出各组分而使用的汉克斯液使用哪个试验区的汉克斯液都可以。例如，可以对后述试验区1～3全部的汉克斯液进行评价，也可以仅使用一部分。
工序4中，在改变温育时间的同时、即在多个时间点从孔对培养基进行取样。例如，在时间点T和T’(T+t1)从孔对培养基进行取样。取样的培养基中化合物的测定方法如后所述。由此，在CE工序(工序4)中，求出隔开间隔t1的化合物量S和S’。通过式(S’-S)/t1，算出化合物从细胞的基底/基底外侧面的排出速度。但根据情况的不同，方便起见，也可以将该工序的起始时刻用于时间点T。
如图2所示，上述工序0～4至少在试验区1～3中的任一个中进行。工序5中，为了通过后述分析获得本发明所需的多个指标数据，对于试验区1～3，分别以不同条件进行处理。以下显示的是一个例子。
<工序5、试验区1(EA1工序)：由37℃崩溃体系回收上清>
在试验区1，如图3的试验区1所示，从细胞向缓冲液(例如汉克斯(-)液)排出胆管侧排出(3)与第二血管侧排出(即来自扩散(1)和转运蛋白(TP)(2)的排出)的总和组分。汉克斯(-)液是不含钙离子、镁离子的汉克斯液，用于本试验区那样的不使细胞间黏附强化的情况等。以积极解除细胞间黏附为目的，如下所述使用EGTA那样的螯合剂。接下来，添加200μL含有1mM的EGTA的汉克斯(-)液。EGTA是具有抑制与细胞间黏附分子的黏附相关的Ca2+、Mg2+的作用的螯合作用、用于解除细胞间黏附的试剂。由此在培养过程中使形成的胆管崩溃。37℃温育30分钟后，回收上清。只要是具有螯合作用的试剂即可，不限定为EGTA。含有EGTA的缓冲液的种类、量、以及温育温度和时间没有特别限定。在工序5的试验区1，在工序4已终止的阶段存留于细胞内的化合物(图3的工序5、以及形象图(1)、(2))、以及向胆管排出的化合物(图3的工序5和形象图(3))全部排出至上清中而被回收(图3的工序5、试验区1)。工序5中将(3)定义为胆管侧排出组分，因为在细胞间黏附部分形成的间隙周围的细胞膜部分相当于顶(Apical)面(图3、105)、且间隙设想为毛细胆管(图3、103)。在工序5的试验区1，温度维持37℃，因此从细胞内向血管侧排出的组分包括被动扩散途径(图3的工序5、(1))和转运蛋白途径(图3的工序5、(2))。
在工序5的试验区1(EA1工序)，在改变温育时间的同时、即在多个时间点从孔对培养基进行取样。例如，在时间点T和T’(T+t2)从孔对培养基进行取样。取样的培养基中化合物的测定方法如后所述。由此，在EA1工序中，求出隔开间隔t2的化合物量B1和B1’。通过式(B1’-B1)/t2，算出化合物从细胞的基底/基底外侧面和顶面的排出速度。但根据情况的不同，方便起见，也可以将该工序的起始时刻用于时间点T。
<工序5、试验区2(EA2工序)：由37℃维持体系回收上清>
试验区2不像试验区1那样使胆管崩溃，仅排出图3中的第二血管侧排出(扩散(1)和转运蛋白(2))。
添加200μL汉克斯液。试验区2与试验区1不同，不含EGTA等螯合剂，因此细胞间黏附得以维持，因此，是也不诱发毛细胆管的崩溃的试验区。37℃温育30分钟后，回收上清。在工序5的试验区2，在工序4已终止的阶段，存留于细胞内的化合物(图3的工序5、和形象图(1)、(2))排出至上清中并被回收(图3的工序5、试验区2)。按照至此为止的说明，排出至上清中的化合物被定义为第二血管侧排出组分。在工序5的试验区2，温度维持在37℃，因此从细胞内向血管侧排出的组分包括被动扩散途径(图3的工序5、(1))和转运蛋白途径(图3的工序5、(2))。
在工序5的试验区2(EA2工序)，在改变温育时间的同时、即在多个时间点从孔对培养基进行取样。例如，在时间点T和T’(T+t2)从孔对培养基进行取样。取样的培养基中化合物的测定方法如后所述。由此，在EA2工序中，求出隔开间隔t2的化合物量B2和B2’。通过式(B2’-B2)/t2，算出化合物从细胞的基底/基底外侧面的排出速度。但根据情况的不同，方便起见，也可以将该工序的起始时刻用于时间点T。
