CN102440848A - 一种胆汁排泄实验动物模型及建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胆汁排泄实验动物模型及建立方法，属于生命科学技术领域。本发明的特征是选取豚鼠作为动物模型，对豚鼠胆囊进行结扎，使胆汁从肝脏分泌后不经胆囊贮存，直接进入胆总管。继而进行胆总管插管，将胆汁引流至5ml离心管中，以备后续分析。该模型手术过程简便、快速、成功率高，特别是针对干扰素类等生物技术药物以豚鼠为具有药理活性的实验动物模型而言，是一种理想的研究胆汁排泄的实验动物模型。

Description

一种胆汁排泄实验动物模型及建立方法

技术领域

本发明属于生命科学技术领域，具体涉及一种胆汁排泄实验动物模型及建立方法。

背景技术

胆汁排泄是大多数药物及其代谢物肾外排泄的最主要途径之一。机体中许多重要的物质如维生素A、D、E、性激素、甲状腺激素经胆汁排泄均较显著。分子量300以上并有极性基团的药物和代谢物亦主要从肝分泌进入胆汁排泄。胆汁排泄速率和程度受药物的理化性质(分子量、化学结构、极性等)和某些生物学因素(动物种属、年龄、性别、胆汁流量、药物生物转化过程等)的影响。同时由于药物在体内存在肠肝循环，通过胆汁排泄研究对阐明药物的药代动力学和药效动力学过程均具有重要意义。药物及其代谢物的肠肝循环在药物的迟滞排泄中起着重要作用，使某些药物的药代动力学曲线常出现双吸收峰的特征。研究表明已烯雌酚、消炎痛、氯霉素、红霉素、吗啡等均可形成肠肝循环。

目前，药物胆汁排泄研究的动物模型一般使用麻醉大鼠作胆管插管引流，手术完成后给药，并以合适的时间间隔分段收集胆汁，进行药物测定。大鼠属啮齿目动物，成年雄性大鼠体重可达300g～400g，雌性大鼠可达180g～270g。且大鼠无胆囊，它们的总胆管括约肌阻力很少，肝分泌的胆汁通过总胆管进入十二指肠，受十二指肠端括约肌的控制。利用大鼠模型对多种生物技术药物包括蛋白质和多肽进行药物胆汁排泄的研究，如重组人生长激素、重组人胸腺素、重组人内皮抑素等药物。但根据SFDA和ICH-6有关生物技术药物非临床评价指导原则中规定，由于生物技术药物大多仅作用于特定的受体产生药效或毒性作用，很难与其它受体发生作用，所以选择相关动物(即在动物体内具有生物活性)用于药代动力学及非临床安全性评价至关重要。化学药物以代谢过程的差异来判断相关动物，通常使用大鼠和犬进行评价，但对生物技术药物而言，除非其在大鼠或犬体内具有生物活性，否则是不合适的。特别是干扰素类药物，对大鼠、仓鼠、豚鼠等多种动物进行了药效学相关动物筛选。结果表明，仓鼠、豚鼠为干扰素类药物的药效学相关动物。仓鼠体型较小，取血困难及动物来源受限较，难以满足临床前药代动力学研究的要求。豚鼠为啮齿目动物，体型适中，易于购买和饲养，是一种理想的实验动物，在医药学和生物学研究方面起着重要的作用。由于豚鼠有胆囊，因此其胆汁排泄模型的建立方法与大鼠较为不同。对于一些不以大鼠为药效学相关动物的药物而言，豚鼠模型的建立填补了这类药物胆汁排泄研究的空白，完善了临床前药代动力学研究的试验技术和方法。本发明建立了豚鼠胆管插管的动物模型，并已应用于聚乙二醇化重组集成干扰素变异体注射液和¹⁵⁸val-重组人集成干扰素α注射液的胆汁排泄研究。当前，国内外均未见利用豚鼠建立胆管插管的实验动物模型进行药物胆汁排泄研究的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种胆汁排泄实验动物模型的建立方法。为了实现上述发明的目的，本发明采用如下的技术方案：

1.将豚鼠麻醉(20％乌拉坦，1.2g/kg，i.p.)后，仰位固定于固定板上，将剑突上下的腹部被毛用剃毛刀剃干净。常规消毒后，以剑突为中心点在腹部正中线使用手术刀纵向切开皮肤(切口长度2.5～3.0cm)。使用眼科镊子提起腹肌，14cm直尖头手术剪剪开腹肌，切口长度约2.5cm左右；用酒精棉将手术切口周围和手术者的手指消毒后，两手手指夹住切口的两侧稍向前方推并压迫腹部，暴露胆囊。轻轻将透明的胆囊拉出，剥离胆囊管周围膜样结缔组织，并将胆囊管近胆总管一端用7^#手术缝合线结扎后，回复原位。

2.胆总管开口于十二指肠，使用止血钳分离胆总管周围膜样结缔组织。将其近十二指肠端用眼科弯尖头手术剪作一斜向切口，插入外径为1.5mm的聚乙烯导管，深度为6-7mm，7^#手术缝合线结扎固定后，回复原位。