此外，通过对从工序5的试验区1和试验区2回收的化合物的量进行定量分析，例如，通过从对试验区1中回收的化合物量进行定量而得的值减去对试验区2中回收的化合物量进行定量而得的值，能够分别算出胆管侧排出(3)的化合物量和第二血管侧排出的化合物量。
<工序5、试验区3(EA3工序)：由4℃维持体系回收上清>
试验区3通过如后所述设为比试验区1、2低的温度条件，抑制第二血管侧排出中由转运蛋白(1)排出的化合物，仅排出通过扩散(2)的排出组分。
添加200μL汉克斯液，4℃温育30分钟后，回收上清。与同一维持体系的工序5的试验区2的试验温度是不同的。这是为了通过设为4℃而抑制转运蛋白途径的血管侧排出。在工序5的试验区3，通过采用抑制转运蛋白活性的4℃低温的试验区，仅对被动扩散途径的排出量进行定量(图3的工序5、(1))，能够在与工序5的试验区2的比较中，算出(定量)通过转运蛋白途径的血管侧化合物排出量。各化合物中存在用于在细胞内外移动的特异性转运蛋白。因此，能够排除被动扩散途径的排出量、对转运蛋白途径的排出量进行定量意味着能够对各化合物的特异性排出量进行定量。缓冲液的种类、量、以及温育温度和时间没有特别限定。通过与上述同样地对从工序5的试验区2和试验区3回收的化合物进行定量，能够算出转运蛋白途径的排出组分。
在工序5的试验区3(EA3工序)，在改变温育时间的同时、即在多个时间点从孔对培养基进行取样。例如，在时间点T和T’(T+t2)从孔对培养基进行取样。取样的培养基中化合物的测定方法如后所述。由此，在EA3工序中，求出隔开间隔t2的化合物量B3和B3’。通过式(B3’-B3)/t2，算出化合物通过被动扩散从细胞的基底/基底外侧面的排出速度。但根据情况的不同，方便起见，也可以将该工序的起始时刻用于时间点T。
此外，本实施例中显示了使用试验区1、2、3分别算出排出组分的例子，但试验区的数量没有必要一定是3个。例如，如果仅想要分离胆管侧排出(3)和第二血管侧排出((1)+(2))，则可以仅实施试验区1和2，如果想要单单分离第二血管侧排出中的扩散(1)和转运蛋白(1)，则可以仅实施试验区2、3。此外，通过根据需要另外设置4℃崩溃体系，能够抑制向毛细胆管侧的排出中转运蛋白途径的排出、仅测定通过扩散的排出组分。由此，例如，根据该4℃崩溃体系与试验区3的比较，能够将通过扩散向毛细胆管侧的排出与通过转运蛋白途径向毛细胆管侧的排出组分分开进行评价。
进一步，通过算出试验区1(EA1工序)与试验区2(EA2工序)的差，可以求出单位时间内的胆汁排泄量。具体地，以上述多个时间点T与T’(T+t2)之间的时间(这里为间隔t2)为分母、以多个时间点的化合物量的差(即胆汁排泄量)为分子算出。例如，通过式{(B1’-B2’)-(B1-B2)/t2，能够算出胆汁排泄量、即化合物从细胞的顶面的排出速度。但根据情况的不同，方便起见，也可以将该工序的起始时刻用于时间点T。
此外，通过算出试验区2(EA2工序)与试验区3(EA3工序)的差，可以求出单位时间内的通过转运蛋白途径的血中排泄量。具体地，以上述多个时间点T与T’(T+t2)之间的时间(这里为间隔t2)为分母、多个时间点的化合物量的差(即转运蛋白途径的血中排泄量)为分子算出。例如，通过式{(B2’-B3’)-(B2-B3)/t2，可以算出通过转运蛋白途径的血中排泄量、即化合物通过转运蛋白途径从细胞的基底/基底外侧面的排出速度。但根据情况的不同，方便起见，也可以将该工序的起始时刻用于时间点T。
上述试验区1～3各自的工序按照哪种顺序进行都可以，也可以并行地实施各工序。
<工序6：胆管组分、细胞内组分的回收>
再次在工序6中回到3个试验区都共通的操作。通过工序6，对用于进行细胞内残留组分的定量的化合物进行回收。使用读板器等对荧光药剂等进行定量的情况下，优选例如添加200μL含有1％的表面活性剂的汉克斯液，悬浮，回收全部量(图2的工序6)。由此，能够使细胞膜破碎，将残留于细胞内的化合物排出。将得到的样品移至培养板，使用读板器，进行荧光测量。准备仅添加汉克斯液的孔用于空白测定。以激发波长484nm、吸收波长519nm测定荧光强度。
此外，使用质量分析(LCMS)装置等对化合物进行定量的情况下，通过水的添加带来的低渗化、有机溶剂处理等来提取细胞内残留组分后，用甲醇等有机溶剂悬浮，回收全部量(图2的工序6)。然后，使用LCMS装置，如后所述进行化合物的定量。
<基于测定结果的各组分中的分配比率的确定和评分>
基于反映通过上述工序得到的化合物量的荧光强度，计算各组分中的分配比率。这里，将工序5、6的总和(图3，B#+C#＝(1)+(2)+(3)+(4))设为化合物量100％。将这种情况作为“图形1”。
由通过荧光量测定求出的6种值(B1、B2、B3、C1、C2、C3)，求出图4的图形1显示的那样的在各分区的分配比率。根据这些值，
·仅通过扩散导致的第二血管侧排出组分(通过扩散的细胞外流出物(Extracellular Efflux by Diffusion)，ExEfx-Dif)对应于B3，
·仅通过转运蛋白途径导致的第二血管侧排出组分(通过转运蛋白的细胞外流出物(Extracellular Efflux by Transporter)，ExEfx-TP)对应于B2-B3，
·胆管侧排出组分(胆管流出物(Bile Canaliculi Efflux)，BCEfx)对应于B1-B2，
·细胞内残留组分(Cell)对应于C1。
基于该结果，可以绘出图5的图形1那样的扇形图，能够在视觉上理解各组分中的分配比率的整体情况。
进一步，基于定量结果，能够实现以下那样的化合物固有的评分。本实施例中显示的是算出的CDF的分数的一例。算出的分数不限定为这一分数。
对利用转运蛋白途径的血管侧排出进行评价的分数是：
·作为通过转运蛋白途径排出的化合物量相对于第二血管侧排出化合物量的比例(通过扩散的细胞外流出物的比例(Ratio of Extracellular Efflux by Diffusion)，RexEMTP)，通过(B2-B3)/B2求出。
对向胆管的排泄进行评价的分数是：
·作为胆管排泄化合物量相对于细胞内摄取的全部化合物量的比例(胆管留存药物(Biliary Retention Drug)、BiRD)，通过(B1-B2)/(C1+C2)，或者，
·另一方法，作为胆管排泄化合物量相对于残留于细胞内的化合物量的比例，通过(C2-C1)/C2、或者(B1-B2)/C1等求出。
<不同化合物间的分配比率和分数的比较>
将CDF改为罗丹明123，通过与上述同样的操作，能够得到图6所示结果(图形1)。可见，能够检测到与显示CDF的结果的图5(图形1)明显不同的分配比率。
此外，例如，通过转运蛋白途径排出的化合物量相对于CDF的血管侧排出化合物量的比例(RexEMTP)和胆管排泄化合物量相对于细胞内摄取的全部化合物量的比例(BiRD)分别为41.08、18.58，而罗丹明123的这两个比例为52.52、4.92，可见，CDF与罗丹明123相比是保持了更容易向胆管排泄、更难向血管侧排出的性质的化合物。如上所述，通过本发明，能够对各化合物显示什么样的动态进行评价。
<化合物动态的可视化>
基于如上述那样操作求出的化合物的摄取量和排泄量，通过将细胞内的化合物动态如图1那样以化合物摄取、排泄曲线(Disposition curve)的形式图表化，能够在视觉上理解化合物的动态。
实施例2
实施例2中，关于基于测定结果对各组分中的分配比率的确定和评分，对使用与实施例1不同的方法的情况进行说明。
本实施例中，通过利用图3记载的S#(相当于工序4)的定量值，在实施例1的图形1所示各组分中的分配比率的基础上，还能够给出给药化合物是容易留在细胞内还是难以留在细胞内的信息，能够进行更精密的评价。即，将工序4、5、6的总和(图3，S#+B#+C#＝(1)’+(2)’+(1)+(2)+(3)+(4))作为100％的给药化合物量。将这种情况作为“图形2”。因此，可以将由工序4、5、6各试验区求出的9种值(S1、S2、S3、B1、B2、B3、C1、C2、C3)用作评价指标。