3.检查腹腔及结扎部，常规缝合肌层与皮层，消毒，并使用生理盐水浸湿的医用纱布覆盖创面。将收集胆汁的导管口保留在外。手术完成后立即给药，并于合适的时间间隔分段收集胆汁，测定药物或代谢物的浓度。如在收集过程中动物清醒，可补充适量麻醉剂。

本发明利用豚鼠模型进行胆汁排泄研究，对豚鼠胆囊进行结扎，使胆汁从肝脏分泌后不经胆囊贮存，直接进入胆总管。继而进行胆总管插管，将胆汁引流至5ml离心管中以备后续分析。该模型手术过程简便、快速、成功率高。可对胆汁中药物实时排泄量、排泄速率、累积排泄量及累积排泄速率进行综合分析。

附图说明

图1是豚鼠皮下注射PEG-IFN-SA 18.6μg/kg后胆汁排泄曲线；

图2是豚鼠胆汁排泄实验动物模型的示意图；

1：胆囊管结扎处 2：胆总管插管处 3：胆管插管 4：收集的胆汁

图3是是豚鼠胆囊管结扎后的照片；

1为胆囊管结扎处

图4是豚鼠胆总管插管后的照片；

1为胆总管插管处

图5是豚鼠胆汁排泄试验动物模型建立后，收集胆汁的照片。

具体实施方式：

实施例1：

本实施例利用本发明建立的豚鼠胆汁排泄研究模型，适用于药物临床前药代动力学研究，建立该模型的具体方法如下：

1.健康豚鼠6只，雌雄各半，体重300～400g；

2.制备动物模型：

(1)将豚鼠麻醉(20％乌拉坦，1.2g/kg，i.p.)后，仰位固定于固定板上，将剑突上下的腹部被毛用剃毛刀剃干净。常规消毒后，以剑突为中心点在腹部正中线使用手术刀纵向切开皮肤(切口长度2.5～3.0cm)。使用眼科镊子提起腹肌，14cm直尖头手术剪剪开腹肌，切口长度约2.5cm左右；用酒精棉将手术切口周围和手术者的手指消毒后，两手手指夹住切口的两侧稍向前方推并压迫腹部，暴露胆囊。轻轻将透明的胆囊拉出，剥离胆囊管周围膜样结缔组织，并将胆囊管近胆总管一端用7^#手术缝合线结扎后，回复原位。

(2)胆总管开口于十二指肠，使用止血钳分离胆总管周围膜样结缔组织。将其近十二指肠端用眼科弯尖头手术剪作一斜向切口，插入外径为1.5mm的聚乙烯导管，深度为6-7mm，7^#手术缝合线结扎固定后，回复原位。

(3)检查腹腔及结扎部，常规缝合肌层与皮层，消毒，并使用生理盐水浸湿的医用纱布覆盖创面。将收集胆汁的导管口保留在外。手术完成后立即给药，并于合适的时间间隔分段收集胆汁，测定药物或代谢物的浓度。如在收集过程中动物清醒，可补充适量麻醉剂。

3.手术完成后，皮下注射聚乙二醇化重组集成干扰素变异体注射液(PEG-IFN-SA 18.6μg/kg，给药体积为1.0ml/kg体重，含¹²⁵I-PEG-IFN-SA 10μCi/300g体重)。

4.收集0-2、2-4、4-6、6-8、8-12和12-24h的胆汁，并计量。取200μl胆汁置于测定管内，用γ-计数器测定放射活性，并计算胆汁中药物排泄量和排泄速率以及累积排泄量，结果见表1、2和图1。给药后24h内由胆汁排出的药量占给药剂量的2.4％。(若在实验中动物清醒，可补充适量麻醉剂)。

表1.豚鼠sc PEG-IFN-SA(18.6μg/kg)后的胆汁累积排泄量(

n＝6)

表2.豚鼠sc PEG-IFN-SA(18.6μg/kg)后胆汁中药物的排泄速率(

n＝6)

结论：上述实例表明，本发明所述方法建立的模型可成功应用于不以大鼠为药效学相关动物的药物胆汁排泄研究。

Claims (4)

1.一种胆汁排泄实验动物模型及建立方法，其特征在于按以下步骤：

(1)将实验动物麻醉、固定、腹部被毛剃除、常规消毒、腹部正中线纵向切开皮肤然后暴露胆囊。剥离胆囊管周围膜样结缔组织，将胆囊管近胆总管一端结扎后回复原位；

(2)胆总管开口于十二指肠，分离胆总管周围膜样结缔组织。将其近十二指肠端作一斜向切口，插入导管，结扎固定后回复原位；

(3)检查腹腔及结扎部，常规缝合肌层与皮层，消毒，并使用生理盐水浸湿的医用纱布覆盖创面。将收集胆汁的导管口保留在外。手术完成后立即给药，合适的时间间隔分段收集胆汁，测定药物或代谢物的浓度。

2.根据权利要求1所述的胆汁排泄实验动物模型，其特征在于所述的动物为豚鼠。

3.根据权利要求1所述的胆汁排泄实验动物模型的建立方法，其特征在于：对豚鼠胆囊进行结扎，使胆汁从肝脏分泌后不经胆囊贮存，直接进入胆总管。继而进行胆总管插管，将胆汁引流至5ml离心管中，以备后续分析。

4.权利要求1-3所述方法所建立的豚鼠胆汁排泄实验动物模型。

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