由通过荧光量测定求出的9种值，求出图4的图形2所示那样的在各分区的分配比率。根据这些值，
·第一血管侧排出组分(Sup组分)对应于S1(≒S2≒S3)，
·仅通过扩散的第二血管侧排出组分(通过扩散的细胞外流出物(ExtracellularEfflux by Diffusion)，ExEfx-Dif)对应于B3，
·仅通过转运蛋白途径的第二血管侧排出组分(通过转运蛋白的细胞外流出物(Extracellular Efflux by Transporter)，ExEfx-TP)对应于B2-B3，
·胆管侧排出组分(胆管流出物(Bile Canaliculi Efflux)，BCEfx)对应于B1-B2，
·细胞内残留组分(Cell)对应于C1。
基于该结果，能够绘成图5的图形2那样的扇形图，能够在视觉上理解各组分中的分配比率整体情况。通过使用实施例2所示方法，作为是容易留在细胞内还是难以留在细胞内的指标的Sup组分在CDF中为70.82，而在罗丹明123中为39.29(图6，图形2)，可见存在CDF容易向血管侧排出的倾向。这与实施例1的细胞内残留组分评价一致。
进一步，基于定量结果，能够实现化合物固有的评分，这正如实施例1记载的那样。
实施例3
本实施例中，以转移至EA工序的细胞内化合物量为基准(100％)进行分析(图形3)。试验区1～3中的化合物量原理上应当是相同的，但因为会产生实验误差，所以基于平均值进行分析。将实施例1的图形1所示各组分的化合物量应用于以下的算式。
化合物量100％＝{(B1+C1)+(B2+C2)+(B3+C3)}/3
利用该图形3，能够实现比图形1更精确的分析。
实施例4
本实施例中，以细胞内化合物的总摄取量为基准(100％)进行分析(图形4)。试验区1～3中的化合物量原理上应当是相同的，但因为会产生实验误差，所以基于平均值进行分析。将实施例2的图形2所示各组分的化合物量应用于以下的算式。
化合物量100％＝{(S1+B1+C1)+(S2+B2+C2)+(S3+B3+C3)}/3
利用该图形4，能够实现比图形2更精确的分析。
实施例5
实施例5中，对于实现实施例1～4中描述的一系列工序的自动化的装置的一例进行描述。此外，对于后述装置的动作的目的、各构成的功能等，与上述实施例1～4重复的情况下，有时会省略记载。
对于实施例1～4所示试验区1～3各自设定的保持细胞的区域，在后述装置构成中使用“试验区1用的孔”“试验区2用的孔”“试验区3用的孔”等表述进行说明，它们例如可以将上述“孔培养板”的多个容器分别设定于各个试验区，也可以对一个孔培养板中的多个孔进行划分，将划分出的各个区域例如设为“第1容器”“第2容器”“第3容器”等。
特别是试验区1用的孔和试验区2用的孔，几乎进行相同的温度调节，因此从精度、速度的观点出发，对一个孔培养板内进行划分进行设定更能有效地进行评价。
此外，关于后述装置动作，对于各试验区用的孔(容器)的替换操作可以自动替换也可以手动操作替换。关于该容器的替换、设置操作，以下省略说明。
如图8所示，本装置由培养部106、样品制备部107(包括样品制备部107的输入部107A)、分析部108和显示部109构成。进一步，样品制备部107具有调节后述各容器(板)内的温度的温度调节部107B和可向容器供应液体或回收液体的送液部107C等。分析部108具有：测定化合物等成分的量的测定部108A；以及由从测定部取得的化合物等成分的量，基于转运蛋白途径、胆管途径、细胞内残留、从转运蛋白和胆管以外排出的组分(扩散)各自的量、多个时间点的测定结果，对排出速度和/或摄取速度进行分析的分析部108B。上述装置构成是一个例子，例如也可以设为仅分析部设置在另外的装置中、将从测定部取得的信息传输至该另外的装置等的构成。
此外，将样品制备部的详细构成示于图9和10。在样品制备部，如到此为止在实施例1～4中描述的那样，目的是自动制备作为分析对象的各组分。各构成要素的说明按照后述流程图来描述。
自动测量装置的动作流程图示于图11。图11的流程图不过是一个例子，如实施例1<工序2>记载的那样，化合物给药的时机不同的情况下，不受这一例子的限定。本实施例中，关于保持细胞的容器，使用具有多个细胞保持区域(孔)的板作为一例进行说明，但容器不限定为板，只要能够保持细胞即可。
<从培养部向样品制备部的输送>
首先，肝细胞在培养部106中培养(图8和图11)(图11(a)子工序1)。然后，保持有培养的肝细胞的板被输送到样品制备部的第一带调温功能板支架210上和第二带调温功能板支架211上(图8和图11)(图11(a)子工序2)。
<样品制备：相当于实施例1～4的工序1>
设置于送液部107C的、附带有用于吸取液体的吸嘴的吸头205移动至上述板支架上的、充满要除去的培养基的培养板001的孔002，从孔吸取培养基，全量除去(图11(a)子工序3)。除去的培养基在废液槽206中丢弃回收。
接下来，在安装于吸嘴的枪头尖204上，从保存有多个枪头的枪头架207安装保持液体的枪头。枪头尖移动至常温药液架209，吸取缓冲液(图11(a)子工序4)。移动至目标孔、添加缓冲液后(图11(a)子工序5)，枪头尖移动至集尘箱214，将枪头丢弃。虽然为了防止污染等，这里利用的是可替换枪头，但并不限定为这种情况。注射泵控制器201控制注射泵203，结果控制枪头尖204和吸头205。此外，调温控制器202对第一带调温功能板支架210和第二带调温功能板支架211、培养部的温度进行调节。
吸头移动至充满缓冲液的孔，进行缓冲液的除去(图11(a)子工序6)。除去的培养基在废液槽206中丢弃回收。该工序合计重复两次(清洗工序)(图11(a)子工序7)。
接下来，在枪头尖204上安装枪头架207内的枪头，枪头尖移动至常温药液架209，吸取缓冲液(图11(a)子工序8)。移动至目标孔、添加缓冲液后，枪头尖移动至集尘箱214，将枪头丢弃。37℃等待10分钟(预处理)(图11(a)子工序9)。然后，吸头205移动至充满缓冲液的孔，将缓冲液全量除去(图11(a)子工序10)。
<样品制备：相当于实施例1～4的工序2>
在枪头尖204上安装枪头架207内的枪头，枪头尖移动至常温药液架209，吸取药液(图11(a)子工序11)。移动至目标孔、添加药液后(图11(a)子工序12)，枪头尖204移动至集尘箱214，将枪头丢弃。37℃等待30分钟(图11(a)子工序12)。然后，作为保持容器的容器保持部的一个构成例的、第一带调温功能板支架210和第二带调温功能板支架211从37℃变为4℃后(图11(a)子工序13)，吸头205移动至充满药液的孔，将药液全量除去(图11(a)子工序14)。
此外，本实施例中的温度调节部说明的是在板支架中搭载有调温功能，温度调节部也可以与容器保持部分开存在。
<样品制备：相当于实施例1～4的工序3>
在枪头尖204上安装枪头架207内的枪头，枪头尖移动至冷藏药液架208，吸取缓冲液(图11(a)子工序15)。如上所述，使用冷藏药液是为了使转运蛋白活性那样的主动生命现象停止。冷藏药液架208是为了该目的而用于将药液、缓冲液等保持于低温的部件。移动至目标孔、添加缓冲液后(图11(a)子工序16)，枪头尖204移动至集尘箱214，将枪头丢弃。吸头移动至充满缓冲液的孔，将缓冲液除去(图11(a)子工序17)。除去的培养基在废液槽206中丢弃。该工序合计重复3次(清洗工序)(图11(a)子工序18)。
<样品制备：相当于实施例1～4的工序4>
第一带调温功能板支架210和第二带调温功能板支架211从4℃变为37℃后(图11(a)子工序19)，在枪头尖204上安装枪头架207内的枪头，枪头尖移动至冷藏药液架208，吸取缓冲液(图11(a)子工序20)。移动至目标孔、添加缓冲液后(图11(a)子工序21)，枪头尖204移动至集尘箱214，将枪头丢弃。37℃等待30分钟(图11(a)子工序20)。然后，第一带调温功能板支架210和第二带调温功能板支架211从37℃变为4℃后(图11(a)子工序22)，在枪头尖204上安装枪头架207内的枪头，移动至充满含有化合物的缓冲液的孔，吸取含有化合物的缓冲液(上清)，分注入第一板支架212和第二板支架213上的回收用回收板(回收)(图11(a)子工序23)。
<样品制备：相当于实施例1～4的工序5>
第一带调温板支架210从4℃变为37℃后(图11(a)子工序24)，在枪头尖204上安装枪头架207内的枪头，枪头尖移动至常温药液架209，吸取含有EGTA的缓冲液(图11(a)子工序25)。移动至第一板支架212上的试验区1用的孔，添加含有EGTA的缓冲液后(图11(b)子工序26)，枪头尖204移动至集尘箱214，将枪头丢弃。37℃等待30分钟(图11(b)子工序26)。
在枪头尖204上安装枪头架207内的枪头，枪头尖移动至常温药液架209，吸取缓冲液(图11(b)子工序27)。移动至第一板支架212上的试验区2用的孔，添加缓冲液后(图11(b)子工序28)，枪头尖204移动至集尘箱214，将枪头丢弃。37℃等待30分钟(图11(b)子工序28)。
在枪头尖204上安装枪头架207内的枪头，枪头尖移动至冷藏药液架209，吸取缓冲液(图11(b)子工序29)。
移动至第二板支架213上的试验区3用的孔，添加缓冲液后(图11(b)子工序30)，枪头尖204移动至集尘箱214，将枪头丢弃。4℃等待30分钟(图11(b)子工序30)。
在枪头尖204上安装枪头架207内的枪头，移动至充满含有化合物的EGTA缓冲液的孔，吸取含有化合物的EGTA缓冲液(上清)，分注入(回收至)第一板支架212上的回收用回收板(图11(b)子工序31)。
在枪头尖204上安装枪头架207内的枪头，移动至充满含有化合物的缓冲液的孔，吸取含有化合物的缓冲液(上清)，分注入(回收至)第一板支架212上的回收用回收板(图11(b)子工序32)。
在枪头尖204上安装枪头架207内的枪头，移动至充满含有化合物的EGTA缓冲液的孔，吸取含有化合物的缓冲液(上清)，分注入(回收至)第一板支架213上的回收用回收板(图11(b)子工序33)。
第一带调温功能板支架210和第二带调温功能板支架211均变为室温后(图11(b)子工序34)，在枪头尖204上安装枪头架207内的枪头，枪头尖移动至常温药液架209，吸取1％TritonX-100或纯水/甲醇(图11(b)子工序35)。移动至第一带调温功能板支架210和第二带调温功能板支架211上的试验区1、2、3用的孔，添加1％TritonX-100或纯水/甲醇后(图11(b)子工序36)，枪头尖204移动至集尘箱214，将枪头丢弃。
在枪头尖204上安装枪头架207内的枪头，移动至充满上述试剂的孔，全量吸取细胞悬浮液，分注入(回收至)第一板支架212和第二板支架213上的回收用回收板(图11(b)子工序37)。
关于上述装置的动作，对依次实施实施例1～4的试验区1～3的各工序中的动作的情况进行了描述，但各工序也可以轮流进行，还可以并行地实施各工序。
<从样品制备部向测定部的输送>
培养板回收到的化合物被输送至测定部(图11(b)子工序38)。在测定部，利用读板器或LCMS进行化合物的测定(图11(b)子工序39)。
<利用分析部算出分配比率和分数并显示结果>
由测定结果，算出各组分的分配比率和分数以及各排出速度和摄取速度(图11(b)子工序40)。然后，将得到的计算值显示在显示部(图11(b)子工序41)。
符号说明
001 培养板
002 孔
101 肝细胞
102 转运蛋白
103 毛细胆管
104 基底(Basal)/基底外侧(Basolateral)面
105 顶(Apical)面
201 注射泵控制器
202 调温控制器
203 注射泵
204 枪头尖
205 吸头
206 废液槽
207 枪头架
208 冷藏药液架
209 常温药液架
210 第一带调温功能板支架
211 第二带调温功能板支架
212 第一板支架
213 第二板支架
214 集尘箱

Claims (13)

1.一种化合物动态分析方法，其为使用细胞的化合物动态分析方法，
包括：在容纳有含有对象化合物的细胞的容器中添加第1缓冲液，将所述容器内的温度调节至第1温度并保温，并且将所述容器内的温度调节至比所述第1温度低的第2温度的CE工序；
在所述CE工序中，隔开间隔t1地测定所述第1缓冲液中所述化合物的量S和S’，
基于所述量S和S’以及所述间隔t1算出所述化合物从所述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
2.根据权利要求1所述的化合物动态分析方法，
包括：
分别在各自容纳有含有所述化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中实施所述CE工序，分别从所述第1容器、所述第2容器和所述第3容器回收所述第1缓冲液的CE终止工序，以及
所述CE终止工序之后，在所述第1容器中添加含有解除细胞间黏附的试剂的第2缓冲液，将所述第1容器内的温度调节至第3温度并保温的EA1工序；
在所述EA1工序中，隔开间隔t2地测定所述第2缓冲液中所述化合物的量B1和B1’；
基于所述量B1和B1’以及所述间隔t2算出所述化合物从所述细胞的基底/基底外侧面和顶面的排出速度。
3.根据权利要求2所述的化合物动态分析方法，
包括：所述CE终止工序之后，在所述第2容器中添加第3缓冲液，将所述第2容器内的温度调节至所述第3温度并保温的EA2工序；
在所述EA2工序中，隔开所述间隔t2地测定所述第3缓冲液中所述化合物的量B2和B2’，
基于所述量B2和B2’以及所述间隔t2算出所述化合物从所述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
4.根据权利要求3所述的化合物动态分析方法，基于所述量B1和B1’以及B2和B2’、所述间隔t2，算出所述化合物从所述细胞的顶面的排出速度。
5.根据权利要求3所述的化合物动态分析方法，
包括：所述CE终止工序之后，在所述第3容器中添加所述第3缓冲液，将所述第3容器内的温度调节至比所述第3温度低的第4温度并保温的EA3工序；
在所述EA3工序中，隔开所述间隔t2地测定所述第3缓冲液中所述化合物的量B3和B3’，
基于所述量B3和B3’以及所述间隔t2算出所述化合物通过被动扩散从所述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
6.根据权利要求5所述的化合物动态分析方法，
基于所述量B2和B2’以及B3和B3’、所述间隔t2，算出所述化合物通过转运蛋白途径从所述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
7.根据权利要求1所述的化合物动态分析方法，
包括：
分别在各自容纳有含有所述化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中实施所述CE工序，分别从所述第1容器、所述第2容器和所述第3容器回收所述第1缓冲液的CE终止工序，以及
所述CE终止工序之后，在所述第2容器中添加第3缓冲液，将所述第2容器内的温度调节至第3温度并保温的EA2工序；
在所述EA2工序中，隔开间隔t2地测定所述第3缓冲液中所述化合物的量B2和B2’，
基于所述量B2和B2’以及所述间隔t2算出所述化合物从所述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
8.根据权利要求1所述的化合物动态分析方法，
包括：
分别在各自容纳有含有所述化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中实施所述CE工序，分别从所述第1容器、所述第2容器和所述第3容器回收所述第1缓冲液的CE终止工序，以及
所述CE终止工序之后，在所述第3容器中添加第3缓冲液，将所述第3容器内的温度调节至比第3温度低的第4温度并保温的EA3工序；
在所述EA3工序中，隔开间隔t2地测定所述第3缓冲液中所述化合物的量B3和B3’，
基于所述量B3和B3’以及所述间隔t2算出所述化合物通过被动扩散从所述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
9.一种化合物动态分析方法，其为使用细胞的化合物动态分析方法，
包括：
分别在各自容纳有含有对象化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中添加第1缓冲液，将所述容器内的温度调节至第1温度并保温，并且将所述容器内的温度调节至比所述第1温度低的第2温度的CE工序，
分别从所述第1容器、所述第2容器和所述第3容器回收所述第1缓冲液的CE终止工序，以及
所述CE终止工序之后，在所述第1容器中添加含有解除细胞间黏附的试剂的第2缓冲液，将所述第1容器内的温度调节至第3温度并保温的EA1工序；
在所述EA1工序中，隔开间隔t2地测定所述第2缓冲液中所述化合物的量B1和B1’，
基于所述量B1和B1’以及所述间隔t2算出所述化合物从所述细胞的基底/基底外侧面和顶面的排出速度。
10.一种化合物动态分析方法，其为使用细胞的化合物动态分析方法，
包括：
分别在各自容纳有含有对象化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中添加第1缓冲液，将所述容器内的温度调节至第1温度并保温，并且将所述容器内的温度调节至比所述第1温度低的第2温度的CE工序，
分别从所述第1容器、所述第2容器和所述第3容器回收所述第1缓冲液的CE终止工序，以及
所述CE终止工序之后，在所述第2容器中添加第3缓冲液，将所述第2容器内的温度调节至所述第3温度并保温的EA2工序；
在所述EA2工序中，隔开间隔t2地测定所述第3缓冲液中所述化合物的量B2和B2’，
基于所述量B2和B2’以及所述间隔t2算出所述化合物从所述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
11.一种化合物动态分析方法，其为使用细胞的化合物动态分析方法，
包括：
分别在各自容纳有含有对象化合物的细胞的第1容器、第2容器和第3容器中添加第1缓冲液，将所述容器内的温度调节至第1温度并保温，并且将所述容器内的温度调节至比所述第1温度低的第2温度的CE工序，
分别从所述第1容器、所述第2容器和所述第3容器回收所述第1缓冲液的CE终止工序，以及
所述CE终止工序之后，在所述第3容器中添加所述第3缓冲液，将所述第3容器内的温度调节至比所述第3温度低的第4温度并保温的EA3工序；
在所述EA3工序中，隔开间隔t2地测定所述第3缓冲液中所述化合物的量B3和B3’，
基于所述量B3和B3’以及所述间隔t2算出所述化合物通过被动扩散从所述细胞的基底/基底外侧面的排出速度。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的化合物动态分析方法，
包括：在所述CE工序之前，在容器内使所述细胞暴露于含有所述化合物的溶液，使所述化合物摄取入所述细胞的摄取工序；
在所述摄取工序中，隔开间隔t3地测定所述溶液中所述化合物的量A和A’，
基于所述量A和A’以及所述间隔t3算出所述细胞摄取所述化合物的摄取速度。
13.根据权利要求1～11中任一项所述的化合物动态分析方法，所述细胞包括肝细胞。
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